Determinación de proteínas

Curso EMA
2013
Ing. Agr . Marta del Puerto
Métodos para determinar proteínas
Se basan en:

a. Propiedad de las proteínas de absorber luz en el

UV
absorción A=280nm

a. Capacidad de unirse a ciertos colorantes

Biuret
Lowry
Acido Bicinconínico BCA
Bradford

a. Formación de derivados químicos

 Propiedad de absorber luz en el espectro
UV
• La mayoría de las proteínas muestran una
absorción a 280 nm, la cual se atribuye al
grupo fenólico de la tirosina y al grupo
indólico del triptofano
• Tiene la ventaja de que no es necesario utilizar
reactivos y la muestra no se daña o destruye
durante la determinación.
 Método de absorción UV
• Se determina la cantidad de luz absorbida una
solución proteica.
• Para el cálculo de la concentración de dicha
solución se aplica la ley de Lambert –Beer:

A = ε ·c ·l
Donde:
• A = absorbancia
•  = Coeficiente de extinción molar.
• l = longitud de la celda.
• C = concentración
€ - coeficiente de extinción molecular : la cantidad de luz absorbida
por unidad de concentración

Se utiliza el coeficiente de extinción de la Albúmina de Suero Bovino

(BSA) que es de 43824 M-1 cm-1
 Métodos colorimétricos
• Usan reactivos determinantes de color

• Miden por colorimetría en espectro luz visible

• Usa curva de proteína patrón (albumina suero

bovino)

• Métodos donde la muestra se destruye

Curva patrón para métodos colorimétricos

Curva patrón albumina suero bovino BSA

 Método de Biuret
• Se basa en la formación
de un complejo
coloreado entre el ion
Cu+2 y los grupos NH4
de los enlaces pépticos
en medio básico (NaOH
o KOH)
Consideraciones del método de Biuret
• Reacción específica
• Color violeta se lee a 540nm contra curva
estándar BSA
• La intensidad del color es proporcional a la
cantidad de proteína
• Baja sensibilidad alta concentración
de proteína
 Método de Lowry
• Combina la reacción del Biuret con la
reducción del reactivo de FOLIN-CIOCALTEAU
por los grupos aromáticos de residuos de
tirosina, triptófano, cistina cisteína e histidina.
• Origina compuesto azul intenso
• Mide a 750nm
 Método del ácido bicinconínico BCA
• Se basa en que las proteínas reducen los iones
cúpricos del reactivo BCA a iones cuprosos en
medio básico.
• Cambio de color del verde (BCA) al morado.

OH-
proteína + Cu+2 Cu+1

Cu +1 + BCA BCA-Cu+1
 Método de Bradford
• Se basa en la unión del reactivo Comassie-
blue G250 a las proteínas en medio ácido

• Reconoce los aa arginina, fenilalanina,

triptófano y prolina

• Origina color azul intenso A=595nm

Aa que reconoce el reactivo de Bradford
 Nitrógeno total o kjeldahl
• El método Kjeldahl se basa en la
transformación del nitrógeno contenido en la
muestra en sulfato de amonio mediante la
digestión con ácido sulfúrico en presencia de
un catalizador. El ion amonio obtenido se
transforma en medio básico en amoníaco que
se destila y valora con una solución de ácido
patrón.
•

DIGESTIÓN

n - C -NH2 + mH2SO4 catalizadores CO2 + (NH4)2 SO4 + SO2

proteína calor

NEUTRALIZACIÓN Y DESTILACIÓN

(NH2)SO4 + 2 NaOH 2NH3 + Na2SO4+ 2H2O

NH3 + H3BO3 (ácido bórico) NH4 + H2BO3- (ión borato)

TITULACIÓN

H2BO3- + H+ H3BO3
 Tamaño de la muestra
IMPORTANTE: homogeneizar la muestra: molido (<1mm) y
mezclado

Materiales sólidos Muestras liquidas

CONT. DE PESO DE MUESTRA Conc de N Vol muestra

PROTEINA % mg mg/l ml
Mas de 5% 1000 - 5000 Menor a 20 100

5 a 30% 500 - 1500 Entre 20 y 50 50

Menos 30% 200 - 1000 Entre 50 y 100 25

 Proceso de digestión
• Romper los enlaces nitrogenados y liberar el
nitrógeno como ion amonio

• Digestión en medio ácido H2SO4

• Catalizador
• Temperatura
• Tiempo
 Cantidad de ácido a agregar
muestra ml acido/ TRIGO
g muestra
Suelo 10.0 PC---- ----- 12.5%
CHO------- 66.6%
MG ------- 3.5%
Grasa 9.7

Proteína 4.9
CALCULO
Carbohidratos 4.0
PC = 12.5% * 4.9 ml/g = 0.61
CHO = 66.5% * 4.0 ml/g = 2.66
Arcilla 0.6 MG = 3.50% * 9.7 ml/g = 0.34

TOTAL 3.61 ml ácido

 CATALIZADOR AGENTE REDUCTOR

• Se usa en algunos compuestos

• Mejorar la velocidad y que requieren ser reducidos
eficiencia de la digestión antes de digerir
• Sulfato de cromo, zinc,
• MERCURIO sucrosa, acido salicilico
• COBRE
• SELENIO
AGENTE OXIDANTE
• TITANIO
• Acelera la descomposición
• Agente antiespumante
• MEZCLAS

• H2O2
 DESTILACION
• OBJETIVO: Convertir el nitrógeno amoniacal (NH4) en
amonio (NH3) mediante el agregado de una álcali
(KOH , NaOH) que se recoge en acido bórico

• (NH)2SO4 + 2NaOH ---- 2NH3 + Na2SO4 + 2H2O

NH3 + H3BO3 --------- NH4 + H2BO3-

ac ion borato
borico
 Titulación y cálculo de %N
• El ion borato se titula con un ácido débil

• H2BO3- + HCl ---------- H3BO3

• Se determina el gasto de HCl para neutralizarlo

• %N = NHCl x gasto x 14 x 100
peso muestra
N normalidad del acido mol/l
Gasto ml de HCl
14 g/mol peso atómico del N
100 Factor de corrección
Peso muestra gramos
 Calculo de % proteína
• Se usa un factor de conversión según al % de
N de la muestra
• En general se usa 6.25 = 100
16

%N x 6.25 = %PC
Factor según la proteína en estudio
 Ejemplo de determinación
muestra P muestra Gasto % nitrógeno Factor % PC
fresca
Forraje 0.8214 14.9 2.47 6.25 15.44
fresco
Forraje 0.8383 15.7 2.55 6.25 15.94
fresco
Avena 0.5053 20.4 18.66 5.36 10.0

Hongos n2 0.2177 7.1 4.82 4.38 21.11

Pupasp512 0.2140 9.8 6.89 6.25 43.06

Base seca