Biomateriales 235 (2020) 119804

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Modi polimérico fi catión de gemcitabina a través de un enlace acetal cíclico para una
potencia anticancerígena mejorada con un lado e insignificante ff ects

Hiroyasu Takemoto ∗∗ , 1 , Takanori Inaba 1 , Takahiro Nomoto, Makoto Matsui, Xiaomeng Liu, Masahiro
Toyoda, Yuto Honda, Kaori Taniwaki, Naoki Yamada, Junhyun Kim, Keishiro Tomoda, Nobuhiro
Nishiyama ∗

Laboratorio de Química y Ciencias de la Vida, Instituto de Investigación Innovadora, Instituto de Tecnología de Tokio, R1-11, 4259, Nagatsuta, Midori-Ku, Yokohama,
Kanagawa, 226-8503, Japón

INFORMACIÓN DEL ARTÍCULO ABSTRACTO

Palabras clave: La gemcitabina (GEM) es un poderoso fármaco contra el cáncer para varios tipos de cáncer. Sin embargo, el anticancerígeno e ffi cacy y el
Polímeros lado e ff Los efectos deben abordarse para e ff Terapéutica eficaz. Con este fin, creamos un polímero conjugado con GEM (PGEM) basado en
Sistema de suministro de medicamento
un enlace acetal cíclico como portador de administración de GEM. El P-GEM obtenido conjugó establemente GEM a pH fisiológico (es
Gemcitabina
decir, torrente sanguíneo), pero liberó GEM en respuesta a ambientes ácidos tales como endosoma / lisosoma. Después de la
Lado e ff ects
administración sistémica de P-GEM para ratones con tumores subcutáneos, logró una circulación sanguínea prolongada y una mayor
sensibilidad al pH
acumulación de tumores en relación con el sistema GEM libre. Además, la estructura conjugada polímero-fármaco de P-GEM se dio
cuenta de e ff Distribución efectiva en los tejidos tumorales hacia la inducción de apoptosis en la mayoría de las áreas de los sitios
tumorales. Es de destacar que el diseño molecular de P-GEM logró una acumulación mínima en los tejidos normales, lo que resultó en un
efecto adverso derivado de GEM insignificante. ff efectos (p. ej., toxicidad gastrointestinal y hematotoxicidad). En última instancia, incluso
una dosis cuatro veces menor de P-GEM sobre una base de GEM logró una supresión del crecimiento tumoral comparable / mayor e ff ect
para dos modelos distintos de tumores pancreáticos, en comparación con el sistema GEM libre. Los resultados obtenidos sugieren el
enorme potencial del presente diseño de polímero conjugado con GEM para terapias contra el cáncer.

1. Introducción
La mayoría de los medicamentos contra el cáncer a base de nucleósidos ff ord el modi
quimico fi catión debido a los sitios de reacción en la estructura, dirigido hacia una mejora de la
producción farmacéutica fi les de las drogas [ 1 , 2 ]. De hecho, pirimidina modi fi catión para la
estabilidad de la sangre [ 3 - 6 ] y conjugación de lípidos para la e ff internalización efectiva por las
células cancerosas [ 6 - 8 ], y tal modi fi Se pueden realizar estrategias de cationes simultáneamente
para aumentar la potencia medicinal de los fármacos [ 6 , 9 ]. En particular, se han informado
muchos estudios sobre modificaciones químicas. fi catión de gemcitabina (GEM) debido a su
potencial superior como fármaco contra el cáncer para varios tipos de cánceres [ 6 , 9 ]. En este
sentido, el GEM tiene un tiempo de circulación sanguíneo corto similar al de la mayoría de los
fármacos de bajo peso molecular solubles en agua, y se dispersa en los tejidos normales, lo que a
su vez produce efectos secundarios graves. ff efectos como náuseas y mielosupresión [ 10 , 11 ].
Modi polimérico fi catión de GEM es una e ff enfoque efectivo para abordar los inconvenientes,
porque la conjugación con polímero biocompatible (por ejemplo, poli (etilenglicol) (PEG)) permite
interacción suprimida con tejidos normales [ 12 - 14 ], así como una circulación sanguínea
prolongada debido al aumento del peso molecular para evitar el rápido aclaramiento por
el riñón [ 15 - 17 ]. Además, la propiedad de circulación sanguínea prolongada de los
fármacos conjugados con polímeros que tienen un tamaño nanométrico conduce a e ff acumulación
efectiva en los tejidos tumorales a través de la vasculatura del tumor con fugas, para
mejorar la actividad anticancerígena [ 18 , 19 ]. Para el modi polimérico fi catión, el 4- ( NORTE)-
grupo amino en la estructura de pirimidina y el 5 ′ - El grupo hidroxilo en la estructura de
azúcar de GEM se ha empleado a menudo como un sitio de reacción para conjugar
polímeros mediante un enlace amida o éster [ 6 , 9 , 20 , 21 ].
El enlace químico que responde a di ambientales ff Las diferencias a través de
la membrana celular son esenciales para el diseño de un fármaco conjugado con
polímero. El enlace químico entre GEM y polímero debe ser estable en el torrente
sanguíneo, pero debe dividirse una vez dentro de las células cancerosas para e ff inducción
efectiva de la actividad medicinal de GEM. Con este fin, el resto ácido lábil
cumpliría fi ll la escisión selectiva en la célula. Los compuestos macromoleculares,
incluidos los polímeros sintéticos, son

∗ Autor correspondiente.
∗∗ Autor correspondiente.
Correos electrónicos: takemoto@res.titech.ac.jp (H. Takemoto), nishiyama.n.ad@m.titech.ac.jp (N. Nishiyama).
1 Estos autores contribuyeron igualmente.

