USAC/Facultad de Agronomía/Área Tecnológica/Subárea de Protección de plantas/2016.

MANUAL DE LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA AGRÍC

1
M.Sc. Carlos Humberto González
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Br. Alba Noj

Practica 3: Omnipresencia de microorganismos y técnicas de aislamiento

I. INTRODUCCIÓN
Los microorganismos juegan un papel muy importante con el ser humano, plantas, animales ya que
están íntimamente ligados a las actividades microbianas en cuanto al reciclado de los nutrientes
esenciales o a la degradación de la materia orgánica. En efecto ninguna forma de vida tiene
importancia similar a la de los microorganismos en el mantenimiento de la vida sobre la tierra.
Stanier (1992) indica que la esencia de la microbiología integran dos operaciones: el aislamiento, que
es la separación de un microorganismo determinado de las poblaciones mixtas que existen en la
naturaleza, y el cultivo que es el crecimiento de poblaciones microbianas en ambientes artificiales
(medios de cultivo) bajo condiciones de laboratorio. Operaciones importantes para poder observar sus
características anatómicas y morfológicas y así poder clasificarlos, por lo que en esta práctica se
mencionan algunas técnicas de aislamiento de microorganismos a partir de distintos materiales como:
tejidos vegetales, suelo, tallos, frutos, entre otros.
Debido a la ubicuidad de los microrganismos, en el laboratorio microbiológico es importante mantener
los microorganismos del ambiente fuera de los materiales de trabajo, para que no interfieran con el
aislamiento de los agentes de nuestro interés. Ello se logra mediante una serie de medidas y cuidados
en la manipulación de medios de cultivo y de los implementos de laboratorio, tendientes a obviar la
contaminación ambiental o la que se pudiera aportar a partir de las manos, respiración u otros.
Además la aplicación correcta de las normas de bioseguridad que garanticen un trabajo correcto de
laboratorio evitara la contaminación de los medios de cultivo y las posibles infecciones por accidentes
de laboratorios.
II. OBJETIVOS

 Demostrar la ubicuidad de los microorganismos.

 Conocer y realizar diferentes técnicas de aislamiento de microorganismos a partir de distintos
materiales.
 Valuar técnicas de aislamiento de microrganismos (hongos y bacterias)
III. MARCO TEÓRICO
3.1 Que son los microorganismos
La Real Academia Española (1997) y Tartora et al. (2007) mencionan que los microorganismos
también son conocidos como microbios (del griego micros= pequeño y bios= vida) que se define como
organismo unicelular que solo es visible al microscopio. Por lo que Madigan (2000) define a la
microbiología como el estudio de los microorganismos, un grupo muy amplio y diverso de organismos
microscópicos que existen como células aisladas o asociadas, las células microbianas se distinguen
de las plantas y animales, ya que no pueden vivir aisladas a la naturaleza y solo existen formando
parte de organismos multicelulares; son capaces de realizar procesos vitales de crecimiento,
generación de energía y reproducción.

