Preinforme 

#9: ELECTROFORESIS DE ADN Y ARN.

Adrián Felipe Duque Castaño.     C.C. 1000090165.

5.2. ¿Cómo funciona el Bromuro de Etidio?

R/= es un agente intercalante usado comúnmente como aclarador de ácidos
nucleicos en laboratorios de biología molecular para procesos como la
electroforesis en gel de agarosa. Cuando se expone esta sustancia a luz
ultravioleta, emite una luz roja-anaranjada, que se intensifica unas 20 veces
después de haberse unido a una cadena de ADN. Este efecto es debido al
aumento de la hidrofobia del medio, y no a la rigidificación del anillo bencénico, no
estando éste entre pares de bases del ADN.

Se trata de un compuesto intercalante, es decir, que tiene afinidad para unirse al

DNA, pues se introduce entre sus bases apiladas. Esto se debe a su geometría
plana y su estructura aromática, que interacciona favorablemente con el interior
hidrófobo de la doble hélice. En menor medida, interacciona también con DNA
monocatenario.
Su utilidad deriva asimismo de su fluorescencia, exaltada al encontrarse en un
entorno hidrófobo, es decir, al estar unido al DNA. Se excita con luz ultravioleta de
onda corta, 254 nm, y emite su fluorescencia como luz visible, de color rosado-
anaranjado.
En la electroforesis, se utiliza para "teñir" el DNA, para revelar su posición en el
gel. Se puede bañar el gel tras la electroforesis en una disolución de bromuro de
etidio, o bien incorporar éste a la disolución de agarosa con la que se prepara el
gel.

5.3. ¿En qué consiste la electroforesis en gel de poliacrilamida y cuál es su uso?

R/= Los geles de poliacrilamida son el resultado de la polimerización química de
una mezcla de acrilamida y bisacrilamida. Controlando la concentración de ambas
obtenemos geles de diferente grado de reticulación (diferente diámetro de poro).
Uno de los métodos de electroforesis más comúnmente aplicado para proteínas es
el que emplea geles de poliacrilamida (PAGE = polyacrylamide gel
electrophoresis) en presencia del detergente aniónico dodecilsulfato sódico (SDS).
Esta técnica es conocida como SDS-PAGE. Para ello se prepara un gel en placa
vertical. En la preparación del gel, la polimerización de los monómeros de
acrilamida produce cadenas lineales. Al incluir bisacrilamida, ésta da lugar a
puntos de ramificación en el polímero, lo que permite formar una matriz
tridimensional, dando lugar al gel de poliacrilamida. El tamaño de los huecos o
poros que forma la retícula del polímero depende de la concentración de
acrilamida y del grado de entrecruzamiento (es decir, de la proporción de
bisacrilamida con respecto al total). Así, variando la concentración de acrilamida y
bisacrilamida en la preparación del gel se consiguen distintos grados de porosidad
y, por tanto, distintos intervalos de separación de proteínas. También se añade un
tampón (comúnmente Tris-HCl). Además, se añade un agente iniciador de la
polimerizacón como el persulfato amónico, que al disolverse en agua genera
radicales libres que transforman la acrilamida en radical libre y se inicia la
polimerización. También se añade al medio TEMED (N,N,N’,N’-tetrametil-
etilenodiamina) como catalizador porque puede existir en forma de radical libre.
Las muestras proteicas se tratan, previamente a su fraccionamiento, con SDS a
100 ºC. Como consecuencia de este tratamiento y de la presencia posterior de
SDS durante toda la separación (tanto en el tampón de electroforesis como en la
composición del gel), las proteínas se mantienen desnaturalizadas. El SDS tiene la
propiedad de unirse a las cadenas polipeptídicas en una proporción masa:masa
constante (1.4 g SDS/g de proteína), de modo que en el complejo SDS-proteína la
carga de la proteína queda enmascarada por la de las múltiples moléculas de SDS
y ésta es proporcional al tamaño (nº de aminoácidos). Esta electroforesis es
discontinua pues utiliza dos geles: Un gel concentrador con bajo grado de
reticulación y pH 6,8 ( gel acumulador o “stacking gel”). Un gel separador con
grado de reticulación mayor con valores entre 6% y 15%, pudiéndose también
utilizar gradientes de concentración de acrilamida (gel separador). En la
electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS, la separación de proteínas se
hace en función de la masa molecular. 

5.4. ¿Cómo funcionan los reactivos de las soluciones Buffer para la electroforesis?
R/= Tampón Tris-HCl

Un tampón denominado "Tris-HCl" se prepara con Tris base a la concentración

indicada y con el HCl necesario para ajustar el pH al valor indicado. La disolución,
por tanto, contiene Tris base, Tris ácido y cloruro.

En la electroforesis, es el tampón que mantiene el pH en el gel.

Tampón Tris-Gly

Un tampón "Tris-glicina" se prepara con Tris base y con glicina, ambos a la

concentración indicada. El pH debe resultar el adecuado sin necesidad de
ajustarlo (pues este tampón no debe llevar cloruro). Una composición frecuente es
125 mM Gly, 25 mM Tris, pH=8,3. En el caso de electroforesis desnaturalizante
lleva además 0,1% de SDS.