https://doi.org/10.1016/j.biomaterials.2020.119804
Recibido el 22 de agosto de 2019; Recibido en forma revisada el 27 de diciembre de 2019; Aceptado el 20 de enero de 2020
On-line el 22 de enero de 2020
0142-9612 / © 2020 Elsevier Ltd. Todos los derechos reservados.
H. Takemoto y col.
Figura 1. Estructura química de P-GEM y la ilustración esquemática del presente estudio. P-GEM utilizado en este estudio consiste en α y β isómeros en el segmento de poliaspartamida
según se determina a partir de 1 Espectro de RMN H, pero solo el α isómero se representa en este fi gure por simplicidad.
internalizado por las células a través de endocitosis, seguido de exposición a un
ambiente ácido en el compartimento endosómico / lisosómico, lo que permite la
escisión eficaz de la fracción lábil al ácido en la célula [ 22 - 24 ].
Los restos de acetal se emplean comúnmente como grupos protectores
temporales para alcoholes en síntesis orgánica. El acetal se forma a través de
reacciones escalonadas de un grupo aldehído con dos restos hidroxilo [ 25 , 26 ]. A
este respecto, la estructura del azúcar de GEM comprende un resto 1,3-diol y, por
lo tanto, la reacción del grupo aldehído y GEM conduce potencialmente a la
formación de acetal cíclico (1,3-dioxano). Es importante destacar que el resto de
acetal es estable a pH fisiológico, pero la escisión mediante hidrólisis se facilita en
condiciones ácidas [ 25 - 27 ].
En el presente estudio, presentamos un nuevo diseño de GEM conjugado con
polímero para mejorar la actividad farmacológica de GEM. A pesar de los
numerosos informes sobre sistemas de administración de nanopartículas de GEM,
como micelas poliméricas y liposomas, aquí desarrollamos un conjugado simple
polímero-fármaco denominado P-GEM ( Figura 1 ). Suponemos que los conjugados
polímero-fármaco con tamaños más pequeños podrían penetrar en sitios más
profundos de los tejidos tumorales y lograr una distribución intratumoral más
homogénea, en relación con el sistema de nanopartículas; Se ha informado que
las nanopartículas quedan atrapadas en regiones perivasculares o tejidos
estromales en modelos tumorales clínicamente relevantes [ 28 , 29 ]. Tal penetración
tisular limitada de nanopartículas en los sitios del tumor puede ser uno de los
obstáculos hacia el éxito en la aplicación clínica [ 28 , 29 ]. En particular, el cáncer de
páncreas, que es el objetivo del presente estudio, construye tejidos ricos en
estroma y, por lo tanto, la ine ffi La penetración ciente de nanopartículas en sitios
más profundos de los tejidos tumorales suele ser un obstáculo para una terapia
anticancerosa eficaz [ 30 , 31 ]. De hecho, recientemente informamos que, a
diferencia de Doxil (doxorrubicina de carga de liposomas PEGilados), PEG- B- grupos
de boro (BSH) con poli (aminoácidos) como un simple conjugado
polímero-fármaco lograron distribuciones intratumorales homogéneas en
modelos de tumores pancreáticos caracterizados por hipovascularidad y densidad fi-
brosis [ 32 ]. El P-GEM desarrollado recientemente en este estudio está compuesto por un
copolímero de bloque de poli (aminoácido) para conjugar múltiples moléculas de
fármaco en la cadena lateral y PEG para mejorar la solubilidad y las propiedades
farmacocinéticas ( Figura 1 ). Tenga en cuenta que los derivados de poli (aminoácidos)
tienen una excelente biocompatibilidad y algunos de ellos se encuentran en ensayos
clínicos como portadores de fármacos para la terapia contra el cáncer; la cadena lateral
de poli (aminoácido) puede modificarse químicamente fi ed para la capacidad de carga de
medicamentos optimizada [ 33 - 35 ]. Para la conjugación del fármaco, se introdujeron
moléculas GEM a través de un enlace 1,3-dioxano a las cadenas laterales del poli
(aminoácido). P-GEM podría evitar la agregación en el torrente sanguíneo y la interacción
con tejidos normales debido a la presencia de PEG, y la
2
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La estabilidad del enlace 1,3-dioxano a pH fisiológico minimizó la fuga de GEM
durante la circulación sanguínea. P-GEM logró una circulación sanguínea
prolongada y una mayor acumulación de tumores en relación con el sistema GEM
libre. Es importante destacar que P-GEM penetró con éxito en áreas más
profundas de los tejidos tumorales, lo que resultó en una notable actividad
antitumoral para dos modelos distintos de tumores pancreáticos. Además, el
sistema P-GEM suprimió con éxito el lado principal e ff efectos de GEM (es decir,
toxicidad gastrointestinal y mielosupresión).
2. Materiales y métodos
2.1. Materiales
NORTE- Carboxianhídrido de β- bencilo L- aspartato (BLA-NCA) fue purificado
perseguido de Chuo Kaseihin Co., Inc. (Tokio, Japón). MeO-PEG-NH 2
se compró a NOF Co., Inc. (Tokio, Japón). Aminoacetaldehído
El dimetilacetal se adquirió en Tokyo Chemical Industry Co., Ltd. (Tokio, Japón). El
clorhidrato de gemcitabina se adquirió de Combi-Blocks, Inc. (San Diego, CA, EE.
UU.). pag- Ácido toluenosulfónico monohidrato (pTSA), N, N- dimetilformamida,
diclorometano, di-
sulfóxido de metilo D 6 ( DMSO - D 6), acetato de sodio, ácido acético, solución de ácido
clorhídrico (5 M), solución de hidróxido de sodio (5 M), solución de sodio
carbonato de hidrógeno, NORTE- metil-2-pirrolidona (NMP), D-PBS ( -), paraformaldehído,
lemosol, disulfuro de sodio fi te, hidrogenofosfato de disodio, dihidrogenofosfato
de sodio y tiocianato de amonio se adquirieron de Wako Pure Chemical Industries,
Ltd. (Osaka, Japón). N, N- Se destilaron dimetilformamida (DMF), éter dietílico y
diclorometano (DCM) con los métodos convencionales antes de su uso. Bromuro
de litio, cloruro de sodio, medio 1640 de Roswell Park Memorial Institute (RPMI
1640), Dulbecco's Modi fi ed Eagle's Medium (DMEM) y la solución de tripsina-EDTA
se adquirieron de Sigma Aldrich (St. Louis, MO, EE. UU.). Ácido 4- (2-hidroxietil)
-1-piperazinetanosulfónico), ácido 2-morfolinoetanosulfónico monohidrato y Cell
Counting Kit-8 se adquirieron en DOJINDO LABORATORIES, Ltd. (Kumamoto,
Japón). El suero fetal bovino (FBS) se adquirió de Biosera Inc. (Manila, Filipinas).
Cy5-NHS se adquirió de Lumiprobe Corp. (Hunt Valley, MD, EE. UU.). La solución
salina se adquirió de Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd. (Tokio, Japón). La solución de
Hemalum de Mayer y la solución de eosina se adquirieron de MUTO PURE
CHEMICALS Co., Ltd. (Tokio, Japón). Drysol se adquirió de KANTO CHEMICAL Co.,
Inc. (Tokio, Japón). Yodo-125 ( 125 I) el radionúclido se adquirió de PerkinElmer Co.,
Ltd.
H. Takemoto y col.
(Waltham, MA, Estados Unidos). La cloramina-T se adquirió de Nacalai Tesque, Inc.
(Kyoto, Japón).
2.2. Células y animales
La línea celular BxPC-3 (cáncer de páncreas humano) y la línea celular MIA
PaCa-2 (cáncer de páncreas humano) se obtuvieron de la American Type Culture
Collection (Manassas, VA, EE. UU.). Se adquirieron ratones BALB / c y ratones
desnudos BALB / c (hembras; 4 semanas de edad) de Charles River Laboratories
Japan, Inc. (Yokohama, Japón). Todos los experimentos con animales se llevaron a
cabo de acuerdo con las políticas del Comité de Ética Animal del Instituto de
Tecnología de Tokio.
2.3. Síntesis de PEG-b-poly ( β- bencilo L- aspartato) (PEG-PBLA)
Un copolímero de bloque de PEG y poli ( β- bencilo L- aspartato) (PEGPBLA) se
sintetizó de acuerdo con Esquema complementario S1 . queso Brie fl y, 720 mg de NORTE-
0,75 ml / min). Se midió la intensidad máxima de la GEM liberada (absorbancia UV
Se disolvió carboxianhídrido de BLA (BLA-NCA) en 10 ml de DMF. La solución se
mezcló con 40 mL de DCM que contenía
600 mg de MeO-PEG-NH 2 ( peso molecular: 10.000), seguido de agitación a 35 ° C
para polimerizar BLA-NCA. Después de 2 días, la reacción
La mezcla se vertió en una cantidad en exceso de éter dietílico y el precipitado se fi Se
filtró y se secó al vacío para obtener PEG-PBLA como un polvo blanco (1,02 g, 84%
de rendimiento). El producto se analizó mediante cromatografía de exclusión por
tamaño (SEC) para evaluar la polidispersidad usando columnas de gel TSK
(columna: SuperAW4000 y SuperAW3000 x 2; eluyente: NMP con LiBr 10 mM; fl caudal: (dimetil acetal) en 2 ml de DCM, seguido de una adición de Cy5-NHS (1,2 eq. a
0,3 ml / min; temperatura: 40 ° C) y un detector de índice de refracción interno (RI).
El 1 H NMR
espectro usando DMSO - D 6 se registró con un Bruker BioSpin AVANCE III 400 MHz
(Bruker, Billerica, MA, EE. UU.). El PEG-PBLA obtenido fue
determinado a partir de la relación de intensidad máxima de los protones de oxietileno
(-(JEFE H 2 C H 2) -, 3,5 ppm) de la cadena PEG a los protones del grupo bencilo
(C 6 H 5 C H 2-, δ = 5.1 y 7.3 ppm) de la cadena lateral ( Fig. Suplementaria S1 ).
2.4. Síntesis de PEG-b-poli [N- (2,2-dimetoxietil) aspartamida] [PEGPAsp (dimetil
acetal)]
CLAVIJA- B- poli [ NORTE-( 2,2-dimetoxietil) aspartamida] [PEG-PAsp (di-
acetal de metilo)] se sintetizó de acuerdo con Esquema complementario S2 . queso
Brie fl y, se disolvieron 500 mg de PEG-PBLA en 8 ml de NMP. A la solución, se le
añadieron 6.080 mg de aminoacetaldehído dimetil acetal (50 eq. Al grupo bencilo
en PEG-PBLA), seguido de agitación durante la noche a temperatura ambiente. La
solución de reacción se vertió en una cantidad en exceso de éter dietílico y el
precipitado se fi Se filtró y se secó al vacío para obtener PEG-PAsp (dimetil acetal)
como un polvo blanco (457 mg, 92% de rendimiento). La conversión cuantitativa
de PEG-PBLA en PEG-
PAsp (dimetil acetal) se con fi rmed por 1 H RMN en DMSO - D 6 de la relación de
intensidad máxima de los protones de los protones de oxietileno
(-(JEFE H 2 C H 2) -, 3,5 ppm) de la cadena de PEG a los protones de metoxi
grupo (C H 3 O-, δ = 3,25 ppm) en la cadena lateral ( Fig. Suplementaria S2 ).
2.5. Síntesis de polímero conjugado con gemcitabina (P-GEM)
El polímero conjugado con gemcitabina (P-GEM) se sintetizó de acuerdo con Esquema
complementario S2 . Aquí, el contenido de GEM objetivo por polímero se estableció
como 10% en peso, con el fin de mantener la buena solubilidad del producto en
