4d3B-2

GUÍA DE PRÁCTICAS

E.A.P. TECNOLOGIA MÉDICA

LABORATORIO CLINICO Y
ANATOMIA PATOLÓGICA

Asignatura Biología Molecular

Autor : Blgo. Jorge Hau Camoretti

2012 -II
 GUIA DE PRACTICA DE BIOLOGÍA
MOLECULAR

SEMESTRE 2012- II

F-CV3-3B-2 2 Rev. Junio 2007

 INTRODUCCIÓN

Las prácticas de la asignatura de Biología Molecular, han sido

elaborados para que el alumno aprenda la parte básica de la biología
molecular: hacer la extracción, cuantificación, purificación,
amplificación, secuenciamiento del ADN y la extracción de ARN, en
muestras biológicas.

La Biología molecular es una herramienta muy importante en el

diagnostico de enfermedades, identificación de animales, plantas y
seres humanos, y principalmente en prevención de la salud.

Jorge Hau Camoretti

Biólogo

F-CV3-3B-2 3 Rev. Junio 2007

 PRÁCTICA No. 1 :
PREPARACION DE MUESTRA DE SANGRE POR TECNOLOGÍA DE FTA

1. Marco teórico
La tecnología de FTA, es una poderosa herramienta revolucionaria y simplificada,
optimizada para la colección, archivo, almacenamiento, purificación y análisis de
ADN y ARN a partir de muestras biológicas como: sangre, plasmidos,
microorganismos, células epiteliales, cultivos celulares, tejidos animales y
vegetales, etc.

2. Competencias :
 El alumno prepara la muestra de sangre en las tarjetas de FTA
3. Materiales y equipos :
 Tubos de vidrio de 150 x 10 mm
 Tarjeta de FTA
 Micropipeta de 100 a 1000 ul
 Tips de 100 a 1000 ul
 Alcohol, algodón, aguja Nro. 21
 Lancetas
4. Procedimiento :
 Se toma sangre del antebrazo por punción venosa en un tubo.
 Se toma 100 ul y se vierte en el Tarjeta de FTA y se deja secar.
 Se toma sangre del pulpejo del dedo, y se coloca directamente al
tarjeta de FTA y se deja secar
5. Resultados ;
Las muestras se sangre en la Tarjetas de FTA, se dejan secar a
temperatura ambiente hasta la siguiente practica, donde se va extraer el ADN.
6. Cuestionario
i. Que normas de Bioseguridad se emplean en laboratorio de Biología
Molecular
ii. Mencione reactivos que puedan causar algún daño al personal del
Laboratorio de Biología Molecular
7. Fuentes de información :
 Manual FTA Tecnology, Collect Transport, Archive and Purify Nucleic Acid.
WB120047, USA

F-CV3-3B-2 4 Rev. Junio 2007

 PRÁCTICA No. 2
EXTRACCIÓN DE ADN POR TECNOLOGÍA DE FTA

1. Marco teórico
Existe una gran variedad de fuentes a partir de las cuales se puede obtener
ADN. En principio, a partir cualquier sustancia biológica que contenga células
nucleadas (sangre, saliva, semen, pelo, huesos, dientes, músculo, orina, heces, etc)
se puede aislar ADN, aunque dependiendo de las condiciones a las que hayan
estado expuestas las muestras, el ADN podría estar degradado en mayor o menor
medida.

Las técnicas de extracción de ADN son relativamente sencillas, tan solo es

necesario lisar células nucleadas, para que el ADN quede libre en un medio acuoso,
y evitar la destrucción mecánica o enzimática del mismo. Este es un punto
importante, puesto que el ADN, aunque es estable en la célula intacta, es muy
vulnerable una vez lisada ésta. El objetivo final es obtener la máxima cantidad
posible de ADN a una concentración adecuada y conservando al máximo su
integridad. El número de métodos descritos para la obtención de ADN no es muy
extenso, aunque sí existen muchas adaptaciones y variaciones de los métodos
originales, destinados a optimizar diversos aspectos de la extracción en función de
la técnica a aplicar posteriormente

La Tecnología de FTA es una de las técnicas mas sencillas y aplicable a todo

tipo de muestras biológicas.
2. Competencias :
 El alumno aprende ha realizar la extracción de ADN por el método de FTA
3. Materiales y equipos:
 Tarjeta de FTA
 Micropipeta de 100 a 1000 ul
 Tips de 100 a 1000 ul
 Solución de purificación de FTA
 Tubos de 1.5 ml.
 Buffer TE (10 mM Tris-HCl, 0.1mM EDTA, pH 7.5),

4. Procedimiento :
Las muestras de sangre serán transferidas a tarjetas de FTA GeneCard, dejar secar
al medio ambiente durante 1 hora o toda la noche.( realizado en el práctica # 1)

 Usando el Micro Punch TM de 1.2 mm, se remueve la muestra o cortando tres

cuadraditos de 3 a 4 mm cuadrados
 La muestra poner el un tubo de 1.5 ml.

