Rojo de Fenol + CHO Caldo nitrato
Indicador Rojo de fenol
Incubación 18-24 hrs
Reactivos Ninguno
usados para la
interpretación
Tamaño del Liviano
inoculo
Bacterias que Miembros de la familia
identifica Enterobacteriaceae
Fundamento Determinar la capacidad de un
microorganismo para fermentar
(degradar) un hidrato de carbono
especifico incorporado en un
medio basal y producir acido o
acido con gas visible.
La principal vía fermentativa de
degradación de la glucosa es la
vía de Embden–Meyerhof-Parmas
(EMP), aunque la degradación
puede ocurrir por vía o en
combinación con el shunt
(desviación) de la pentosa (vía de
Warburg-Dickins, shunt de
monofosfato de hexosa (HMP) o ia
de Entner-Doudoroff (ED). Sin
embargo, las requieren de la
fosforilación inicial de la glucosa
antes de que pueda ocurrir la
degradación.
Interpretación 1. Un cambio de color del caldo de
Rojo a Amarillo, indica que el
microorganismo ha utilizado el
carbohidrato correspondiente.
2. Si no se parecía cambio de
Rojo de metilo (RM)
Ninguno Ninguno
35°C de 24-48 hrs
Reactivo A: α- Naftilamina o N,
N-dimetil-α-naftilamina.
Reactivo B:Acido sulfanílico
Denso
Enterobacterias
Determinar la capacidad de un
microorganismo de reducir los
nitratos a nitritos o a gas
nitrógeno libre, en un medio
líquido de caldo nitratado.
En esta prueba se detecta una
respiración anaerobia: la que
utiliza nitrato como aceptor
final de electrones y así
obtener oxígeno a partir del
nitrato. Los nitratos se
reducen a nitritos y algunas
bacterias reducen los nitritos a
productos gaseosos (N2 y
N2O). Las enzimas
responsables de ambas
reducciones se denominan
nitrato y nitrito reductasa,
respectivamente.
La presencia de nitritos en el
medio de prueba se detecta al
agregar el reactivo A y el
reactivo B en igual
proporción, dando un color
rojo intenso por la formación
de un compuesto de diazonio
(p-sulfobenceno-azo-α-
naftilamina) después de 1 a 2
minutos, lo cual indica que los
nitratos fueron reducidos a
nitritos.
1. Si el medio revela un color
rojo, entonces el
microorganismo es capaz de
reducir nitrato a nitrito.
(Prueba positiva)
Voges Proskauer (VP)
Ninguno
35°C de 48-72 hrs
Rojo de metilo
Liviano
Bacterias entéricas,
principalmente para diferenciar
entre la E. Coli y los grupos
Klebsiella-Enterobacter.
Determina la capacidad de un
microorganismo para producir
acido suficiente por la
degradación de la glucosa por la
vía de fermentación acida mixta
para mantener el pH por debajo
de 4,4 (el valor críticos de color
acido del indicador rojo de
metilo). Los principales ácidos
“fuertes” que se producen por
esta vía son el ácido láctico,
acido succínico, ácido acético y
ácido fórmico.
1. Un cambio de color del caldo
a Rojo, indica que el
microorganismo metaboliza la
glucosa produciendo grandes
cantidades de ácidos “fuertes”
Gelatina nutritiva
Ninguno
35° de 24-48 hrs 22-25°C o 35°C durante 24 hrs a 14 días
Α-naftol al 5% Ninguno
KOH al 40% En ambiente de anaerobiosis se puede agregar
tiosulfato de sodio al 0.05% para el cultivo de
ciertos clostridios.
Liviano Abundante/ Denso
Algunas cepas del grupo Identificación de bacterias fermentadoras
Klebsiella-Enterobacter- (Enterobacteriaceae) y no fermentadoras,
Serratia-Hafnia principalmente para identificar cultivos puros.
Postivas:
 Staphylococcus aures
 Staphylococcus epidermis (lenta)
 Serratia liquefaciens
 Serratia marcescens
 Pseudomonas aeruginosa
 Especies de Flavobacteriumm
Negativas:
 Listeria mnocytogenes
Determina la capacidad de un Determina la capacidad de un microorganismo de
microorganismo de degradar la producir enzimas de tipo proteolítico (gelatinasas)
glucosa por la vía de a que licuan/hidrolizan la gelatina o muestran
fermentación de butilenglicol cambios característicos debido a los productos de
produciendo baja cantidad de degradación.
ácidos y mayormente productos La gelatina es una proteína derivada del colágeno
neutros como la acetoína (acetil animal.
metil carbonil), la cual al Las proteínas que se producen naturalmente son
adicionar hidróxido de potasio demasiado grandes para entrar en una célula
en presencia de oxigeno bacteriana, por lo que para que una célula utilice
atmosférico, se transformó a las proteínas, primero deben ser catabolizadas en
diacetilo. El diacetilo se componentes más pequeños. Las enzimas
convierte en un complejo rojo al extracelulares del tipo proteolítico, gelatinasas,
reaccionar con la peptona del son secretadas por ciertas bacterias para
medio por acción catalítica del desdoblar a las proteínas, esta capacidad ayuda a
α-naftol. la identificación bacteriana.
1. Un cambio de color del caldo 1. Licuefacción (L): El medio se encuentra licuado.
a Rojo, indica que el La licuefacción de la gelatina comienza en la
microorganismo es capaz de superficie del medio y se extiende; la magnitud
metabolizar la glucosa en depende del grado de licuefacción.
acetoína como producto 2. Sin licuefacción (SL):
 color o es rosa a rojizo, entonces
se reporta como negativo para la
utilización del carbohidrato.
3. Una coloración naranja se
reporta como tardío y deberá de
volverse a incubar.
En caso de haber puesto la