En la electroforesis PAGE discontinua, es el tampón con el que se llena la cubeta

o tanque de electroforesis.

 Tampón TAE

Es el medio usado para preparar el gel y desarrollar la electroforesis. Recibe este

nombre de las iniciales de sus componentes.

El pH es alcalino, para que todos los grupos fosfato del DNA estén ionizados por
completo y éste se mantenga cargado negativamente. La composición habitual es
Tris 40 mM, ác. acético 19 mM, EDTA 1 mM, pH=7,5
En la electroforesis, permite mantener las moléculas de DNA con una carga
negativa uniforme y constante. Es, por ello, componente del gel y del tampón de
electroforesis, o tampón de cubeta.

 Tris + Acético + EDTA = TAE

Tampón de carga

Es una disolución que se mezcla con la muestra antes de aplicarla al gel. Sus
componentes cumplen varios propósitos:

 En electroforesis de DNA:

 Glicerol para aportar densidad a la muestra y facilitar su aplicación a los pocillos.

Azul de bromofenol (u otro colorante como el xileno-cianol) como marcador del

frente de avance de la electroforesis. Asimismo, su color es una ayuda visual
durante la carga de muestra en los pocillos.

Tampón para estabilizar el pH y, por tanto, la carga de las moléculas.

En electroforesis de proteínas SDS-PAGE se denomina también tampón de

ruptura (ya que provoca la desnaturalización):

 Glicerol para aportar densidad a la muestra y facilitar su aplicación a los pocillos.

Azul de bromofenol como marcador del frente de avance de la electroforesis.

Asimismo, su color es una ayuda visual durante la carga de muestra en los
pocillos.

SDS para provocar la desnaturalización de las proteínas (ayudado por un

calentamiento breve a 90-100° C).

β-mercaptoetanol para romper los enlaces disulfuro (una reacción de reducción, el

disulfuro se convierte en dos tioles).

Tampón para estabilizar el pH y, por tanto, la carga de las moléculas.

6.1. ¿Cómo se determina el peso molecular de una muestra problema, corrida en

un gel de agarosa?
R/=  Gracias al uso de un WM= Weight Marker o marcador de peso,un
estándar de referencia que contiene fragmentos de ADN de longitudes conocidas.
Los marcadores de ADN comerciales cubren diferentes intervalos de tamaños, por
lo que trataremos de usar uno con buena "cobertura" en el intervalo de tamaños
en el que esperamos encontrar nuestros fragmentos. Están diseñados para
visualizar la migración del DNA en geles de agarosa y poliacrilamida. Su mezcla
de compuestos como el glicerol ayudan a precipitar la muestra y EDTA para inhibir
la actividad de nucleasas.

6.2. ¿Qué son los colorantes? ¿En qué se basa su selectividad? Mencione 5
ejemplos y que partes tiñe cada uno de ellos.
R/= Son compuestos orgánicos que tienen alguna afinidad específica por los
materiales celulares. Muchos colorantes utilizados con frecuencia son moléculas
cargadas positivamente (cationes) y se combinan con intensidad con los
constituyentes celulares cargados negativamente, tales como los ácidos nucleicos
y los polisacáridos ácidos. Ejemplos de colorantes catiónicos son el azul de
metileno, el cristal violeta y la safranina. Otros colorantes son moléculas cargadas
negativamente (aniones) y se combinan con los constituyentes celulares cargados
positivamente, tales como muchas proteínas. Esos colorantes incluyen la eosina,
la fucsina ácida y el rojo Congo. Otro grupo de colorantes son sustancias
liposolubles; los colorantes de este grupo se combinan con los materiales lipídicos
de la célula, usándose a menudo para revelar la localización de las gotículas o
depósitos de grasa. Un ejemplo de colorante liposoluble es el negro Sudán.

Azul de Coomassie: El nombre completo es azul brillante de Coomassie R-250.

Se trata de un compuesto coloreado que se une a todo tipo de proteínas. Es poco
soluble en agua, por lo que habitualmente se disuelve en una mezcla de agua,
ácido acético y metanol o isopropanol.

Tras realizar la electroforesis, el gel se "tiñe" sumergiéndolo durante unos 30

minutos en la disolución de Coomassie para que éste penetre y se fije a las
proteínas. Dado que todo el gel se impregna del colorante, es preciso después
realizar una destinción, lavando varias veces con disolvente libre del colorante.

Azul de bromofenol: Se trata de un compuesto coloreado y con carga, utilizado

para comprobar el progreso de la electroforesis.

En la electroforesis, por su menor tamaño, se mueve más rápido que las proteínas
o que la mayoría de moléculas de DNA (aquéllas superiores a 300 pb), es decir,
marca el "frente de avance". Puesto que su color azul-violeta es bien visible,
permite detener la electroforesis con la confianza de que las moléculas de proteína
o DNA no se hayan salido del gel.