F-CV3-3B-2 5 Rev. Junio 2007

  Se adiciona 200 ul.(03 punch) o 600 ul (3 cuadraditos), de la solución de
purificación FTA a cada tubo, dejar incubar durante 5 min. a temperatura
ambiente, vortecear o agitar suavemente 2 veces.
 Utilizando pipeta desechar todo el reactivo posible, si fuera necesario utilizar
papel secante.
 Repetir los paso 4 y 5, tres veces o mas, (hasta quedar blanco las muestras).
 Después del lavado con solución de FTA, adicionar a cada tubo 200ul.(03
punch) o 600 ul (3 cuadraditos), de Buffer TE, dejar incubar durante 5 min. a
temperatura ambiente, vortecear, suavemente 2 veces o mas.
 Utilizando pipeta desechar todo el buffer TE, si fuera necesario utilizar papel
secante. Repetir tres o mas veces.
 Dejar secar los Puch (los quedan listos para la amplificación por PCR).
 Las muestras de sangre extraídas mediante la solución de purificación de FTA
no requieren cuantificación
5. Resultados:
Los alumnos han obtenidos ADN puro mediante la tecnología FTA,
6. Cuestionario:
 Se encuentra ADN genómico y ADN mitocondrial en el punch de FTA
 El ADN extraído se puede cuantificar, porque
 Cuanto ADN hay en un punch de 1.2 mm FTA
 Que Significa FTA
7. Fuentes de información
 Manual FTA Tecnology, Collect Transport, Archive and Purify Nucleic Acid.
WB120047, USA

F-CV3-3B-2 6 Rev. Junio 2007

 PRÁCTICA No. 3
EXTRACCIÓN DE ADN GENOMICO POR WIZARD KIT

1 Marco teórico
Las técnicas de extracción de ADN son relativamente sencillas, tan solo es
necesario lisar células nucleadas, para que el ADN quede libre en un medio acuoso,
y evitar la destrucción mecánica o enzimática del mismo. Este es un punto
importante, puesto que el ADN, aunque es estable en la célula intacta, es muy
vulnerable una vez lisada ésta. El objetivo final es obtener la máxima cantidad
posible de ADN a una concentración adecuada y conservando al máximo su
integridad. El número de métodos descritos para la obtención de ADN no es muy
extenso, aunque sí existen muchas adaptaciones y variaciones de los métodos
originales, destinados a optimizar diversos aspectos de la extracción en función de
la técnica a aplicar posteriormente

El método de Wizard es una tecnología basada en al extracción orgánica de

fenol-cloroformo-alcohol isoamilico.
.
2. Competencias :
 El alumno aprende a realizar la extracción de ADN por el método de Wizard

3. Materiales y equipos:
 Micropipeta de 100 a 1000 ul
 Tips de 100 a 1000 ul
 Tubos de 1.5 ml.
 Tubos de10 ml.
 Kit de extracción Wizard
4. Procedimiento :

a. Se pone 1.5 ml. De sangre en tubo 15 ml

b. Se agrega 4.5 ml. de la solución de lisis celular y se mezcla por inversión
c. Se incuba a temperatura ambiental por 10 minutos
d. Centrifugar a 2000 x g por 10 minutos o máxima velocidad
e. Descartar sobrenadante y agitar el pellet
f. Agregar 1.5 ml de la solución de lisis nuclear y se mezcla por inversión
g. Adicionar 0.5 ml. de la solución de precipitación de proteínas y se mezcla
por inversión por 20 seg.
h. Centrifugar a 2000 x g por 10 minutos o máxima velocidad
i. Verter 1.5 ml. De isopropanol a un tubo de 15 ml.
j. Transferir el sobrenadante al tubo que contiene el isopropanol y se mezcla
por inversión.
k. Centrifugar a 2000 x g por 10 minutos o máxima velocidad

F-CV3-3B-2 7 Rev. Junio 2007

 l. Descartar el sobrenadante y agregar 1.5 ml. de etanol al 70 % y se mezcla
por inversión.
m. Centrifugar a 2000 x g por 10 minutos o máxima velocidad
n. Eliminar el etanol
o. Se rehidrata el ADN con 125 ul. de la solución de rehidratación de ADN
A 65 ° C x 1 hora o 4°C toda la noche
5. Resultados:
 Los alumnos han obtenidos ADN puro mediante método de Wizard,
6. Cuestionario:
 El ADN extraído se puede cuantificar, porque
 Para Ud. Que paso es el más importante, porque
 Se ha extraído ADN Mitocondrial o Genómico porque
7. Fuentes de información
 Manual Wizard, Promega, USA

F-CV3-3B-2 8 Rev. Junio 2007

 PRÁCTICA No. 4
EXTRACCIÓN DE ADN POR METODO DE CHELEX

1. Marco teórico

Un método alternativo es la utilización de resinas quelantes, como El

®
Chelex , con alta afinidad por los iones metálicos polivalentes que podrían dañar el
ADN a temperaturas elevadas. El método del hervido, en presencia de este tipo de
resinas, ayuda a romper células y a desnaturalizar proteínas, pudiendo recuperar
ADN a partir de un bajo número de células, ya que el Chelex® protege al ADN
frente a la degradación por DNAsas.

La técnica de extracción con Chelex® es muy simple, ya que tan solo es

necesario incubar la muestra en una solución al 5-10% de la resina, normalmente a
56ºC, durante un tiempo variable. Además, en función del tipo de muestra, también
se puede añadir proteinasa K o agentes reductores como el DTT (este último rompe
las cabezas de los espermatozoides, en muestras de semen, y las queratinas en
muestra de cabello).

