UNIVERSIDAD MILITAR NUEVA GRANADA

PRESENTACIÓN DE PROYECTOS: PIC Y OPCIÓN DE GRADO

PROGRAMA DE BIOLOGÍA APLICADA
FACULTAD DE CIENCIAS BÁSICAS Y APLICADAS

1. INFORMACION GENERAL DEL PROYECTO:

Título: Evaluación de la presencia de genes relacionados con la reducción de óxido nitroso en aislados bacterianos
de sedimentos del humedal Santa María del Lago.
Nombre del estudiante: María Fernanda Bejarano Suta
Datos de contacto del estudiante:
Dirección: Calle 156 B Nº96-74 E-mail: u0501035@unimilitar.edu.co
Teléfonos: 3112912483-2507802 Fax:
Ciudad: Bogotá D.C Departamento: Cundinamarca
Nombre del Grupo de Investigación: Reconocido: SI (X) NO ()
HIDROBIA Clasificación: ()
Línea de investigación: Hidrobiología
Correo electrónico grupo de investigación: maribeb.castro@unimilitar.edu.co
El proyecto se desarrollará en alianza con el grupo:
Reconocido: SI (x) NO ()
Clasificación: (C)
Correo electrónico del grupo de investigación:
Nombre de todos los investigadores que participan en el proyecto:
1.director: Maribeb Castro González
2.Otros:
Si el grupo de investigación con el cual se realizó la alianza para el desarrollo de este proyecto pertenece a
otra institución, debe diligenciarse la siguiente información:
Nombre de la Institución:
Tipo de Entidad: (Seleccione el tipo de entidad)
Universidad Pública: Universidad Privada:
Entidad o Instituto Público: ONG:
Centro de Investigación Privado: Centro de Desarrollo Tecnológico
Centro Empresarial o Gremio: Empresa:
País:
Duración del Proyecto (en meses): 12 meses
Tipo de Proyecto:
PIC: Trabajo de grado: X Pasantía:
Palabras claves: Desnitrificación, genes, NirS, NosZ, oxido nitroso, humedal.

Propuesta de pares y correo electrónico

2. RESUMEN DEL PROYECTO: (español e ingles)

Formato para la presentación de Proyectos PIC y de Opción de Grado – Programa de Biología Aplicada, UMNG
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 El humedal Santa María del Lago (SML) pertenece a un complejo de humedales de la cordillera
Oriental de los Andes. Estos humedales regulan procesos importantes ecológicos, ya que están
involucrados en el desarrollo de diferentes ciclos de nutrientes e hidrológicos. Además, albergan
una alta diversidad e intervienen en la depuración de contaminantes orgánicos. Este complejo de
humedales ha sido estudiado de manera extensiva a partir de análisis biodiversidad y en poca
cantidad investigaciones limnologicas. Sin embargo, las comunidades microbianas que regulan
ciclos biogeoquímicos en los ecosistemas acuáticos de humedales no han sido estudiados a
profundidad. Por ende, este trabajo busca evaluar la presencia de genes funcionales que codifican
para la expresión de las reductasas de nitrito y óxido nitroso en aislados bacterianos
desnitrificantes de sedimentos del humedal SML y estimar su potencial de reducción de Óxido
Nitroso. Para esto se realizarán experimentos en laboratorio con la comunidad microbiana
desnitrificante, en la cual se realizarán análisis de amplificación de genes funcionales nirS y nosZ
involucrados en la reducción del nitrito y el óxido nitroso respectivamente. Posteriormente, para
cada una de las cepas se realizarán análisis con el uso de un inhibidor específico del proceso
microbiano de desnitrificación. Esto será realizado, para cuantificar la producción o consumo de
Óxido nitroso y contrastarlo con lo reportado en literatura en estudios previos en otros humedales
urbanos. Se espera reconocer cepas bacterianas que posean capacidad de depuración de
compuestos tóxicos como el nitrito y gases de efecto invernadero como el óxido nitroso, en
humedales eutróficos.

ABSTRACT

The Santa María del Lago (SML) wetland belongs to a complex of wetlands in the Eastern
Andean. These wetlands regulate important ecological processes because they are involved in the
development of different nutrient and hydrological cycles. In addition, it harbors a high diversity
and intervene in the purification of organic pollutants. This wetland complex has been
extensively studied, principally on biodiversity analysis and in small quantity of limnological
research. However, the microbial communities that regulates biogeochemical cycles in wetland
aquatic ecosystems have not been studied enough. Therefore, this work has as a main objective
evaluate the presence of functional genes that encode for the expression of nitrite and nitrous
oxide reductases in denitrifying bacterial isolated from SML wetland sediments. To carry out this
research, it will be performed laboratory experiments with the denitrifying microbial community.
On the other hand, it will be executed an amplification analyzes of functional genes nirS and
nosZ involved in the reduction of nitrite and nitrous oxide. Subsequently, for each strain, it will
be analyzed a specific inhibitor of the microbial denitrification process. It will allow the
quantification, of production and consumption of nitrous oxide, for subsequent comparison with
previous reports in other urban wetlands. It is expected to recognize bacterial strains that possess
the ability to purify toxic compounds such as nitrite and greenhouse gases such as nitrous oxide,
in eutrophic wetlands.

3. DESCRIPCIÓN DEL PROYECTO:

3.1 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

Los humedales son ecosistemas de una gran importancia funcional y ecológica, ya que regulan

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 diferentes procesos ambientales y poseen una gran diversidad de flora y fauna (Ascencio & Roa,
2017). La función dinámica y reguladora de los humedales dependen de factores físicos, químicos
y en especial de factores bioecológicos, destacando en este último las comunidades microbianas
que son agentes importantes en el ciclado de nutrientes y del equilibrio de los diferentes ciclos
biogeoquímicos (Monroy, 2017). Dentro de los ciclos biogeoquímicos más importantes
encontramos el ciclo del nitrógeno ya que de él depende el equilibrio dinámico de composición de
gases en la biosfera (Fort, 2012), incluidos los gases tipo invernadero como el óxido nitroso y el
óxido nítrico. A raíz de esto, una de las principales problemáticas relacionadas con los productos
nitrogenados es la alteración del ciclo del nitrógeno natural por causas antrópicas que da como
resultado la acumulación de compuestos tóxicos y contaminantes, este proceso ha dado lugar a un
aumento de las concentraciones atmosféricas de N 2O (óxido nitroso) a una tasa anual de casi 0,8
ppb (Hou et al., 2013). Los ecosistemas de humedales urbanos son un ejemplo de la producción
de compuestos nitrogenados tóxicos por la acción antrópica que causan una grave eutrofización y
deterioro del ambiente afectando directamente el ciclo del nitrógeno y eventualmente el rol
ecológico del ecosistema (Wang et al.,2009; Deemer et al.,2011; Vinasco & Solís, 2011;
Canchala, 2014). En este sentido, se ha estudiado a nivel mundial la emisión de gases de efecto
invernadero por parte de cuerpos lénticos, en diferentes ambientes, sin embargo, en zonas
tropicales son escasos las investigaciones realizadas (Canchala, 2014). Colombia, tiene un área
extensa de cuerpos de agua de los cuales 20’252.500 hectáreas son humedales (Andrade et al.,
2002), esto lo define como un ecosistema importante en el país. Sobre la producción de óxido
nitroso, se han registrado estudios en manglares (Betancourt et al.,2013), represas (Castro-
González & Torres-Valdés 2015) lagos, lagunas y humedales (Canchala, 2014), y
principalmente los estudios están dirigidos a la dinámica física y química de estos ecosistemas que
conducen la producción de este gas, sin embargo, no se conoce la actividad microbiológica
involucrada en este proceso. El humedal Santa María del Lago ha sido catalogado como un cuerpo
de agua léntico eutrófico (López, 2012; Fierro & Caballero, 2015; Martín, 2017) y estudios
recientes han registrado una producción de Óxido nitroso en bajas concentraciones lo que indica
desnitrificación en los sedimentos (Castro & González, 2020), además, el análisis metagenómico
de la composición bacteriana de los sedimentos indica que existe una alta diversidad de bacterias
pero una baja riqueza de bacterias reductoras de óxido nitroso en este ecosistema (Castro-
González et al., en prep. ). A raíz de esto surge la problemática principal de la investigación ya
que, si bien es cierto que existen diversas vías de generación de N 2O en cuerpos de agua , la única
vía biológica de eliminación es la desnitrificación en los sedimentos la cual es catalizada por un
sistema enzimático específico, sin embargo, no se conoce si la presencia de los genes que
codifican las reductasas involucradas en la desnitrificación está relacionado con los niveles de
producción de óxido nitroso por parte de las comunidades desnitrificantes, en el caso de esta
investigación enfocándose en los genes que codifican para la reductasa del nitrito a óxido nítrico
(gen nirS) y del óxido nitroso a nitrógeno molecular (gen nosZ). Por esta razón cabe destacar la
importancia del conocimiento de la dinámica ecológica de estas comunidades microbianas que
permita analizar como la presencia de los genes está relacionada o no con la actividad metabólica,
que puede determinar si dichas comunidades pueden regular la producción y/o consumo del gas
invernadero óxido nitroso que pueda generarse en el humedal.

