UNIVERSIDAD PARTICULAR DE CHICLAYO

I. INTRODUCCIÓN

Con frecuencia, la identidad de una especie requiere que se conozca de manera

detallada su actividad bioquímica, porque otras características no son
suficientemente distintivas o diferenciales.

En el laboratorio disponemos de numerosas técnicas para la caracterización

bioquímica de una especie.

Además de los productos finales de los procesos metabólicos, también se necesita

saber con detalle cómo se producen estos cambios, cómo ocurren paso a paso las
reacciones químicas, cuales enzimas intervienen, cuales son los productos
intermediarios además de que se deben reconstruir las secuencias de las reacciones
bioquímicas que tienen lugar dentro de la célula.

En general el microorganismo se cultiva en medios que contienen una sustancia

nutritiva específica o sustrato y después de la incubación del cultivo se examinan para
ver los cambios químicos que hayan ocurrido.

El alumno.

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II. OBJETIVOS
II.1. Realizar algunas pruebas bioquímicas que son de utilidad general para la
identificación de bacterias.
II.2. Realizar las lecturas e interpretaciones correspondientes de las pruebas
bioquímicas efectuadas.

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III. FUNDAMENTO TEORICO:

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IV. PROCEDIMIENTOS Y MATERIALES:

IV.1. EXPERIENCIA 1: Degradación de glucosa-lactosa- sacarosa y producción
de gas y H2S ( prueba TSI : triple azúcar, hierro)
IV.1.1. Finalidad: Incluye varias pruebas que permite determinar:
 La utilización microbiana de glucosa, lactosa y/o sacarosa.
 La producción microbiana de gas y ácidos.
 La producción de H2S.
IV.1.2. Medio de cultivo: Agar TSI:
 Extracto de carne..................... 0.3 g.
 Extracto de levadura ............... 0.3 g.
 Peptona .................................. 1.5 g.
 Proteosa peptona ................... 0.5 g.
 Glucosa .................................. 0.1 g.
 Lactosa .................................. 1.0 g.
 Sacarosa ................................ 1.0 g.
 Sulfato ferroso .......................... 0.02 g.
 Cloruro sódico ........................ 0.5 g.
 Tiosulfato sódico .................... 0.03 g.
 Agar ....................................... 1.2 g.
 Rojo fenol ............................. 0.0024 g.
 H2O destilada .....................100 ml
 pH: 7.3 0.1

INDICADOR: Rojo de fenol a pH: 8.4 (alcalino) vira a rojo y a pH: 6.8 (ácido) vira a
amarillo.

Se dispone en el comercio este medio en forma deshidratada; prepararlo en la

forma indicada en el envase. Repartir en tubos de 100 x 13 mm, llenando hasta la
mitad de los mismos y tapar de modo que se mantengan en condiciones de
aerobiosis durante su utilización. Enfriar los tubos en posición inclinada.

IV.1.3. Cultivos Bacterianos: Cepas de Proteus vulagris, Salmonella tiphi y

Escherichia coli.
IV.1.4. Procedimiento:
 Siembra: tomar 3 tubos de agar TSI inclinado y con lápiz de
cera rotulados del 1 al 3. Inocular la colonia de
microorganismos asignada en los 3 tubos. La inoculación se
realiza introduciendo una sola vez, el asa bacteriológica de
extremo recto por el centro basta tocar el fondo del tubo,

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retirar por el mismo trazo y sembrar en estría en la parte