condición acuosa. queso Brie fl y, se disolvieron 200 mg de PEG-PAsp (dimetil
acetal) en NMP. A la solución, se le añadieron 1,4 g de hidrocloruro de gemcitabina
(10 eq. Al resto dimetilacetal) y 90 mg de pTSA (1 eq. Al resto dimetilacetal),
seguido de agitación durante la noche a 50ºC. La solución de reacción se vertió
gota a gota en
exceso de NaHCO 100 mM 3 (aq) en hielo para neutralizar el pTSA. Luego, la solución
obtenida fue puri fi ed por ultra fi filtración (Amicon Ultra,
corte de peso molecular o ff = 3.000, Merck Millipore, Burlington, MA,
3
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EE. UU.) Para eliminar el disolvente orgánico, la gemcitabina sin reaccionar, el pTSA y
NaHCO 3. El puri fi La solución ed se liofilizó para obtener P-GEM como un polvo
incoloro (187 mg, 88% de rendimiento). La proporción de introducción de GEM
fue calculado por 1 Análisis de H NMR usando DMSO - D 6 desde el pico en
relación de tensión de los protones de los protones de oxietileno (- (OC H 2 C H 2) -,
3,5 ppm) de la cadena PEG a los protones de gemcitabina (H-1 ', H-5 y
H-6, δ = 5.8 - 7,4 ppm) en la cadena lateral ( Fig. Suplementaria S3 ).
2.6. Ensayo de liberación de GEM para P-GEM
Se disolvió P-GEM en acetato de sodio 50 mM bu ff er (pH 4.2), 50 mM MES bu ff er
(pH 5,5), o HEPES bu 50 mM ff er (pH 7,4) a una concentración de 1 mg / mL,
seguido de incubación a 37 ° C durante 1, 3, 4,
6, 12, 24 y 72 h. Las soluciones incubadas se analizaron mediante cromatografía
de exclusión por tamaño (columna: Superdex 200 (GE Healthcare, Boston, MA, EE.
UU.); Eluyente: HEPES 50 mM NaCl 150 mM (pH 7,4); temperatura: 35ºC; fl caudal:
a 271 nm) para calcular la relación de liberación de GEM de P-GEM usando una
curva estándar de GEM.
2.7. Análisis de tamaño de P-GEM
El análisis de tamaño de P-GEM fue realizado por fl espectroscopia de
correlación de fluorescencia (FCS). Antes del análisis de FCS, se preparó P-GEM
(Cy5-PGEM) marcado con Cy5. queso Brie fl y, se disolvieron 10 mg de PEG-PAsp
PEG-PAsp (dimetil acetal)) y una cantidad catalítica de trietilamina. Después de
agitar durante la noche a temperatura ambiente, la solución de reacción se dializó
contra metanol y agua desionizada (corte de peso molecular o ff: 3500) y se liofilizó
para obtener PEG-PAsp (dimetil acetal) marcado con Cy5. Luego, el producto se
convirtió en Cy5-P-GEM de manera similar al método descrito en la sección 2.5 ,
para obtener un polvo azul (7,5 mg, rendimiento del 71%).
El análisis de FCS se realizó utilizando microscopía de barrido láser confocal
(LSM710, Carl Zeiss, Oberkochen, Alemania) equipada con un módulo Confocor3 y
un objetivo de inmersión en agua Zeiss C-Apochromat 40 ×. Él - Se utilizó láser Ne
(633 nm) para la excitación de Cy5 y la emisión se detectó mediante una ruta de
banda de 667 nm fi ltro. Cy5-P-GEM (0.02 mg / mL) en PBS (pH 7.4) con / sin FBS
(10%, 30%, 50%, 70% y 90%) se colocaron en un cubreobjetos de borosilicato de 8
pocillos . Las curvas de autocorrelación obtenidas de 10 mediciones en un tiempo
de muestreo de 10 s fueron fi tted con el software Zeiss Confocor3 para producir di ff
tiempo de uso. Di ff coeficiente de uso ffi ciente para las muestras se calculó a partir
de la di obtenida ff tiempo de uso, basado en el valor de Cy5COOH como
referencia. El di ff coeficiente de uso ffi cient se convirtió en tamaño hidrodinámico
basado en la ecuación de Stokes-Einstein. De manera similar, se midió el tamaño
de Cy5-P-GEM (0,0001 mg / mL) en presencia de P-GEM (las concentraciones
totales de polímero fueron 0,0001 mg / mL,
0,001 mg / mL, 0,01 mg / mL, 0,1 mg / mL, 1 mg / mL y 10 mg / mL) para analizar la
relación entre el tamaño y la concentración. Los resultados se expresaron como
media y desviación estándar obtenidas de diez mediciones.
2.8. Ensayo de viabilidad celular para células cultivadas
Se sembraron células BxPC-3 en placas de 96 pocillos (2500 células / pocillo)
en RPMI 1640 que contenía FBS al 10% y se incubaron durante 24 h. Las células se
trataron con GEM libre o P-GEM a concentraciones de 100 μ M, 10 μ M, 1 μ M, 100
nM, 10 nM, 5 nM, 2,5 nM, 1,25 nM y 0,625 nM sobre una base de GEM durante 3
días. La viabilidad celular se midió usando Cell Counting Kit-8 (Dojindo,
Kumamoto, Japón), de acuerdo con el protocolo del fabricante. La absorbancia
para cada pocillo a 450 nm se midió usando un lector de microplacas (iMark,
BIO-RAD). La viabilidad celular se determinó como un porcentaje de la
absorbancia de las células no tratadas. De manera similar, la viabilidad celular tres
días después del tratamiento con P-GEM o PEG-PAsp (dimetil acetal) a las
concentraciones de
H. Takemoto y col.
166 nM, 16,6 nM, 8,3 nM, 4,15 nM, 2,075 nM, 1,0375 nM,
Se analizó 0,051875 nM de polímeros. Los resultados se expresaron como la media
y el error estándar de la media obtenida de seis muestras.
2.9. Análisis microscópico de escaneo láser confocal para las células tratadas con
P-GEM
Se sembraron células BxPC-3 en una placa de vidrio de 35 mm (Iwaki, Tokio,
Japón) a una densidad de 10.000 células / ml en RPMI 1640 que contenía FBS al
10% seguido de una incubación de 24 h. El medio antiguo se reemplazó con medio
fresco y Cy5-P-GEM y FITC-PEG (peso molecular:
20.000) se agregaron a fi concentración final de 0.05 mg / mL. Después de la
incubación durante 24 h, las células se lavaron con PBS tres veces. El núcleo de las
células se tiñó con Hoechst 33,342 (Dojindo, Kumamoto, Japón) y luego se observó
con un microscopio de barrido láser confocal (CLSM) utilizando LSM710 (Carl Zeiss,
Oberkochen, Alemania) equipado con un objetivo de inmersión en aceite
Plan-Apochromat 40x ( apertura numérica: 1,4). Las longitudes de onda de
excitación fueron 405 nm para Hoechst 33,342 (banda de emisión: 420 - 470 nm),
488 nm para FITC-PEG (banda de emisión: 500 - 550 nm) y 633 nm para Cy5-P-GEM
(banda de emisión: 650 - 760 nm).
2.10. Análisis de citometría de flujo para las células tratadas con P-GEM
Se sembraron células BxPC-3 en placas de 24 pocillos (20.000 células / pocillo)
en RPMI 1640 que contenía FBS al 10% y se incubaron durante 24 h. El medio
antiguo se reemplazó con medio nuevo y se añadió Cy5-P-GEM a
fi concentraciones finales de 0.01 mg / mL, 0.05 mg / mL y 0.08 mg / mL. Después
de la incubación durante 2, 4, 10 y 24 h, las células se lavaron con PBS tres veces.
Las células se tripsinizaron y Cy5 fl La intensidad de la fluorescencia de las células
recolectadas se midió mediante fl citometría de flujo con un Guava easyCyte 6-2 L
(Merck Millipore, Alemania). Los resultados representan la media con desviación
estándar obtenida de tres muestras.
2.11. Radiomarcaje de GEM y P-GEM libres con 125 I
La estructura de pirimidina de GEM libre y P-GEM se marcó con 125 Yo según el
método informado [ 36 ]. Se disolvió Free GEM o P-GEM (1 mg / mL y 10 mg / mL,
respectivamente) en 0,01 M de fosfato bu ff er (pH 7,4). 5 μ L de 125 Yo solucion y 75 μ SePOD, Roche, Basilea, Suiza) para la sección de tejido obtenida de acuerdo con el
mezclaron L de solución de cloramina T (10 mg / mL) con 100 μ L de solución libre
de GEM o P-GEM, seguido de una incubación durante 1 ha temperatura ambiente.
Entonces, 100 μ L de
metabisulfito de sodio (Na 2 S 2 O 5) Se añadió una solución (20 mg / ml) a las
soluciones de reacción para detener la reacción. P-GEM radiomarcado
( 125 I - P-GEM) fue puri fi editado por la columna PD-10 (GE Healthcare, Boston, MA,
EE. UU.) para eliminar 125 I.Para GEM libre radiomarcada ( 125 IGEM), gel de
intercambio aniónico (DEAE Sephadex ™ A-50, GE Healthcare, Boston, MA, EE. UU.)
Se utilizó eliminar sin reaccionar 125 I.
2.12. Biodistribución de GEM y P-GEM libres para ratones portadores de
tumores subcutáneos
Se inocularon células BxPC-3 por vía subcutánea en el lado derecho fl ank de
ratones desnudos BALB / c (hembras, 6 semanas de edad) a 5 × 10 6 células por
ratón. El volumen tumoral se calculó mediante la ecuación de ab 2 / 2, donde
" a "es el diámetro más grande y " B " es el diámetro más pequeño. Cuando el
volumen del tumor alcanzó los 100 mm 3, 200 μ L de 125 I-GEM o 125 I - Se inyectó por
vía intravenosa solución de P-GEM en solución salina en la vena de la cola (80 mg /
kg y 20 mg / kg, respectivamente, sobre una base de GEM). Después de 30 min, 2
h, 6 hy 24 h, los ratones se sacrificaron fi ced y se recolectaron su sangre, órganos y
tejidos tumorales. Radiactividad de 125 I para cada muestra se midió por
γ- contador para calcular la abundancia de 125 I-GEM o 125 I - P-GEM. Los resultados
representan la media con error estándar de la media obtenida de fi cinco muestras.
De manera similar, se investigó la biodistribución de Cy5-P-GEM basándose en
fl fluorescencia. Cy5-P-GEM (200 μ L, 20 mg / kg sobre una base GEM)
4
Biomateriales 235 (2020) 119804
se inyectó en ratones portadores de tumor BxPC-3 subcutáneo (tamaño = 100 mm 3).
Después de 30 min, 2 h, 6 hy 24 h, se sacrificaron los ratones.
fi ced y se recolectaron su sangre, órganos y tejidos tumorales. Los tumores y
órganos se mezclaron con Passive Lysis Bu ff er (Promega Corporation, Madison,
WI, EE. UU.) y se homogeneizó usando un shocker de perlas múltiples (Yasui Kikai
Corporation, Osaka, Japón). El suero se extrajo de la sangre recolectada después
de una centrifugación y se mezcló con lisis bu ff er. El sobrenadante de las
soluciones homogeneizadas después de una centrifugación, así como la mezcla de
suero, se transfirieron a placas negras de 96 pocillos (Thermo Fisher Scienti fi c, Inc.
Waltham, MA, EE. UU.) y el
fl La fluorescencia de Cy5 fue cuanti fi ed utilizando un lector de microplacas (Spark,
TECAN, Zürich, Suiza) (Ex / Em = 640/685 nm). Los resultados representan la media
con error estándar de la media obtenida de fi cinco muestras.
2.13. Ensayo de inhibición del crecimiento tumoral para ratones portadores de tumores subcutáneos
Se inocularon células BxPC-3 por vía subcutánea en el lado derecho fl ank de
ratones desnudos BALB / c (hembras, 6 semanas de edad) a 5 × 10 6 células por
