Centro Investigación de Estudios Avanzados

Unidad Irapuato

Programa

Biotecnología de Plantas

Laboratorio

Metabolómica y Espectrometría de Masas

Dr. José Juan Ordaz Ortiz

Rotación 1

Missael Molina Jiménez

Presenta:

Espectrometría de Masas (MS) en la

determinación del estado de glucosilación de la
proteína Spike del SARS-CoV-2.
Introducción
El Coronavirus 2 causante del síndrome respiratorio agudo severo (SARS CoV2),
ocasiona fiebre, enfermedad respiratoria grave y neumonía. (1, 2). El SARS CoV2
posee una proteína llamada Spike (S) ampliamente glucosilada que se proyecta
sobre la superficie del virus para establecer la unión con la enzima convertidora de
angiotensina 2 (ACE2) y así llevar a cabo el ingreso a la célula huésped. (3) La
proteína S es una proteína trimérica de clase I, formada por dos subunidades
responsables de la unión al receptor (S1) y la fusión de la membrana (S2) (4, 5). La
superficie de Spike esta compuesta por glucanos derivados de la célula huésped, y
cada trímero posee 66 sitios N-glucosilados. La proteína S es un punto clave en los
esfuerzos de la producción de vacunas (6), y entender la glucosilación de la proteína
Spike recombinante puede dilucidar las características principales de la biología del
virus y llevar a cabo las estrategias del modelado de vacunas (7,8).

La implementación de vacunas contra el Coronavirus 2 causante del síndrome

respiratorio agudo severo (SARS-CoV2) se concentra en la proteína trimérica Spike,
que comienza la infección. Cada unidad del trímero tiene 22 sitios de glucosilación.
La forma en la que se glucosilan estos sitios puede afectar las células que el virus
puede atacar y podría intervenir en la protección de varios epítopos de la
neutralización de anticuerpos.

Es por eso que se han llevado a cabo experimentos para la expresión y purificación
de los trímeros de Spike (S) glucosilados recombinantes, seguidos de la proteólisis
de glucopéptidos y determinación de la composición de los sitios de glucosilación
por espectrometría de masas. Ya que este análisis otorga un punto de referencia
que puede ser empleado para medir la calidad del antígeno a medida que se
desarrollan las vacunas y las pruebas de anticuerpos.

Rol de la glucosilación de las proteínas de superficie virales

La glucosilación es una modificación postraduccional de proteínas agregando un

nivel extra de información, llevando a cabo un papel grande en la función de las
proteínas. Los glucanos son secuencias cortas de carbohidratos que consisten en
un solo monosacárido o grandes polisacáridos que consisten en miles de unidades
de sacáridos. Los glucósidos pueden ser liberados y medidos por espectrometría
de masas para dilucidar su composición.

La glucosilación de las proteínas virales tiene amplios roles en el alcance de la

patología biológica del virus que incluye la intervención del plegamiento y la
estabilidad de las proteínas y la configuración del tropismo viral. (9). Los puntos de
glucosilación están bajo tensión selectiva ya que permiten la evasión del sistema
inmune al proteger epítopos específicos de la neutralización de anticuerpos. No
obstante, se ha observado baja tasa de mutación en los aminoácidos N-
glucosilados. (10). Las áreas con una densidad raramente alta en glucósidos
también pueden permitir el reconocimiento inmunológico (9,11,12). El papel de la
glucosilación en la evasión de los epítopos de proteína inmunogénicas se ha
estudiado para otros coronavirus. (10,13,14). Los coronavirus forman viriones por
gemación de la membrana transitoria entre el retículo endoplásmico y el aparato de
Golgi. (15, 16). Por otro lado, los glucanos observados de tipo complejo en residuos
virales nos han hecho pensar que las glucoproteínas virales están relacionadas con
enzimas de procesamiento del aparato de Golgi. (13, 17)