inclinada.
 Incubación: incubar a 37ºC durante 24 horas.
IV.1.5. Lectura , simbología e interpretación del TSI:
a) La producción de H2S se manifiesta por el precipitado negro en el
medio (H2S positivo). Se simboliza de acuerdo a su intensidad de + a +
+++.
b) La presencia de gas se manifiesta por el resquebrajamiento del
medio (Gas positivo). Se simboliza según su intensidad de ++ a ++++.
c) La Acidez se manifiesta por un cambio del medio al color amarillo
(acidez positiva). Se simboliza con la letra A.
d) La alcalinidad en este medio se manifiesta por su cambio al color
grosella (alcalinidad positiva). Se simboliza con la letra K.
e) La degradación de la glucosa se manifiesta por la alcalinidad en la
parte inclinada (K) y acidez en el fondo (A) (Glucosa +) se simboliza
por K/A.
f) La degradación de la Lactosa y/o sacarosa se manifiesta por el
cambio total del medio al color amarillo. (lactosa y/o sacarosa +). Se
simboliza por A/A.
IV.2. EXPERIENCIA 2: Descarboxilación de la lisina, producción de Indol y
H2S (agar lisina hierro : LIA)
IV.2.1. Finalidad: Incluye varias pruebas que permite determinar:
 La utilización microbiana de la lisina por los mecanismos de
descarboxilación y desaminación.
 Demostrar la producción de Indol y H2S.

Aunque la producción de H2S, como producto de la degradación microbiana de

aminoácidos no tiene mayor importancia en el medio LIA sin embargo, solamente
se le considera de valor cuando en el TSI sea negativo y en el LIA positivo.

IV.2.2. Medio de cultivo: Medio Agar Lisina Hierro (LIA):

Indicador: Púrpura de Bromocresol a pH: 6.8 (alcalino) vira a violeta y a pH: 5,2
(ácido) vira a amarillo.

Se dispone en el comercio este medio en forma deshidratada; prepararlo en la

forma indicada en el envase. Repartir en tubos de 100 x 13 mm, llenando hasta la
mitad de los mismos y tapar de modo que se mantengan en condiciones de
aerobiosis durante su utilización. Enfriar los tubos en posición inclinada.

IV.2.3. Cultivos Bacterianos: Cepas de Proteus vulagris, Salmonella tiphi y

Escherichia coli.
IV.2.4. Procedimiento:
 Siembra: tomar 3 tubos de agar LIA inclinado y con lápiz de
cera rotulados del 1 al 3. Inocular la colonia de
microorganismos asignada en los 3 tubos . La inoculación se

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realiza introduciendo una sola vez, el asa bacteriológica de
extremo recto por el centro basta tocar el fondo del tubo,
retirar por el mismo trazo y sembrar en estría la parte
inclinada.
 Incubación: incubar a 37ºC durante 24 horas.
IV.2.5. Lectura , simbología e interpretación del LIA:
a) La producción de H2S se manifiesta por el precipitado negro
en el medio (H2S positivo). Se simboliza de acuerdo a su
intensidad de 1+ a 4+.
b) La presencia de gas se manifiesta por el resquebrajamiento
del medio (Gas positivo). Se simboliza según su intensidad de
+ a ++++.
c) La Acidez se manifiesta por un cambio del medio al color
amarillo (acidez positiva). Se simboliza con la letra A.
d) La alcalinidad en este medio se manifiesta por su cambio al
color violeta (alcalinidad positiva). Se simboliza con la letra K.
e) La degradación de la glucosa se manifiesta por la alcalinidad
en la parte inclinada (K) y acidez en el fondo (A) (Glucosa +)
se simboliza por K/A.
f) La degradación de la Lactosa y/o sacarosa se manifiesta por
el cambio total del medio al color amarillo. (lactosa y/o
sacarosa +). Se simboliza por A/A.
IV.3. EXPERIENCIA 3: Prueba del citrato
IV.3.1. Finalidad: Determinar la utilización del citrato por bacterias como la
única fuente de carbono.
IV.3.2. Medio de cultivo: Agar Citrato de Simons.
IV.3.3. Cultivo bacteriano: Cepas de Proteus
IV.3.4. Procedimiento
 Siembra: Sembrar en 3 tubos inóculos de la colonia de
microorganismos asignada, por picadura en la columna de
agar y por estría en la superficie inclinada, en un tubo de agar
citrato de Simons inclinado. Utilizar para esto una asa
bacteriológica con el alambre recto a fin de sembrar el inóculo
pequeño.
 Incubación: Incubar a 37º C por 24 a 48 hs.
IV.3.5. Lectura: Observar los tubos y anotar como reacción positiva (Citrato
+) si el crecimiento es visible, el crecimiento se manifiesta por el
cambio de color de verde a azul. y como reacción negativa si el color
no ha cambiado (citrato -). El color azul es por la presencia en el medio
del indicador azul de bromo timol que a pH 6.0 (ácido) vira a amarillo y
a pH 7.6 (alcalino) vira a azul.
IV.4. EXPERIENCIA 4: PRUEBA DE SIM (SULFURO-INDOL-MOVILIDAD):
IV.4.1. Finalidad: Medio de cultivo semisólido cuya finalidad es la
observación de la motilidad y la formación de H 2S en el marco del
diganóstico de enterobacteriáceas
IV.4.2. Medio de cultivo: Agar SIMS
IV.4.3. Cultivo bacteriano: en 3 tubos de agar SIMS y con lápiz de cera
rotulados del 1 al 4. Inocular la colonia de microorganismos asignada
en los 3 tubos.
IV.4.4. Procedimiento:

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Siembra: La inoculación se realiza introduciendo una sola vez,
el asa bacteriológica de extremo recto por el centro hasta tocar
el fondo del tubo, retirar por el mismo trazo.
 Incubación: incubar a 37ºC durante 24 horas.
IV.4.5. Lectura: Observar los tubos, la motilidad se pone de manifiesto por la
turbidez difusa del medio de cultivo alrededor del canal de la picadura,
(motilidad +) la no motilidad se caracteriza por el crecimiento
producido exclusivamente a lo largo de dicho canal (motilidad - ). La
producción de H2S se reconoce por el ennegrecimiento de la zona de
crecimiento.
En este medio también se demuestra la formación de Indol de algunas
bacterias, para la demostrar la formación del indol se recubren
ulteriormente los tubos con Reactivo de indol. La formación de indol
da lugar a una coloración rojo púrpura en la capa de reactivo.
IV.5. EXPERIENCIA 5: DEGRADACIÓN DE LA UREA
IV.5.1. Finalidad: Este medio se utiliza para la diferenciación de micro-
organismos degradadores de urea, según Christensen, tales como
Proteus sp, otras enterobacterias y estafilococos.
IV.5.2. Medio de cultivo: Agar UREA de Christhiansen
IV.5.3. Cultivo bacteriano: Cepas de Proteus
IV.5.4. Procedimiento:
 Siembra; Sembrar en 3 tubos inoculos de la colonia asignada,
por estría en la superficie inclinada, en un tubo de agar urea
de Christhiansen inclinado. Utilizar para esto un asa
bacteriológica con el alambre recto a fin de sembrar el inóculo
pequeño.
 Incubación: Incubar a 37º C por 24 a 48 hs.
IV.5.5. Lectura: Observar los tubos y anotar como reacción positiva (Urea +)
si el crecimiento es visible, el crecimiento se manifiesta por el cambio
de color amarillo al rojo purpura y como reacción negativa si el color no
ha cambiado (urea - ). El color rojo púrpura es por la presencia en el
medio del indicador de pH Rojo de fenol
 Forma de actuación: La úrea es hidrolizada por la enzima
ureasa, dando dióxido de carbono y amoniaco. Este último da
reacción alcalina al medio, como puede comprobarse por el
viraje del amarillo al rojo-púrpura del indicador de pH Rojo de
fenol.

REALIZAR EL SIGUIENTE ESQUEMA DE SIEMBRA:

AGAR CITRATO
AGAR LIA AGAR TSI DE SIMONS AGAR UREA AGAR SIM

Se pica en el fondo y Siembra en la Se pica en el

luego se realiza un superficie en forma de centro del
zig-zag en la zig-zag medio
superficie (Estría)

 Después de realizar las siembras llevar a incubar a la estufa calibrada de 35 – 37 °C por

18 – 24 horas. Observar los resultados.