Este procedimiento es más sencillo y rápido que la extracción orgánica y no

utiliza ningún reactivo tóxico. Además, la reducción de pasos en la preparación de
las muestras ayuda a reducir los problemas de contaminación y los costes de
material. Uno de los inconvenientes de las resinas quelantes es que, al trabajar con
un extracto celular total, la solución en la que se encuentra el ADN puede contener
inhibidores. Además es muy importante eliminar, por centrifugación, los posibles
restos de chelex, ya que podrían interferir en la PCR, al secuestrar iones Mg+2 e
inactivar la Taq polimerasa.

2. Competencias :
 El alumno aprende a realizar extracción de ADN por el método de Chelex
3. Materiales y equipos:
 Chelex al 10 %
 Micropipeta de 100 a 1000 ul
 Tips de 100 a 1000 ul
 Solución de purificación de FTA
 Tubos de 1.5 ml.
 Ultracentrifuga

4. Procedimiento :
 Se mezclan, en un tubo de 1.5 ml, 300 µl de sangre líquida con 1 ml de H2Od
 Se deja la mezcla incubando durante 30 minutos a temperatura ambiente

F-CV3-3B-2 9 Rev. Junio 2007

  Se centrifugan los tubos a 12.000 rpm durante 5 minutos
 Se retiran 950 µl del sobrenadante, dejándole pellet en unos 50 µl
 Se añaden 200 µl de Chelex al 10%.
 Se incuban las muestras a 56º C durante 1 hora en agitación
 Se agitan los tubos en el vortex a alta velocidad durante 5-10 segundos
 Se ponen los tubos en agua hirviendo durante 8 minutos.
 Se agitan los tubos en el vortex durante 5-10 segundos
 Se centrifugan a 12.000 rpm durante 5 minutos
 Se recoge el sobrenadante, asegurándose de que no se cogen bolitas de chelex,
ya que podrían inhibir la reacción de PCR.
 El sobrenadante (ADN) se guarda refrigerado en tubos de 1.5 ml hasta el
momento de su uso en la reacción de PCR.

5. Resultados:
Los alumnos han obtenidos ADN puro mediante la Chelex
6. Cuestionario:
a. El ADN extraído es de simple o doble cadena, porque
b. El Método de extracción de ADN Chelex se puede empleará en cualquier
muestra biológica
7. Fuentes de información
 Manual Chelex, USA

F-CV3-3B-2 10 Rev. Junio 2007

 PRÁCTICA No. 5

VISITA A LABORATORIO DE BIOLOGIA MOLECULAR

1. Marco teórico
En la visita guiada a Laboratorio de Biología Molecular, se apreciara el
funcionamiento los diferentes equipos se emplean :

• La Extracción de ADN como la cabina de flujo laminar,

ultracentrífugas, Stirrres, etc.

• El Cuantificación de ADN como fuente de poder, cámara

electroforética horizontal, espectrofotómetro, cubetas de cuarzo.

 Equipos par Purificación del ADN

2. .- Competencias :
El alumno aprenderá el funcionamiento de los la cabina de flujo laminar,
ultra centrífugas, Stirres, fuente de poder, cámara electroforética horizontal,
espectrofotómetro, cubetas de cuarzo, Equipos par Purificación del ADN

3. Materiales y equipos:
 Cabina de flujo laminar,
 Ultracentrífugas,
 Stirres,
 Fuente de poder,
 Cámara electroforética horizontal,
 Espectrofotómetro,
 Cubetas de cuarzo,
 Equipos par Purificación del ADN
4. Procedimiento :
Los alumnos estarán con su mandil para ingresar al Laboratorio de Biología
molecular designado, el profesor le explicara el funcionamiento de los diferentes
equipos, con la casuística correspondiente.
5. Resultados:
Los alumnos se familiaricen los equipos del Laboratorio de Biología Molecular.
6. Cuestionario:
 Que se equipo para Ud. es el más importante y porque
 Cuál es su opinión de Laboratorio de biología Molecular visitado.

F-CV3-3B-2 11 Rev. Junio 2007

 PRÁCTICA No. 6

EXTRACCION DE ADN POR EL KIT DNA IQ SYSTEM

1. Marco teórico

El DNA IQ ™ es un sistema de aislamiento del ADN y el sistema de cuantificación

diseñado específicamente para la comunidad forense y de paternidad. Este sistema
emplea una nueva tecnología con partículas magnéticas para preparar muestras
limpias para short tandem repeat (STR) el análisis de forma fácil y eficaz. El DNA
IQ ™ El sistema puede ser usado para extraer ADN de las manchas o las muestras
de líquidos como sangre o como resultado soluciones de ADN.

La única resina DNA IQ ™ está diseñado para eliminar los inhibidores de la PCR y
purificar la contaminación frecuentemente encontrados en las muestras de casos
individuales. Cuando se trabaja con muestras más grandes se encuentran en la
paternidad y base de datos, el DNA IQ ™ sistema proporciona automáticamente la
misma cantidad de ADN total. frotis bucal, manchas, papel y sangre líquida han
sido analizados con el sistema (el DNA IQ ™ Canastillas de vuelta no son
necesarios para el análisis de sangre líquida).

