D

DEPART
TAMEN
NTO DEE 
BIO
OQUÍM
MICA Y B
BIOLOG
GÍA MO
OLECULLAR 

 
 
 
 
 
 
G
GRADO
O EN BIO
OLOGÍA
A 
 
 
 
PRÁ
ÁCTICA
AS DE B
BIOLOG
GÍA MO
OLECULAR APLLICADA
A  
 
 
 
 
 
NOMBRE Y APELLIDOS 
 
 
 
PRÁCTICAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR APLICADA  
(Parte correspondiente a Bioquímica y Biología Molecular) 
 
 
PLANIFICACIÓN: 
Para  la  realización  de  estas  prácticas  se  dispone  de  un  total  de  7  horas 
distribuidas en tres días a razón de tres horas el primero y segundo día y 
una hora el tercer día.  
Día 1 
Se  llevará  a  cabo  la  práctica  1(Purificación  de  RNA  total  de  hígado  de 
rata)  y la práctica 2: Sintesis del cDNA  
 
Día 2 
Se  llevará  a  cabo  la  práctica  3:  Estudio  de  la  expresión  de  algún  gen 
mediante  la  amplificación  del  cDNA  (obtenido  en  la  práctica  2)  por  la 
Reacción en cadena de la polimerasa(PCR). También, mientras transcurre 
la  PCR,  los  alumnos  prepararán  los  geles  de  poliacrilamida  para  llevar  a 
cabo el análisis electroforético de los resultados de la PCR 
 
Día 3 
La práctica 4 consistirá en el: Análisis electroforético de los resultados de 
la  PCR.  Obtención  de  imágenes,  documentación  y  discusión  de  los 
resultados obtenidos 
 
   
PRÁCTICA 1.‐ Purificación de RNA total a partir de tejido 
hepático de rata. (Tri‐Reagent). 
A  partir  de  50‐100  mg  de  tejido  hepático  extraido  de  rata  y  conservado 
ultracongelado  a ‐80   0C,  se prepara el RNA siguiendo un procedimiento 
basado en el descrito originalmente por Chomczynski P, Sacchi N. en 1987. 
El  Tri‐ReagentTM*  es  un  reactivo  comercial  que  contiene  un  agente 
caotrópico,  el  tiocianato  de  guanidinio,  que  desnaturaliza  proteínas  y 
disgrega  el  tejido,  además  el  reactivo  contiene  fenol  en  un  tampón  a  pH 
acido que contribuye a la disgregación del tejido, lisis celular y extracción 
de  moléculas  hidrofóbicas  durante  la  etapa  de  separación  de  fases.  La 
posterior  precipitación  del  RNA,  presente  en  la  fase  acuosa,  mediante  la 
adición de isopropano,l permite obtener una preparación de RNA celular 
total para su utilización en la síntesis del cDNA. 
 
Procedimiento: 
1.‐  El  trozo  de  tejido  ultracongelado  se  tritura  en  el  mismo  tubo 
eppendorf,  donde ha permanecido conservado después de su extracción 
del animal, e inmediatamente se lisan las células mediante la adición de 1 
ml de Tri‐Reagent por cada 100 mg de tejido Mezclar bien hasta lograr la 
lisis total de las células e incubar 5 min a temperatura ambiente. 
2.‐  Añadir  0,2  ml  de  cloroformo  por  cada  ml  de  reactivo  usado.  Agitar  e 
incubar de 2 a 15 min a temperatura ambiente.  
3.‐  Centrifugar  la  mezcla  a  máxima  velocidad  en  la  microcentrífuga 
durante 15 min a 4°C. Esta centrifugación separa la mezcla en tres fases: la 
fase  orgánica  que  contiene  proteínas  y  componentes  celulares 
hidrofóbicos,  una  interfase  que  contiene  el  DNA  (y  proteínas)  y  la  fase 
acuosa superior e incolora que contiene el RNA. 
4.‐ Transferir la fase acuosa a un tubo eppendorf de 1,5 ml limpio y añadir 
0,5 ml de isopropanol por cada ml de reactivo. Mezclar bien e incubar 5‐
10  min  a  temperatura  ambiente.  5.‐  Centrifugar  a  máxima  velocidad  en 
microcentrífuga  durante  10  min  a  4°C.  El  RNA  precipita  y  formará  un 
sedimento en el fondo y el lateral del tubo. 
6.‐  Eliminar  el  sobrenadante  y  lavar  el  sedimento  añadiendo  1  ml  de 
etanol  al  75%  por  ml  de  Tri‐  Reagent  usado  en  la  preparación  de  la 
muestra.  Mezclar  y  centrifugar  a  maxima  velocidad.  Las  muestras  se 
pueden guardar en etanol a 4°C durante 1 semana o a ‐20°C durante mas 
tiempo. 
7.‐ Secar el sedimento de RNA durante 5‐10 min sin dejar que se reseque 
ya  que  disminuye  mucho  su  solubilidad  y  disolver  en  un  volumen 
adecuado de agua‐DEPC ( 20 a 50 µl)  
8‐ Cuantificar la concentración del RNA obtenido mediante medida de la 
absorbancia a 260 y a 280 nm y conservar la preparación a ‐20 0C hasta su 
utilización 
Normalmente se suelen obtener unos 6‐10 μg de RNA por cada mg de 
tejido, y con un grado de pureza expresado en una relación de 
absorbancia 260/280 ≥ 1,7. 
 