ratón. Cuando el volumen del tumor alcanzó los 50 mm 3, Se inyectó por vía
intravenosa GEM libre en solución salina en la vena de la cola (80 mg / kg) cada
tres días durante cuatro veces. Asimismo, se inyectaron solución salina y P-GEM
(10 mg / kg y 20 mg / kg en base a GEM) en los ratones portadores de tumores. El
tamaño del tumor y el peso corporal de los ratones se midieron cada tres días
durante 18 días. De manera similar, se prepararon ratones que portaban tumores
subcutáneos (MIA PaCa-2) y se trataron con solución salina, GEM libre y P-GEM.
Los resultados representan la media con error estándar de la media obtenida de fi cinco
muestras.
2.14. Ensayo TUNEL
Se inocularon células BxPC-3 por vía subcutánea en el lado derecho fl ank de
ratones desnudos BALB / c (hembras, 6 semanas de edad) a 5 × 10 6 células por
ratón. Cuando el volumen del tumor alcanzó los 100 mm 3, Se inyectaron
intravenosamente GEM, P-GEM y solución salina libres de una manera similar al
ensayo de inhibición del crecimiento tumoral. Un día después de la segunda
inyección, se recogió el tejido tumoral y la sección congelada (espesor = 4 μ m)
estaba preparado. Se realizó el ensayo TUNEL (In Situ Cell Death Detection Kit
protocolo del fabricante. Las muestras teñidas se fotografiaron con un
microscopio (BZ-X710, KEYENCE, Osaka, Japón).
2.15. Imágenes fluorescentes de tejido tumoral
Se inocularon células BxPC-3 por vía subcutánea en el lado derecho fl ank de
ratones desnudos BALB / c (hembras, 6 semanas de edad) a 5 × 10 6 células por
ratón. Cuando el volumen del tumor alcanzó los 100 mm 3, 200 μ Se inyectaron por
vía intravenosa L de la solución que contenía Cy5-P-GEM (1 mg / mL) y Doxil (4 mg
/ mL basado en doxorrubicina) en la vena de la cola. Después de 24 h, 50 μ L de
anticuerpo anti-CD31 de ratón marcado con eFluor450 (Thermo Fisher Scienti fi c,
Inc) se inyectó por vía intravenosa para visualizar los vasos sanguíneos. Después
de 30 min, el ratón fue sacri fi Se recogió tejido tumoral y ced. El tejido tumoral se
diseccionó y se observó utilizando LSM710 equipado con un objetivo de inmersión
en aceite Plan-Apochromat 40x (apertura numérica: 1,4). Las longitudes de onda
de excitación fueron 405 nm para eFluor450 (banda de emisión: 420 - 480 nm), 488
nm para Doxil (banda de emisión: 500 - 550 nm) y 633 nm para Cy5-P-GEM (banda
de emisión: 650 - 760 nm).
2.16. Ensayo de ingesta de alimentos
Solución gratuita de GEM o P-GEM en solución salina se inyectó por vía intravenosa
en ratones Balb / c (20 mg / kg sobre una base GEM) todos los días durante tres veces.
Como control, se preparó un grupo tratado con solución salina. La cantidad de alimentos
consumidos se midió tres días después de la fi primera inyección. Además, se midió el
peso corporal de los ratones todos los días durante tres días. El
H. Takemoto y col.
Figura 2. Relación de liberación de GEM de P-GEM después de la incubación durante los períodos
indicados a pH 7,4, 5,5 y 4,2.
Los resultados representan la media con error estándar de la media obtenida de fi cincoacuosas.
muestras.
2.17. Análisis histológico del duodeno.
Se inyectaron por vía intravenosa GEM y P-GEM libres en los ratones Balb / c de una
manera similar al experimento para el ensayo de ingesta de alimentos. Como control,
también se preparó un grupo tratado con solución salina. Tres días después de la
fi primera inyección, los ratones fueron sacrificados fi ced, y se recogió su duodeno.
Las muestras recolectadas fueron fi fijado en una solución de paraformaldehído al
4% durante la noche y luego incrustado en para ffi norte. El para ffi n secciones (4 μ m
de espesor) se tiñeron con hematoxilina-eosina (tinción H&E). Las muestras
teñidas se fotografiaron con un microscopio (BZ-X710). Se midió la longitud de las
vellosidades. Los resultados representan la media con error estándar de la media
obtenida de tres muestras (se midieron 50 vellosidades para cada muestra).
2.18. Análisis de componentes sanguíneos
Se inyectaron por vía intravenosa GEM y P-GEM libres en los ratones Balb / c de una
manera similar al experimento para el ensayo de ingesta de alimentos. Como control,
también se preparó un grupo tratado con solución salina. Tres días después de la
fi primera inyección, los ratones fueron sacrificados fi ced, y se recogió su sangre.
Las muestras recolectadas se aplicaron para el servicio subcontratado de
evaluación hematológica (Oriental Yeast Co., Ltd., Tokio, Japón), con el fin de medir
las concentraciones de glóbulos blancos (neutrófilos, eosinófilos, basófilos,
linfocitos y monocitos), hematíes células, nitrógeno ureico en sangre y creatinina.
Los resultados representan la media con error estándar de la media obtenida de fi cincorelación con el sistema GEM libre, puede explicarse por la tasa de liberación de
muestras.
3. Resultados
3.1. Síntesis de P-GEM
Se siguió la síntesis de polímero conjugado con GEM (P-GEM).
Esquemas complementarios S1 y S2 . El PEG-PBLA obtenido tenía un
polidispersidad estrecha METRO w / METRO norte: 1,15), con un grado de polimerización de 44 (= 220
(números de protones integrados a 7,3 ppm) / 5 (protones
números por resto aromático en la cadena lateral)) para la unidad BLA de acuerdo
con 1 Análisis de H NMR ( Fig. Suplementaria S1 ). Luego, el PEG-PBLA se transformó
en el precursor de P-GEM mediante la reacción de aminólisis de
aminoacetaldehído dimetil acetal con grupos bencilo en las cadenas laterales de
PBLA para introducir el resto dimetilacetal [PEG-PAsp (dimetil acetal)] ( Fig.
Suplementaria S2 ). Finalmente, se realizó la reacción de transacetalización entre el
resto dimetilacetal y el grupo 1,3-diol en GEM para la conjugación de GEM en
cadenas laterales de PEG-PAsp (dimetilacetal) mediante un enlace acetal cíclico
(resto 1,3-dioxano). El polímero conjugado con GEM obtenido (P-GEM) tenía aprox.
7 moléculas de GEM por polímero, lo que corresponde a un contenido de GEM de
aprox. 10% en peso, según
Biomateriales 235 (2020) 119804
para 1 Análisis de H NMR ( Fig. Suplementaria S3 ).
3.2. Análisis de tamaño de P-GEM
El tamaño hidrodinámico de P-GEM en condiciones fisiológicas con / sin
proteínas séricas fue analizado por fl espectroscopia de correlación de
fluorescencia (FCS). Antes del análisis de FCS, se preparó P-GEM marcado con Cy5
en el extremo (Cy5-P-GEM). El tamaño de Cy5-P-GEM fue
9,90 ± 0,97 nm en fosfato bu ff solución salina (PBS), y se observó un tamaño similar
independientemente del aumento de la concentración de FBS hasta el 90% ( Fig.
Suplementaria S4 ). Por tanto, P-GEM no se agregó y mantuvo su tamaño original
en presencia de componentes sanguíneos (p. Ej., Lípidos y proteínas).
El análisis de tamaño de P-GEM se realizó además en las diversas
concentraciones (0,0001 mg / mL a 10 mg / mL) ( Fig. Suplementaria S5 ). Como
resultado, el tamaño se mantuvo en aprox. 10 nm, lo que sugiere la estructura
hidrófila de P-GEM; por lo tanto, P-GEM existiría sin agregación en condiciones
3.3. Liberación de GEM para P-GEM en respuesta al pH ácido
Se investigó la liberación de GEM de P-GEM en respuesta al estado
intracelular. En general, los compuestos macromoleculares que incluyen PGEM
pueden ser captados por las células mediante endocitosis, seguida de exposición a
pH luminal ácido en el endosoma / lisosoma. Por lo tanto, se incubó P-GEM con un
pH fisiológico de 7,4 [ 37 , 38 ] así como pH endosomal 5.5 [ 37 , 38 ] y pH lisosomal 4,2
[ 37 , 38 ] a 37 ° C, y las soluciones incubadas se analizaron mediante cromatografía
de exclusión por tamaño para medir la cantidad liberada de GEM ( Figura 2 ). La
incubación de P-GEM a pH 5,5 mostró una liberación de GEM dependiente del
tiempo, y la velocidad de liberación se aceleró mediante la incubación a pH 4,2; las
proporciones de liberación de GEM fueron
14,7% y 33,3% a las 72 h para pH 5,5 y pH 4,2, respectivamente. Por el contrario, la
incubación con pH 7,4 desaceleró la liberación de GEM (la relación de liberación
fue del 5,3% a las 72 h).
3.4. Citotoxicidad para las células cultivadas
La citotoxicidad de P-GEM fue con fi rmed para células cultivadas. Se aplicaron
Free GEM y P-GEM para cultivos de células de cáncer de páncreas (células BxPC3) y
se analizó la viabilidad celular después de 72 h ( Fig. Suplementaria S6a ). Aunque
ambos sistemas mostraron citotoxicidad dependiente de la concentración, la
concentración para inducir la viabilidad celular del 50% fue menor para GEM libre
(aproximadamente 1,0 nM) que para P-GEM (aproximadamente 74,9 nM en base a
GEM). La citotoxicidad más baja para las células cultivadas en el sistema P-GEM, en
GEM en el sistema P-GEM; El 33,3% de GEM se liberó de P-GEM 72 h después de la
incubación en condición lisosomal (pH 4,2, 37 ° C) ( Figura 2 ), posiblemente
conduciendo a la aparente disminución de la citotoxicidad para las células
cultivadas. El sistema PEG-PAsp (dimetil acetal) mostró menor citotoxicidad que el
sistema P-GEM, con fi Confirmando que GEM en las cadenas laterales de P-GEM
juega un papel crítico para la citotoxicidad ( Fig. Suplementaria S6b ).
3.5. Análisis de captación celular de Cy5-P-GEM
La captación celular de Cy5-P-GEM fue con fi rmed para células BxPC3
cultivadas usando fl citometría de flujo Fig. Complementaria S7 ). La señal de
fluorescencia por célula se incrementó según el período de incubación y la
concentración de Cy5-P-GEM. Con el fin de investigar más a fondo los fenómenos
de captación celular, se observó la distribución intracelular de Cy5-P-GEM
mediante microscopía de barrido láser confocal. Aquí, Cy5-PGEM, FITC-PEG para
teñir endosomas y núcleos teñidos con Hoechst 33342 se visualizaron como rojo,
verde y azul, respectivamente ( Fig. Suplementaria S8 ). La residencia de píxeles
rojos en la celda indica la captación celular de P-GEM. Además, los píxeles rojos se
colocalizaron con píxeles verdes para mostrar píxeles amarillos, lo que sugiere la
endocitosis de P-GEM, como se observa a menudo para otros macromoleculares.
5
H. Takemoto y col. Biomateriales 235 (2020) 119804