Figura 1. Funciones de la glicosilación en la patogenia viral. Las funciones que contribuyen a la

patogenia viral y las estrategias de la célula huésped utilizadas para responder a la infección viral
son de color azul y rojo, respectivamente. El verde y el rosa indican estados de procesamiento de
oligomanosa y glucanos ligados a N de tipo complejo, respectivamente.
La alta densidad de glucósidos virales y la estructura de las proteínas cercanas
pueden modificar estéricamente la maduración de glucanos. Una carente
maduración de glucanos origina la presencia de glucanos de tipo oligomanosa, y
este es un indicador de la estructura de las proteínas nativa (8), y el análisis de estos
glucanos propiamente del sitio pueden ser empleados para la comparación de
diversos inmunógenos y controlar los procesos de síntesis (18). Sumado a esto, la
glucosilación puede afectar el tráfico de inmunógenos recombinantes hacia los
centros germinales.

Figura 2. Variación de la N-glicosilación y O-glucosilación en proteínas.

La glucosilación juega un papel en el mantenimiento de la salud y las enfermedades.

Mientras que la importancia de la glucosilación ha sido encontrada, la capacidad
para determinar y cuantificar moléculas ha limitado la habilidad para obtener detalles
más definidos con relación al papel de la glucosilación. Por tanto, la modificación de
proteínas por glucosilación ha sido un gran obstáculo por la incertidumbre de los
métodos para caracterizar y cuantificar glucanos. A diferencia del proteoma o del
genoma, no existe una plantilla para el glicoma. Los glucósidos son sintetizados por
un grupo de enzimas que añaden un monosacárido al añadido anteriormente.
Además, no existe una estructura "completa". La proteína puede salir en cualquier
punto a lo largo de la vía de glucosilación originando un grupo de estructuras que
se diferencian de manera homogénea según los enlaces, la longitud, el número de
antenas y la composición. Debido a esto, las técnicas glucómicas y
glucoproteómicas no han tenido un avance tan rápido como los métodos genómicos
y proteómicos. Sin embargo, ha habido mejoras considerables recientemente. Las
herramientas disponibles para el perfilado de glucanos, ya sea en masa para
producir composiciones o por separación para producir estructuras, miden el
alcance de la glucómica, mientras que los métodos proteómicos y lipidómicos están
avanzando para producir glucoconjugados intactos. Las técnicas de espectrometría
de masas (MS) que proporcionan masas precisas, fragmentos estructuralmente
informativos, en conjunto con técnicas avanzadas de separación que incluyen
electroforesis capilar (CE), cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) y
cromatografía líquida de ultra alta presión (UPLC) han contribuido significativamente
al esfuerzo.

Análisis de la glucosilación de proteínas de superficie viral por Espectrometría

de Masas (EM)

MS, la producción y detección de iones separados en relación con sus proporciones

de masa a carga (m/z), puede darnos la identificación estructural de glucanos,
identificación de glucanos particulares y ser utilizada para buscar cambios en la
composición, patrón y sitio de glucanos (34, 36, 37).

Figura 3. Niveles de complejidad en el análisis de glucoproteínas.

La comprensión de la glucosilación de proteínas por MS se logra típicamente
usando dos enfoques principales:

• Los glucósidos se escinden del péptido de manera enzimática/química,

• La glucoproteína se puede digerir con proteasas, dando lugar a una mezcla
de péptidos y glucopéptidos.

Estos glúcidos/ glucopéptidos posteriormente se separan por cromatografía

previamente a la ionización en el espectrómetro de masas donde se obtienen los
datos de MS y MS en tándem.

Figura 4. Diagrama del método quimioenzimático para la liberación secuencial y análisis de

glucanos N y O-ligados.
Las ventajas analíticas de la EM la han puesto como una herramienta fundamental
para el análisis de glucanos y glucoproteínas. Principalmente dos áreas especificas
han permitido un gran desarrollo del análisis de glucoproteínas por MS.