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En el ambiente los microorganismos están en aguas, suelo, animales, plantas, aire, suspendidos en
granos de polvo y gotas de agua. Aquellos que conviven con nosotros y constituyen la microflora, cuya
presencia se traduce en beneficios, Sin embargo, algunos de esos agentes de la flora nativa son
potencialmente patógenos y pueden llegar al ambiente a partir de secreciones, aerosoles y
excreciones de animales y de individuos enfermos, de portadores o de cadáveres en descomposición.
3.2 Ecología microbiana
Los microorganismos, por su omnipresencia, afectan a toda la biosfera. La relación de los
microorganismos con el resto de las especies y con su entorno abarca todos los dominios: Eucariota,
arqueas, bacterias y virus. La vida microbiana juega un papel primordial en la regulación
biogeoquímica en todos los ambientes del planeta, desde ambientes gélidos y lagos ácidos hasta
respiraderos hidrotermales en el fondo de los océanos. La magnitud cuantitativa de la vida microbiana
en la tierra es de 5,0 x1030 células, ocho ordenes de magnitud mayor que el número de estrellas en el
universo. Las bacterias constituyen un importante sumidero de carbono, tienen un papel clave en la
fijación de nitrógeno para las plantas, en el metabolismo de metano y del azufre y están presentes en
los ciclos biogeoquímicos de la biosfera. La inmensidad de la producción de microorganismos es tal
que, incluso en la ausencia total de la vida eucariota, la mayoría de los microbianos seguirían sin
cambios.
La comunidad microbiana interacciona en todas las formas de simbiosis, desde el mutualismo al
parasitismo, pasando por el simple comensalismo.
Las poblaciones de las comunidades microbianas se relacionan de varios modos y tales interacciones
pueden ser perjudiciales o beneficiosas. En muchos casos, las poblaciones interaccionan y cooperan
en sus funciones nutricionales con los productos de desecho derivados de las actividades metabólicas
de algunas células sirviendo como nutrientes para otras. Los organismos de un hábitat también se
relacionan con su ambiente físico y químico.
En conjunto se denomina ecosistema a los organismos y a los componentes físicos y químicos de su
medio. Hay importantes ecosistemas microbianos acuáticos (océanos, estanques, lagos, corrientes,
fuentes termales), terrestres (suelos, rocas, etc.) e incluso asociados a organismos superiores, plantas
o animales.
El conocimiento de los microrganismos en la naturaleza comienza con estudios que utilizan el
microscopio.
Los microorganismos podrían ser capaces no solo de realizar más eficiente diferentes procesos, como
la fijación biológica del nitrógeno, degradación de materia orgánica, también hay organismos capaces
de llevar a cabo el control de enfermedades, o de realizar proceso como la degradación de restos de
pesticidas o insecticidas tóxicos (biorremediación) (Madigan 2000).
3.3 Aislamiento de microorganismos
Stanier (1992) indica que la esencia de la microbiología integran, dos clases de operaciones: el
aislamiento, que es la separación de un microorganismo determinado de las poblaciones mixtas que
existen en la naturaleza, y el cultivo, que es el crecimiento de poblaciones microbianas en ambientes
artificiales (medios de cultivo) bajo condiciones de laboratorio. Estas dos operaciones entran en juego
sin tener en cuenta la clase de microorganismo que está manejando el microbiólogo; son básicamente

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iguales para el estudio de los virus, las bacterias, los hongos, las algas y los protozoos e incluso para
el de pequeños invertebrados. Además, en los últimos años se han extendido a estudios de
aislamiento de células o tejidos derivados de animales y plantas (cultivo de tejidos). La unidad de la
microbiología como ciencia, a pesar de la diversidad biológica de los organismos de que se ocupa, se
deriva de su base operativa común.
Existen diversos métodos para el aislamiento microbiano. La elección del método adecuado depende
del tipo de microorganismo que se desea obtener en cultivo puro o de su abundancia en la mezcla de
la cual se parte.
Algunos de los métodos más utilizados para la separación de un microorganismo determinado a partir
de una población mixta son:

 Aislamiento por diluciones sucesivas

 Asilamiento por estría en superficie
Dependiendo de la concentración del microorganismo que se desea aislar en la mezcla inicial,
cualquiera de estos dos métodos de aislamiento se pueden utilizar con o sin un enriquecimiento previo.
Ambos métodos implican una dilución de la mezcla original, donde las diluciones más altas solo
contendrán la especie más abundante.
3.3.1 Aislamiento por diluciones sucesivas
Se toma la muestra de partida, se siembra en el primer tubo y se mezcla. Se toma parte del primer
tubo y se siembra en el segundo y se mezcla, este procedimiento se repite un número de veces
suficiente como para obtener en algunos de los últimos tubos un numero de bacterias tan bajo que
permita obtener colonias aisladas luego del crecimiento en placa, luego el contenido de cada tubo se
coloca en una placa de Petri. En las placas con las diluciones más altas las colonias estarán
suficientemente separadas entre sí.
3.3.2 Asilamiento por agotamiento o estría en superficie.
Este método se utiliza generalmente para la identificación de bacterias, se toma la muestra o cultivo
mixto muy concentrado con un asa, se realiza varias pasadas sucesivas (estrías) sobre uno de los
bordes de la placa, luego se esteriliza el asa, se toma una de las últimas estrías realizadas y continuar
la siembra sobre el resto de la superficie del medio teniendo cuidado de no pasar dos veces el asa por
el mismo lugar. Luego se procede a la incubación a una temperatura adecuada. Con esta metodología
se obtendrán zonas en la placa donde las colonias estén bien separadas con el objetivo de tomar
colonias aisladas y repetir el procedimiento de estriado.
Muchas de las colonias que aparecen en la primera placa son colonias mixtas formadas por dos o más
tipos de bacterias que crecen juntas, por este motivo resulta fundamental repetir el proceso de
aislamiento (Gamazo 2005).
3.3.3 Aislamiento de hongos
Esta técnica se puede realizar desde el material infectado. Para el aislamiento de hongos podemos
dividir los medios de cultivos generales PDA (Potato Dextrosa Agar) y AA (agar agua) y medios
selectivos.

