Apuntes

Prototipo de Inhibidores Bacterianos de ADN Ligasa dependientes de NAD+

Las ADN ligasas se unen a los extremos adyacentes 3'-hidroxilo y 5'-fosforilo para formar
un enlace fosfodiéster en el ADN dúplex. Las ADN ligasas funcionan en la replicación del
ADN uniendo fragmentos de Okazaki en la hebra rezagada del ADN y participan en varias
vías de reparación del ADN (p. Ej., Reparación por escisión de nucleótidos). La ligadura
del ADN procede en tres pasos de transferencia de nucleotido. El primer paso implica la
formación de un intermedio de ADN ligasa-adenilato covalente. En el segundo paso, el
AMP(nucleótido que funciona como segundo mensajero en varios procesos biológicos. Es
un derivado del adenosín trifosfato ATP) se transfiere de la ADN ligasa al fosfato'del ADN
cortado a través de un enlace pirofosfato. En el tercer paso, se forma un enlace fosfodiéster
para unir polinucleótidos adyacentes y se libera AMP
Las ADN ligasas se agrupan en dos familias según el sustrato (NAD + o ATP) utilizado
para formar el intermedio ADN ligasa-adenilato. Las ADN ligasas bacterianas dependientes
de NAD + pertenecen a un grupo filogenético de enzimas distinto y altamente
conservado. Por el contrario, las ADN ligasas dependientes de ATP de mamíferos, hongos
y virus forman un grupo poco definido de enzimas asociadas. Las ADN
ligasas bacterianas dependientes de NAD + son esenciales para la viabilidad de todas las
bacterias Gram positivas y Gram negativas analizadas hasta la fecha, incluidas Bacillus
subtilis , Staphylococcus aureus , Streptococcus pneumoniae , Salmonella entericaserovar
Typhimurium y Escherichia coli 
Esta ha atraído interés como una posible diana antibacteriana de amplio espectro porque es
indispensable para la replicación del ADN, en este trabajo plantearemos el diseño de un
nuevo análogo de adenosina sustituido el cual sirve como inhibidor selectivo de ADN
ligasas dependientes de NAD + .

Se llevo a cabo una investigación en bases de datos para reconocer cuales eran las
moléculas que se adherían a la ligasa y su rol en la misma, para posteriormente identificar
inhibidores de S. aureus RN4220 LigA mediante el uso de un ensayo de ligación de ADN 
Proceso
Para comenzar se deben aislar Los fragmentos de ADN que contienen el gen ligA los cuales
van a ser separados mediante la técnica PCR en un plásmido apropiado mediante un
proceso denominado ligación utilizando cebadores y ADN genómico molde aislado de S.
aureus RN4220() una vez que se haya verificado la secuencia del ADN clonado se
construyen cepas para la evaluación del modo de acción contra LigA, posteriormente se
procede con la purificación del fragmento y así poder utilizar el método de resonancia de
florecencia para medir la energía de DNA ligasa en el bacteria
Para determinar si la ADN ligasa estaba inhibida en bacterias, se deben observar  los
niveles intracelulares de fragmentos de Okazaki DE S. aureus RN4220 fraccionando en
conjuntos de ADN en gradientes de sacarosa
Funcionamiento de inhibidor
la función primordial de la ligasa es catalizar un enlace fosfodiéster entre el grupo 3'-
hidroxilo extremo de una de las cadenas de ADN y el grupo 5'-difosfato del extremo de la
otra cadena de ADN. Y esto debe hacerse en función de un sustrato en este caso el NAD+
el cual el cual va a efectuar la hibridación. Por ende al inocular el análogo de adenosina , a
nivel intracelular va competir con el sustrato NAD+ para que funcione la enzima, sin
embargo, si ocurre la unión al análogo este cambiara el sitio activo de la enzima impidiendo
la unión con el sustrato de NAD+, generando la inhibición de la replicación del DNA
generando la disminución reproductiva de la misma.

Analogo
El Staphylococcus aureus 
Utiliza el NAD como coenzima y como fuente de energía para la reacción. Es esencial para
la replicación del ADN y la reparación del ADN dañado.La cual Utiliza la posición 112
como sitio activo, y las posiciones 32-36, 81-82 para la unión de nucleótidos. En donde la
Catálisis de la reacción: NAD + + desoxirribonucleótido (n) + desoxirribonucleótido (m) =
AMP + nucleótido de nicotinamida + desoxirribonucleótido (n + m).
El análogo de adenosina se une en el bolsillo de unión a AMP del dominio de adenilación
de LigA, estudios experimentales establecen que este análogo reduce la carga bacteriana en
el tejido de un órgano infectado correspondiente hasta 1000 veces, estableciendo así la
LigA como un objetivo para la terapia antibacteriana.