1) La aparición de plataformas de separación por cromatografía inspiradas

sobre las propiedades hidrofílicas de los glucósidos.
2) El desarrollo de técnicas nuevas de fragmentación iónica, especialmente
técnicas de radicales de electrones que fragmentan iones peptídicos a la vez
que dejan intactas los cambios de aminoácidos lábiles, (es decir,
glucosilación). Estos avances fueron adquiridos rápidamente por los
virólogos para la adquisición de perfiles de glucósidos completos para las
proteínas de superficie virales.

Perfil de glucósidos de proteínas de superficie viral.

El empleamiento de técnicas actualizadas basadas en EM para la identificación

solida de la glucosilación de proteínas de superficie viral conlleva el uso de una
diversidad de métodos que proporcionen diversos niveles de detalle de las
glucoproteínas. Por ejemplo, la MS de los glucósidos liberados da un perfil amplio
del tipo de oligosacáridos que existen para una proteína de superficie viral
determinada. El análisis de los péptidos obtenidos posteriormente a la liberación de
glucanos por MS aporta información acerca de la ocupación del sitio de glucanos.
El análisis extra de los glucopéptidos por MS no provee perfiles de heterogeneidad
específicos para los sitios de N glucosilación. La combinación de estas técnicas y
otras no dan perfiles de glucanos para las proteínas de superficie viral, que pueden
ser utilizadas para la comprensión del rol de los oligosacáridos en la estructura y
función de las proteínas de superficie viral.

Perfiles de glucósidos escindidos

Para comenzar con la identificación de proteínas de superficie viral, el análisis de

MS de glucósidos liberados es ideal. Este tipo de análisis de glucósidos de proteínas
de superficie viral nos asegura que la glucosilación de proteínas de superficie viral
depende de las células que expresan el virus. (38,39,40,41). Estos perfiles facilitan
la explicación acerca de las diferencias entre la capacidad de neutralización de
anticuerpos (Ab) del virus producido en diversos tipos celulares. (42,43). Así como
los O-glucanos los N-glucanos pueden escindirse de manera química o enzimática
(44). Los O-glucósidos se escinden normalmente por métodos químicos como la
hidrazinólisis. Estos métodos se emplearon para la caracterización de O-glucanos
en EBOV GPs, que al compararlos pudieron notarse diferencias entre los patrones
de estos en diversas cepas.

Los N glucósidos son usualmente escindidos por medio de la digestión enzimática

de N-glucosidasa F (PNGasa F), la cual actúa sobre todos los tipos de N-glucósidos
excepto aquellos con un núcleo de α (1,3) fucosa, para cual se utiliza la PNGasa A;
no obstante, tiene menor eficiencia. Dentro de los perfiles de oligosacáridos
presentes en las proteínas de superficie virales se han identificado las de HIV 1
gp120, dengue GP E, proteínas E1 y E2 de Chinkungunya, y complejos GP de
LASV.

Figura 5. Perfil de glucósidos escindidos de VIH-1tratado con neuraminidasa

Identificación de los aminoácidos glucosilados.

Otro enfoque del glucoperfil es la identificación de los sitios de unión de los

aminoácidos unidos a glucósidos en la proteína. El sitio de unión nos revela
información que se aplica para investigaciones mutacionales para la caracterización
de los sitios de glucósidos que son relevantes para el rol funcional de las proteínas
y la identificación de los puntos que juegan un papel en la evasión inmunológica.
La identificación de los puntos N-glucosilados se logra a través de la escisión
enzimática parcial o completa de los N-glucósidos. La escisión completa de los
glucósidos por la PNGasa F da como resultado la desaminación de la asparagina a
aspartato, lo que se confirma mediante EM en tándem para la elucidación del sitio
de glucosilación, como en el caso de la proteína Spike del SARS CoV-2. De manera
alterna, para disminuir el error causado por la desaminación espontanea, se utiliza
la endoglucosidasa (Endo) para identificar el sitio de glucosilación consolidando la
heterogeneidad del glucósido en un oligosacárido por medio de la eliminación
parcial del glucósido. Cada Endo posee especificidad por un tipo variable de N-
glucósido, pero todos se eliminan entre los dos residuos de GlcNAc en el núcleo de
diactilquibiosa del oligosacárido dejando una sola GlcNAc o un disacárido de Fuc-
GlcNAc unido a la asparagina. Estos métodos son importantes para las proteínas
de superficie viral que tiene una gran cantidad de NGS potenciales, como VIH-1, Flu
HA y LASV GP.

