CLASE DOPPING: 23/04/09

Análisis de screening o técnicas de screening para conocer cual es la posible droga que puedo tener
en la matriz biológica que estoy analizando.

INMUNOENSAYOS

Inmunoensayo nueva técnica desde la década de los 50 y en un principio estuvo dedicada a estudiar
los casos nuevos que se presentaban en pacientes diabéticos que usaban insulina, y que tenían
respuesta inmune a ella y había que identificar anticuerpos en el organismo. Y para esto se creo esta
técnica denominada yodo 131. Se les extraía una muestra de sangre al pacte. que debería tener el
anticuerpo formado e iba a existir una competencia entre la insulina sin estar marcada y aquella
marcada con yodo 131. Ambos antígenos (la insulina y la insulina marcada) iban a competir por los
sitios de unión del anticuerpo. La cantidad de insulina marcada que se unía al anticuerpo se podía
cuantificar a través de la medición de la radiación gamma y así se sabia de forma indirecta la
cantidad de anticuerpos que la persona producía. Luego esta técnica se empezó a utilizar para
cuantificación de diversos grupos. Hasta ese momento no existía una técnica rápida que permitiera
detectar los niveles de hormonas de una persona, y a partir de inmunoensayos se empezó a hacer.
Esta primera técnica que utilizaba un marcador que emitía radiación se denominó RIA,
radioinmunoensayo, que fue la primera técnica analítica.

¿Como se producen los anticuerpos?

Tenemos al organismo, mamíferos que al estar expuestos a antígenos, los linfocitos van a producir
anticuerpos. De estos hay diferentes, los anticuerpos son las inmunoglobulinas, la M, G, E, A, D.
generalmente en los imunoensayos se utiliza la igG, que es la que se produce en mayor proporción en
la rpta. inmune (90%).
¿Cuándo se logra esta máxima proporción?
Después de 14 días de la exposición al antígeno. Las técnicas de inmunoensayo siempre todas se
basan en la competición entre un antígeno y un antígeno marcado, por el anticuerpo.
Monito: anticuerpo, tenemos los dos casos, tenemos el caso de una droga que estamos analizando en
la matriz biológica, se va a unir al anticuerpo y va a producir este complejo, y va a producir su
constante de formación los enlaces no son covalentes sino que son enlaces que pueden variar
dependiendo de las condiciones del medio. Se produce la competencia de la droga con marcador,
que compite con la droga por el mismo sitio de unión en el anticuerpo.
Monito esquematica de lo que es el radioinmunoensayo: el radioinmunoensayo utiliza un tubo que en
el fondo de la pared se encuentran los anticuerpos, ahí en rombo esta la droga y en rombo con
asterisco la droga marcada. ¿Que ocurre? Cuando hay alta concentración de droga, la droga se unirá
altamente al anticuerpo y en menor cantidad se une la droga marcada. Cuando hay bajas
concentraciones de droga la droga se unirá en menor proporción al anticuerpo y la mayor cantidad de
pick de unión al anticuerpo va a estar dado por la unión de la droga marcada. Esto se ve graficando
concentración de droga no marcada por la intensidad de señal (medido en radiación gamma) y puedo
obtener una curva, si yo quiero linealizar esta curva, aplico logaritmo y voy a tener una curva de
logaritmo de la concentración de la droga que estoy midiendo v/s log de intensidad de radiación
gamma.
Mono igG: la igG es una proteína que pesa alrededor de 150 mil Dalton, tiene dos cadenas livianas
color blanco, y cadenas pesadas oscuras de color negro. El antígeno se une a la fracción ab.
Lo que se une al anticuerpo, los antígenos deben tener ciertas características para unirse al
anticuerpo, es una unión relativamente especifica. Esta regida por la composición molecular del
antígeno. Por ejemplo si tengo kit para analizar anfetamina, el kit de anticuerpos será específico para
unirse a anfetamina y nada más. Pero también tengo que tener en cuenta la orientación espacial de la
molécula. Porque la unión es tan especifica, que no tiene la misma especificidad o grado de unión
para dextroanfetamina que para levo. Por lo tanto estas dos condiciones tiene que tener el antígeno
para que se una al anticuerpo.
El problema es como yo puedo producir anticuerpos para una droga en particular, si sabemos que si
hay una rpta. inmune el antígeno tiene que tener un peso molecular elevado y la droga no lo tiene,
por ejemplo la anfetamina 135 Da y las drogas en general para la cual esta hecho el inmunoensayo,
ninguna tiene peso molecular mayor a 380?. Por lo tanto para producir anticuerpos para esta droga en
conejo no lo voy a conseguir. La idea es unir la droga que es una molecula pequeña, a una
macromolécula y así conseguir una respuesta inmune o antigénica.