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La mayoría de enfermedades se diagnostican al observarlas a simple vista o mediante el microscopio,

lo cual hace innecesario el aislamiento del patógeno. Sin embargo, hay muchas enfermedades
bacterianas y fungosas en las que es imposible identificar al patógeno que ya se encuentra mezclado
con uno o más contaminantes; o bien cuando es causado por un patógeno desconocido, el cual debe
aislarse y estudiarse.
A. Aislamiento a partir de hojas
En caso de que la infección de las hojas de una planta avance en forma de mancha foliar fungosa y en
el caso de que las esporas del hongo aparezcan sobre la superficie, algunas de estas esporas deben
depositarse sobre una caja petri que contenga medio de cultivo. Si el hongo crece en cultivo, al cabo
de unos cuantos días aparecerán colonias de micelio aisladas debido a la germinación de las esporas.
B. Aislamiento a partir de tallos, frutos, y otros órganos aéreos de la planta.
La mayoría de los métodos que se han descrito para aislar bacterias y hongos patógenos de las hojas,
pueden también utilizarse para aislar esos mismos patógenos de las infecciones superficiales de los
tejidos mencionados.
C. Aislamiento a partir de raíces, tubérculos, raíces carnosas y frutos de hortalizas que
se encuentran en contacto con el suelo, etc.
El aislamiento de los patógenos de cualquier tejido vegetal enfermo que se encuentre en contacto con
el suelo, presenta una serie de problemas adicionales que ocasionan numerosos organismos
saprófitos que invaden el tejido después de que ha sido destruido por el patógeno (Agrios 2004).
D. Aislamiento de esporas utilizando aguja de cristal
El método usado para aislar un hongo en particular a partir de un sustrato natural, y obtener un cultivo
puro, depende de alguna manera de las circunstancias, ciertas especies pueden producir cuerpos
fructíferos, mientras que otro puede producir pocas esporas. Si el crecimiento de hongos es
exuberante, con numerosas estructuras de fructificación aéreas visibles, entonces el método de
aislamiento es generalmente sencillo. El aislamiento se puede lograr mediante el uso de unas pinzas
finas y agujas de disección para tomar de unas pocas esporas o una sola espora y transferirlas a un
medio de cultivo adecuado. Un cultivo puro a menudo es el resultado de esta transferencia.
Esta metodología consiste en utilizar agujas de cristal realizadas con pipetas pasteur de vidrio para el
arrastre de esporas en un medio de cultivo Agar-Agua (AA), con el fin de obtener la germinación de
una sola espora, para luego ser trasladada a otro medio de cultivo ideal para nuestro microorganismo
de interés y tener como resultado un cultivo monospórico (cultivo que se parte de una sola espora o
conidia).
Un problema comúnmente encontrado en el aislamiento de hongos de sustratos naturales por
transferencia de esporas directa es la contaminación bacteriana. Colonias de hongos que crecen en un
medio con antibióticos incorporadas todavía pueden estar contaminados con bacterias. Otra
complicación es que ciertas bacterias inhiben fuertemente el crecimiento de hongos. Si tales bacterias
están presentes, el aislamiento de hongos sería un fracaso.