3.2 PREGUNTAS DE INVESTIGACIÓN E HIPÓTESIS

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 3.2.1 PREGUNTA

¿La presencia de genes que codifican para la reducción de nitrito y de óxido nitroso en bacterias
desnitrificantes aisladas de sedimentos del humedal Santa María del Lago, está relacionado con la
variación en la producción de óxido nitroso por parte de estos microorganismos?

3.2.2 HIPOTESIS

Ho1= Existe una relación directa entre la presencia de los genes funcionales nirS y nosZ y la
producción de óxido nitroso en bacterias desnitrificantes del humedal Santa María del Lago.

Ha1= No existe relación directa entre la presencia de los genes funcionales nirS y nosZ y la
producción de óxido nitroso por parte de bacterias desnitrificantes del humedal Santa María del
Lago.

3.3 JUSTIFICACIÓN

Resulta importante el estudio de la desnitrificación en ecosistemas como los humedales, pues

estos remueven más del 20% del nitrógeno fijado en cuerpos de agua, además, es el principal
proceso biológico para el control de calidad y autopurificación de dichos ambientes (Castro,
2014). Además, en la última década se han realizado estudios bajo el enfoque de la contribución
de la composición bacteriana en los sedimentos a la producción de gases de efecto invernadero.
Canchala en el 2014, registró un flujo de emisión de óxido nitroso de 5.63 μg.m 2.h-1. en el lago
Sonso el cual es un ecosistema eutrófico, en un humedal horizontal de flujo superficial en
Catalunya Fort en el 2012, registró una producción de óxido nitroso de 46.41 mg N 2O/ m 2*día,
Deemer y colaboradores en el 2011, registraron una tasa de producción de óxido nitroso de 51
μmol N2O-N m2*d1 y finalmente en el humedal Santa María del Lago Castro y González en el
2020, registraron una tasa de producción de N 2O de 1.35 ± 0.31 nmoles L-1d-1, lo anterior señala la
importancia de centrar la investigación en la producción de gases de efecto invernadero como lo
es el óxido nitroso en humedales eutróficos urbanos como el humedal Santa María del Lago.
Ahora bien, es relevante estudiar los procesos biológicos e impulsores ecológicos en comunidades
microbianas ya que de ellas depende el ciclado de distintos nutrientes y la degradación o
producción de gases de efecto invernadero, como lo es el óxido nitroso, este último es un potente
GEI que es 300 veces más fuerte que el CO 2 (Ren et al., 2019) y además es una sustancia que
agota el ozono. Además, la concentración de óxido nitroso ha aumentado 0.27 % en el periodo de
2016-2017, según el Boletín de Gases de Efecto Invernadero de la OMM (Tarasova et al., 2019).
Ahora bien, el enfoque hacia las comunidades bacterianas desnitrificantes es de suma importancia,
pues son los organismos dominantes que participan en la desnitrificación en diferentes entornos
(Wallenstein et al., 2006). Actualmente, el estudio ecológico y genético de dichas comunidades
microbianas se realiza en base a los genes funcionales, los genes más utilizados son el nirS y el

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 nosZ debido a que son genes que tienen roles importantes en la desnitrificación y muchos grupos
taxonómicos los poseen, de esta manera se usan como marcadores de desnitrificación en distintas
comunidades en ecosistemas acuáticos (Li et al., 2017). La distribución del gen nosZ en
comunidades desnitrificantes es cosmopolita y es importante porque codifica la reductasa de
óxido nitroso (Wallenstein et al., 2006). Por otro lado el nirS tiene una función importante ya que
codifica la nitrito reductasa que cataliza el primer paso a la obtención del producto gaseoso oxido
nítrico (NO) a partir de la reducción de nitrito que si se acumula a ciertas concentración podría
llegar a ser tóxico en el ecosistema (Ka et al., 1997;Hou et al., 2013).Finalmente es importante
realizar investigaciones no solo metagenómicas sino también directamente con las bacterias
desnitrificantes que habitan los sedimentos para determinar si existen organismos que tengan una
alta capacidad de depuración de compuestos tóxicos como el nitrito y gases de efecto invernadero
como el óxido nitroso que puedan ser candidatos para ser usados posteriormente en procesos de
biorremediación de ecosistemas acuáticos.

3.4 OBJETIVOS DEL PROYECTO

3.4.1 General

Evaluar la presencia de genes funcionales que codifican para la expresión de las reductasas de
nitrito y óxido nitroso en aislados bacterianos desnitrificantes de sedimentos del humedal SML y
estimar su potencial de reducción de Óxido Nitroso.

3.4.2 Específicos

- Caracterizar los aislamientos bacterianos morfológicamente y molecularmente.

- Detectar la presencia de los genes que codifican para la reductasa de óxido nitroso (nos Z) y
reductasa de nitrito (nirS) en bacterias desnitrificantes aisladas previamente de sedimentos del
humedal SML.
- Estimar las tasas de producción de Óxido Nitroso por parte de aislados bacterianos
desnitrificantes obtenidos previamente de sedimentos del humedal SML.
- Comparar las tasas de producción de óxido nitroso entre aislados bacterianos
desnitrificantes provenientes de sedimentos del humedal SML y establecer la relación con los
genes de estudio.

4. MARCO TEÓRICO

4.1 Humedales.

En la actualidad existen diferentes definiciones del ecosistema humedal, la convención

RAMSAR define a los humedales como “las extensiones de marismas, pantanos y turberas, o
superficies cubiertas de aguas, sean éstas de régimen natural o artificial, permanentes o
temporales, estancadas o corrientes, dulces, salobres o saladas, incluidas las extensiones de
agua marina cuya profundidad en marea baja no exceda de seis metros”(RAMSAR,

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 2006).Los humedales tienen diferentes funciones ecológicas y ambientales ya que actúan en la
regulación de distintos ciclos biogeoquímicos, y tienen un potencial de biodiversidad de flora
y fauna (Monroy, 2017).

4.2 Humedales en Bogotá.

Los humedales en Bogotá, son ecosistemas de cuerpos de agua lénticos urbanos, los cuales
están clasificados según las definiciones en RAMSAR 2006 como humedales de interior, con
sistema palustre-permanente de clase arbustivo y subclase pantanos arbustivos, por sus
características ambientales. En Bogotá, los humedales han sido clasificados como humedales
naturales y artificiales, esta clasificación está guiada en base a la diferenciación de los cuerpos
de agua permanentes o estacionales asociados con la red principal y cauces del río Bogotá
(Villa, 2012). Los humedales en el altiplano de Bogotá han sufrido alteraciones por acción
antrópica, causando el fraccionamiento de sus biomas, pérdida de terreno, disminución de
procesos ecológicos importantes, contaminación entre otros (Ascencio & Roa, 2017). A raíz
de esto se ha realizado estudios en diversos ecosistemas de humedal en la ciudad, en los
cuales se realizan análisis de calidad de agua y manejo ambiental del ecosistema (DAMA,
2000; AAB, 2006; Bejarano, 2007;Camayo et al.,2011;Monroy, 2017), entre los más
caracterizados se encuentra el humedal Santa María del Lago  (López, 2012; Caicedo &
Herrera, 2015;Fierro & Caballero; 2015; Martin, 2017; Castro & González, 2020).