Esto se consigue, así: convertir la droga en una astemia , esta astemia se va a formar dependiendo de
los grupos funcionales de la droga. Depende si es un hidroxilo, carbonilo o un aldehído
convertiremos la droga químicamente para obtener un hemisuccinato o una oxima. Si la droga que
quiero unir a la macromolécula tiene un grupo amino yo directamente puedo unir mi droga a la
macromolécula. Si la droga tiene alguno de los grupos funcionales nombrados arriba, primero tengo
que convertir la droga a lo que se nombró, antes de unirla a la macromolécula.
Las macromoléculas pueden ser albuminas humanas o bovinas, pueden ser tiroglobulinas, polilisinas
hemocianinas. Que es una molécula que transporta oxigeno y se encuentra en ciertas especies de
mono??.
Como mi droga ya la transforme en hemosuccinato. Ya obtuve la astemia produzco lo que se llama
un inmunogeno que es lo que se inyecta en el animal en el cual quiero producir la respuesta inmune.
Aquí esta explicado, por ejemplo la metanfetamina se combina con este producto, alargo su cadena,
tengo el asteno este lo uno a la proteína macromolécula y así obtengo el inmunogeno.
Entonces esta respuesta inmune (una vez que inyecte inmunogeno en animal) puedo producir en el
laboratorio, dos anticuerpos :monoclonales o policlonales la diferencia es que los policlonales se
producen en animales. Yo tengo inmunogeno lo inyecto en animal, después de 14 dias en que se
produce la máxima cantidad de igG, extraigo y obtengo diferentes tipos de anticuerpos que se
produjeron para ese inmunogeno. La desventaja es que los anticuerpos producidos tienen diferente
especificidad. En un conejo voy a obtener distintos títulos de anticuerpos aunque inyecte el mismo
inmunogeno. Esto es poco conveniente para el análisis.
Los monoclonales se producen in vitro
mono: arriba la droga que tiene diferentes sitios de respuesta inmune, hay un sitio A que es un
cuadrado, B que es una semicircunferencia y C que es un triangulo. El inmunogeno se inyecta en el
ratón pasado 14 días yo extraigo sangre del ratón, mas o menos unos 10 ml y obtengo anticuerpos.
Anticuerpos que se van a producir para el sitio A, para el sitio B y para el sitio C, por lo tanto, la
afinidad de cada uno de los anticuerpos es distinta. Distintas km para A,B,C y nunca produzco la
misma cantidad de anticuerpos para cada uno de los sitios de mi droga. Esto se soluciona con los
monoclonales, ¿como se hace?, al ratón se le extrae el bazo, donde se encuentra mayor la cantidad
de linfocitos que son los encargados de producir anticuerpos. Saco los linfocitos y estos linfocitos por
una técnica de hibridación lo uno a células tumorales, y los coloco en un medio de cultivo y obtengo
millones de hibridomas. Los hibridomas por una parte van a tener el linfocito encargado de producir
anticuerpos y por otro lado una celula tumoral, la celula tumoral necesita una reproducción en el
tiempo casi infinita. Si pongo en el medio de cultivo solo al linfocito, pasado cierto número de
generaciones (3,4), en el medio de cultivo no va a haber linfocito. Para esto si lo uno a células
tumorales, genero hibridomas A,B,C y D, si a mi me interesa solamente uno, los separo y replico por
ejemplo solo el hibridoma A, para que surjan solo anticuerpos para el sitio A. así consigo anticuerpo
que es especifico para el sitio de unión que yo estoy buscando.
Lo importante en la técnica monoclonal, es su especificidad, la cual se define como la capacidad del
ensayo de detectar únicamente un compuesto en específico. Como trabajamos con matrices
biológicas, el voluntario debe solamente ser capaz de reconocer la droga (uña, pelo, etc). el
anticuerpo producido debe ser solamente capaz de detectar el analito.
El anticuerpo para anfetamina, será capaz de detectar otras cosas? Si tengo un compuesto parecido a
la anfetamina, que es una fenilalquilamina, con la misma orientación espacial, esta molécula seria
capaz de unirse al anticuerpo y esto se denomina reacción cruzada.
Reacción cruzada: grado de respuesta en un inmunoensayo, a una sustancia que es diferente al
analito.