Para la identificación de los sitios de O-glucosilación, las muestras reciben un

tratamiento previo con PNGasa F para enriquecer los puntos de O-glucosilación.
Bagdonite et. al. informaron acerca del perfil de O-glucósidos en el herpes virus
HSV-1, virus de la varicela zoster (VZV), HCMV y EBV para identificar los sitios de
unión. Se han implementado otras glucosidasas, como la sialidasa para consolidar
la fracción de sacáridos en las formas desializadas incrementando la posibilidad de
observar el sitio de unión por EM.

Figura 6. Confirmación de los sitios de glucosilación por MS en Tándem para un glucopéptido de

VIH1 digerido con Endo H.
Ocupación de los sitios de glucosilación.

La ocupación de los sitios N-glucósidos es una evaluación adicional de la

espectrometría de masas que se puede utilizar en el glucoperfil de proteínas de
superficie viral. Con el propósito de obtener la ocupación del sitio, los N-glucósidos
se escinden por medio de la PNGasa F. Los péptidos producidos que contienen
aspartato se emplean para determinar el nivel de ocupación de glucanos en un NGS
dado. Go y col. Elaboraron un mapa de calor generado a partir del análisis de
ocupación del sitio de glucosilación de 40 NGS observados entre inmunógenos de
la envoltura del VIH-1 tempranos y tardíos. Se cuantificaron las relaciones entre los
niveles de péptidos con aspartato (sitio ocupados) a péptidos con asparagina (sitios
desocupados) para estimar la ocupación del sitio. Un estudio realizado para la gripe
HA se informó una ocupación de >90% de 9 de los 11 sitios- Se empleo una técnica
similar en el análisis de 94 variantes de la envoltura del VIH-1 y se notifico que el
83% de las posibles secuencias estaban presentes y el 92% de esas secuencias
presentaban una ocupación total o parcial. Para las proteínas de superficie virales,
como VIH-1 y Flu HA con muchos sitios de N glucosilación, hay probabilidad de
NGS desocupado y la presencia o ausencia de este modifica las interacciones
importantes que influyen en la función de la proteína.

Perfiles de glucanos específicos del sitio

Ya que muchas proteínas de superficie viral están glucosiladas, el perfil de glucanos

escindidos y las confirmaciones de los sitios de unión no pueden darnos toda la
información de glucósidos necesaria, particularmente cuando los tipos de
glucósidos particulares tienen una función para la aptitud viral.

La realización de un análisis glucoproteómico específico del sitio para las proteínas

de superficie virales necesitan diversas proteasas y digestiones con glucosidasas.
Estas proteasas dan lugar a péptidos que contienen uno o dos sitios potenciales de
glucosilación. Un protocolo reciente para el análisis general de sitios específicos del
procesamiento de N-glucósidos empleo dos tratamientos Endo para ingresar firmas
de masa únicas para sitios de glucosilación que no tuvieran glucanos, glucanos tipo
hibrido/ con alto contenido en manosa y glucanos complejos. Estas estrategias han
aparecido de la necesidad de una vacuna contra el SARS-CoV2.