4.3 Humedal Santa María del Lago.

Este humedal se encuentra a 2550 m.s.n.m, ubicado en la localidad de Engativá, rodeado por
calles altamente transitadas, por la acción antrópica sobre el humedal se perdió la conexión
con el rio Juan Amarillo con el que tenía conexión inicialmente. Cumple una función
ecológica de retención de agua freática y agua lluvia, funcionando como filtro purificador
(Andrade & Benítez, 2005). El clima de este ecosistema posee una temperatura media
multianual 13.7ºC, régimen de precipitación bimodal con periodos de lluvia entre marzo-
mayo con valores entre 87.5 mm y 129.9 mm y octubre-noviembre con valores de 81.2mm y
117.7mm (Martin, 2017).
Actualmente, se ha realizado estudios de la calidad del agua del humedal, caracterizándolo
como un cuerpo de agua eutrófico con valores de Nitratos (NO3) (0.5 mg/L), Nitritos (NO2)
(0.06 mg/L), concentraciones de oxígeno con tendencia a la hipoxia, alta carga de materia
orgánica (López, 2012; Pulido & Pinilla, 2017; Castro & González, 2020). Esto forma la
línea base de investigaciones ecológicas en este ecosistema para establecer las relaciones
bióticas y abióticas que establezcan la dinámica del ecosistema.

4.4 Ciclo del nitrógeno.

El nitrógeno es un elemento ampliamente distribuidos en la naturaleza. Está presente en la

atmósfera, la litosfera y la hidrosfera, además es el cuarto elemento más abundante a nivel
celular (Mendel et al., 2001). El ciclo de nitrógeno es un complejo sistema que depende de un
equilibrio redox, además es un proceso que se desarrolla en ambientes aeróbicos y

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 anaeróbicos y es regulado a partir de diferentes procesos microbiológicos (Ritter &
Bergstrom, 2001). Generalmente, los principales procesos del ciclo del nitrógeno son la
nitrificación, la desnitrificación y la fijación de nitrógeno. Eventualmente, existen procesos
internos en los cuales se transforman las formas nitrogenadas encontradas en diferentes
ecosistemas (Stein & Klotz en el 2016). En la figura 1. se relaciona los productos intermedios
del ciclo de nitrógeno propuestos por Stein & Klotz en el 2016.

Figura 1: Productos intermedios del ciclo de nitrógeno.

Figura 1. Productos intermedios del ciclo del nitrógeno. Intermedios, que representan
nueve estados de oxidación, que donan o aceptan electrones, contribuyendo así al flujo de
electrones y la conservación de energía en los microbios participantes.
Obtenido de: Stein & Klotz (2016). 

Dentro del ciclo del nitrógeno existen diferentes procesos de reducción u oxidación del
nitrógeno la amonificación se puede lograr ya sea por la reducción de dinitrógeno (también
conocida como 'fijación de nitrógeno' o 'Nif'), o por el proceso de reducción de nitrito
disamilatorio a amonio (DNRA). La nitrificación se compone por la oxidación de amoníaco a
nitrito (también denominado 'nitratación') y la oxidación de nitrito a nitrato (también
denominado 'nitración'). Reducción de nitrato a nitrito, se puede acoplar a otros procesos.
Finalmente, la desnitrificación que también se conoce como 'gasificación de óxido de
nitrógeno'. Anammox que se conoce como la oxidación anaeróbica de amonio, la cual es una
reacción independiente y diferente.

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 Las comunidades microbianas involucradas en el reciclado del nitrógeno forman una red
importante de transformación del nitrógeno en ecosistemas naturales y artificiales. Además,
este proceso es llevado a cabo por un conjunto complejo que se regula en respuesta a
diferentes factores tanto bióticos y abióticos (Kuypers et al., 2018). En la figura 2. se puede
evidenciar un ejemplo de las interacciones entre comunidades en un complejo sistema de
transformación del nitrógeno en un cuerpo de agua.

Figura 2: Redes microbianas transformadoras de nitrógeno.

Figura 2. Complejo microbiano de zonas mínimas de oxígeno marino. Las comunidades de

nitrificación aeróbica que están bien adaptadas a las condiciones de bajo oxígeno realizan la
oxidación de amoníaco a nitrito y nitrato. Las zonas mínimas de oxígeno son las principales
regiones de pérdida de nitrógeno debido a la actividad de las bacterias anaerobias oxidantes de
amonio y, en menor medida, a la desnitrificación. Comunidades complejas de microorganismos
están involucradas en el proceso de desnitrificación.
Obtenido de: Kuypers et al. (2018).

4.5 Desnitrificación.

La desnitrificación es la reducción secuencial de nitrato (NO3-) a gas dinitrógeno (N2), este

proceso remueve más de la mitad del nitrógeno inorgánico fijado en cuerpos de agua. El sistema
de desnitrificación es mediado por microorganismos los cuales poseen sistemas enzimáticos que
son codificados por genes funcionales específicos (Seitzinger, 2008). Este proceso transforma los
nitratos en productos gaseosos, como el dinitrógeno molecular  (N2) y el gas de óxido nitroso
(N2O) que son de importancia ambiental ya que representan  gases traza y gases de efecto

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 invernadero (Abell et al, 2010).La desnitrificación es entonces,  un componente importante en el
ciclo del nitrógeno (N), donde actúan distintas comunidades microbianas con una variedad
extensa de grupos taxonómicos, que utilizan el nitrógeno en sus formas oxidadas las cuales sirven
como aceptores para el transporte de electrones en el proceso de respiración (Wallenstein et
al,2006).

La importancia ambiental de la desnitrificación ha llevado a diferentes investigaciones a nivel

mundial en diferentes ecosistemas como lo son suelos, sedimentos y el interfaz agua- sedimento,
agua dulce y salada (Wallenstein et al,2006). A raíz de esto se ha estudiado los controles
fisicoquímicos y biológicos que regulan este proceso, identificando factores distales y proximales
(Thomas, et al., 1994), los primeros son los factores que actúan a largo plazo y los proximales
son los que alteran la desnitrificación de manera instantánea.
En ecosistemas de humedales eutróficos, diferentes  investigaciones demostraron que la
diversidad y abundancia de las comunidades desnitrificantes se regulan por la variación de los
factores físico químicos influyentes en el ecosistema (Chon et al., 2011).Factores como
temperatura, pH, OD, profundidad del agua, metales pesados, concentraciones de nutrientes
potencial redox y contenido de materia orgánica son los factores más influyentes en la
composición de las comunidades desnitrificantes en ecosistemas eutróficos (Wang et al.,
2007;Hou et al., 2013; Song et al., 2017).

