56 Sección I Aspectos generales
El método detalla la microdilución y macrodilución agente antimicrobiano por probar. Las bandas se ubican en
para hongos que causan micosis invasoras como Aspergi-
llus spp., Fusarium spp., Rhizopus spp., Pseudallescheria
boydii y Sporothrix schenkii. Sin embargo, no se ha logrado
que los modelos en animales reproduzcan la infección
humana, además de que la cinética de los fármacos es dife-
rente en humanos y animales.
Método de difusión en disco para levaduras
Se desarrollaron con el objetivo de que las pruebas fueran
menos laboriosas, más rápidas y económicas. El documen-
to en el que se consignan es el M44-A (2004). Contiene
información sobre la preparación y concentración de los
inóculos, medio de cultivo, condiciones de incubación,
requisitos de control de calidad y definición de lectura de
CIM para fluconazol y voriconazol.
Las concentraciones para fluconazol son: sensible, con
CIM ≥19 mm; sensible dependiendo de la dosis, con CIM
entre 15 y 18 mm, y resistentes, con CIM ≤14 mm de diá-
metro en la inhibición del crecimiento.
Para el voriconazol los resultados fueron los siguientes:
sensible, con una CIM ≥17 mm; sensibles dependiendo de
la dosis, con CIM de 14 a 16 mm, y resistentes, con CIM
≤13 mm de inhibición del crecimiento.
Prueba colorimétrica
Se basa en el uso de azul de Alamar para producir cambio
de color de azul a rojo, cuando se reduce en presencia de un
crecimiento microbiano. Las sales de tetrazolio pueden
cambiar de color cuando se reducen, y para detectarlo se
usa el espectrofotómetro.
La técnica de Heatley consiste en tomar una suspen-
sión homogénea que contenga dos millones de esporas,
levaduras o fragmentos de filamentos por milímetro, y dis-
tribuirla de manera uniforme en una caja de Petri que con-
tenga medio de Sabouraud. Se colocan en la superficie
pequeños discos de papel filtro previamente impregnados
durante 30 a 60 minutos con el medicamento por estudiar,
y secados a 37 °C. Cuando se desarrolla el hongo, se miden
las zonas de inhibición alrededor de los discos.
Las pruebas de contacto reproducen muy de cerca la
actividad antifúngica in vivo. Se colocan fragmentos o
pequeñas gotas de material anatomopatológico en una
laminilla que contenga concavidades; se cubre el material
con la solución antimicótica, y se mantiene el contacto 1 a
10 minutos. Se enjuaga dos veces con agua destilada y los
fragmentos se siembran en medio de Sabouraud. El control
se lleva a cabo con especímenes no procesados de esta
manera. Se incuban durante el tiempo necesario para el
crecimiento del hongo por estudiar. Una variante es colocar
en los tubos con los medios de cultivo la sustancia antimi-
cótica a diferentes concentraciones.
La prueba E (E test Biodisk®) se ha usado con bacterias,
es una banda impregnada con un gradiente definido del
el agar sembrado con el hongo por determinar. Si se presen-
ta zona de inhibición, se lee en la escala impresa en la cinta
lo que corresponde a la concentración del fármaco. Existen
dificultades para medir derivados azólicos. Quizá tal prue-
ba sea prometedora en la valoración de la CIM cuantitativa,
es similar a las pruebas de disco-difusión y está disponible
en el comercio.
Se preparan 4 a 5 tubos con 9 ml de agua estéril. Para el
primer tubo se calcula 1 g o 1 ml de sustrato, por ejemplo,
suelo. Se homogeneiza y se pasa 1 ml al segundo tubo, y así
sucesivamente; de los dos últimos tubos se toma 1 ml y se
vierte en cajas de Petri estériles, en éstas se vacían 20 ml de
agar-papa-dextrosa fundido y enfriado a 45 °C. En otras
dos, se pone rosa de Bengala en las mismas condiciones y se
homogeneiza por rotación sobre la mesa.
Para sustratos poco contaminados, se cortan en una
caja de Petri fragmentos pequeños del material problema y
se distribuyen sobre la superficie de otra caja con agar-
papa-dextrosa igual que la anterior, se deja solidificar y se
incuba a 28 °C. Para hongos del medio ambiente, se colocan
cajas de Petri con agar-papa-dextrosa y rosa de Bengala,
se destapan y exponen al ambiente durante 5 a 10 min, se
cubren y se observan a diario.
Aislamiento del hongo
El hongo patógeno debe aislarse de otros microorganismos.
Para las levaduras, se pueden agregar dos gotas de una mez-
cla de penicilina-estreptomicina (5 000 U/ml y 5 mg/ml) o
emplear medios que contengan cloranfenicol (500 mg/L).
En hongos filamentosos, deben eliminarse las bacterias
saprofitas al colocar la muestra antes de sembrarla en líqui-
do de Raulin, pues tiene pH ácido e inhibe bacterias; tam-
bién es posible ubicar la muestra en una solución con
antibióticos antibacterianos (penicilina-estreptomicina-
cloranfenicol) o situar dos tubos de la mezcla de antibióti-
cos en el medio de cultivo, pues éstos se difunden bien; para
muchos es más sencillo utilizar medios con antibióticos
termoestables (cloranfenicol).
Es más difícil eliminar hongos saprofitos de los culti-
vos; para lograrlo, es factible incubar a 30 a 37 °C (los hon-
gos saprofitos banales se desarrollan con mayor lentitud a
estas temperaturas); usan medios especiales para agentes
patógenos, con sangre o vitaminas, o simplemente emplear
medios con cicloheximida (Actidione).