El DNA IQ ™ sistema ha sido probado con los AluQuant ® cuantificación de ADN

humano y el sistema PowerPlex ® 16 Sistema de garantizar un proceso eficiente.
Esto se traduce en productos fiables que den resultados óptimos del aislamiento a la
cuantificación y el análisis de STR.
El DNA IQ ™ System utiliza una nueva tecnología con partículas magnéticas para
preparar muestras limpias para short tandem repeat (STR) el análisis de forma fácil
y eficaz. Uso de la DNA IQ ™ Sistema para procesar muestras pequeñas trabajo de
casos requiere de dos pasos. Para el material biológico en soportes sólidos, el
primer paso proporciona un método de extracción de manchas fácil, rápida,
eficiente y casi universal. Este paso es necesario para muestras líquidas. El segundo
paso utiliza la resina paramagnética para purificar el ADN sin necesidad de un
lavado para eliminar el reactivo de lisis. Este sistema está diseñado para purificar
rápidamente pequeñas cantidades de ADN y dar rendimientos consistentes para un
tipo de muestra específica.

2. Competencias :
El alumno aprenderá a otro método de extracción de ADN con magnetos

F-CV3-3B-2 12 Rev. Junio 2007

 3. Materiales y equipos:
 Kit DNA IQ System de Promega
 Canastillas para tubos 1.5 ml.
 Tubos de 1.5 ml.
 Baño María
 UltraCentrifuga
 Micropipeta de 1000 ul, 100 ul, 50 ul y 10 ul
 Tips de 10, 50, 100, 1000 ul

4. Procedimiento :
PREPARAR BUFFER DE LISIS : 100 ul Buffer lisis+ 6 ul 1M DTT
Para muestra de 25 mm2 se prepara 300 ul por muestra

1. En un tubo de 1.5 ml. se coloca la muestra biologica.

2. Se añade 200 ul. de buffer de lisis y se incuba a 70°C por 30 minutos.
3. Se transfiere el buffer a un tubo de 1.5 ml con canastilla y se centrifuga a
máxima velocidad por 2 mit.
4. Se retira la canastilla
5. La resina de IQ DNA se mezcla en el vortex hasta homogenizarse.
6. Se agrega 7 ul. de la resina IQ DNA al buffer lisis, se mezcla en el vortex y se
incuba por 5 mit. A temperatura ambiente, cada minuto se mezcla por 3 seg.
7. Se mezcla por 2 seg en el vortex y se lleva los tubos a la gradilla magnética por
3 mit.
8. Muy cuidadosamente se descarta el buffer, sin tocar la resina.
9. Se agrega 100 ul del buffer de lisis, se mezcla en el vortex y se coloca en la
gradilla magnética por 3 mit.
10. Se descarta muy cuidadosamente se descarta el buffer solución sin tocar la
resina.
11. Se le agrega 100 ul de buffer del lavado 1X se mezcla bien en el vortex se
coloca en la gradilla magnética por 3 mit.
12. Se descarta muy cuidadosamente se descarta el buffer de lavado sin tocar la
resina, se repite 2 veces
13. El tubo en la gradilla magnética con la tapa abierta se deja secar por 5 mit.
Como máximo 20 mit.
14. Se agrega 25 ul. de buffer de elución se mezcla en el vortex por 3 seg. Y se
incuba a 65° C por 5 mit.
15. Se mezcla en el vortex y se pone en le gradilla magnética por 3 mit.

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 16. Se retira la solución que contiene el ADN a un tubo 1.5 ml
17. Se almacena -4°C por periodo corto y -20 a -70°C por periodo largo.

5. Resultados :
 Los alumnos obtiene ADN Genómico por método de magnetos.

6. Cuestionario:
 Para Ud. Que paso es el mas y menos importante en este método DNA
IQ
7. Fuentes de información
 Promega, Technical Bulletin DNA IQ System- Small, Sample Casework
Protocol

F-CV3-3B-2 14 Rev. Junio 2007

 PRÁCTICA No. 07
INTERPRETACION DE RESULTADOS DE EXTRACCION DE ADN
Y
EXAMEN PARCIAL DE PRÁCTICA

1. Marco teórico
En la actualidad donde se aplica mas la biología molecular, es en la parte legal,
mediante la identificación de personas humanos, filiación.

Nosotros heredamos 50 % de padre y 50 % de la madre, por lo cual cuando

realizamos el perfil genético de una persona, encontramos 02 alelos uno del padre y
el otro de la madre.

Cuando se busca la identificación de una persona, homologando los perfiles de la

muestra y sospechosos.
.
2. Competencias :
El alumno Analizara los métodos empleados para la extracción de ADN y ARN
3. Materiales y equipos:
 Proyector de Multimedia
 Computadora
4. Procedimiento :
A cada grupo de alumno analizara un método empleado para la extracción de ADN

5. Resultados:
Los alumnos aprenderán analizar las ventajas y desventajas de cada método
6. Cuestionario:
a. Que se encuentra en el punch de FTA¨
b. El ADN extraído se puede cuantificar, porque

F-CV3-3B-2 15 Rev. Junio 2007

 PRÁCTICA No. 8

Primer Examen de Teoría

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 PRÁCTICA No. 09
EXTRACCION DE ADN POR EL KIT ULTRA CLEAN BLOOD DNA
ISOLATION KIT

1. Marco teórico

El UltraClean Blood DNA Isolation Kit, emplea para extracción de ADN en

muestras de Sangre y tejido óseo, hisopado bucal cultivo celular y otros fluidos.