Anotación de los datos de la preparación del RNA purificado 
 
 
 
 
 
 
   
PRÁCTICA 2.‐Síntesis de cDNA a partir del RNA total obtenido 
en la Práctica 1, utilizando oligo dT como cebador. 
Se utiliza el protocolo adaptado que acompaña a la transcriptasa reversa 
RevertAid H minus reverse transcriptase (de la casa comercial Fermentas). 
 
Procedimiento: 
Para  ello  se  mezclarán  en  un  tubo  eppendorf  de  1,5  ml  las  cantidades 
siguientes de cada uno de los componentes de la reacción: 
‐X µl de RNA (conteniendo 4‐5 µg de RNA 
‐1 µl oligo dT 
‐Agua  hasta  12,5  µl.  Incubar  a  650C  durante  5  min  y  poner 
inmediatamente en hielo 2 min. 
A cada reacción (MANTENER EN HIELO) añadir 
‐4 µl de tampón de reacción 5X 
‐0,5 µl de inhibidor de RNAsa (RiboLockTM)  
‐2 µl dNTPs 10 mM 
‐1 µl de transcriptasa reversa RevertAid H minus reverse transcriptase (de 
Fermentas) 
‐Incubar (son en total 20 µl) a 42 0C durante 1 hora 
‐Parar la reacción calentando a 700C durante 10 min y guardar el cDNA a    
‐200C hasta su utilización en el análisis de la expresión de genes. 
   
Práctica 3: Estudio de la expresión de algún gen mediante la 
amplificación del cDNA (obtenido en la práctica 2) por la 
Reacción en Cadena de la Polimerasa(PCR) 
Para  la  PCR  se  utiliza  la  Taq  polimerasa  de  Thermus  aquaticus 
recombinante  suministrada  por  la  casa  comercial  Sigma‐Aldrich  y  en  el 
procedimiento se incluyen las recomendaciones de uso que acompañan al 
enzima. 
 
Procedimiento: 
En  un  microtubo,  adecuado  al  aparato  de  PCR  que  se  vaya  a  utilizar,  se 
coloca en hielo y se añaden las siguientes cantidades de los componentes 
de la reacción: 
‐1 µl de cDNA 
‐2,5 µl tampón 10X(sin Mg2+ ) 
‐2,5 µl MgCl2 25 mM  
‐0,5 µl dNTPs 10 mM  
‐1 µl primer “forward”  
‐1 µl primer “reverso” 
‐0,5 µl Taq polimerasa  
Agua hasta 25 µl 
Para cada tipo de muestra de amplificación se debe poner un control que 
lleve todos los mismos componentes excepto el cDNA molde 
El tubo (o tubos) de las distintas reacciones se colocan en el termociclador 
previamente programado de acuerdo con las siguientes premisas: 
‐En cada ciclo ha de haber tres etapas: 
1ª) Desnaturalización a 94 0C durante 30 seg 
2ª) Hibridación a la temperatura ligeramente inferior a la de las Tm del par 
de oligodesoxirribonucleótidos cebadores durante 30 seg. 
3ª) Síntesis a 72 0C durante un tiempo a razón de 1 min/Kb 
‐ Este ciclo de 3 etapas  se repetirá 30‐35 veces 
‐  A  estos  30‐35  ciclos  le  seguirá  una  única  etapa  de  elongación  a  72  0C 
durante 2 min. 
 
 
   
Práctica 4.‐ Análisis electroforético de los resultados de la PCR. 
Obtención de imágenes, documentación y discusión de los 
resultados obtenidos 
 
Procedimiento: 
a) Preparación de geles de poliacrilamida al 7 % 
Para dos geles del miniprotean II las cantidades necesarias son: 
9,5 ml de agua desionizada 
4 ml de solución de acrilamida(30%)/Bis‐acrilamida(0,8%) 
1,5 ml de tampón TBE 10X 
280 µl de persulfato amónico al 10% 
12 µl de TEMED. 
 
b) Electroforesis 
La separación electroforética de los productos de la(s) PCRs se lleva a cabo 
a  voltaje  constante  de  200  voltios,  en  tampón  TBE  1X,  durante 
aproximadamente 45 min 
 
c) Análisis de imagen de los productos de la electroforesis 
Una  vez  finalizada  la  electroforesis  los  geles  son  incubados  en  una 
solución  conteniendo  bromuro  de  etidio  y  fotografiados  utilizando  un 
equipo  que  analiza  la  imagen  fluorescente  emitida  por  el  agente 
intercalante al ser iluminado con luz ultravioleta. 
 
      RESULTADOS 
Adjuntar la imagen obtenida 
Discusión y conclusiones