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Objetivo: Aprender de manera correcta la utilización de material microanalitico y realizar una

curva de calibración de un colorante utilizando el mismo
 
Introducción: Las pipetas automáticas son dispositivos que se caracterizan por carecer de depósito
y se utilizan principalmente para medir o transvasar pequeños volúmenes de líquido de un
recipiente a otro con gran exactitud
El uso de micropipetas permite emplear distintos líquidos sin tener que lavar el aparato: para ello,
se usan puntas desechables de plástico que normalmente son estériles. Hay distintos tipos de
puntas como las amarillas que son usadas para volúmenes pequeños y las de color azul que son
para volúmenes grandes
Materiales
 Espectrofotómetro de rango visible
 Kit de pipetas automáticas
 Solución de azul de metileno
 Agua desionizada
 Tubos de ensayo 18 x 50
 Puntillas desechables
 Muestra problema A, B y C
 Etanol al 70 %
 Datos de la Muestra
 Se puede especificar que la muestra es liquida con una absorbancia de 0.345
Sol. Azul de metileno mg/mL Absorbancia

10 0.12

20 0.211

30 0.309

40 0.412

50 0.499
Cálculos realizados
Absorbancia de la muestra: 0.345
y = 0.0096x + 0.0225
[Muestra problema] = 0.345-0.0225/0.0096 = 33.59 mg/mL
Resultados:
La concentración de la muestra problema que presenta una absorbancia de 0.345 es de 33.59
mg/mL
Valores de Referencia:
No aplica ya que no es un análisis de una muestra biológica, además al desconocer su identidad no
podemos comparar con la normativa correspondiente

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Objetivo: El alumno aprenderá a medir la actividad de una enzima comercial y la comparará con
una enzima cruda.
 
Introducción: Las enzimas amilasas son hidrolasas producidas en el humano por el páncreas
y las glándulas salivares que degradan el glucógeno y el almidón presentes en los alimentos para
producir azúcares simples.
Estas enzimas requieren iones cloruro para actuar ya que se inactivan totalmente en
ausencia de ellos. Pueden actuar en cualquier parte de la cadena larga de polisacárido
rompiendo el enlace alfa 1,4 y produciendo maltotriosa y maltosa a partir de la amilasa y
maltosa, glucosa y dextrina a partir de la amilopectina. Su pH óptimo está entre 6.7 y 7.0,
volviéndose totalmente inactivas a pH de 3.3.
Método 1
El tubo blanco no contiene el sustrato (almidón) ni la enzima ni el buffer, solo el diluyente que es
agua, por lo que con él se ajustará a “0” el espectrofotómetro. No hay que olvidar que existen
otros controles en los métodos analíticos, como el “0” de la curva de calibración, que en este caso
sería un Std sin glucosa o también el “0” de actividad que sería una muestra sin enzima o sin
sustrato, Para estos dos últimos casos un equipo en particular preparará un solo tubo para
después compartir los resultados con el grupo. Los estándares y el blanco se preparan y
posteriormente se toma 1 ml de ellos y se deposita en un tubo nuevo que contenga 3 ml de DNS.
Posteriormente se añade 1 ml de agua a cada uno.A partir de aquí se conservan para
posteriormente leer en el espectrofotómetro la densidad óptica y con los datos construir la
curva de calibración.
El tubo de Reacción se prepara e incuba a 60°C. Debes iniciar el conteo del tiempo una vez que los
tubos estén en el agua a 60ºC. Toma1 mL de muestra cada 10 minutos por una hora y transfiere
cada una delas muestras tomada sa tubos independientes que contengan previamente 3 mL de
DNS para inactivar la reacción. Una vez terminada la reacción, las muestras, los estándares y
el blanco con el DNS se calentarán a ebullición por 5 min, asegurándote que el agua esté
hirviendo antes de sumergir los tubos. El color de la solución cambiará, no olvides documentar tus
observaciones. Enseguida los tubos se enfriarán en hielo por 5 min, se les agregará 1 mL de agua
destilada y se medirá la densidad óptica a 540 nm. No olvides agitar los tubos antes de leer
la absorbancia, una vez que ya tienen todos los reactivos.
Cálculos
y=0.002x-0.2162

glucosa=0.1 + 0.2162/0.002 =158.1mg/mL a los 0 minutos 

glucosa=0.2 + 0.2162/0.002 =208.1mg/mL a los 10 minutos

glucosa=0.32 + 0.2162/0.002 =268.1mg/mL a los 20 minutos
glucosa=0.51 + 0.2162/0.002 =363.1mg/mL a los 30 minutos
glucosa=0.72 + 0.2162/0.002 =468.1mg/mL a los 40 minutos
glucosa=0.89 + 0.2162/0.002 =553.1mg/mL a los 50 minutos
glucosa=0.99 + 0.2162/0.002 =603.1mg/mL a los 60 minutos
Actividad enzimática
        mg/mL         Abs                                Min           Abs
y=0.002x-0.2162                   y=0.0159x-0.0561

m1=dABS/dglucosa                         m2=dABS/dTIEMPO
Actividad enzimática=m1/m2
Actividad enzimática=0.002/0.0159= 0.1257 mg/mL/Minutos
Resultados: 
Se  determinó  la concentración de glucosa (azúcar reductor)  de una solución de almidón 
por  el  método  del  ácido  3,5-dinitrosalicílico. Utilizando este método, se obtuvo una
actividad de enzimática de la α-amilasa de 0.1257mg/mLminutos, esto relacionando las
pendientes de las ecuaciones de la recta.