La Calidad del ADN extraído es muy buena y se puede usar en amplificación,

hibridizacion, secuenciamiento y aplicaciones de clonación. Se obtiene ADN de 25
a40 ug de ADN / ml de sangre humana, un rango de 1,8 a 2,0 de A260 / A 280

2. Competencias :
El alumno aprenderá a otro método de extracción de ADN

3. Materiales y equipos:
 Kit UltraClean Blood DNA Isolation de MO BIO
 Centrifuga para tubos 15 ml.
 Tubos de 15 ml.
 Tips de 10, 50, 100, 1000 ul

4. Procedimiento :
Para muestra de sangre de 3 cc.

1. En un tubo de 15 ml. se coloca 3 cc. De sangre

2. Se agrega 9 cc de Solución G 1, se mezcla por inversión durante 5 mit a
temperatura ambiente.
3. Se Centrifuga por 5 mit. a 2,500 x g, se elimina el sobrenadante sin tocar el
se pellet, se deja 500 ul de sobrenadante, para resuspender el pellet
4. Se adiciona 3 cc de la solución G2 y se mezcla por inversión durante 10 mit
a temperatura ambiente.
5. Se adiciona 1 cc de la solución G3 y se mezcla por inversión fuertemente por
15 seg.
6. Se Centrifuga por 5 mit. a 2,500 x g, y se transfiere el sobrenadante a otro
tubo de 15 cc sin tocar el se pellet.
7. Se agrega 3 cc de isopropanol al 100 %, se mezcla por inversión 15 veces y
se incuba a temperatura ambiente por 3 mit.

F-CV3-3B-2 17 Rev. Junio 2007

 8. Se Centrifuga por 10 mit. a 2,500 x g, y se elimina el sobrenadante sin tocar
el se pellet
9. Se adiciona 3 cc de etanol al 70 %, e mezcla por inversión 5 veces.
10. Se Centrifuga por 5 mit. a 2,500 x g, y se elimina el sobrenadante sin tocar
el pellet
11. Se deja 10 mit. A temperatura ambiente
12. Se adiciona 250 ul de la Solucion G4 y se incuba 65°C por 1 hora
13. Se centrifuga por 1 mit a 2500 x g
14. Se transfiere a un tuvo 1.5 cc y se alamcena -4°C.
15. Se almacena -4°C por periodo corto y -20 a -70°C por periodo largo.

5. Resultados :
 Los alumnos obtiene ADN Genomico por método de soluciones.

6. Cuestionario:
 Para Ud. Que paso es el mas y menos importante en este método
UltraClean Blood DNA Isolation Kit
7. Fuentes de información
 Mo Bio, Manual UltraClean Blood DNA Isolation Kit.

F-CV3-3B-2 18 Rev. Junio 2007

 PRÁCTICA No. 10

VISITA A LABORATORIO DE BIOLOGIA MOLECULAR

1. Marco teórico
En la visita guiada a Laboratorio de Biología Molecular, se apreciara el
funcionamiento los diferentes equipos se emplean :

 La amplificación de ADN cono los termocicladores, para la Técnica de

Reacción en cadena de la Polimerasa

 El secuenciamiento de ADN mediante el analizador genético ABI 310e

2. Competencias :
El alumno aprenderá el funcionamiento de los termocicladores y el
analizador genético ABI

3. Materiales y equipos:
 Termocicladores
 Analizador Genético
4. Procedimiento :
Los alumnos estarán con su mandil para ingresar al Laboratorio de Biología
molecular designado, el profesor le explicara el funcionamiento de los diferentes
equipos, con la casuística correspondiente.
5. Resultados:
Los alumnos se familiaricen los equipos del Laboratorio de Biología Molecular.
6. Cuestionario:
a. Que se equipo para Ud. es el mas importante y porque
b. Cual es su opinión de Laboratorio de biología Molecular visitado.

F-CV3-3B-2 19 Rev. Junio 2007

 PRÁCTICA No. 11

EXTRACCIÓN DE ARN

1. Marco teórico
Las técnicas de extracción de ARN son relativamente sencillas, tan solo es
necesario lisar células nucleadas, para que el ARN quede libre en un medio acuoso,
y evitar la destrucción mecánica o enzimática del mismo. Es igual que la
extracción de ADN
2. Competencias :
 El alumno aprende ha realizar la extracción de ARN

3. Materiales y equipos:
 Micropipeta de 100 a 1000 ul
 Tips de 100 a 1000 ul
 Tubos de 1.5 ml.
 Tubos de10 ml.
 Kit de extracción de ARN
4. Procedimiento :
Las muestras de sangre .( realizado en el práctica # 1)

 Se pone 3 ml. De sangre tubos 10 ml.

 Se pone 1.5 ml de reactivo I, se centrifuga a 6000 rpn por 3 mint
 Se forma un pellet y se elimina el sobrenadante
 Se agrega 0.5 ml.de solución II, se agita y se centrifuga por 6000 rpm por 3
mint
 Se forma, un pellet, se elimina el sobredadante.
 El pellet se resuspende en 0.5 ml. De solución III.
5 . Resultados:
 Los alumnos han obtenidos ARN puro
6. Cuestionario:
Para Ud. Es mas fácil la extracción de ADN ò ARN
7.Fuentes de información
 Manual del Kit de extracción de ARN

F-CV3-3B-2 20 Rev. Junio 2007

 PRÁCTICA No. 12
CUANTIFICACION DE ADN POR ELECTOFORESIS EN GEL DE AGAROSA

1. Marco teórico
Una vez terminado el proceso de extracción y purificación, suele realizarse
la cuantificación del ADN para determinar la cantidad de ácido nucleico de la que
disponemos para realizar distintos análisis. Generalmente no es necesaria una
determinación muy exacta y basta con realizar una estimación de la concentración
de ADN, incluso para muestras indubitadas a menudo se realiza una estima a priori
de la cantidad de ADN que va a rendir el método de extracción. Sin embargo, en el
caso de muestras poco habituales o muestras límite, es conveniente realizar una
cuantificación de la cantidad de ADN antes de realizar la PCR.