Fig. 3. Abundancia de GEM después de la administración sistémica de GEM libre y P-GEM en sangre (a), excrementos (b) y tejidos tumorales (c) en los puntos de tiempo indicados. Los
resultados representan la media con error estándar de la media obtenida de fi cinco muestras.

compuestos [ 39 - 41 ]. a las 24 h) ( Figura 4 a). Mientras tanto, signi fi se detectó acumulación de canto de
P-GEM en el riñón; Se observó un 15,7% de DI / g de tejido a los 30 min, pero el
valor disminuyó a las 24 h (10,2% de DI / g de tejido) ( Figura 4 B). Tenga en cuenta
3.6. Biodistribución de GEM y P-GEM libres
que una cantidad apreciable de 125 No se detectó I-GEM para órganos relacionados
con el sistema reticuloendotelial (RES) (p. Ej., Hígado y bazo) para ambos sistemas
A continuación, se investigó la biodistribución de GEM y P-GEM libres en
GEM libre y P-GEM. Para la acumulación en tejidos tumorales, el sistema P-GEM
ratones que portaban tumores subcutáneos (BxPC3). En este documento, la
exhibió 2.6% de DI / g de tejido a las 2 h, que fue 2.4 veces mayor que el sistema
estructura de pirimidina de GEM se marcó radiactivamente con 125 Yo por el
GEM libre (1.1% de DI / g de tejido) ( Fig. 3 C). El mayor nivel de acumulación en
método de cloramina-T [ 36 ]. Después de la inyección intravenosa del GEM libre
tejidos tumorales para el sistema PGEM (0,9% de DI / g de tejido), en relación con
radiomarcado ( 125 IGEM) y P-GEM ( 125 I - P-GEM), se evaluó su cantidad en sangre,
el sistema GEM libre (0,3% de DI / g de tejido), todavía se observó 24 h después de
órganos, tumores y excrementos en los puntos de tiempo indicados mediante la
la administración.
medición de la radiactividad para 125 Yo de las muestras recolectadas ( Higos. 3 y 4 ).
La biodistribución de P-GEM se examinó adicionalmente usando Cy5-P-GEM. Tenga
El sistema P-GEM exhibió 21,9% de la dosis inyectada / mL de sangre (% de DI / mL
en cuenta que el tinte Cy5 se conjugó con la cadena del polímero y, por lo tanto, el
de sangre) para sangre a los 30 min, y el valor se redujo para ser
resultado obtenido mostró la residencia de la cadena principal del polímero en los
1,2% de DI / mL de sangre a las 24 h, mientras que el valor para el sistema GEM
órganos ( Fig. Suplementaria S9 ). Como resultado, el comportamiento de la circulación
libre fue de 8,6% de DI / mL de sangre a los 30 min ( Fig. 3 a). De acuerdo con el
sanguínea fue comparable entre 125 Sistema I y sistema Cy5, lo que demuestra aún más el
hecho de que la eliminación del torrente sanguíneo fue más rápida para GEM libre
enlace estable del resto acetal cíclico en la estructura P-GEM. Es de destacar que el
en comparación con PGEM, la excreción del cuerpo, que fue evaluada por la
comportamiento de acumulación de órganos mostró una di ff tendencia actual para el
radiactividad de 125 Yo de excrementos, también era más rápido para GEM gratis ( Fig.
bazo y el hígado en relación con 125 Yo sistema; nivel apreciable de Cy5
3 B). Después de 24 h de administración, se detectó un 86,3% de DI en el
fl Se detectó fluorescencia en bazo (7,0% de DI / g de tejido a las 24 h) e hígado
excremento para el sistema P-GEM y el valor fue del 98,5% de DI para el sistema
(19,8% de DI / g de tejido a las 24 h), aunque 125 El nivel de I en los dos órganos fue
GEM libre. Pro de acumulación fi le de GEM libre y P-GEM en órganos normales se
pequeño (3,1 y 6,8% de DI / g de tejido a las 24 h para el bazo y el hígado,
mostró en Figura 4 . Para el sistema GEM libre, la porción considerable se acumuló
respectivamente). Además, el nivel de acumulación también fue diferente para la
en el estómago a los 30 min (35.8% de DI / g de tejido), en relación con el sistema
tiroides. El yodo se acumula en la tiroides para convertirse en hormonas y, por lo
PGEM (7.3% de DI / g de tejido), pero el nivel de acumulación disminuyó
tanto, el nivel de detección en la tiroides es relativamente alto.
obviamente en un tiempo- de manera dependiente (0,3% de DI / g de tejido