Figura 7. Perfil de Heterogeneidad sitio específica para un sitio de N-glicosilación de VIH1 gp120

Obtención del perfil de glicosilación de la proteína Spike del SARS CoV-2

Para resolver la especificidad de los puntos de glucosilación de la proteína S del

SARS CoV2 y observar la distribución de las diferentes variedades de glucósidos
en la proteína, se han expresado y purificado proteínas recombinantes, de manera
similar a la técnica utilizada para la obtención de la estructura crioelectrónica de alta
resolución (Cryo-EM). Como resultado, se observó que las proteínas S obtenidas,
poseen los 22 glucanos de la proteína S del SARS Cov2.

Llevaron a cabo la estabilización de la estructura trimérica a través de mutaciones

estabilizadoras 2P (20) en los aminoácidos 986 y 987, la sustitución de Gly, Ser, Ala
y Ser, en el punto de escisión de la furina (residuos 682 a 685) y la adición de un
motivo de trimerización C-Terminal. Esto facilitó la manutención de la estructura
cuaternaria durante el procesamiento de los glucósidos. Previo al análisis, el
sobrenadante que contenía la proteína Spike recombinante se purificó por
cromatografía de exclusión de tamaño para estar seguros de que solo se analizaba
la proteína trimérica nativa. La estructura trimérica del material purificado se aseguró
usando EM de tinción negativa.

Para establecer la glucosilación especifica de la proteína Spike, se llevó a cabo la

escisión proteolítica con tripsina, quimotripsina y proteasa lítica alfa para obtener
glucopéptidos que tuvieran un solo N-glucósido unido. Los glucopéptidos se
analizaron mediante cromatografía liquida y espectrometría de masas, y se
establecieron las composiciones de glucanos para los 22 sitios N glucosilados. Para
dilucidar las principales características del procesamiento en cada sitio, las
abundancias de cada glucano se suman en categorías de tipo oligomanosa, hibrido
y complejo, con base en la ramificación y la fucosilación.

Dos puntos en la proteína S del SARS Cov2 son mayormente de tipo oligomanosa:
N234 y N709. La arquitectura del glucósido de tipo oligomanosa mayormente
observada en la proteína, a excepción de N234, es Man5-GlcNAc2, por lo que se
concluye que estos puntos son ampliamente accesibles para la α-1,2- manosidasas,
pero son sustratos nulos para GlcNacT-I, que es la enzima de inicial en la formación
de glucanos de tipo hibrido y complejo en el aparato de Golgi. La fase en la que se
inhibe el procesamiento es característica que se relaciona con la densidad y
presentación de glucósidos en la proteína Spike del virus.

Los oligosacáridos de tipo complejo se encuentran en los sitios N61, N122, N603,
N717, N801 y N1074. De los 22 puntos de glucosilación de la proteína Spike, 8
poseen altas poblaciones de glucósidos de tipo oligomanosa, lo que resalta el
procesamiento divergente de las glucoproteínas del huésped (25). Los otros 14
puntos de glucosilación restantes están dominados por glucósidos de tipo complejo.

Aun después de la detección de los puntos de glucosilación desocupados en la

proteína Spike, al ser cuantificados, se mostró que formaban un componente escaso
del conjunto de péptidos totales. En estudios de inmunógenos de VIH-1, se ha
probado que los espacios generados por sitios de glucanos vacíos son
inmunogénicos y fuertemente dan lugar a epítopos pantalla (26). La gran ocupación
de las secuencias de N-glucósidos unidos de la proteína Spike muestra que los
inmunógenos recombinantes no necesitan una mayor optimización para mejorar la
ocupación del sitio.