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V. RESULTADOS :
V.1.EXPERIENCIA 1: Degradación de glucosa-lactosa- sacarosa y producción de gas y
H2S ( prueba TSI : triple azúcar, hierro):
V.1.1. Tubo 1:

V.1.2. Tubo 2:

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V.1.3. Tubo 3:

V.2.EXPERIENCIA 2: Descarboxilación de la lisina, producción de Indol y H2S (agar

lisina hierro : LIA)

V.2.1. Tubo 1:

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V.2.2. Tubo 2:

V.2.3. Tubo 3:

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V.3.EXPERIENCIA 3: : PRUEBA DEL CITRATO

V.3.1. Tubo 1:

V.3.2. Tubo 2:

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V.3.3. Tubo 3:

V.4.EXPERIENCIA 4: PRUEBA DE SIM (SULFURO-INDOL-MOVILIDAD).

V.4.1. Tubo 1:

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V.4.2. Tubo 2:

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V.4.3. Tubo 3:

V.5.EXPERIENCIA 5: DEGRADACIÓN DE LA UREA.

V.5.1. Tubo 1:

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V.5.2. Tubo 2:

V.5.3. Tubo 3:

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VI. INTERPRETACIÓN:
VI.1. Prueba TSI (triple azúcar, hierro):
 En el medio de cultivo, el extracto de carne y la pluripeptona, aportan los
nutrientes necesarios para el desarrollo bacteriano.
 La lactosa, sacarosa y glucosa son los hidratos de carbono fermentables.
 El tiosulfato de sodio es el sustrato necesario para la producción de ácido
sulfhídrico, el sulfato de hierro y amonio, es la fuentes de iones Fe3+, los
cuales se combinan con el ácido sulfhídrico y producen sulfuro de hierro,
de color negro.
 El rojo de fenol es el indicador de pH, y el cloruro de sodio mantiene el
balance osmótico.
 Por fermentación de azúcares se producen ácidos, que se detectan por
medio del indicador rojo de fenol, el cual vira a color amarillo en medio
ácido.
 El tiosulfato de sodio se reduce a sulfuro de hidrógeno el que reacciona
luego con una sal de hierro, proporcionando el típico sulfuro de hierro de
color negro.
VI.2. Agar LIA:

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 En el medio de cultivo, la peptona y el extracto de levadura aportan los

nutrientes para el desarrollo bacteriano.
 La glucosa es el hidrato de carbono fermentable, y la lisina es el sustrato
utilizado para detectar la presencia de las enzimas descarboxilasa y
desaminasa.
 El citrato de hierro y amonio, y el tiosulfato de sodio, son los indicadores
de la producción de ácido sulfhídrico.
 El púrpura de bromocresol, es el indicador de pH, el cual es de color
amarillo a pH igual o menor a 5.2, y de color violeta a pH igual o mayor a
6.8.
 Por descarboxilación de la lisina, se produce la amina cadaverina, que
alcaliniza el medio y esto produce el viraje del indicador a color violeta.
 La descarboxilasión de la lisina, tiene lugar en medio ácido, por lo que es
necesario que la glucosa sea previamente fermentada.
 Los microorganismos que no producen lisina decarboxilasa, pero que son,
fermentadores de la glucosa, producen un viraje de la totalidad del medio
de cultivo al amarillo, pero a las 24 h de incubación se observa el pico de
color violeta, debido al consumo de las peptonas, y el fondo amarillo.
 La producción de sulfuro de hidrogeno, se visualiza por ennegrecimiento
del medio debido a la formación de sulfuro de hierro.
 Las cepas de los géneros Proteus, Providencia y algunas cepas del
morganella, desaminan la lisina, esto produce un ácido alfa-ceto-
carbónico, el cual, con la sal de hierro y bajo la influencia del oxígeno
forma un color rojizo en la superficie del medio.
 RESULTADO:
o Descarboxilación de la lisina:
Prueba Positiva: Pico Violeta / fondo Violeta.
Prueba Negativa: Pico Violeta / Fondo Amarillo.
o Desaminación de la lisina:
Pico rojizo / Fondo amarillo
o Producción de ácido sulfhídrico:
Prueba positiva: ennegrecimiento del medio (especialmente en el
límite del pico y el fondo).
VI.3. PRUEBA DEL CITRATO:
 En el medio de cultivo, el fosfato monoamónico es la única fuente de
nitrógeno y el citrato de sodio es la única fuente de carbono. Ambos
componentes son necesarios para el desarrollo bacteriano.
 Las sales de fosfato forman un sistema buffer, el magnesio es cofactor
enzimático.
 El cloruro de sodio mantiene el balance osmótico, y el azul de bromotimol
es el indicador de pH, que vira al color azul en medio alcalino.