Técnicas de aislamiento para líquidos,
sólidos y ambiente
Se usa una técnica de dilución y vaciado en placa para sus-
tratos líquidos o sólidos muy contaminados.
Identificación de los hongos
Al obtener el cultivo de un hongo se deben estudiar sus
características macroscópicas, microscópicas y fisiológicas

para definir el género y la especie; las cuales varían con el
medio de cultivo, la naturaleza de los azúcares, la pureza de
la peptona, el pH, el grado de humedad y la temperatura.
Por eso es preferible utilizar siempre medio glucosado de
Sabouraud para estudiar y comparar características están-
dar en las mismas condiciones de humedad y temperatura,
evitando contaminaciones.
Morfología macroscópica
Se deben estudiar las siguientes características:
• Forma y tamaño.
• Color en la superficie o en el reverso.
• Difusión del pigmento.
• Coloración: blanca, rosada, gris, anaranjada, verde, ro-
jiza, negra.
• Textura: yesosa, glabra, terrosa, granulosa, vellosa, la-
nosa, cérea, cremosa.
• Superficie: elevada o plana, levantamiento central
(agregaciones micelianas).
• Aspecto: plegado, radiado, cerebriforme, crateriforme.
• Consistencia: dura, suave, firme, membranosa.
• Rapidez de crecimiento: por ejemplo, las levaduras y
los agentes oportunistas crecen en 24 a 48 h, y los der-
matofitos en 5 a 10 días.
Morfología microscópica
Pueden utilizarse los métodos que siguen:
• Análisis a través del tubo. Se usa la lupa del micros-
copio, se observa el borde de crecimiento. Es un méto-
do poco preciso, pero rápido.
• Análisis de un fragmento del cultivo. Consiste en
tomar un fragmento de la colonia, dilacerarlo y obser-
varlo con azul de lactofenol. Es el método habitual,
pero puede destruir los aparatos esporíferos y dificultar
la identificación.
• Método de la cinta adhesiva transparente (Rush-
Munro). Es una variante de la técnica anterior y permi-
te observar las estructuras fúngicas casi sin alteración.
Se recorta un pequeño cuadrado de cinta y se adhiere a
la parte terminal del asa de platino, después se aplica la
parte adhesiva sobre la colonia y luego se coloca sobre
un portaobjetos con una gota de colorante y se retira el
asa, se añade otra gota de colorante, se pone un cu-
breobjetos y se observa al microscopio.
• Cultivo en lámina o microcultivo. Es el más preciso y
permite observar las estructuras fúngicas in situ. Consis-
te en obtener un cultivo sobre un portaobjetos y obser-
var el hongo sin deterioro de su morfología (figura 5-7).
En el estudio de los órganos fúngicos se deben estudiar:
• Talo: Filamentos o levaduras; grosor; bifurcaciones;
presencia o ausencia de tabiques (micelio tabicado o
cenocítico); color.
Capítulo 5 Diagnóstico de laboratorio 57
• Esporas asexuadas y aparato conidiógeno.
• Esporas sexuadas y estructuras donde se forman.
• Cualquier formación anexa (ornamentaciones) (figura
3-6).
Este estudio puede facilitarse utilizando contraste de
fase.
Preservación y conservación de cultivos
Los laboratorios de enseñanza e investigación deben almace-
nar una colección (stock) para disponer en el futuro de colo-
nias típicas y atípicas de los hongos patógenos, así como de
los agentes oportunistas. El objetivo de conservarlos es pre-
servar su viabilidad, sin degeneración, variación ni mutación.
Se pueden mantener en agar, transfiriendo de forma
periódica a medios frescos inclinados. Para hongos fila-
mentosos, es posible usar medio de Sabouraud simple,
agar-papa, extracto de malta, harina de maíz (corn meal),
y para levaduras, de preferencia medio de Sabouraud y
extracto de malta; en caso de la fase levaduriforme de hon-
gos dimorfos, se puede usar infusión de cerebro-corazón.
El método de agua destilada sirve para preservar más
de un año, y hasta en 10 años se obtienen esporas fértiles,
prácticamente sin cambios morfológicos ni fisiológicos. En
un pequeño frasco de cristal con tapón de rosca y revesti-
miento de caucho, se añaden 2 a 4 ml de agua destilada, se
esterilizan en autoclave y aquí se transfiere una parte de la
colonia sin exceso de agar; se enrosca con firmeza y se colo-
ca un trozo de parafilm alrededor de la tapa; se pueden con-
servar a temperatura ambiente y en la oscuridad. Es cómodo,
sencillo y económico.
La colonia se puede congelar en refrigeradores a menos
de 70 °C en agar o glicerol, se mantiene por más de un año; si
se obtiene un inóculo, se debe regresar de inmediato al con-
gelamiento. Congelado en nitrógeno líquido, se conserva has-
ta cinco años. Para el sellado con aceite, se cubre la cepa con
aceite mineral estéril (2 horas a 120 °C); esta técnica es simple,
económica y se prefiere para zigomicetos. Quizá la técnica
más conveniente es la de liofilización, pues permite conservar
hongos hasta por 30 y 40 años. Como los tubos permanecen
sellados, se elimina la posibilidad de contaminación.
Técnicas de microscopia alternativas
Contraste de fase
Se inserta un disco de cristal o placa de fase en la lente del
objetivo para retirar los rayos luminosos que difractan a tra-
vés de las estructuras fúngicas, resaltándolas con brillo de
fase. Es muy útil para visualizar las estructuras de reproduc-
ción con mejor definición y para excelentes microfotografías.
Campo oscuro
Se invierte el sistema óptico y se observa una imagen bri-
llante contra un fondo oscuro, lo cual permite precisar las
características de las paredes celulares.