Ejemplo, cuando utlilizo técnica de inmunoensayo, siempre el fabricante de la técnica, en el cierre
del tríptico pone este inmunoensayo tiene la siguiente reactividad cruzada. Por ejemplo anfetamina o
metanfetamina, puede ser con MDA, MDMA, Cloroquina extasis efedrina, pseudoefedrina,
fenilpropanolamina, fentarmina, ….etc. unas sustancias que tienen un nitrógeno en la molécula.
La BZD puede tener reacciones cruzadas con Clorpromazina
La cocaína con ecgonina, ecgonina metil ester
El canabinoide, metabolitos de THC, reacción cruzada con casi todos los AINES
LSD con otros componentes derivados del ergot, como la ergotamina, o fentanilo, ATD triciclicos,
verapamilo.
Morfina reacción cruzada con todos los opiáceos,
Etc.
Las reactividades cruzadas no tienen la misma posibilidad de unión, por ejemplo para la anfetamina,
entregan una tabla en donde sale que la dextrometanfetamina va a tener una reactividad con
anticuerpo que es un 100%, dextroanfetamina es un 100%, para el isómero levo de anfetamina es un
50%. Diapos!! Se refiere al % de que si se va a unir al anticuerpo.
La ractividad cruzada depende de concentración de analito, por ejemplo pseudoefedrina 100 ppm
tiene casi nada y a los 1000 ppm la mitad de nada, si una persona que tomo nastizol se hace
inmunoensayo de anfetamina debería salir negativa. Pero depende de las concetraciones. En orina la
anfetamina y metanfetamina no se excretan mas alla de los 5 mil nanogramos por ml. A diferencia de
pseudoefedrina o efedrina que las cantidades que se excretan van desde los 10 mil nanogramos hasta
los 200 mil nanogramos por ml. Por lo tanto, estos datos de reactividad cruzada están siempre para
una concentración.
Si tengo 100 mil nanogramos de pseudoefedrina estoy obligando casi mi antígeno (pseudoefedrina)
se una al anticuerpo. Por lo tanto el porcentaje de reactividad será elevado. Y esto se ve porque saldrá
positiva al inmunoensayo de metanfetamina.
Todos los análisis de droga a diferencia de otros, son mas problemáticos ya que siempre el resultado
tendrá un sanción. Si se trata de adulterar las muestras, con el fin de que el resultado salga negativo,
agregando ácidos, bases,a la orina, detergentes, blanqueadores, vanish, sal. ….etc. estos adulterantes
se pueden detectar por medios físicos o químicos. Si agrego acido o base lo detecto por pH, si agrego
….. con agua mido densidad de liquidos, si agrego sal, lo mismo. Antes de hacer análisis, tengo que
tener identidad de la muestra, para ver si hubo adulteración, si la persona toma mucho agua, va a
diluir la orina y disminución de la densidad y alteración de la concentración original de la droga,
entonces mido densidad y mido pH.
Antes de realizar inmunoensayo uno debe cerciorarse que esta muestra no tenga adulterante. Tomar
pH , densidad, nitritos y medición de creatinina. Todo esto tiene que estar dentro de parámetros
normales, si es así se analiza, si no, no porque está adulterada.
Estas muestras pueden dar falsos negativos, dependiendo de la droga que estoy analizando y el
método que utilizo, por ejemplo si tengo una acido comúnmente me va a afectar el EIA, que es como
el ELIS y es un método en el cual la droga está unida a una enzima, el RIA que es un
radioinmunoensayo. Un blanqueador afecta al FPI, que es por luz polarizada, al NA, al enzimático,
etc. Si agrego tal adulterante cual inmunoensayo voy a alterar dando falso negativo a un positivo 
en tabla diapo!
Los compuestos marcadores hacen la diferencia entre un inmunoensayo y otro, y deben tener dos
características:
- inmunologicamnte similares al (compuesto problema) analito o antígeno para que puedan
competir por el sitio de unión al anticuerpo.
- Deben detectarse sin que haya interferencias de la matriz biológica

Marcadores pueden ser: moléculas radiactivas, fluorescentes, enzimas, macropartículas, etc. La

molécula marcada se agrega a la mezcla reactiva en el inmunoensayo. Y los cambios asociados al
marcador se usan para medir la cantidad de compuesto marcado en el ensayo.
Cuando hagamos laboratorio instrumental, haremos tres técnicas diferentes de inmunoensayo,
haremos test de elisa, FPIA, inmunocromatografía. No todas las técnicas de inmunoensayo son
iguales, porque existen técnicas heterogeneas y homogéneas.