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 El medio de cultivo es diferencial en base a que los microorganismos

capaces de utilizar citrato como única fuente de carbono, usan sales de
amonio como única fuente de nitrógeno, con la consiguiente producción
de alcalinidad.
 El metabolismo del citrato se realiza, en aquellas bacterias poseedoras de
citrato permeasa, a través del ciclo del ácido tricarboxílico. El
desdoblamiento del citrato da progresivamente, oxalacetato y piruvato.
Este último, en presencia de un medio alcalino, da origen a ácidos
orgánicos que, al ser utilizados como fuente de carbono, producen
carbonatos y bicarbonatos alcalinos. El medio entonces vira al azaul y esto
es indicativo de la producción de citrato permeasa.
 RESULTADOS:
o POSITIVO: crecimiento y color azul en el pico, alcalinidad.
o NEGATIVO: el medio permanece de color verde, debido a que no
hay desarrollo bacteriano y no hay cambio de color.
VI.4. PRUEBA DE SIM:
 El triptófano es un aminoácido constituyen de mucha peptonas, y
particularmente de la tripteína, que puede ser oxidado por algunas
bacterias para formar indol.
 En el proceso interviene un conjunto de enzimas llamadas triptofanasas.
 El indol producido se combina con el aldehído del reactivo de Kovac’s o
de Erlich, para originar un compuesto de color rojo.
 Las cepas móviles pueden apreciarse en este medio, por la turbidez que
producen alredor de la punción de siembra, mientras que aquellas cepas
productoras de sulfhídrico se distinguen por la formación de un
precipitado negro de sulfuro de hierro, a partir del tiosulfato siempre que
el medio se mantenga a un pH mayor a 7.2.
 RESULTADOS:
o Cepas Móviles: producen turbidez del medio, que se extiende más
allá de la línea de siembra.
o Cepas Inmóviles: el crecimiento se observa solamente en la línea
de siembra.
o Cepas SH2 positivas: ennegrecimiento a los largo de la línea de
siembra o en todo el medio.
o Cepas SH2 negativas: el medio permanece sin cambio de color.
o Cepas indol positivas: desarrollo de color rojo luego de agregar el
reactivo de Kovac’s o Erlich.
o Cepas indol negativa: sin cambio de color.
VI.5. PRUEBA DE UREA:
 Este medio de cultivo, formulado por Rustigian y Stuart, presenta bajo
contenido de nutrientes y alta capacidad buffer.

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 El extracto de levadura es la única fuente de carbono, nitrógeno,

vitaminas y cofactores y aporta los nutrientes esenciales para el desarrollo
bacteriano. Las sales de fosfatos constituyen el sistema buffer, el rojo de
fenol es el indicador de pH y la urea es el sustrato de la enzima ureasa.
 Aquellas bacterias que poseen la enzima ureasa, pueden utilizar el
nitrógeno proveniente de la urea, la hidrolizan, liberando amoniaco y
dióxido de carbono. Estos productos metabólicos alcalinizan el medio,
haciendo virar el indicador rojo de fenol de amarillo al rojo.

VII. CONCLUSIONES
VII.1. Se realizó mediante esta práctica algunas pruebas bioquímicas que son de
utilidad general para la identificación de bacterias clínicamente importantes y
cuya identificación es de vital importancia para el médico.
VII.2. Se realizó las lecturas e interpretaciones correspondientes de las pruebas
bioquímicas efectuadas.

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VIII. BIBLIOGRAFÍA
 Sanabria Gómez J. Manual de Laboratorio Microbiología. Universidad del Valle
[revista en internet]; 2001. [acceso 08 de febrero de 2011]. Disponible en:
http://www.scribd.com/doc/395622/Manual-de-laboratorio
 Brooks, Carrol, Butel, Morse. Microbiología Médica de Jawetz, Melnick y
Adelberg. 19 ed. México: El Manual Moderno; 2007.

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