4.6 Genética de la desnitrificación.

El análisis de la actividad enzimática involucrada en la desnitrificación, presenta la presencia de

diferentes genes, dichos genes son funcionales y codifican enzimas clave, como nitrato, nitrito,
óxido nítrico y óxido nítrico reductasa en la vía de desnitrificación. Según Chon y colaboradores
en el 2011, definieron el sistema enzimático del proceso de desnitrificación el cual empieza por la
reducción de nitrato soluble a nitrito la cual es catalizada por una proteína unida a una membrana
(nar) o un nitrato reductasa (nap), que están codificadas por el gen narG o napA, respectivamente.
La reducción de nitrito soluble a gas de óxido nítrico es catalizada por un citocromo cd 1 nitrito
reductasa (codificada por nirS) o un cobre nitrito reductasa (codificada por nirK). La reducción de
NO a N2O está catalizada por dos reductasas de óxido nítrico. El último paso de la vía de
desnitrificación es la reducción del óxido nitroso a dinitrógeno, el cual es catalizado por la
reductasa de óxido nitroso (codificada por la nosz) que existe en el periplasma. Al estudiar las
comunidades desnitrificantes se proporciona una perspectiva biológica hacia el proceso
biogeoquímico del Nitrógeno. Este proceso se considera como anaerobio facultativo y esta
característica establece la capacidad de encontrar un grupo muy diverso de bacterias
filogenéticamente relacionadas. Dentro de este grupo multiverso se encuentran miembros de
Aquificae, Deinococcus-Thermus, Firmicutes, Actinobacteria, Bacteroides y Proteobacteria phyla
Algunos hongos y Archaea (Wallenstein et al., 2006).

4.7 Ecología y filogenia de los organismos desnitrificantes.

La capacidad desnitrificante se puede observar en una amplia variedad de géneros en los cuales se
encuentran bacteria, arquea y hongo esto se sabe a partir del análisis de los genes funcionales,

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 además, la posesión de dichos genes y la distribución de los mismos entre los taxones
desnitrificantes podría deberse a un ancestro común que existía antes de la clasificación de los
procariotas en 2 dominios (Zumft, 1997). En general la expresión genética y la capacidad
desnitrificante no está estrechamente relacionada, pues, taxones filogenéticamente emparentados
no necesariamente cumplen las mismas habilidades en la desnitrificación, con esto, se puede
encontrar taxones distantes que comparten las mismas capacidades desnitrificantes (Jones et al.,
2008), esto define un complejo evolutivo en el cual se ha perdido, ganado y heredado genes de la
desnitrificación. 
Las filogenias basadas en el análisis del ARNr mostraron incongruencias al comparar con árboles
filogenéticos realizado a partir de genes funcionales de desnitrificación, por esta razón
actualmente se utiliza dichos genes como marcadores moleculares de la desnitrificación
(Goregues et al., 2005). Ahora bien, en cuanto a la expresión genética y la expresión funcional
del sistema enzimático de la desnitrificación se ha discutido que existe una regulación mediada
por factores externos como variables fisicoquímicas y factores internos como interacciones
genéticas del sistema enzimático en las comunidades. Ejemplo de lo anterior, el número de copias
que se establece del gen nirS es mayor que posee el gen nosZ en el genoma bacteriano, esto ha
sido reportado en varias investigaciones (Huang et al,2011; Correa,2016) y soporta la
información otorgada sobre la cantidad de microorganismos que poseen los genes que codifican
para enzimas desnitrificantes, además, se ha reportado que una tercera parte de las bacterias
desnitrificantes presentes en el ambiente no poseen la capacidad de reducir el óxido nitroso,
debido a que carecen del gen que codifica para la óxido nitroso reductasa (nosZ) (Jones et
al,2008),  una de las explicaciones es la transferencia horizontal de genes que permite la
variabilidad de la disposición y presencia de los genes de desnitrificación en el genoma bacteriano
(Jones et al,2008).

4.8 Óxido nitroso.

El óxido nitroso es un potente gas de efecto invernadero el cual es producido a partir del
metabolismo de diferentes comunidades microbianas. Este gas de efecto invernadero agota el
ozono desde el siglo XXl, aumentando a una tasa de 0.26 por año (Tian et al, 2015).Las
características de producción de N 2O difieren entre organismos, además, también existe una
regulación mediada por factores ambientales como  el oxígeno disuelto (OD), la temperatura (T),
el pH, la relación carbono / nitrógeno (C / N), el tiempo de retención de lodos (SRT) y
acumulación de nitratos y nitritos (Ren et al, 2019).
Existe una diversidad amplia de organismos que producen óxido nitroso. Inicialmente
encontramos a los organismos nitrificantes en las que se pueden diferenciar las bacterias
oxidantes de amonio (AOB) en las que se diferencian microorganismos con metabolismo
autótrofo y heterótrofo, además, también se encuentra la producción de óxido nitroso por la vía
del desnitrificador-nitrificador que se guía por los productos obtenidos en la oxidación de
amoniaco y su posterior reducción a N2 (Law et al., 2012). Luego encontramos la producción
de este gas por arqueas oxidantes de amonio (Chen et al., 2018), finalmente encontramos los
organismos desnitrificadores que también pueden diferenciarse entre autótrofos o heterótrofos
(Ren et al, 2019). Cabe resaltar que la regulación de las vías de señalización de estos
microorganismos está inmersa en el ciclo del nitrógeno y eventualmente se realiza el ciclado de

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 este elemento a partir de las distintas formas nitrogenadas, hablando específicamente de
ecosistemas acuáticos. Ahora bien, existe una regulación genética en esta producción del gas.
Poughon y colaboradores en el 2001, han documentado la expresión genética de enzimas como
el amonio monooxigenasa (AMO), la hidroxilamina oxidoreductasa (HOA), las reductasas tipo
Nir y nosZ, que se encuentran en un sistema celular y molecular donde se regula la catálisis y
bioenergética celular mediado por un componente genético (Zumft, 2002).

4.9 Análisis moleculares.

Se han utilizado distintas técnicas moleculares para el análisis de estos genes desnitrificantes en
distintos ambientes, en general se utiliza técnicas para cuantificar la diversidad y abundancia de la
composición genética encontrada en dichos ambientes. Normalmente se utilizan técnicas como la
PCR que está guiada a amplificar genes de interés en una comunidad mixta lo cual proporciona el
estudio de la composición microbiana, sin embargo no existe solo esta técnica también se puede
encontrar la técnica de polimorfismo de longitud del fragmento de restricción terminal (T-RFLP)
o la electroforesis en gel con gradiente de desnaturalización (denaturing gradient gel
electrophoresis, DGGE) que establecen la identidad de miembros específicos de las comunidades
desnitrificantes estableciendo una comparación activa sobre la diversidad de las mismas (Castro-
González, 2014). A continuación, se exhibe los distintos procesos involucrados en el estudio de
comunidades desnitrificantes en sedimentos:
Figura 3: Técnicas moleculares para el estudio de comunidades desnitrificantes.

Figura 3: Una ilustración de técnicas moleculares alternativas para examinar comunidades

desnitrificadoras. Después de extraer los ácidos nucleicos de las muestras ambientales, se pueden
analizar directamente mediante técnicas de hibridación, o los genes de desnitrificación se pueden
amplificar mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Se puede usar una técnica de
PCR modificada (qPCR) para cuantificar la abundancia relativa de genes desnitrificantes. Los

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 productos de PCR también se pueden utilizar para evaluar la estructura o diversidad de la
comunidad general mediante electroforesis en gradiente de gel desnaturalizante (DGGE) o
polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción terminal (TRFLP). O se pueden obtener
secuencias de organismos no cultivados mediante técnicas de clonación y secuenciación
Obtenido de: Wallenstein et al.,2006.
5. METODOLOGÍA

5.1 Área de estudio

El estudio se llevará a cabo en el laboratorio de Biotecnología y Microscopía del Campus de la

Universidad Militar Nueva Granada (4°56’36’’ N -74°00’45” O).

5.2 Reactivación de cepas bacterianas.

Se utilizarán 15 cepas previamente aisladas e identificadas como bacterias desnitrificantes por

Castro y Gonzales en el 2020.Dado que las cepas de bacterias desnitrificantes se encuentran
congeladas a -4ºC estas deberán reactivarse para su cultivo. Para esto se usará agar nutritivo (AN)
para lo cual se pesarán 23g del medio y se disolverán en 1L de agua destilada, el medio se
esterilizará. Posteriormente, el medio líquido se verterá en cajas de Petri (estériles) 20 mL, y se
dejará gelificar. Para el aislamiento bacteriano se realizará un raspado de la cepa madre y
posteriormente se diluirá en 100 µL de agua destilada, se tomará el inoculo y será sembrarlo en
AN, finalmente se incubará a 37ºC, al durante 24 horas.