Campana de Durham se podrá
observar una burbuja, lo que se
interpreta como producción de
Gas (Anaerógeno)
Consideraciones 1. El medio con hidratos de
especiales carbono, cuando se calienta o se
retira de la autoclave, posee un
color anaranjado suave. Esto
cambia al naranja-rojo cuando se
enfría.
2. Todos los hidratos de carbono
deben rotularse de manera
apropiada inmediatamente
después de la preparación. Todos
los hidratos de carbono parecen
iguales y deben prepararse en una
gradilla en un orden determinado,
lo que depende del protocolo de
laboratorio.
3. Se recomienda reportar como
Acidez en lugar de positivo. Si
existe gas se podrá reportar como
2. Si el medio no cambia de suficientes para disminuir el pH intermediario derivado del a) El medio permanece sólido.
color, puede ser por dos del medio. Se reporta como metabolismo de la glucosa b. Reincubar un tiempo adicional.
razones: positivo. (fermentación butanodiolica). 3. Tubo control: El medio permanece sólido, forma
 Porque la bacteria 2. Si no se aprecia un cambio de Esto a pocos minutos después un gel firme debido a la resolidificación de la
no reduce a nitrito color en el caldo indica que el de una agitación competa del gelatina no licuada.
(Prueba negativa) microorganismo metaboliza la tubo.
 Porque la bacteria glucosa obteniendo productos 2. Si no se apreció un cambio de
reduce de Nitrato a neutros y baja cantidad de color a Rojo en el caldo indica
Nitrito y este a N2 o ácidos. Se reporta como que no produce acetoina como
N2O (gas). negativo. producto de la degradación de la
En este último punto se puede glucosa.
presentar un falso negativo,
por lo que es importante
comprobar si la bacteria
reduce a gas de dos maneras:
 Añadiendo Zinc al
medio. Si después
de añadir el Zinc no
se observa color
quiere decir que los
nitratos han sido
reducidos a N2 o
N2O (gas). (Prueba
positiva)
Si después de
añadir zinc se
observa color
rosado-rojizo
después de 5 a 10
min quiere decir que
hay nitratos en el
medio (Prueba
negativa)
 Colocando una
campana de
Durham (del revés)
en el tubo de
ensayo para
comprobar la
formación de gas.
1. La α-Naftilamina es 1. Si la reacción es negativa, 1. El orden de adición de 1. La gelatina varia en su capacidad de
cancerígena, por lo que se puede continuar incubando reactivos es fundamental. La gelificación. Procesar siempre un tubo control (no
sustituye por N, N-dimetil-α- durante otros 3 días (a 30°C) y adición invertida puede dar lugar licuado) en paralelo con el microorganismo a
naftilamina. agregar un poco más de rojo de a falsos negativos. probar; un solo control es suficiente si se prueban
2. El medio basal para metilo. 2. La prueba no debe leerse varios microorganismos simultáneamente pero
efectuar esta prueba contiene 2. Si se realiza la prueba antes después de 1 h después del solo si todos los tubos se siembran al mismo
nitrato de potasio (KNO3) en del tiempo de incubación reposo, ya que se puede tiempo.
una concentración de 0.1%. indicado se podrían obtener desarrollar un color cobrizo e 2. La gelatina es sólida cuando se incuba a 20°C o
3. El color producido en una resultados incorrectos. interpretarse como positivo menos y es líquida a una temperatura de 35°C o
reacción positiva puede (falso positivo) superior. La gelatina cambia de un gel (sólido) a
perderse con rapidez por ello un líquido aproximadamente a los 28 °C. Por lo
se tiene que interpretar los que si los tubos de gelatina se incuban a 35°C o
resultados de inmediato. más, deben colocarse en un refrigerador o baño
de hielo y deben enfriarse antes de determinar si
hay licuefacción.
3. No sacudir la gelatina mientras está caliente, ya
que el desarrollo y la licuefacción de la gelatina
con frecuencia sólo ocurren en la capa superficial.
AG. Si la gelatina se agita y se mezcla con el líquido
caliente del medio, el microbiólogo puede pasar
por alto un resultado positivo e informar un
resultado falso negativo.
4. La velocidad de licuefacción depende de la
edad del medio con gelatina; la viscosidad de la
gelatina esterilizada en autoclave aumenta con el
almacenamiento a temperatura ambiente.
5. La sensibilidad de la licuefacción de la gelatina
aumenta a concentraciones más bajas; la gelatina
al 4% forma un gel a 5°C que se mantiene a 21°C.
6. Una concentración de gelatina de 12-15%
puede inhibir el desarrollo.
7. La gelatina debe estar libre de hidratos de
carbono fermentables.
8. A 30-35°C de incubación, la gelatina es un
líquido; por consiguiente, no pueden usarse picos
de flauta.
9. Una concentración de gelatina de 12-15%
puede inhibir el desarrollo.
9. Para determinar la licuefacción de la gelatina
por especies con requerimientos especiales y
anaerobios obligados debe usarse Thiogel.
Reacción y Resultados

 Rojo de fenol

 Caldo nitrato

 Rojo de metilo

 Voges Proskauer (VP)
 Gelatina nutritiva

El catabolismo de las proteínas por parte de las gelatinasas es un proceso de dos pasos; el resultado final es una mezcla de aminoácidos aislados.
La gelatina es hidrolizada por la gelatinasa en sus aminoácidos constitutivos, con pérdida de sus características gelificantes.