En los protocolos de amplificación de marcadores STRs normalmente se

utiliza una cantidad de ADN del orden de 1 nanogramo (ng). El número de copias
de cada locus STR que hay en 1 ng de ADN
.
Geles de agarosa

El ADN es una molécula polianiónica uniformemente cargada (con carga

negativa) que le permite migrar en un campo eléctrico. La electroforesis a través de
geles de agarosa o de poliacrilamida son dos de los métodos utilizados para separar,
identificar y purificar fragmentos de ADN. Las moléculas de ADN con un tamaño
comprendido entre las 200 bp y la 50 kilobases (kb) de longitud se pueden separar
en geles de agarosa de diversa concentración. Este tipo de geles se someten a
electroforesis horizontales en un campo eléctrico de dirección constante. Los
factores que pueden afectar a la movilidad del ADN en geles de agarosa se
estudiarán en mayor profundidad en temas posteriores.

7. Competencias :
 El alumno aprenderá a cuantificar ADN por electroforesis
8. Materiales y equipos:
 Agarosa al 0.8 %
 Bromuro de Etidio
 TAE 1X
 Cámara electroforética horizontal
 Fuente de Poder
 Micropipeta de 1000 ul, 100 ul, 50 ul y 10 ul
 Tips de 10, 50, 100, 1000 ul

F-CV3-3B-2 21 Rev. Junio 2007

 9. Procedimiento :
Las muestras de ADN extraído de sangre .( realizado en el práctica # 2, 3 , 4, 5)

a) Se prepara un gel de agarosa al 0.8% con TAE 1X, al que se le añade 1 µl de

bromuro de etidio (10mg/ml)
b) Se mezcla 1 µl del ADN que queremos cuantificar con 2 µl de solución de carga
y 10 µl de TAE 1X (se pueden preparar distintas cantidades o diluciones de ADN
para realizar una cuantificación más exacta)
c) Se mezcla, por duplicado, 1µg del marcador Lambda/HindIII con 10 µl de TAE
1X
d) Se cargan en los pocillos internos los ADN problema y en los pocillos
flanqueantes el marcador Lambda/HindIII.
e) Se corre el gel durante 2 horas a 70 voltios o durante 1 hora a 100 voltios.
f) Se pone el gel en el transiluminador de luz ulravioleta y se toma una fotografía.
g) Se calcula la cantidad de ADN de las muestras problema por comparación con los
fragmentos del marcador Lambda/HindIII, de los que conocemos su
concentración.

111 Cantidad de ADN

Fragmento (bp) %
2 por banda (ng)
3 1 23130 47.7 477
4
2 9416 19.4 194
3 6557 13.5 135
5
6 4 4361 9.0 90
5 2322 4.8 48
6 2027 4.2 42
7 564 1.2 11
8 125 0.3 3
TOTAL: 100 % 1 µg
7
8

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 . Patrón de bandas a partir de 1 µg de marcador Lambda/HindIII corrido a 17
V/cm en un minigel de agarosa al 1% con TAE 1X. * Puede aparecer una banda
extra de 27491 bp, como consecuencia de la unión de los fragmentos de 23130 y
4361 bp. Esto puede ser evitado calentando el marcador durante 5 minutos a 65ºC
y pasándolo directamente a hielo durante 3 minutos.

PREPARACION DE REACTIVOS PARA ELECTROFORESIS EN GEL DE

AGAROSA
BROMURO DE ETIDIO (10 mg/ml)

− Se disuelven 100 mg de bromuro de etidio en 10 ml de H2Od

− Se alicuota 400 µl en tubos de 1.5 ml protegidos de la luz con papel de aluminio
− Se conservan refrigerados, protegidos de la luz.

MARCADOR DE PESOS MOLECULARES (Marker VIII)

− Se mezcla en un tubo de 15 ml:

Reactivo Cantidad
DNA Molecular Weight Marker VIII 400 µl
H2Od 2.8 ml
Solución de carga 640 µl

− Se dispensa en alícuotas de 700 µl en tubos de 1.5 ml

− Se guardan refrigerados

SOLUCIÓN DE CARGA (TBE LB) (50 ml)

− Se echan 34 ml de H2Od en un tubo de 50 ml

− Se añaden 0.6 ml de una mezcla de bromofenol y xileno cianol al 12.5 % (preparado
añadiendo 1.25 g de cada uno en 10 ml de H2Od)
− Se añaden 15 ml de glicerol
Se agita suavemente, se alícuota en tubos de 1.5 ml y se guarda refrigerado

TAE 50X (1 litro)

F-CV3-3B-2 23 Rev. Junio 2007

 − Se mezcla:

Reactivo Cantidad
Tris Base 242 g
Ácido acético glacial 57.1 ml
EDTA 0.5 M pH 8.0 100 ml

Se lleva hasta un volumen de 1 litro con H2Od y se guarda a temperatura ambiente

TE-4 (500 ml)

− Se mezcla:

Reactivo Cantidad
Tris-HCl 1 M pH 8.0 5 ml
EDTA 0.5 M pH 8.0 100 µl
H2Od ~ 495 ml

Tris-HCl 1M (pH 7.4)

− Se mezcla:

Reactivo Cantidad
Tris Base 121.1 g
HCl al 37% 70 ml
H2Od 800 ml

− Se ajusta el pH a 7.4 con la solución a temperatura ambiente

− Se lleva hasta 1 litro con H2Od
− Se autoclava y se guarda a temperatura ambiente.

