AUSENCIA DE

Escherichia coli O157:H7

EN MUESTRAS
AMBIENTALES
Belloso Claudio

Belloso Claudio
Mendoza 4197 - 2.000 Rosario - Argentina
Tel-Fax: 041-380853 e-mail: belloso@satlink.com

Palabras Claves: Escherichia coli O157:H7, Síndrome Urémico He-

molítico, Verocitotoxina.
 RESUMEN

Se investigó la presencia de Escherichia coli O157:H7 en 529 muestras ambienta-

les provenientes de distintas regiones, industrias e instituciones de la zona confor-
madas por 493 muestras de aguas, 25 muestras de aire ambiental y 10 muestras de
suelos.
El resultado fue negativo, en ninguna de las muestras analizadas se pudo encontrar
esta bacteria.
La ausencia de Escherichia coli O157:H7 en las muestras analizadas podría obede-
cer tanto a factores ambientales como a inhibiciones competitivas por parte de la flo-
ra de acompañamiento.

INTRODUCCION
Desde hace tiempo, la bacteria Escherichia coli es considerada uno de los indicadores microbiológi-
cos de contaminación fecal más importantes.
En el medio ambiente se la suele encontrar preferentemente en aguas contaminadas con materia fe-
cal, suelos y en todo aquello que pueda tomar contacto con estos, como por ejemplo, los alimentos.
El término descriptivo Escherichia coli comprende un grupo diverso de microorganismos que pueden
infectar cualquier sistema del huésped y producir un vasto número de factores de virulencia que varían
desde características estructurales hasta toxinas excretadas.
Se han descripto hasta el presente, cuatro cepas patógenas de E. coli, Enteropatógena (EPEC),
Enterotoxigénica (ETEC), Enteroinvasiva (EIEC) y Enterohemorrágica (EHEC) (1). Escherichia coli
O157:H7 es el prototipo del grupo de EHEC, produce una toxina llamada verocitotoxina o shiga-like
toxin. Se conocen dos tipos: VT1 (SLT-I) y VT2 (STL-II).
Estas verocitotoxinas han sido asociadas con tres síndromes humanos: diarrea acuosa, colitis hemo-
rrágica y el Síndrome Urémico Hemolítico (SUH) (2).
El SUH comprende una anemia hemolítica microangiopática, trombocitopenia e insuficiencia renal
aguda. Los niños menores de 5 años y los adultos mayores de 60 años constituyen los grupos de
riesgo para el SUH (3). Argentina posee una tasa de incidencia anual de 7,8/100.000 niños menores
de 5 años, la más alta del mundo (3).
Las infecciones en humanos están asociadas al consumo de alimentos contaminados como carnes y
leches no pasteurizadas.
Relevamientos epidemiológicos mostraron que el ganado vacuno puede excretar VTEC en sus heces,
representando así un importante reservorio y fuente de infección.
E. coli O157:H7 es considerado patógeno para humanos desde 1982, después de la investigación de
dos brotes producidos en Estados Unidos asociados al consumo de hamburguesas en restaurantes
pertenecientes a una cadena de comidas rápidas (3).
El 5 de Julio de 1995, el Winnebago Country Health Department (WCHD) de Illinois, recibió un reporte
de un Hospital local el cual notificaba la infección de 5 niños residentes en Rockford con E. Coli
O157:H7. Una entrevista realizada a los padres de los chicos no reveló una fuente común en los ali-
mentos consumidos, sin embargo, coincidentemente, todos los niños habían concurrido a un parque
de Illinois y habían nadado en el lago del parque.
Finalmente, luego de un arduo trabajo de investigación epidemiológica, se determinó que la fuente de
contagio podría haber sido el agua del lago (7).
A principios del año 1996, en Argentina, se notificaron varios casos de SUH en niños. En la mayoría
de éstos casos no se pudo determinar el medio de contagio, por lo cual varios efectores de salud
comenzaron a desconfiar de su transmisión a través del agua.
 OBJETIVO

Investigar la presencia de este serotipo no sólo en aguas sino también en suelos y aerosoles produ-
cidos en plantas de tratamiento de efluentes industriales.