5.3 Caracterización morfológica de los aislamientos.

Como parte del objetivo 1, se realizará caracterización macroscópica de cada aislamiento a partir
de la observación directa de las cepas, y se describirán características de cada colonia, estas
bacterias se diferenciarán por forma, borde, pigmentación, superficie, consistencia, olor, entre
otras. Para el reconocimiento microscópico se tendrá en cuenta morfología celular y tipo de
tinción Gram.

5.4 Extracción de ADN.

Para el desarrollo del objetivo 2 se requerirá realizar la extracción de ADN que se realizará
mediante el seguimiento del protocolo de Moore, et al., (2004), donde se selecciona con un asa
estéril las colonias en el medio de cultivo aislado por medio de un barrido sobre el agar, y se
disuelve en 100 µL de agua esterilizada dentro de tubos eppendorf. Luego, se somete las células
en suspensión a baño maria (97 °C) durante 5 minutos para generar un choque térmico y así
provocar la lisis celular. Por último, se transporta los tubos de eppendorf a una centrifuga y se
ponen a 15000 gravedades durante 10 minutos para la separación de los componentes celulares,
luego de la centrífuga se selecciona el sobrenadante de la separación (Colecta el ADN de interés)
y se pone en tubos de eppendorf en conservación a 20° C hasta la realización de la PCR.

5.5 Amplificación de genes nirS y nosZ.

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 La amplificación de los genes nirS y nosZ se realizará utilizando primers específicos los cuales se
encuentran diferenciados en la Tabla 1. (Anexos) partir de esto se realizará el Master mix estándar
(sujeto a cambios) para muestras de 15 μL para amplificación por PCR de genes nirS y nosZ las
cuales serán llevados al termociclador por el tiempo establecido en el perfil térmico de los genes
correspondientes. El master mix (para una muestra de 15 μL) del gen nosZ y nirS se compone de:
Agua MiliQ 8.675 μL, Buffer de carga 1.5μL, MgSO 4 1.5μL, BSA 1.2μL, Primer F y R 0.375μL,
dNTP 0.3 μL, Tag DNA 0.075μL y por último 1μL concentrado de la muestra biológica. Con esta
metodología se podrá determinar qué cepas tienen uno u otro o ambos genes relacionados con la
desnitrificación.

5.6 Caracterización molecular de los aislamientos bacterianos a través de la

obtención de Fragmentos de restricción.

Una vez se obtengan los amplicones de los genes nosZ y nirS por medio de PCR, se realiza la
digestión enzimática por enzimas de restricción, se utilizarán las enzimas HhaI (Sitio de corte G
CG▼C- C▲GC G) y MspI (Sitio de corte C▼CG G-G GC▲C). Siguiendo lo indicado por el
proveedor (PROMEGA,2011), para una muestra de 20μL , la digestión se prepara con 15μL de
agua estéril desionizada, 2μL de Buffer (10mM Tris-HCl (pH 7.3), 50mM KCl, 1mM DTT,
0.1mM EDTA, 0.2mg/ml BSA, 50% glycerol para MspI )(10mM Tris-HCl (pH 7.4), 50mM NaCl,
0.1mM EDTA, 1mM DTT, 0.5mg/ml BSA, 50% glycerol para HhaI), 0.2µl de BSA y 1µl de la
muestra amplificada. El análisis de los fragmentos de restricción se realizará por medio de
electroforesis observando las bandas por excitación UV en un gel de agarosa al 1%. Con este
análisis se compararán los patrones de bandas para determinar si los aislamientos corresponden
también a diferentes morfotipos moleculares debido a diferencias en las secuencias del ADN entre
los aislamientos, dado que pueden tener diferencias en los sitios de restricción.

5.7 Cuantificación de óxido nitroso.

Para el desarrollo del objetivo específico 3 se deberán realizar dos pasos crecimiento bacteriano
en medio líquido y experimentos de producción de N 2O en laboratorio con cada cepa como se
indica a continuación.

5.7.1 Enriquecimiento bacteriano.

Para el cultivo bacteriano en frascos de ámbar de 120 mL se realizará un inóculo de 2 mL de

la cepa en 50 mL del medio de cultivo LB. Cada cepa se cultivará por triplicado. Los frascos
ámbar se taparán con tapones de goma, el proceso de inoculación se llevará a cabo bajo
condiciones de atmósfera de N 2 con el fin de evitar la oxigenación de los experimentos
(Carlson & Ingraham, 1983), el crecimiento se realizará durante 24 horas a 25ºC. Se usará
medio de cultivo Luria-Bertani (LB) utilizado por Carlson & Ingraham (1983), el cual está
conformado por 10 g de triptona, 5.0 g de extracto de levadura, 5.0 g de NaCl, 1.0 g de
glucosa, 10 ml de 1 M Tris-hidrocloruro (pH 7.5), 1.0 ml de MgSO4 1 M - 7H20 y agua (por
litro). El medio de cultivo se esterilizará.

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 5.7.2 Cuantificación de óxido nitroso.

Luego de tener el cultivo en crecimiento exponencial (Fase exponencial se reconocer por la

técnica de conteo en laca para cada una de las cepas), se tomará 3 mL del cultivo de cada
bacteria y se incubaran en viales de 70 mL y se suplementaran con diferentes volúmenes de
KNO3 0.75mg/L, 1.5mg/L y 2.0mg/L por triplicado y se mantendrá las condiciones de
anaerobiosis bajo atmósfera de N2 a temperatura ambiente. Luego se inyectará suavemente 10
ml de C2H2 ultra puro a todos los frascos, y se dejarán tres frascos por cada cepa como
control a los cuales no se les adicionará acetileno. Todos los frascos se mantendrán bajo
agitación a 150 rpm a 24ºC durante 12 horas (Carlson & Ingraham, 1983). Para estimar las
tasas de producción de N2O, se tomará 5ml de la fase gaseosa de la muestra con una jeringa
hermética, se realizará toma del gas cada 6 horas durante 24 horas en total para estimar en el
tiempo la tasa de producción de N2O. Para esto previamente se debe utilizara la técnica de
equilibrio de fases de McAuliffe (1971), en la cual se inyectarán 7 mL de He ultrapuro y se
mantendrá en agitación durante 2 horas a 40 ºC. Para el análisis de la concentración de N 2O
gaseoso se inyectarán 5ml de la fase gaseosa en viales preevacuados al vacío para su
cuantificación con un cromatógrafo de gases (Shimadzu GC), equipado con detector de
captura de electrones 63Ni a 325°C (N 2O), con fase móvil de N2 ultrapuro. Límite de
detección de 0.1 ppm. Se usarán estándares de N 2O balanceados en N con una precisión de
±5 %. La concentración de N 2O disuelto se calculará usando la fórmula de solubilidad de
Weiss & Price (1980) (Castro & González, 2020). Los experimentos de realizara por
triplicados por cada cepa, tomando las muestras de diferentes tubos a los distintos tiempos de
muestreo (0, 6, 12, 18 y 24 horas).

5.8 Análisis e interpretación

Se establecerá los patrones de amplificación en el gel de agarosa de la electroforesis, comparando

el tamaño en pb de las bandas respecto a un marcador molecular. Posteriormente, se realizarán
matrices de presencia/ausencia de los genes nir S y nosZ sobre todas las cepas analizadas. Por otro
lado, el análisis de caracterización de las cepas desnitrificantes, la morfología microscópica y
macroscópica se recopila en tablas que relacionan dichas características por cepa. Finalmente,
para los fragmentos de restricción se observa el perfil de restricción de la digestión enzimática,
comparando los patrones de bandas en los geles por cada cepa y por cada enzima. Se revisará la
heterogeneidad de los fragmentos obtenidos en cada perfil de ambas enzimas y se comparará con
un marcador molecular.