Tris-HCl 1M (pH 8.0)

− Se mezcla:

Reactivo Cantidad
Tris Base 121.1 g
HCl al 37% 42 ml

F-CV3-3B-2 24 Rev. Junio 2007

 H2Od 800 ml

− Se ajusta el pH a 8.0 con la solución a temperatura ambiente

− Se lleva hasta 1 litro con H2Od
− Se autoclava y se guarda a temperatura ambiente.

Resultados:
 Los alumnos han preparado los reactivos a emplear en la siguiente
práctica
 Los alumnos han podido realizar la cuantificación de su muestra de ADN

10. Cuestionario:
 Para que se utiliza el gel de agarosa
 Cual es la función del marcador molecular
 Para Ud. que reactivos se sospecha de ser cancerígenos, porque

11. Fuentes de información

 Griffin H., Griffin A., PCR Technology : Current Innovations, Editorial
CRC Press, Editado por Hugh G. Griffin y Anette M. Griffin, Florida
United States of America.2009

 Laboratory Division FBI. Procolos para la Tipificacion de ADN

Basados en PCR, Spanish, Washington DC. USA

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 PRÁCTICA No. 13
AMPLIFICACION DE ADN POR LA TECNICA DE REACCION EN CADENA
DE POLIMERASA

1. Marco teórico
La PCR (Polymerase Chain Reaction) es una técnica que permite la
amplificación in vitro de una secuencia específica de ADN hasta generar millones
de copias de una manera rápida y sencilla. Esta técnica, puesta a punto por Kary B.
Mulis y colaboradores en 1985 (Mullis and Faloona, 1987), es extremadamente
sensible, ya que permite analizar muestras con cantidades mínimas de ADN (del
orden de picogramos) e incluso muestras en las que el ADN se encuentra
parcialmente degradado.

Uno de los aspectos más importantes, y del que se hablará en este capítulo
en mayor profundidad, es el de la optimización de la PCR, es decir, se detallarán los
parámetros que afectan al rendimiento de la PCR, con el objetivo de poder mejorar
su rendimiento, especificidad y reproducibilidad. Además, también se profundizará
en las precauciones, generales y específicas, que son necesarias en un laboratorio de
Genética Forense, para evitar la contaminación, uno de los principales problemas
derivados de la enorme sensibilidad de la PCR.
2. Competencias :
 El alumno aprenderá ha realizar la técnica de PCR
3. Materiales y equipos:
 Kit de Amplificacion
 Micropipeta de 10, 50, 100, 1000 ul
 Tips de 100 a 1000 ul
4. .Procedimiento :
• Mezcla de Reacción (Volumen final: 25 µl)

• Se prepara en un tubo de PCR en hielo la mezcla de amplificación:

Componente Volumen por muestra

H2O estéril 5.5 µl
PCR Reaction Mix 10.5 µl
Primer Set 5.5 µl
Taq Gold® DNA polymerase 0.5 µl (2.5 U)

• Para cada muestra se añade a tubos de PCR en hielo:

- 22 µl de la mezcla de amplificación
- 3 µl de ADN (5-10 ng) #

F-CV3-3B-2 26 Rev. Junio 2007

 • Para extracciones a partir de sangre líquida se usan diluciones 1:25. Para
extracciones a partir de manchas o saliva se usan diluciones 1:5. En el caso de
muestras límite añadir ADN directo o diluciones 1:2

• Es necesario procesar en paralelo un control positivo de amplificación (1 ng del

ADN control 9947A, suministrado con el kit), así como un control negativo (3 µl de
H2O estéril en lugar de ADN)

• Protocolo de amplificación para termocicladores PE GeneAmp® PCR System 2400

o 9700:

95º C, 11 minutos 1 ciclo

94º C, 1 minuto
59º C, 1 minuto 28 ciclos
72º C, 1 minuto1

60º C, 45 minutos

• Una vez completada la amplificación, los productos amplificados han de ser

guardados refrigerados y protegidos de la luz, para evitar su degradación.

PREPARACION DE REACTIVOS PARA EL PCR

CLORURO SÓDICO 5 M (1 litro), NaCl 5M

− Se disuelven 292.2 gramos de NaCl en 800 ml de H2Od

− Se añade H2Od hasta un volumen final a 1 litro (Nota: el NaCl no se disuelve
completamente hasta alcanzar el volumen final de 1 litro)
− Se autoclava y se guarda a temperatura ambiente

CLORURO POTÁSICO 3 M (1 litro), KCl 3M

− Se disuelven 223.68 gramos de KCl en 700 ml de H2Od

− Se añade H2Od hasta un volumen final a 1 litro
− Se autoclava y se guarda a temperatura ambiente

SDS 10% (1 litro)

F-CV3-3B-2 27 Rev. Junio 2007

 − Se pesan, con mascarilla, 100 gramos de SDS y se disuelven con 800 ml de H2Od (se
puede calentar a 68ºC para ayudar a su disolución)
− Se ajusta el pH a 7.2 con HCl y se lleva a 1 litro con H2Od
− Se guarda a temperatura ambiente
Nota: Cuando la temperatura es baja, el SDS puede flocular, y la solución aparece con
precipitados más o menos visibles. Para solucionar el problema, se calienta la botella en un baño
a 37ºC durante 5-10 minutos.