6
H. Takemoto y col.
Figura 4. Abundancia de GEM después de la administración sistémica de GEM (a) y P-GEM (b) libres en órganos normales en los puntos temporales indicados. Los resultados representan la media con
error estándar de la media obtenida de fi cinco muestras.
cuando usamos 125 Yo como rastreador. De hecho, cuando usamos Cy5-P-GEM para la
biodistribución, el nivel de acumulación en la tiroides fue mucho menor (ca.
1,0% de DI / g de tejido a las 24 h) en relación con 125 Sistema I (aproximadamente 5,6% de DI / g
de tejido a las 24 h).
La distribución intratumoral de P-GEM se visualizó usando Cy5-P-GEM para investigar
el comportamiento de penetración en los tejidos tumorales ( Fig. Suplementaria S10 ). En
este documento, Doxil como una nanopartícula convencional se inyectó
simultáneamente a ratones que portaban un tumor subcutáneo. Como resultado,
Cy5-P-GEM se distribuyó en la mayoría de las áreas de los tejidos tumorales, mientras
que la mayoría de Doxil residía en los vasos sanguíneos cercanos. Este comportamiento
de distribución intratumoral distinto de los dos sistemas sugiere que el diseño actual de
P-GEM es adecuado para la penetración tisular en los sitios del tumor.
3.7. Ensayo de inhibición del crecimiento tumoral de GEM libre y P-GEM
Se examinó la actividad anticancerosa de GEM libre y P-GEM para ratones que
portaban tumores subcutáneos (BxPC3). Se inyectó por vía intravenosa GEM libre
o P-GEM cuatro veces a intervalos de 3 días, y luego se midió el volumen del tumor
durante 18 días ( Figura 5 a). Se administró GEM libre a una dosis de 80 mg / kg,
que se informa como la dosis máxima tolerada [ 42 ], resultando en signi fi no puede
suprimir el crecimiento tumoral en relación con el grupo de control tratado con
solución salina. Para los ratones tratados con P-GEM,
7
Biomateriales 235 (2020) 119804
Se observó una supresión del crecimiento tumoral comparable a la del sistema
tratado con GEM libre a una dosis de 10 mg / kg en base a GEM, y se logró una
disminución adicional en el crecimiento tumoral a una dosis de 20 mg / kg en base
a GEM. Además, se realizó el ensayo TUNEL para los tejidos tumorales
recolectados ( Figura 6 ). Obviamente, la tinción marrón derivada de células
apoptóticas se observó en un rango más amplio para el sistema P-GEM en relación
con el sistema GEM libre. El resultado obtenido aún más con fi rmed la actividad
antitumoral mejorada de P-GEM, y el anticancer e ff El efecto se indujo en la
mayoría de las áreas de los tejidos tumorales. El e ffi Se reprodujo la supresión
ciente del crecimiento tumoral mediante el tratamiento con PGEM para los
ratones portadores de otro tumor subcutáneo (MIA PaCa-2), con fi rmar la potencia
anticancerígena de PGEM ( Fig. Suplementaria S11a ). Todo el sistema no mostró
una disminución considerable del peso corporal durante el período de tratamiento
( Figura 5 by Fig. Suplementaria S11b ).
3.8. Investigación del lado e ff efectos de GEM libre y P-GEM in vivo
El lado e ff Los efectos de P-GEM se investigaron más a fondo en ratones sanos. En
este documento, GEM libre o P-GEM se inyectaron por vía intravenosa tres veces al día a
una dosis de 20 mg / kg en base a GEM, mientras que GEM libre (80 mg / kg) o P-GEM (10
mg / kg o 20 mg / kg sobre una base de GEM) se administraron cuatro veces a intervalos
de 3 días para la evaluación anticancerosa ( Figura 5 y Figura S11 ). Los ratones tratados
con P-GEM mostraron una tendencia similar en
H. Takemoto y col.
peso corporal en relación con el grupo tratado con solución salina, mientras que los
ratones tratados con GEM libre dieron como resultado una disminución del 17.3% en el
día 3 ( Figura 7 a). La ingesta de alimentos para los ratones tratados con GEM libre
también se redujo a la mitad de la de los grupos tratados con PGEM o solución salina ( Figura De hecho, la GEM es internalizada por las células a través de transportadores de
7 B). De interés, el análisis histológico del duodeno indica que la longitud de las
vellosidades fue 40.0% más corta, y la cripta intestinal estaba obviamente atrofiada para
el grupo tratado con GEM libre, mientras que el grupo tratado con P-GEM mostró una
apariencia similar del intestino, en relación con la solución salina. grupo tratado Figura 8 ).
Uno de los principales lados e ff Los efectos de GEM es la hematotoxicidad. Por lo tanto,
se contó la población de células sanguíneas de los ratones tratados para los tres
sistemas ( tabla 1 y Tabla complementaria S1 ). Grupo tratado con GEM libre exhibió el
signi fi No puede disminuir la cantidad de glóbulos blancos (por ejemplo, la cantidad de
neutrófilos y linfocitos fue 40 / μ Tierra
1,550 / μ L, respectivamente), en relación con los grupos tratados con solución salina (el
número de neutrófilos y linfocitos fue 1090 / μ L y 4.350 / μ L, respectivamente). Por el
contrario, tal disminución en el número de glóbulos blancos, en comparación con el
grupo de solución salina, no se observó en el grupo tratado con P-GEM. Tenga en cuenta
que también se midió la cantidad de creatinina y nitrógeno ureico en sangre para
investigar la toxicidad renal en los ratones tratados; como resultado, tanto los grupos
tratados con GEM libre como con P-GEM mostraron valores similares a los del grupo
tratado con solución salina, lo que sugiere su toxicidad insignificante para el riñón ( Tabla
2 ).
4. Discusión
GEM tiene una gran potencia contra el cáncer y actúa contra una amplia gama de
tumores sólidos, incluidos el páncreas, los pulmones no pequeños, la mama y los ovarios.
Figura 6. Imágenes histológicas de los tejidos tumorales (ensayo TUNEL) de los ratones portadores de tumores subcutáneos (BxPC3) después del tratamiento con solución salina (a), GEM libre (b) o
P-GEM (c).
8
Biomateriales 235 (2020) 119804
Figura 5. Tamaño tumoral relativo (a) y peso corporal
relativo (b) de ratones que portan tumores
subcutáneos (BxPC3) después del tratamiento con
solución salina, GEM libre o P-GEM a las
concentraciones indicadas. Las flechas indican el día
de la inyección. Los resultados representan la media
con error estándar de la media obtenida de fi cinco
muestras. * y ** indican p < 0,5 y <0,01,
respectivamente (ANOVA de dos vías con prueba de
comparación múltiple de Tukey).
cánceres [ 6 , 9 ]. Sin embargo, GEM es un fármaco soluble en agua y de bajo peso
molecular, por lo que encuentra una rápida eliminación del torrente sanguíneo que
conduce a ine ffi ciente acumulación de tumores, así como dispersión en tejidos normales.
nucleósidos (NT) [ 9 , 43 , 44 ], y por lo tanto se acumula en órganos enriquecidos con NT (p.
ej., gastrointestinales) [ 45 , 46 ], y causa efectos adversos e ff ects en tales órganos. Además,
la mielosupresión causada por GEM puede ser una razón fundamental para detener la
administración a los pacientes [ 10 , 11 ]. Con este fin, desarrollamos P-GEM en el presente
estudio; varias moléculas de GEM se conjugaron con PEG biocompatible mediante un
enlazador de acetal cíclico. El aumento de tamaño, así como la conjugación estable de
GEM con la columna vertebral del polímero, permite una circulación sanguínea
prolongada y una mayor acumulación de tumores en relación con GEM libre para e ff supresión
efectiva del crecimiento tumoral. La estructura polimérica de P-GEM conduciría a la
endocitosis, en lugar de la internalización celular mediada por NT, y por lo tanto evita
potencialmente la acumulación en las vías gastrointestinales. Después de la endocitosis
de P-GEM por las células cancerosas, puede liberar GEM en respuesta a condiciones
ácidas en el endosoma / lisosoma como resultado de la hidrólisis de la fracción acetal
cíclica, lo que ejerce una acción anticancerígena. ff ect.
Después de la administración sistémica de P-GEM a ratones con tumores
subcutáneos, logró una circulación sanguínea más prolongada y una mayor acumulación
de tumores en relación con el sistema GEM libre. Como resultado, P-GEM provocó e ff la
supresión efectiva del crecimiento tumoral, y la tendencia similar en el peso corporal
durante el período de tratamiento al sistema salino sugiere el lado bajo e ff efectos para la
administración de P-GEM ( Figura 5 B). Es de destacar que una dosis cuatro veces menor
para el sistema P-GEM (20 mg / kg sobre una base GEM) que para el sistema GEM libre
(80 mg / kg sobre una base GEM) indujo comparables /
H. Takemoto y col. Biomateriales 235 (2020) 119804