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Este método funciona bien con hogos hifomicetos que tienen grandes conidios de color, tales como
Alternaria, Corynespora, y Helminthosporium, pero es difícil de usar con especies de Aspergillus y
Penicillium (Goh 1999).
3.3.3 Manejo de las muestras y toma de inóculo
La toma de inoculo de una muestra de medio sólido o líquido es simple, pero requiere alguna atención,
se recomienda las maniobras siguientes:
1. Coloque frente al manipulador el mechero y la preparación o muestra que contiene los
microrganismos, así como el resto de material necesario (portaobjetos, tubos, placas, pinzas, azas,
etc.,). Todo ello debe ser alcanzado con facilidad.
2. Tome el asa de siembra y flamee el filamento hasta que alcance un rojo incandescente. Enfríelo a la
proximidad de la llama (aprox. 10 s.). Recuerde que las llamas “frías” son anaranjadas y aunque se
ven bien, no esterilizan.
3. Tome con la otra mano el recipiente (tubo, placa, etc.) que contiene la muestra. Si la muestra está
con un tubo, quite el tapón con los dedos meñique y anular. Se debe flamear la boca del tubo. Si la
muestra está en una placa Petri, coloque la paca invertida sobre la mesa de trabajo y levante la parte
que contiene el medio de cultivo con los microorganismos. Llévela a la proximidad de la llama del
mechero.
4. Trabajando en todo momento en la proximidad de la llama, introduzca el asa de siembra y tome una
pequeña muestra del cultivo mediante un ligero roce.
5. transfiera el inoculo a otro medio de cultivo estéril tomando las mismas precauciones en su manejo
(flameando bocas de tubos, trabajando en la proximidad de la llama, etc.) o bien proceda a preparar un
frotis para tinción.
6. en el caso de tubos flamee la boca de estos antes de colocar el tapón o sellar las cajas Petri.

IV. METODOLOGÍA

 Los estudiantes trabajaran en forma individual o se organizarán en parejas

 En cada punto de trabajo de laboratorio estarán colocadas cajas Petri con medio de cultivo estéril.
 No abrir las cajas hasta que esté realizando los procedimientos que posteriormente se le indican.
 Identificar con marcador indeleble las cajas de Petri que será utilizada para las diferentes pruebas
con un código, del cual en su cuaderno de trabajo tendrá la información siguiente: medio de cultivo,
ambiente estudiado, nombre de los estudiantes que lo realizaron y fecha.

4.1 Omnipresencia de los microorganismos

 Tomar una caja de Petri con medio de cultivo (PDA), abrirla y exponerla al ambiente por espacio de
15 minutos.
 Una vez transcurrido el tiempo, cerrarla, identificarla y proceder a colocarla en la incubadora.
 Tomar lecturas cada 24 horas durante 5 días.

4.2. Aislamiento por agotamiento o estría

El objetivo de esta técnica es diluir la muestra de tal manera que al final se obtenga colonias
separadas para poder iniciar el estudio de identificación y sensibilidad a los antimicrobianos.
Se tomara una muestra o suspensión de bacterias.

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 Realizar un macerado de muestras vegetales con síntomas de bacterias.

 Obtener la muestra con el asa y suspenderla en un extremo de la placa con medio de cultivo (Agar
nutritivo), haciendo estrías (líneas) de un extremo a otro (primer cuadrante)
 Flamear el asa, enfriar en el extremo e iniciar estrías desde el cuadrante primero y extenderlas
hasta el cuadrante dos, así sucesivamente hasta realizar en el cuadrante cuatro (ver figura 2)

Figura 2: técnica de estriado en medio de cultivo.

 Identificar y proceder a incubar por 48 horas.

 Cuando haya crecimiento bacteriano proceder a la purificación de cepas realizando estriado
(mismo procedimiento anteriormente descrito).

