PCR en tiempo real

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La PCR cuantitativa (en inglés,
quantitative polymerase chain reaction; qPCR o Q-PCR) o PCR en tiempo
real (en inglés real time PCR) es una variante de la reacción en cadena de la
polimerasa (PCR) utilizada para amplificar y simultáneamente cuantificar de forma
absoluta el producto de la amplificación de ácido desoxirribonucleico (ADN). Para
ello emplea, al igual que la PCR convencional, un molde de ADN, al menos un par
de cebadores específicos, dNTPs, un tampón de reacción adecuado y una ADN
polimerasa termoestable. A dicha mezcla se le adiciona una sustancia marcada
con un fluoróforo que permita medir la tasa de generación de uno o más productos
específicos.1 en un termociclador provisto de sensores de fluorescencia, tras
excitar el fluoróforo a la longitud de onda apropiada. Dicha medición se realiza tras
cada ciclo de amplificación, y es por esto que se le denomina PCR en tiempo real
(es decir, PCR inmediata, simultánea). En muchos casos, el molde que se emplea
para la PCR cuantitativa no es ADN desde el principio, sino que puede ser ADN
complementario (ADNc), de hebra simple, obtenido por retrotranscripción de ácido
ribonucleico (ARN); en este caso, la técnica es una RT-PCR cuantitativa o en
tiempo real, o RT-Q-PCR. Debe evitarse la confusión con la técnica denominada
«PCR tras transcripción inversa» (RT-PCR, del inglés reverse transcriptase PCR),
en la cual existe un paso de retrotranscripción de ARN a ADN pero que no
necesariamente cuantifica el producto a tiempo real.
La PCR cuantitativa junto a los chip de ADN son modernas metodologías para el
estudio de la expresión génica, aunque otros métodos tradicionales como
el Northern blot, si bien no con tanta precisión, también permiten su abordaje. 2 La
variabilidad que se introduce en la cuantificación y que conlleva a errores en la
estimación deriva de la integridad del ADN, la eficiencia enzimáticay otros muchos
factores, por lo que se han desarrollado numerosos sistemas de estandarización.
Los hay para cuantificar de forma absoluta la expresión génica, pero, de forma
más común, se orientan a la cuantificación relativa del gen de estudio respecto de
otro, denominado «normalizador», que se selecciona por su expresión casi
constante. Estos genes suelen denominarse, en inglés, house-keeping genes, ya
que suelen estar involucrados en funciones básicas en la supervivencia celular, lo
cual suele implicar una expresión constitutiva.34 De este modo, efectuando en
cada experimento la medición de los genes de interés y dividiéndolos por la
expresión del gen normalizador seleccionado es posible comparar los primeros
aún sin conocer en términos absolutos su nivel de expresión. Los genes
normalizadores más empleados son aquellos que codifican las siguientes
proteínas: tubulina, gliceraldehído-3-fosfato
deshidrogenasa, albúmina, ciclofilina, ARN ribosomales, etc.2