La tasa de producción de N2O se analizarán bajo la metodología propuesta por Castro-González

& González (2020) en la cual se realiza un análisis de regresión lineal de los datos obtenidos
durante las 24 horas del experimento, y la tasa se estimará a partir de la pendiente obtenida en
dicho análisis. Los valores positivos indicaran producción de N 2O y los valores negativos
representaran el consumo. El error en la tasa se estimará desde el error estándar de la pendiente. El
test de t-student se usará para evaluar la significancia de las diferencias entre las pendientes
obtenidas entre las cepas.

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 Con los datos de N2O producido por cada cepa, se efectuará un análisis exploratorio (estadística
descriptiva) mediante un diagrama de cajas o boxplot. En el software R-Studio se realizará la
prueba Shapiro-Wilk de normalidad de los datos entre la presencia de los genes y la producción de
óxido nitroso. Se realizará un análisis de varianza (ANOVA) de dos factores para evaluar la
relación entre la presencia de los genes en cada una de las cepas y la producción de óxido nitroso
y análisis de varianza para evaluar si existen diferencias significativas entre la producción de
óxido nitroso. Se realizará una prueba de comparación múltiple Duncan para analizar si existen
diferencias significativas entre la producción de óxido nitroso y la concentración de nitrato en el
medio de cultivo, esto con el fin de establecer la concentración de nitrato que potencializa la
desnitrificación en relación a la medida de producción de Óxido nitroso.

6. CONSIDERACIONES ETICAS

La universidad Militar Nueva Granada cuenta con el permiso marco de recolección de muestras
de la diversidad biológica del ANLA, otorgado por el Ministerio del Medio ambiente de Colombia
bajo la resolución Nº1198 del 15 de octubre de 2014.

7. RESULTADOS E IMPACTOS

7.1 Generación de nuevo conocimiento

Objetivo Resultado/Producto
Indicador Beneficiario
esperado
O.G. Evaluar la     - Grupo de
presencia de genes -Articulo sometido a -Carta de investigación
funcionales que revista internacional aceptación de la HIDROBIA.
codifican para la Q1 o revista nacional revista. - Universidad
expresión de las A1 Militar Nueva
reductasas de nitrito y Granda.
óxido nitroso en - Comunidad
aislados bacterianos científica nacional.
desnitrificantes de - Comunidad
sedimentos del científica
humedal SML y internacional
estimar su potencial de
reducción de Óxido
Nitroso.
O.E.4 Comparar las      - Grupo de
tasas de producción de - Listado de cepas -Registro de investigación
óxido nitroso entre bacterianas autóctonas colección HIDROBIA.
aislados bacterianos del HSML y tasas de microbiológica . - Universidad
desnitrificantes producción de Oxido -Uso de datos de Militar Nueva
provenientes de nitroso por cada una las tasa de Granda.

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 sedimentos del de las cepas. producción por - Comunidad
humedal SML y entidades científica nacional.
evidenciar la relación ambientales . - Comunidad
con los genes de científica
estudio. internacional

7.2 Fortalecimiento de la comunidad científica

Objetivo Resultado/Producto
Indicador Beneficiario
esperado
O.G. Evaluar la    -Acta de -Comunidad
presencia de genes -Formación de sustentación. científica de la
funcionales que estudiante de universidad Militar
codifican para la pregrado. Nueva Granada.
expresión de las -Articulo sometido a -Carta de -Comunidad
reductasas de nitrito y revista internacional revisión y científica nacional e
óxido nitroso en Q1 o revista nacional aceptación. internacional.
aislados bacterianos A1-
desnitrificantes de -Ponencia. -Carta de -Comunidad
sedimentos del aprobación del científica nacional e
humedal SML y resumen. internacional.
estimar su potencial de
reducción de Óxido
Nitroso.

7.3 Apropiación social del conocimiento

Objetivo Resultado/Producto
Indicador Beneficiario
esperado
O.G. Evaluar la presencia -Participación en un Carta de -Comunidad
de genes funcionales que congreso nacional o aprobación del académica y
codifican para la expresión internacional resumen enviado científica nacional o
de las reductasas de nitrito internacional.
y óxido nitroso en aislados
bacterianos
desnitrificantes de
sedimentos del humedal
SML y estimar su
potencial de reducción de
Óxido Nitroso.
O.E.4 Comparar las tasas Uso y - Grupo de
de producción de óxido -Reconocer cepas reconocimiento investigación
nitroso entre aislados bacterianas como agentes de las cepas en HIDROBIA.

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 bacterianos importantes con estudios e - Universidad
desnitrificantes capacidad de depuración investigaciones Militar Nueva
provenientes de de compuestos tóxicos de ecosistemas Granda.
sedimentos del humedal como el nitrito y gases acuáticos - Comunidad
SML y evidenciar la de efecto invernadero (Humedales) por científica
relación con los genes de como el óxido nitroso. entidades de nacional.
estudio. regulación - Comunidad
ambiental científica
nacional e internacional
internacional.

7.4 IMPACTOS ESPERADOS A PARTIR DEL USO DE LOS RESULTADOS

Plazo (años) después de finalizado el

Impacto Indicador
proyecto: corto (1-4 ), mediano (5- Supuestos*
esperado verificable
9), largo (10 o más)
    Cepas bacterianas -Profesionales en el
Ambiental Largo plazo reconocidas como área de restauración
agentes importantes ambiental utilizaran la
con capacidad de cepas para
depuración de investigación sobre
compuestos tóxicos biorremediación de
como el nitrito y ecosistemas eutróficos.
gases de efecto  
invernadero como -Microbiota de
el óxido nitroso, en sedimentos, con genes
humedales de desnitrificación
eutróficos. presentes disminuirán
los niveles de
contaminantes como
nitrito y oxido nítrico.
Científico Mediano- corto Listas sobres las Investigadores
tasas de producción utilizaran los datos
de oxido nitroso por como indicadores
cepas bacterianas biológicos para
analizadas de los ecosistemas acuáticos
sedimentos. eutróficos urbanos
sobre la influencia de
comunidades
microbianas en
procesos
biogeoquímicos y de
regulación ecológica en
humedales.

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 8. REFERENCIAS

 Abell, G., Revill, A., Smith, C., Bissett, A., Volkman, J., & Robert, S. (2010). Archaeal
ammonia oxidizers and nirS-type denitrifiers dominate sediment nitrifying and
denitrifying populations in a subtropical macrotidal estuary. The ISME journal, 4(2), 286.
 Acueducto y alcantarillado de Bogotá (2006). Plan de manejo ambiental, humedal
Jaboque. Bogotá, Colombia.
 Andrade, M., & Benítez, H. (2005). Los Humedales de la Sabana de Bogotá: Área
Importante para la Conservación de las Aves de Colombia y el Mundo. Instituto De
Investigación de Recursos Biológicos Alexander von Humboldt, Bogotá, Colombia.
 Andrade, A., Rivera, M., Caicedo, D., & Camargo, L. (2002). Política Nacional para
humedales interiores de Colombia. Estrategias para su conservación y uso racional (pp
21). Ministerio del Medio Ambiente.
 Ascencio, D., & Roa, A. (2017) Determinación de los principales efectos ambientales en
humedales debido a la variación climática en la ciudad de Bogotá D.C como un análisis
del cambio climático (Proyecto curricular), Universidad Distrital Francisco José de
Caldas.
 Bejarano, P. (2007). Dinámica del paisaje del humedal Juan Amarillo durante el periodo
1950-2005 (tesis de maestría). Universidad Nacional de Colombia, Bogotá, Colombia.
 Betancourt, J., Parra, J., & Villamil, C. (2013). Emisión de metano y óxido nitroso de los
sedimentos de manglar de la Ciénaga Grande de Santa Marta, Caribe colombiano. Boletín
de Investigaciones Marinas y Costeras, 42, 1.
 Bullister, J. (2015). Atmospheric Histories (1765-2015) for CFC-11, CFC-12, CFC-113,
CCl4, SF6 and N2O. Carbon Dioxide Information Analysis Center, Oak Ridge National
Laboratory, US Department of Energy, Oak Ridge, Tennessee.
 Caicedo, S., & Herrera, L. (2015). Determinación de la cantidad de CO2 capturado y O2
producido por los diferentes biotopos en el humedal Santa María del Lago. (Tesis de
grado). Universidad Santo Tomás. Bogotá, Colombia.
 Camayo, M., Sierra, D., & Camacho, M. (2011). Seguimiento a las políticas ambientales
distritales y las herramientas de planeación en dos humedales del distrito capital. Revista
gestión integral en ingeniería neogranadina, 3(2), 1-18.
 Canchala T. (2014). Generación de gases de efecto invernadero en los sedimentos de un
humedal natural eutrofizado: Influencia de nutrientes (N y P) (Tesis de doctorado),
Universidad del Valle.
 Carlson, C. A., & Ingraham, J. L. (1983). Comparison of denitrification by Pseudomonas
stutzeri, Pseudomonas aeruginosa, and Paracoccus denitrificans. Appl. Environ.
Microbiol., 45(4), 1247-1253.
 Castro, M. (2014). Evaluación de la comunidad desnitrificante nosZ en la columna de
agua de Isla del Sol, embalse de Prado, Tolima. Revista de la Academia Colombiana de
Ciencias Exactas, Físicas y Naturales, 38(149), 385-392.