Xileno-cianol y verde cianol: Se trata de compuestos coloreados y con carga,

utilizados para comprobar el progreso de la electroforesis.

En la electroforesis el xileno-cianol se mueve aproximadamente como las

moléculas de DNA de 3500 a 5000 pb (depende del tampón y el % de agarosa en
el gel).

Ambos tienen un color azul turquesa que permite detener la electroforesis con la
confianza de que las moléculas grandes de DNA no se hayan salido del gel.
Bromuro de etidio: Se trata de un compuesto intercalante, es decir, que tiene
afinidad para unirse al DNA, pues se introduce entre sus bases apiladas. Esto se
debe a su geometría plana y su estructura aromática, que interacciona
favorablemente con el interior hidrófobo de la doble hélice. En menor medida,
interacciona también con DNA monocatenario.

Su utilidad deriva asimismo de su fluorescencia, exaltada al encontrarse en un

entorno hidrófobo, es decir, al estar unido al DNA. Se excita con luz ultravioleta de
onda corta, 254 nm, y emite su fluorescencia como luz visible, de color rosado-
anaranjado.

En la electroforesis, se utiliza para "teñir" el DNA, para revelar su posición en el

gel. Se puede bañar el gel tras la electroforesis en una disolución de bromuro de
etidio, o bien incorporar éste a la disolución de agarosa con la que se prepara el
gel.

GelRed™: Es la marca comercial de un compuesto adecuado para revelar el DNA

en geles. Su estructura es un secreto comercial bajo patente, pero es algo similar
al compuesto mostrado a la derecha.

Dos núcleos aromáticos: le confieren capacidad intercalante, es decir, que tiene

afinidad para unirse al DNA, pues se introduce entre sus bases apiladas. Esto se
debe a su geometría plana y su estructura aromática, que interacciona
favorablemente con el interior hidrófobo de la doble hélice.

Una cadena alifática larga que hace de conector entre ambos núcleos
intercalantes.

Por otra parte, su ligera carga positiva también facilita su unión al DNA
(recuérdese que éste es una molécula polianiónica).

Su utilidad deriva asimismo de su fluorescencia:

En forma libre, los dos núcleos aromáticos interaccionan entre sí y por ello la
molécula apenas es fluorescente.

Al unirse al DNA los dos núcleos se separan y, al encontrarse en un entorno

hidrófobo, emiten una fluorescencia intensa. Se excitan con luz ultravioleta de
onda corta, 254 nm, y emiten luz visible, de color rojo (de ahí el nombre del
reactivo).

En la electroforesis, se utiliza para "teñir" el DNA, para revelar su posición en el

gel. Se puede bañar el gel tras la electroforesis en una disolución de GelRed™, o
bien incorporar éste a la disolución de agarosa con la que se prepara el gel.

Los ensayos realizados por el fabricante indican que este compuesto no es

cancerígeno como el etidio, lo cual se atribuye a que su estructura y, en particular,
su carga impiden que atraviese las membranas celulares.
6.3. ¿Cómo se diferencia en un gel de agarosa un ARN puro e íntegro de un ARN
contaminado o degradado?
R/= Luego de realizar la electroforesis, se podrá observar el desplazamiento del
ARN siendo una franja oscura sin dejar ningún trazo, esta será una muestra
integra ,al contrario de un ARN degradado que dejara un trazo a medida que
avanza por el medio estacionario, mostrando lo conocido como ensayo de cometa,
La electroforesis en gel de agarosa al 0,7% (p/v), permite la valoración de la
integridad de la muestra de ADN. Se considera que una muestra de ADN es
íntegra cuando su perfil en una electroforesis en gel de agarosa se corresponde a
una banda discreta. El nivel de degradación de una muestra está determinado por
la pérdida de definición de la banda predominante y el acompañamiento de una
estela o smear a lo largo del gel.

6.4. ¿Qué es un espectrofotométro y cómo se puede utilizar para medir la cantidad

y pureza del ARN aislado?
R/= es un instrumento usado en el análisis químico que sirve para medir, en
función de la longitud de onda, la relación entre valores de una misma magnitud
fotométrica relativos a dos haces de radiaciones y la concentración o reacciones
químicas que se miden en una muestra. También se utiliza en laboratorios de
química para la cuantificación de sustancias y microorganismos.
Este instrumento tiene la capacidad de proyectar un haz de luz monocromática a
través de una muestra y medir la cantidad de luz que es absorbida por dicha
muestra. Esto le permite al operador realizar dos funciones:

1. Dar información sobre la naturaleza de la sustancia en la muestra,

2. Indicar indirectamente qué cantidad de la sustancia que nos interesa está
presente en la muestra.
Mediante espectrofotometría se puede determinar la concentración y la pureza de
una muestra de ADN basándose en la capacidad de absorbancia de un
compuesto presente en una solución a una longitud de onda determinada. De este
modo la concentración de la muestra de ADN se calcula teniendo en cuenta el
valor de absorbancia obtenido a una longitud de onda de 260 nm. Mientras que la
relación de absorbancias A260/280 y A260/230 se utilizan para evaluar la pureza
de las muestras.