Inmuoensayo heterogeneo: se requiere separación de antígeno libre y antígeno enlazado antes de
medir antígeno marcado. En el caso del RIA, se supone que va a estar la droga y droga marcada,
ambos compiten por unión a anticuerpo, y lo que no se unió voy a tener que sacarlo, antes de medir
cual fue la proporción de antígeno marcado que se unió al anticuerpo.
Inmunoensayo homogéneo: no es necesario separar, lo que no se unió al anticuerpo y quedo en
solución, no va a interferir en nada en la medición del complejo que se forma entre el anticuerpo y el
antígeno marcado.
El apellido de inmunoensayo depende de marcador a utilizar.
RIA, el marcador es yodo radioactivo?
EMIT, es enziamtico.
FPIA, fluorescencia por luz polarizada
CEDIA
ELISA
KIM, usa microparticulasw
Etc.
En el laboratorio, haremos FPIA. Voy a tener anticuerpo, si la persona no ha consumido droga, toda
droga marcada (unida a fluoresceína) se va a unir a anticuerpo y se va a formar complejo anticuerpo-
droga marcada y fluorescencia. Si la persona si consumio droga toda esa droga se va a unir al
anticuerpo, y la droga unida a fluoresceina va a quedar libre en el medio. Entonces la fluoresceina es
un compuesto que al hacer incidir luz polarizada sobre ella va a absorber a 450 nm, y va emitir luz
polarizada fluoerscente entre los 520 y los 550 nm. Cuando la persona no consumio droga, la
fluorseceina es grande y al unirse al anticuerpo va a formar un complejo grande que rotara muy lento
en la solución. Si a este complejo le hago incidir luz polarizada, al rotar muy lentamente, va a reflejar
luz polarizada que se verá como fluoerescencia y es lo que estoy midiendo.y será alta. Y esto en el
grafico se ve, cantidad de luz polarizada, concentración de droga. Si la cantidad de luz polarizada es
alta, la concentración de droga es baja.
Si la persona si consumio droga, droga se unió al anticuerpo y complejo que se forma entre
anticuerpo y droga marcada, va a ser de menor peso, y va a rotar de forma mas libre en la solución,
por lo tanto, al hacer visible luz polarizada ya no va a reflejarse como luz polarizada sino que va a ser
luz en diferente escala, por lo tanto, la intensidad de luz polarizada que voy a medir va a ser mas baja.
Siempre la afinidad de droga con anticuerpo tiene que ser un poco mayor a la del anticuerpo-droga
marcada. Ambos tienen que competir pero depende de las concentraciones, no es lo mismo una
persona con 50 nanogramos por ml que va a lograr un porcentaje de unión al anticuerpo, si tengo
150 ng por ml este porcentaje aumenta. Esto es automatizado, comúnmente uno tiene un tubo de
orina (150 ul) al cual le agraga un kit con droga marcada, buffer con anticuerpo, se coloca run y el
equipo hace todo, sabe cuanto tomar de todo.
*Ventajas de método con luz polarizada,
- Es homogénea,
- El complejo droga-fluoresceina es mas estable que droga-enzima por lo tanto duración de los
reactivos es mayor que para elisa
- Limite de detección es bajo
- Efecto de matriz pequeño (matriz que interfiere en la medición)
* Desventajas:
- cuando hay sales biliares también tienen propiedades fluorescentes y pueden dar falsos positivos.
- Es más costoso que inmunoensayos enzimáticos.
La otra técnica que se hara en laboratorio es ELISA, se basa en droga marcada con enzima
peroxidasa y sobre esta un sustrato que es TMB. Al producirse la reacción enzimática se produce
compuesto coloreado de color azul. El color azul va a tener una absorción de longitud de onda a los
850 nm. En el lab vamos a tener muestras controles de concentración conocida de la droga, una
muestra negativa de la droga (orina negativa) y muestras reales de cocaína , de marihuana ,
anfetamina. que ocurre cuando se esta en presencia de la droga, que se une al anticuerpo fijo en el
posillo, al agregar la droga marcada (unida a la enzima), como los sitios de unión al anticuerpo ya
están ocupados, no van a haber sitios de unión. Y como es heterogéneo voy a tener que sacar la droga
unida a enzima que no se unió al anticuerpo y queda solución incolora.
Si muestra negativa al agregar droga unida a enzima se unira a sitios de unión del anticuerpo. El
sustrato que es TMB, reacciona con enzima y da un producto coloreado que es azul, esto se mide en
un lector de elisa, que mide absorbancia producida a 450 nm. El valor de absorbancia en el caso
negativo será alta.
En el caso positivo, será el valor de absorbancia bajo y es incoloro.
Con los valores de absorbancia puedo hacer comparación.