Mediante el empleo de la estructura Cryo-EM del trímero de Spike, se ha mapeado

el estado de glucosilación del modelo tridimensional de la proteína determinada
experimentalmente. En conjunto con la espectrometría de masas ha mostrado como
los N-glucósidos unidos esconden distintas regiones a lo largo de la superficie de la
proteína Spike del SARS CoV-2

En este modelo se observan el recubrimiento de los sitios de unión al receptor de la

proteína Spike por los sitios de glucosilación cercanos (N165, N234, N343),
principalmente cuando el dominio de unión al receptor está en la conformación
“down”. El recubrimiento de los sitios de unión al receptor por los N- glucósidos es
común en glucoproteínas virales, como pueden ser observados en SARS CoV-2
(10, 13), VIH-1 (27), hemaglutinina de la influenza (28,29) y el LASV GPC (24).
Debido a las limitaciones en las funciones de los sitios de los puntos de unión al
receptor y las nulas tasas de mutación de estos residuos, podría existir una tensión
selectiva para emplear N-glucósidos para esconder una de las áreas más
conservadas y mayormente vulnerable de sus proteínas.

Se ha observado que los glucósidos de tipo oligomanosa en las subunidades S1 y

S2 están dispersos. Esto no es observado en otras glucoproteínas virales como los
agrupamientos densos de oligomanosa en cepas de VIH-1, que son detectados por
anticuerpos (32,33). En la proteína S del SARS-CoV-2, los glucanos de tipo
oligomanosa posiblemente están protegidos por la proteína, como es el caso del
glucósido N234, que se posiciona parcialmente en medio de los dominios N-
terminal y de unión al receptor.

Se han caracterizado los glucósidos N ligados en bucles flexibles extendidos (N74

y N149) y en el extremo C, proximal de la membrana (N1158, N1173, N1194) que
no se habían resuelto en los mapas de Cryo-EM (4). Se determinó que estos eran
glucósidos de tipo complejo, de acuerdo con la accesibilidad estérica de estos
residuos.
En tanto que el contenido de glucósidos de tipo manosa (28%) se encuentra arriba
del observado en glucoproteínas típicas del hospedador, en comparación con otras
glucoproteínas virales es mucho menor, ya que estas pueden mostrar hasta 60%
de glucósidos de tipo oligomanosa, como es el caso de las proteínas Spike de VIH1.
Esto denota que las proteínas Spike está menos densamente glucosilada y que los
glucósidos forman menor blindaje en comparación con otras proteínas virales.

Aunado a esto, el procesamiento de glucanos de tipo complejo es un factor de

importancia en la ingeniería de inmunógenos, especialmente considerando que los
epítopos de anticuerpo neutralizantes contra la proteína Spike del SARS CoV-2
posean glucósidos fucosilados en N343 (35). De los 22 sitios de glucosilación, el
52% están fucosilados y el 15% de los glucósidos poseen al menos un residuo de
sialato. N343 permanece altamente glucosilado con un 98% de los glucósidos
detectados que llevan sacáridos de fucosa. Cambios de glucósidos pueden verse
mayormente influenciadas por el modelo de expresión celular empleado. Se ha
demostrado anteriormente para la glucosilación del VIH-1, que el procesamiento de
los glucósidos de tipo complejo es inducido por la célula productora, pero que los
niveles de glucósidos de tipo oligomanosa eran mayormente independientes del
modelo de expresión y se encuentran mucho más relacionados con la arquitectura
de las proteínas y la densidad de glucósidos.

Conclusión

La espectrometría de masas se ha convertido en una herramienta básica para el

análisis del estado de glucosilación de proteínas de superficie virales como el SARS
CoV2. Los múltiples esfuerzos en la investigación de este virus has provisto de
detalles específicos acerca del patrón de glicosilación, como los perfiles de glucanos
escindidos, los sitios de glicosilación, los sitios de ocupación, y perfiles de
heterogeneidad de glucanos de sitio específicos. Los datos de glucoperfilación son
usados junto con experimentos estructurales, por los virólogos para establecer la
forma en la que afecta la virulencia a través de la modulación de la unión con el
receptor del virus, ocultando los sitios antigénicos e inhibiendo la respuesta inmune
de la célula hospedadora. Comprendiendo la modificación postraduccional de las
proteínas de superficie víricas como Spike, nos dará información única que permitan
un mejor desarrollo de vacunas para la prevención de la infección del SARS CoV2.

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