TWEEN-20 10% (100 ml)

− Se disuelven 10 ml de Tween-20 y 90 ml de H2Od

− Se guarda a temperatura ambiente

5. Resultados:
 Los alumnos han amplificado ADN por PCR
 Los alumnos han preparado los reactivos ha emplear en la siguiente práctica

6. Cuestionario:
 Que se etapa es la mas importante en el PCR, porque
 Que reactivos se sospecha de ser cancerígenos

7. Fuentes de información
• PE Applied Biosystems. ABI PRISM 310 Genetic Analyzer, User’s
Manual, PE Applied Biosystems, A Division of Perkin Elmer, The Perkin
Elmer Corporation, USA 2004

F-CV3-3B-2 28 Rev. Junio 2007

 PRÁCTICA No. 14

SECUENCIAMINETO DE ADN
MAMEJO DE ANALIZADOR GENETICO

1. Marco teórico
Esta nueva tecnología está basada en el empleo de fluorocromos, que emiten
a diferentes longitudes de onda, para el marcaje de moléculas de ADN y su posterior
detección con sistemas automatizados de electroforesis capilar, que incorporan un
láser y un lector para la detección de dicha fluorescencia.

El análisis de polimorfismos de ADN utilizando esta tecnología automatizada

ha supuesto una serie de ventajas como son: mayor facilidad y rapidez en el análisis;
gran sensibilidad y precisión en la lectura de las muestras, pudiendo resolver alelos
con una única base de diferencia; y sobre todo la posibilidad de analizar
simultáneamente un gran número de sistemas con rangos de tamaño coincidentes, ya
que pueden ser marcados con diferentes fluorocromos y detectados a diferentes
longitudes de onda.

2. Competencias :
El alumno visualizará el secuenciamiento de ADN y el manejo del analizador
Genetico
3. Materiales y equipos:
 Analizador Genetico
 Kit de secuenciamiento
4. Procedimiento :
 Se prepara la mezcla de carga combinando 1 µl de GS-Rox 500 con 24 µl de
formamida desionizada.
 Se añaden, en tubos especiales para el secuenciador ABI PRISM 310, 25 µl de la
mezcla de carga y 3 µl de producto amplificado.
 Se prepara otro tubo combinando 1 µl de AmpFlSTR® Profiler Plus Allelic Ladder y
25 µl de la mezcla de carga.
 Se desnaturalizan las muestras y el ladder calentando los tubos durante 3 minutos a
95º C e inmediatamente se enfrían en hielo durante otros 3 minutos. Las muestras se
desnaturalizan justo antes de cargarlas en el secuenciador.
 La preparación del ABI PRISM® 310 Genetic Analyzer se realiza siguiendo las
instrucciones que aparecen en el protocolo PRT-F029

F-CV3-3B-2 29 Rev. Junio 2007

  En la lista de inyección hay que seleccionar los siguientes parámetros:

Module: GS STR POP4 (1ml) F

Inj. Secs: 5
Inj. KV: 15.0
Run kV: 15.0
Run ºC: 60
Run Time: 24

Matrix File: Matriz F: 6-FAM/JOE/NED/ROX

Analysis Parameters: Profiler Plus

Size Standard: GS-Rox 500

5. Resultados:
Los alumnos han tipificado un pefril genético de ADN
6. Cuestionario:
Para que se puede emplear el analizador genético

7. Fuentes de información
 PE Applied Biosystems. ABI PRISM 310 Genetic Analyzer, User’s
Manual, PE Applied Biosystems, A Division of Perkin Elmer, The
Perkin Elmer Corporation, USA 2004

F-CV3-3B-2 30 Rev. Junio 2007

 PRÁCTICA No. 15
INTERPRETACION DE CASOS DE IDENTIFICACION HUMANA
Y
EXAMEN FINAL DE PRÁCTICA

11. Marco teórico

En la actualidad donde se aplica mas la biología molecular, es en la parte legal,
mediante la identificación de personas humanos, filiación.

Nosotros heredamos 50 % de padre y 50 % de la madre, por lo cual cuando

realizamos el perfil genético de una persona, encontramos 02 alelos uno del padre y
el otro de la madre.

Cuando se busca la identificación de una persona, homologando los perfiles de la

muestra y sospechosos.
.
7. Competencias :
El alumno avaluara los perfiles genéticos de diferentes personas
8. Materiales y equipos:
 Proyector de Multimedia
 Computadora
9. Procedimiento :
A cada grupo de alumno se le entregara un caso y se discutirá..

10. Resultados:
Los alumnos aprenderán a interpretar casos de identificación humana
11. Cuestionario:
a. El perfil genético de un hijo cuanto hereda de sus abuelos
b. El perfil genético de gemelos idénticos y fraternos cual es la diferencia
12. Fuentes de información
 Lorente A. M., Lorente A. J., Villanueva E., Identificación Humana y
Medicina Legal : Consideraciones Éticas y Jurídicas,

 Martínez B., La Prueba del ADN en Medicina Forense, La genética al

Servicio de la Ley en Análisis de Indicios Criminales y en la Investigación
Biológica de la Paternidad, Editorial MASSON SA, Barcelona España.
2008

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