-Formato para la presentación de Proyectos PIC y Opciones de Grado – Programa de Biología Aplicada, UMNG 18
  Castro, M. & González, A. (2020). La producción neta de óxido nitroso en un humedal
urbano en Colombia es principalmente influenciada por cambios estacionales. Limnetica
39(2):1-17.
 Castro, M., Pacheco, M. & Restrepo, M. (2020). Temporal changes of sediment microbial
communities in a shallow urban wetland (Santa Maria del Lago, Colombia). En
preparación
 Castro M., Torres, V. (2015). Gases invernadero en aguas con bajo oxígeno en el
reservorio eutrófico de Prado (Colombia). Rev. Acad. Colomb. Cienc. Ex. Fis. Nat.
39(152):399-407.
 Chon, K., Chang, J., Lee, E., Lee, J., Ryu, J., & Cho, J. (2011). Abundance of denitrifying
genes coding for nitrate (narG), nitrite (nirS), and nitrous oxide (nosZ) reductases in
estuarine versus wastewater effluent-fed constructed wetlands. Ecological Engineering,
37(1), 64-69.
 Correa Galeote, D. (2016). Biodiversidad y ecología funcional de bacterias
desnitrificantes. Tesis doctoral. Universidad de Granada.
 Departamento Técnico Administrativo del Medio Ambiente (DAMA). (2000). Historia de
los humedales de Bogotá: con énfasis en cinco de ellos. Bogotá: Alcaldía Mayor de
Bogotá.
 Diemer, R., Harrison, A., & Whitling, W. (2011). Microbial dinitrogen and nitrous oxide
production in a small eutrophic reservoir: An in-situ approach to quantifying hypolimnetic
process rates. Limnology and oceanography, 56(4), 1189-1199.
 Fierro Ortiz, E., & Caballero Rodríguez, L. E. (2015). Evaluación de la calidad del agua
del humedal de santa maría del lago mediante el uso de índices biológicos y
fisicoquímicos para su implementación en otros humedales (Tesis). Universidad Santo
Tomás, Bogotá, Colombia.
 Fort, R. (2012). Emisión de gases de efecto invernadero en el tratamiento de aguas
residuales mediante humedales construidos (Tesis). Universidad Politécnica de Cataluña,
Barcelona.
 Goregues, C.., Michotey, V., & Bonin, P. (2005). Molecular, biochemical, and
physiological approaches for understanding the ecology of denitrification. Microbial
ecology, 49(2), 198-208.
 Huang, S., Chen, C., Yang, X., Wu, Q., & Zhang, R. (2011). Distribution of typical
denitrifying functional genes and diversity of the nirS-encoding bacterial community
related to environmental characteristics of river sediments. Biogeosciences, 8(10), 3041-
3051.
 Hou, J., Cao, X., Song, C., & Zhou, Y. (2013). Predominance of ammonia-oxidizing
archaea and nirK-gene-bearing denitrifiers among ammonia-oxidizing and denitrifying
populations in sediments of a large urban eutrophic lake (lake donghu). Canadian Journal
of Microbiology, 59(7), 456-464.
 Jones, C. M., Stres, B., Rosenquist, M., & Hallin, S. (2008). Phylogenetic analysis of
nitrite, nitric oxide, and nitrous oxide respiratory enzymes reveal a complex evolutionary
history for denitrification. Molecular biology and evolution, 25(9), 1955-1966.

-Formato para la presentación de Proyectos PIC y Opciones de Grado – Programa de Biología Aplicada, UMNG 19
  Ka, J., Urbance, J., Ye, R., Ahn, T., & Tiedje, J. (1997). Diversity of oxygen and N-oxide
regulation of nitrite reductases in denitrifying bacteria. FEMS Microbiology Letters,
156(1), 55-60.
 Kloos, K., Mergel, A., Rösch, C., & Bothe, H. (2001). Denitrification within the genus
Azospirillum and other associative bacteria. Functional Plant Biology, 28(9), 991-998.
 Kuypers, M., Marchant, K. & Kartal, B. (2018). The microbial nitrogen-cycling network.
Nature Reviews Microbiology, 16(5), 263.
 Li, E., & Lu, S. (2017). Denitrification processes and microbial communities in a
sequencing batch reactor treating nanofiltration (NF) concentrate from coking wastewater.
Water Science and Technology, 76(12), 3289-3298.
 Li, F., Li, M., Shi, W., Li, H., Sun, Z., & Gao, Z. (2017). Distinct distribution patterns of
proteobacterial nirK- and nirS-type denitrifiers in the yellow river estuary, china.
Canadian Journal of Microbiology, 63(8), 708-718.
 Liu, H., Ding, Y., Zhang, Q., Liu, X., Xu, J., Li, Y., & Di, H. (2019). Heterotrophic
nitrification and denitrification are the main sources of nitrous oxide in two paddy soils.
Plant and Soil, 445(1), 39-53.
 López, R. (2012). Estado trófico de un humedal urbano andino tropical: Santa María del
Lago. Universidad Militar Nueva Granada. Cajicá, Colombia.
 Martín, Z. (2017). Determinación de la estructura y dinámica de la comunidad perifítica
del humedal Santa María del Lago (Tesis). Universidad Santo Tomás. Bogotá, Colombia.
 Monroy, G. (2017). Estudios ecológicos en humedales de Bogotá: aplicaciones para su
evaluación, seguimiento y manejo. Universidad Nacional de Colombia. (pp 34-35)
Bogotá, Colombia. Coordinación de Publicaciones, Facultad de Ciencias.
 Mengel, K., Kirkby, EA, Kosegarten, H. y Appel, T. (2001). Nitrógeno. En Principios de
nutrición vegetal (pp. 397-434). Springer, Dordrecht.
 Moore E., Arnscheidt A., Krüger A., Strömpl C., y Mau M. (2004). Simplified protocols
for the preparation of genomic DNA from bacterial cultures. Molecular Microbial
Ecology Manual, Second Edition 1.01: 3–18.
 PROMEGA (2011) Assembly of Restriction Enzyme Digestions. Recuperado
de:https://worldwide.promega.com/products/cloning-and-dna-markers/restriction-
enzymes/hhai/?catNum=R6441#specifications.
 Pulido, P., & Pinilla, G. (2017). Evaluación del estado trófico de El Salitre, último
humedal urbano de referencia en Bogotá. Revista de la Academia Colombiana de
Ciencias Exactas, Físicas y Naturales, 41(158), 41-50.
 Poughon, L., Dussap, C., & Gros, J. (2001). Energy model and metabolic flux analysis for
autotrophic nitrifiers. Biotechnology and Bioengineering, 72(4), 416-433.
 RAMSAR (2006). Manual de la Convención de Ramsar: Guía a la convención sobre los
humedales (Ramsar, Irán, 1971). Suiza: 4ta. edición. Gland. (Suiza): Secretaría de la
Convención de Ramsar. (pp 7-10).
 Ren, Y., Ngo, H., Guo, W., Ni, B., & Liu, Y. (2019). Linking the nitrous oxide production
and mitigation with the microbial community in wastewater treatment: A review.
Bioresource Technology Reports, 7, 100191.