4.3 Aislamiento por diluciones

Se utilizará la técnica de diluciones, realizar lo siguiente:
 Medir un gramo de suelo y mezclarlo con 9 mL de agua destilada (dilución 1:10).
 De la dilución 1:10, con una pipeta estéril, tomar 1 ml y diluirlo en otros 9 ml de agua destilada
estéril (dilución 1:100).
 Continuar diluyendo hasta 1:10000.
 Utilizar 1 ml de las soluciones 1:100, 1:1000 y 1:10000 y verterlo en igual número de cajas de Petri
con medio de cultivo (PDA), las cuales deberán estar debidamente identificadas.
 Colocar las cajas en la incubadora.
 Tomar lecturas cada 24 horas durante 5 días
 Posteriormente tomar un microorganismo aislado y realizar un cultivo puro.

4.4 Aislamiento tejidos vegetales

 Realizar la desinfección del material vegetal enfermo, realizando el tren de desinfección el cual se
detallará a continuación
o Depositar las porciones de tejido vegetal en el primer vidrio de reloj (agua estéril).
o Seguidamente, trasladarlas al vidrio de reloj que contiene alcohol (30 s)
o Trasladar al siguiente vidrio de reloj que contiene agua estéril, para eliminar el exceso de
alcohol.
o Luego, pasarlos al siguiente vidrio de reloj con hipoclorito de sodio (30 s)
o Pasarlos sucesivamente en los dos vidrios de reloj que contienen agua estéril.
 Colocar las porciones de tejido sobre una hoja de papel filtro estéril, para quitarles el exceso de
agua.
 Depositar las porciones de tejido en la caja Petri donde se hará crecer el microorganismo.
 Cuidar que el recipiente se encuentre cerca de la llama del mechero y que la respiración sea
contenida un poco.

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 Las cajas Petri deberán identificarse con el nombre del estudiante y día de laboratorio e incubarse
a 28 ºC por espacio de 5 días.
4.5 Aislamiento de esporas utilizando aguja de cristal

 Con la ayuda de una aguja de disección fina previamente esterilizada, se toma el cuerpo fructífero
del hongo (micelio, picnidio, acérvulo, etc.) y se coloca en la caja petri con medio de cultivo Agar-
Agua (AA).
 La caja Petri se coloca bajo el esteresocopio y con una aguja de cristal o de vidrio esterilizada con
alcohol se procede al arrastre, para su diseminación y dispersión.
 Las cajas Petri sembradas se sellan y colocan en la incubadora por 48 horas.
 Después de las 48 horas se procede a tomar una espora germinada y se siembra en un medio de
cultivo Agar Papa Dextrosa, para obtener un cultivo monospórico.
 Sellar e identificar la caja Petri e incubar para observar el crecimiento del hongo.
V. TAREA

 Realizar un cultivo monospórico de hongos, asilamiento y purificación de bacterias

 Así mismo tomar datos de observación de cada uno de los procedimientos llevados a cabo, ya que
este reporte se complementará con la siguiente práctica.

VI. BIBLIOGRAFÍA
1. Agrios, GN. 2004. Plant pathology. 5th Edition. Elsevier Academic Press Publications. 903p.
2. Álvarez, GA; Santos, MC; Centes, LF. 2013. Bioprospección de los hiperparásitos Cicinobolus
cesatii de Bary 1870 y Eudarluca caricis (Biv.) O.E. Erikss. 1966, sobre cultivos y plantas
adyacentes en la region central de Guatemala.
3. Gamazo, C; López, I; Díaz, R. 2005. Manual práctico de Microbiología. 3ra. Edición. Barcelona,
España. Masson, S.A.91p
4. Goh, TK. 1999. Single-spore isolation using a hand-made glass needle. Fungal Diversity 2: 47-
63p.
5. Madigan, MT; Martinko, JM; Parker, J. 2000. Brock Biología de los Microorganismos, 12ª
edición. Pearson Educación. 1259p.
6. Real Academia Española (RAE). 1997. Boletín de la Real Academia Española. Volumen 77.
7. Stanier, YR; Ingraham, JL; Wheelis, ML; Painter, PR. 1992. MICROBIOLOGÍA. 2da. Edición.
España. Editorial Reverté, S.A. 727p.
8. Tartora, GJ; Funke, BR; Case, CL. 2007. Introducción a la Microbiología. 9ª. Edición. Médica
Panamericana. 988p.

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