Figura 7. ( a) Peso corporal relativo de los ratones

durante el tratamiento. Las flechas indican el día de la
inyección. (b) Cantidad de ingesta de alimento de los
ratones después del tratamiento con solución salina,
GEM libre o P-GEM todos los días durante tres veces.
Los resultados representan la media con error
estándar de la media obtenida de fi cinco muestras. NS
y ** indican p> 0.05 y p < 0,01, respectivamente
(ANOVA con prueba de comparación múltiple de
Tukey).

Figura 8. ( ac) Imágenes histológicas del duodeno (tinción H&E) de los ratones después del tratamiento con solución salina (a), GEM libre (b) o P-GEM (c) todos los días durante tres veces.
Las flechas indican las criptas intestinales. (d) La longitud de las vellosidades del duodeno. Los resultados representan la media con error estándar de la media obtenida de tres
muestras (se midieron 50 vellosidades para cada muestra). NS y ** indican p> 0.05 y p < 0,01, respectivamente (ANOVA con prueba de comparación múltiple de Tukey).

mayor nivel de supresión para el crecimiento tumoral, en relación con el sistema GEM
libre, en los dos modelos de tumores subcutáneos distintos (BxPC3 y MIA PaCa-
2). Además, el pequeño tamaño de P-GEM (ca. 10 nm) permitió la penetración
efectiva en los tejidos tumorales, en relación con Doxil (ca. 80 nm) ( Fig.
Suplementaria S10 ), que es consistente con un estudio previo
informando que el conjugado polímero-fármaco permitió la penetración intratumoral al
sitio más profundo [ 32 ]. Tal comportamiento de distribución de P-GEM en los tejidos
tumorales condujo a la apoptosis de las células cancerosas en un área amplia de los sitios
del tumor ( Figura 6 ), más con fi Confirmando el potencial de P-GEM para la terapia contra
el cáncer.