-Formato para la presentación de Proyectos PIC y Opciones de Grado – Programa de Biología Aplicada, UMNG 20
  Samuiloviene, A., Bartoli, M., Bonaglia, S., Cardini, U., Vybernaite-Lubiene, I.,
Marzocchi, U., ... & Zilius, M. (2019). The effect of chironomid larvae on nitrogen
cycling and microbial communities in soft sediments. Water, 11(9), 1931-1935.
 Seitzinger, S. (2008). Nitrogen cycle: out of reach. Nature, 452(7184), 162.
 Stein, L. y Klotz, M. (2016). El ciclo del nitrógeno. Current Biology, 26 (3), R94-R98.
 Song, H., Xu, J., Lavoie, M., Fan, X., Liu, G., Sun, L. & Qian, H. (2017). Biological and
chemical factors driving the temporal distribution of cyanobacteria and heterotrophic
bacteria in a eutrophic lake (West Lake, China). Applied microbiology and
biotechnology, 101(4), 1685-1696.
 Tarasova, O., Vermeulen, A., Ueno, M., & Dlugokencky, E. (2019). The state of
greenhouse gases in the atmosphere using global observations through 2017. In
Geophysical Research Abstracts (Vol. 21).
 Thomas, K., Lloyd, D., & Boddy, L. (1994). Effects of oxygen, pH and nitrate
concentration on denitrification by Pseudomonas species. FEMS microbiology letters,
118(1-2), 181-186.
 Villa, H. (2012). Importancia histórica y cultural de los humedales del borde norte de
Bogotá (Colombia). Revista UDCA Actualidad & Divulgación Científica, 15(1), 167-180.
 Vinasco, J., & Solís, A. (2011). Estimación de gases de efecto invernadero en humedales
construidos de flujo subsuperficial. Ingeniería y Universidad, 15(2).
 Wang, H., Yang, L., Wang, W., Lu, J., & Yin, C. (2007). Nitrous oxide (N2O) fluxes and
their relationships with water‐sediment characteristics in a hyper‐eutrophic shallow lake,
China. Journal of Geophysical Research: Biogeosciences, 112(G1).
 Wallenstein, M., Myrold, D., Firestone, M., & Voytek, M. (2006). Environmental controls
on denitrifying communities and denitrification rates: insights from molecular methods.
Ecological applications, 16(6), 2143-2152.
 Wang, H., Yang, L., Wang, W., Lu, J., & Yin, C. (2007). Nitrous oxide (N2O) fluxes and
their relationships with water‐sediment characteristics in a hyper‐eutrophic shallow lake,
China. Journal of Geophysical Research: Biogeosciences, 112(G1).
 Yang, A., Zhang, X., Agogué, H., Dupuy, C., & Gong, J. (2015). Contrasting
spatiotemporal patterns and environmental drivers of diversity and community structure
of ammonia oxidizers, denitrifiers, and anammox bacteria in sediments of estuarine tidal
flats. Annals of microbiology, 65(2), 879-890.
 Zhang, Y., Song, C., Zhou, Z., Cao, X., & Zhou, Y. (2019). Coupling between
Nitrification and Denitrification as well as Its Effect on Phosphorus Release in Sediments
of Chinese Shallow Lakes. Water, 11(9), 1809-1812.
 Zumft, W. G. (1997). Cell biology and molecular basis of denitrification. Microbiol. Mol.
Biol. Rev., 61(4), 533-616.

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 9. ANEXOS
9.1 Cronograma.

En el documento adjunto se relaciona el cronograma del desarrollo del proyecto de investigación de la

propuesta de tesis. Este está comprendido en un periodo de 18 meses, dando inicio con el artículo de
revisión y finalización con la sustentación del trabajo de grado. Se puede observar el esquema muestra
el porcentaje de copleado de cada supuesto en el desarrollo de la investigación.

9.2 Presupuesto.

9.2.1 Presupuesto global de la propuesta por fuentes de financiación (en miles de $).
RUBROS FUENTES TOTAL
UMNG
PERSONAL $ 3.200 $ 3.200
EQUIPOS $ 2.000 $2.000
SOFTWARE  - -
MATERIALES $ 6.000 $ 6.000
TOTAL $ 11.200 $ 11.200

9.2.2 Descripción de los gastos de personal (en miles de $).

Nombre del RECURSO TOTA
Tipo de Función Número de S L
Investigador y DEDICACIÓ
vinculación dentro en meses de
formación N
con la el vinculación con
académica / Experto/ Horas/semana UMNG
UMNG proyecto el proyecto
Auxiliar
Maribeb Castro Docente Director 12 1 $3200 $3200
María Fernanda Estudiante Tesista 12 40 - -
Bejarano
TOTAL $3.200 $3.200
* Agregar una columna para cada fuente de financiación diferente de la entidad que presenta el
proyecto.

9.2.3 Descripción del software que se planea adquirir (en miles de $).
JUSTIFICACIÓ RECURSOS TOTAL
SOFTWARE
N UMNG
Análisis
R Studio estadísticos y de - -
comparación.

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 9.2.4 Descripción y cuantificación de los equipos de uso propio (en miles de $)

VALOR
EQUIPO
(UMNG)
Incubadora $102
Centrifuga $737
Cabina de flujo laminar $669
Termociclador $497
Cámara de electroforesis $91
Cromatógrafo de gases $699
TOTAL $2795

9.2.4 Materiales y suministros (en miles de $)

Materiales* Justificación UMNG TOTAL
Vidriería, desechable , Kit análisis Tratamiento de muestras y $6000 $6000
molecular. extracción ADN y N2O

TOTAL $6000

9.3 Primers utilizados en la amplificación de nirS y nos Z

Tabla 1. Primers usados en PCR para amplificación de genes funcionales.

Perfil térmico
Ge Primers Tamaño
Referencia
n (5`-3`) (pb)
Desnaturalización Alineamiento Extensión Ciclos

NirS1F- 890 95 °C * 5 min/5 seg 57 °C*30 seg 72ºC *40 seg 30 Zhang et
NirS6R al.,2019.

Cd3aF- 410 95 °C* 1 min/45 55 ° C * 45 seg 72ºC * 45 seg 40 Liu et a., 2019.
nirS
R3cd seg

R4bcd- 856 t 94 ◦C* 10 min 94 ◦C*1 min, 60 ◦C*1 72 ◦C* 5 min 40 Samuiloviene et
R3cd min, 72 ◦C *1.5 min al., 2019.

nosZF- 267 95°C * 3 min 95°C *30 seg*, 53ºC* 72°C * 10min 35 Yang et al.,2015.
nosZ16 40 seg, 72°C * 40 seg
22R

nos1527 - 95ºC * 30seg 95ºC*10 seg, 59ºC *20 72ºC *10 min 45 Li & Lu, 2017.
nosZ F- seg, 72ºC * 20 seg
Nos152
7R

nosZ11 700 94°C *20 seg 65°C*30 seg, 72°C * 40 72°C * 10 min Kloos et al., 2001

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 88F- seg
nosZ18
69R
Tabla 1: Representación de cebadores utilizados para la amplificación de genes funcionales por PCR y su respectivo perfil
térmico.

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