Puedo tener inmunoensayos que solo son cualitativos y otros que son cuali-cuantitativos. FPIA es
cuali-cuantitativa, elisa también. Si yo tengo control de cantidad conocida tengo absorbancia y lo
comparo con el valor de muestras reales, y conocer estimativamente cual es la concentración de
droga presente en el medio.
Las ventajas, es que esta es la que por su menor límite de detección, yo disminuyo efecto de matriz
como efecto de etapa de lavado (ensayo hetereogeneo). Los reactivos tienen periodo de duración
largos. La Azida de sodio es preservante que se agrega a la orina para evitar la aparición de hongos,
pero puede bloquear la actividad de la enzima, por lo tanto, si tengo azida de sodio no puedo hacer
ELISA.
El costo es mas alto que para un ensayo homogéneo
El último inmunoensayo del lab, inmunocromatografía. Que consiste en los test de embarazo, en vez
de detectar gonadotrofina corionica humana, se detectan drogas. El metabolito de THC. Hay una
zona S donde se agrega la orina, voy a tener una ventana que tiene dos letras T de test y C de control,
entonces acá puedo tener diferentes muestras de orina, si aparecen dos líneas marcadas en C y T, el
inmunoensayo será negativo.
Si la línea T no esta marcada pero si la C de control, el resultado será positivo.
Si la línea T es tenue y en la zona C no hay línea, el resultado es inválido. Esto quiere decir que el
resultado no es confiable.
A diferencia de los otros, es solo cualitativo. Y sirve para detectar drogas en el ámbito laboral. En
este ámbito para decidir si una muestra es positiva o no , las muestras tienen que estar sobre un cut
off (concentración de droga) sobre este cut off las muestras son positivas, bajo son negativos. Como
es técnica de screening, si es negativo muestra es negativa y no se hace nada mas. Si el resultado es
positivo tiene que ir a analsiis confirmatorio, que se deber realizar por técnica de cromatografía
acoplada a espectrometría de masa.
Tengo cut off para técnica de screening y para técnicas de confirmación
En el caso de inmunoensayo, el cut off de THC tiene un corte en el screening de 50ng por ml y para
confirmación 15ng por ml. O sea si al hacer screening me dio 60 0 70 ng/ml estoy obligado a hacer
técnica de confirmación, y si al hacer técnica de confirmación y si esta me da 18 ng/ml el resultado es
positivo.
Si el screening me dio 45 ng/ml el resultado es negativo.
Tendre cortes para todas las drogas, anfetamina, BZD, opiáceos, etc.
Estas placas están fabricadas con estos cortes de screening esta técnica en el caso de THC es positivo
cuando esta sobre los 50 ng/ml bajo los 50 ng/ml aparecerán dos líneas. Si las placas son para otras
drogas los cortes serán distintos.
¿Como se produce una línea? Si hay droga presente en la muestra la droga se une al conjugado
anticuerpo con colorante y lo satura. Se bloquea asi la formación del enlace del conjugado con la
droga marcada que está presente en la zona T y no se forma línea purpura.
….bla bla bla diapos
Esta es la zona donde se agregan gotas de orina, aquí están viajando anticuerpos que se unieron a
orina. En la zona C hay una línea de control que tiene otros anticuerpos, en la línea T hay droga en la
supesta línea. Cuando la orina es negativa, van a viajar los anticuerpos con las esferas coloreadas y
van a llegar hasta la zona T que es donde va a estar la droga y se va a producir este complejo que van
a producir una línea. Y el exceso de orina que exista va allegar hasta el otro anticuerpo y va a forma r
una especie de sándwich Y se va a marcar. La zona C siempre se va a marcar si se agrega exceso de
orina.
Si orina es positiva, la droga se unió al anticuerpo con el colorante, asi no permite que el anticuerpo
se una a este. Por lo tanto no se forma el complejo y no se va a producir línea. Pero como esta en
exceso el anticuerpo va a ser capaz de unirse al otro y va a formar la línea en C
Y el tercer caso de formación de línea tenue en T, no había línea en C puede pasar porque no fue
suficiente la cantidad de orina (los anticuerpos al viajar no pudieron llegar al otro anticuerpo y no se
pudo formar línea). Asi se agrega mas orina.
También puede ser que el kit se haya vencido no se va a formar línea aunque agregue mas orina
O porque se le agrega adulterante (viscosante) a orina lo que impide viaje por capilaridad por lo tanto
no es capaz de llegar ni a la zona C ni a la zona T y no se produce ninguna línea.
La dificultad no esta en el análisis, excepto en el ELISA. La dificultad es la interpretación de los
resultados