9
H. Takemoto y col.
tabla 1
Concentraciones de glóbulos blancos y plaquetas en la sangre de los ratones tratados con solución salina, GEM libre o P-GEM. Los resultados representan la media con error estándar de
la media obtenida de fi cinco muestras. ND indica " indetectable ”. ** indica p < 0.01 (ANOVA con prueba de comparación múltiple de Tukey).
Neutrófilo Eosinófilos
(/ μ L) (/ μ L)
Salina 1090 ± 180 80 ± 30
GEM gratis 40 ± 10 ** DAKOTA DEL NORTE
P-GEM 850 ± 110 30 ± 20
Tabla 2
Concentraciones de nitrógeno ureico y creatinina en la sangre de los ratones tratados
con solución salina, GEM libre o P-GEM. Los resultados representan la media con error
estándar de la media obtenida de fi cinco muestras.
Nitrógeno ureico en sangre Creatinina
(mg / dL) (mg / dL)
Salina 24,9 ± 1,3 0,14 ± 0,01
GEM gratis 23,1 ± 0,9 0,15 ± 0,02
P-GEM 25,1 ± 1,1 0,14 ± 0,01
La mayor parte de la GEM cargada en P-GEM (> 80%) se excretó dentro de las
24 h posteriores a la administración, sin una acumulación notable en los tejidos
normales. Tenga en cuenta que las partículas relativamente pequeñas (<10 nm) se
eliminan del torrente sanguíneo por vía renal fi ltración [ 15 - 17 ]; por lo tanto, PGEM
(aproximadamente 10 nm de tamaño) experimentaría un aclaramiento renal,
como lo sugiere el aumento de la cantidad de P-GEM para excrementos y la
disminución concomitante en el riñón ( Higos. 3b y 4 B). Mientras tanto, se observó
una acumulación apreciable de Cy5-P-GEM en el bazo (7,0% de DI / g de tejido a
las 24 h) e hígado (19,8% de DI / g de tejido a las 24 h) ( Fig. Suplementaria S9 ),
aunque el nivel de 125 I-GEM en los dos órganos fue bajo (3,1 y
6,8% de DI / g de tejido a las 24 h para bazo e hígado, respectivamente). Por lo tanto, una
porción de P-GEM circulante fue atrapada por el bazo y el hígado de manera similar a
otros nanoportadores reportados [ 47 ], pero la GEM liberada en las células puede
excretarse fuera del cuerpo a través de e ffl ux en el torrente sanguíneo [ 48 ]. El sistema
Free GEM también mostró una tendencia de excreción rápida, pero la porción
considerable de GEM se detectó en el aparato digestivo, especialmente a los 30 min,
posiblemente debido al alto nivel de expresión de NT en el aparato digestivo [ 45 , 46 ].
Aunque el nivel de acumulación de GEM para los sistemas gastrointestinales mostró una
disminución dependiente del tiempo, resultó en una obvia toxicidad gastrointestinal,
como lo indica la disminución en la ingesta de alimentos ( Figura 7 b), vellosidades
acortadas y cripta atrofiada para el intestino ( Figura 8 c y
D). Por el contrario, P-GEM no mostró una acumulación considerable en el aparato
digestivo, donde GEM se conjugó de forma estable con un vehículo a base de
polímero. El bajo nivel de acumulación de P-GEM en el aparato digestivo debe
explicarse por el hecho de que las células captan P-GEM a través de endocitosis,
como lo indica la observación de CLSM ( Fig. Suplementaria S8 ). Como
consecuencia, P-GEM evitó la inducción de toxicidad gastrointestinal, lo que
sugiere fuertemente la importancia de la excreción de la carga útil del fármaco sin
la acumulación en tejidos normales. Es probable que el GEM cargado en P-GEM se
detecte en el riñón en lugar de en el tubo digestivo ( Figura 4 b), probablemente
porque el riñón está en la vía de excreción de P-GEM. Sin embargo, las
concentraciones de creatinina y nitrógeno ureico en sangre después del
tratamiento con P-GEM fueron comparables a las del sistema salino, lo que indica
la toxicidad renal insignificante para el sistema P-GEM ( Tabla 2 ). Es de destacar
que las poblaciones comparables de glóbulos blancos para el sistema P-GEM al
sistema salino indican la reducción de la hematotoxicidad (o mielosupresión) de
GEM, que es uno de los efectos secundarios más graves. ff efectos de GEM [ 10 , 11 ]
como también se observó en el presente estudio ( tabla 1 ). El mecanismo
subyacente de la hematotoxicidad reducida de P-GEM no se dilucidó en el
presente estudio, lo que sería digno de una mayor investigación en la
investigación futura. Estos hechos con fi rm la reducción exitosa de la toxicidad
derivada de GEM para el sistema P-GEM.
El diseño molecular de P-GEM a ff aclaramiento renal ordenado, lo que conduce a una
circulación sanguínea más corta en relación con los sistemas de nanopartículas
Biomateriales 235 (2020) 119804
Basófilo Linfocito Monocitos Plaqueta
(/ μ L) (/ μ L) (/ μ L) (10 4 / μ L)
DAKOTA DEL NORTE 4350 ± 840 90 ± 30 61 ± 3,5
DAKOTA DEL NORTE 1550 ± 340 ** 20 ± 10 49 ± 6,1
DAKOTA DEL NORTE 4470 ± 480 120 ± 30 56 ± 6.2
(por ejemplo, micelas poliméricas y liposomas). Como resultado, el nivel de
acumulación tumoral de P-GEM no fue tan alto (aproximadamente 1% a las 24 h)
como los sistemas de nanopartículas reportados (> 5% a las 24 h) [ 49 , 50 ],
probablemente debido a la propiedad de circulación sanguínea más corta (<5% de
DI a las 24 h) en relación con los sistemas de nanopartículas informados (> 20% de
DI a las 24 h) [ 49 , 50 ]. De hecho, la encapsulación en liposomas [ 51 , 52 ] o el modi
lipídico fi catión (p. ej., escualenoilación) para formar la nanopartícula a través de la
interacción hidrofóbica [ 5 , 7 , 53 , 54 ] se ha dado cuenta de una mayor acumulación
de tumores de GEM y anticancerígenos e ffi cacy. Incluso una dosis 10 veces menor
en base a GEM para el sistema liposomal ha logrado una actividad anticancerosa
comparable en relación con el sistema GEM libre [ 51 ]. Mientras tanto, el sistema
de nanopartículas, especialmente cuando el tamaño es> 100 nm, a menudo
experimenta acumulación en órganos relacionados con RES (p. Ej., Hígado y bazo),
lo que puede resultar en efectos adversos e ff ect en tales órganos [ 55 , 56 ]. El
presente estudio desarrolló un solo polímero como portador de fármacos (es
decir, P-GEM), y el tamaño es relativamente pequeño incluso en presencia de
suero (aproximadamente 10 nm) en comparación con los sistemas de
nanopartículas. Además, P-GEM comprende PEG antiincrustante (y biocompatible)
para evitar la interacción de GEM con tejidos normales. El fármaco cargado debe
excretarse del cuerpo con la mínima interacción con (o acumulación en) los tejidos
normales para minimizar el lado e ff ects. En este contexto, la excreción del GEM
cargado en P-GEM sin la acumulación considerable en tejidos normales y efectos
adversos derivados de GEM ff Los efectos, así como la potencia anticancerígena
mejorada, serían una noción importante para el diseño de portadores de parto.
Las moléculas GEM se conjugaron con el polímero mediante un enlace acetal
cíclico en el presente diseño molecular de P-GEM. Otros enlaces químicos que
responden a condiciones intracelulares (p. Ej., Disul fi de y amida de ácido maleico)
se han empleado a menudo para la construcción de portadores de fármacos y
biomateriales [ 57 , 58 ], pero sufrirían una escisión moderada en el torrente
sanguíneo por la liberación inesperada de las cargas útiles [ 57 , 59 ]. El resto de
acetal cíclico permitió minimizar la fuga de GEM a pH fisiológico, pero liberó GEM
en respuesta al pH ácido en el endosoma / lisosoma que conduce a la inducción de
la e medicinal ff ect. De hecho, P-GEM no indujo efectos adversos derivados de
GEM. ff efectos, como toxicidad gastrointestinal y hematotoxicidad, y se excretó sin
una acumulación apreciable en los tejidos normales. Tenga en cuenta que la
estructura polimérica se puede emplear para otros fármacos relacionados con el
azúcar (p. Ej., Doxi fl uridina y citarabina), aunque el presente estudio se centró en
GEM. La instalación de la fracción dirigida al tumor (p. Ej., Folato y péptido RGD
cíclico) [ 4 , 60 ] en P-GEM facilitaría el nivel de acumulación de tumores, que pueden
ser las tácticas futuras para modificaciones poliméricas fi tecnología catiónica de
GEM.
5. Conclusión
En el presente estudio, desarrollamos un nuevo portador de administración para
GEM, donde varias moléculas GEM se conjugaron con PEG biocompatible a través de un
enlace acetal cíclico. P-GEM conjugaría de manera estable GEM en el torrente sanguíneo,
pero liberaría GEM en orgánulos ácidos después de la endocitosis por las células
cancerosas para ejercer efectos medicinales ff ect. El sistema P-GEM permitió una
circulación sanguínea prolongada y mejoró la acumulación de tumores, en relación con el
sistema GEM libre, después de la inyección intravenosa para ratones con tumores
subcutáneos. Además, una dosis cuatro veces menor de P-GEM sobre una base de GEM
logró un nivel comparable / más alto de supresión del crecimiento tumoral, en
comparación con el sistema GEM libre, lo que sugiere la fuerte potencia anticancerígena
de P-GEM. Cabe destacar que P-GEM logró e ff distribución efectiva
10
H. Takemoto y col.
en una amplia gama de sitios tumorales, lo que lleva a la inducción de apoptosis
en la mayoría de las áreas de los tejidos tumorales. Mientras tanto, el diseño
molecular de P-GEM no mostró una acumulación apreciable en los tejidos
normales, incluidos los órganos con alta expresión de NT (p. Ej.,
Gastrointestinales), seguida de excreción a través del aclaramiento renal. Como
resultado, los efectos adversos derivados de GEM ff No se observaron efectos tales
como toxicidad gastrointestinal y hematotoxicidad, así como toxicidad para el
riñón que está en la vía de excreción de PGEM. Estos hechos sugieren que una
mayor acumulación en los tejidos tumorales de anticancerígenos e ff ect y minimiza
la interacción con los tejidos normales para el lado e insignificante ff Los efectos
pueden realizarse mediante el diseño molecular actual de P-GEM.
Nota
Los autores declaran no contra fl tic de interés.
Agradecimientos
Los autores agradecen a la División de Análisis de Materiales de Suzukake-dai,
Departamento Técnico, Instituto de Tecnología de Tokio, por el análisis de 1H
NMR. Este trabajo fue fi financiado por el Proyecto de Investigación y Evolución
Terapéutica del Cáncer (P-CREATE) (JP 19cm0106202) de la Agencia Japonesa de
Investigación y Desarrollo Médico (AMED), el programa Centro de Innovación (COI)
de la Agencia Japonesa de Ciencia y Tecnología (JST), cinco -Estrella Alliance del
Ministerio de Educación, Cultura, Deportes, Ciencia y Tecnología (MEXT),
subvención JSPS KAKENHI para jóvenes científicos (A) (17H04743) a HT de JSPS, y
por JSPS KAKENHI número de subvención 18H04163 a NN de JSPS.
Apéndice A. Datos complementarios
Se pueden encontrar datos complementarios a este artículo en línea en https:
// doi.org/10.1016/j.biomaterials.2020.119804 .
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