MATERIALES Y METODOS
Se analizaron un total de 528 muestras ambientales provenientes de distintas regiones, industrias e
instituciones de la zona conformadas por 493 muestras de aguas, 25 muestras de aire ambiental y 10
muestras de suelos.
Las muestras de aguas estaban compuestas por 118 muestras de aguas de pozo, 103 muestras de
aguas superficiales tratadas, 26 muestras de aguas de arroyos, 38 muestras de agua superficial ex-
traídas del Río Paraná, 18 muestras de agua de lagos artificiales, 17 muestras de efluentes líquidos
industriales y 173 muestras de agua de pileta de natación.
En las muestras de aguas se realizaron las siguientes determinaciones: recuento de bacterias aero-
bias heterótrofas, Coliformes Totales, Escherichia coli, presencia de Escherichia coli O157:H7 y
Pseudomonas aeruginosa (4).
El recuento de bacterias aerobias heterótrofas se realizó en Plate Count Agar (Merck) por la técnica
de volcado (4), las placas fueron incubadas a 35°C durante 48 horas, el resultado se expresó en
UFC/ml. Los Coliformes totales se determinaron por la técnica de los tubos múltiples (Número Más
Probable) (4) en Caldo Fluorocult Brila (Merck) con tubos Durham que se incubaron durante 48 h a
35°C. Se consideró positivo para Coliformes a todos aquellos tubos en los que se determinó presen-
cia de gas en tubos Durham. Se determinó luego la fluorescencia a la luz UV emitida por aquellos tu-
bos positivos para coliformes.
A los tubos con fluorescencia positiva se les agregó el reactivo de Kovacs para determinar la forma-
ción del Indol. Se consideraron positivos para E. coli aquellos tubos en los cuales se observó forma-
ción de gas, fluorescencia y test del Indol positivo.
Para investigar la presencia de E. coli O157:H7 se tomó 1 ml de caldo Fluorocult Brila de cada uno
de los tubos positivos y negativos del ensayo para Coliformes una vez cumplimentado las 48 horas de
incubación, siempre antes de realizar el test del indol. Se reunieron las porciones de caldo extraídas
en un tubo de ensayo estéril. De ese caldo se tomaron ansadas y se procedió a hacer estriados en
Agar Mac Conkey Sorbitol (Difco) y Fluorocult E. coli O157:H7 Agar (Merck). Las placas se incubaron
a 35°C durante 24 horas. Se consideraron sospechosas a todas aquellas colonias no fermentadoras
de sorbitol en Agar Mac Conkey Sorbitol. En el agar Fluorocult O157:H7 (6), se consideraron sospe-
chosas a todas aquellas colonias verdosas que no demostraron ser fluorescentes a la luz UV. Dichas
colonias sospechosas en ambos medios fueron repicadas a un medio nutritivo sólido inclinado como
el Agar Tripticase Soya (Merck) e incubadas a 35°C durante 24 horas para luego someterlas a ensa-
yos primarios presuntivos tales como Agar Hierro Tres Azúcares (Merck), Citrato de Simmons
(Merck), Caldo MR-VP (Merck) y Medio SIM (Merck). En algunos casos se procedió a inocular tiras
API (BioMérieux) con los cultivos puros aislados oportunamente.
Finalmente se procedió a realizar la serología correspondiente a todas aquellas colonias aisladas de
los distintos agares que demostraron tener un esquema de fermentación similar al de E. coli (8). Se
emplearon los sueros de Difco, Bacto E. coli O Antiserum O157 y Bacto E. coli H Antiserum H7. Se
siguió la metodología descripta en el prospecto de los mismos.
Como ensayo de control positivo, se sembraron artificialmente muestras diversas de aguas con la ce-
pa E. coli O157:H7 ATCC 35.150. Se siguió el mismo procedimiento de recuperación anteriormente
descripto.
La recuperación de E. coli O157:H7 de las muestras de agua inoculadas artificialmente fue aproxima-
damente del 90 %.
La investigación de Pseudomonas aeruginosa se realizó por la técnica de los tubos múltiples en cal-
do Asparagina. Se consideraron positivos presuntivos a todos aquellos tubos que emitieron fluores-
cencia al ser irradiados con luz ultravioleta luego de 24h de incubación a 35°C, su confirmación se lle-
vó a cabo en caldo Acetamida. Todos aquellos tubos en los cuales se constató el uso de Acetamida
luego de 36h de incubación a 35°C fueron considerados positivos para Pseudomonas aeruginosa.
Se tomaron 25 muestras del aire ambiental periférico de plantas de tratamiento de efluentes líquidos.
Cada muestra estuvo compuesta por 18 placas de Petri con agares solidificados, el tiempo de expo-
sición a placa descubierta fue de 15 minutos (5). Los agares empleados fueron los siguientes: Plate
Count Agar (Merck), Agar Mac Conkey Sorbitol (Difco), Fluorocult E. coli O157:H7 Agar (Merck), Agar
Xilosa Lisina Desoxicolato (Merck), Agar Mac Conkey (Merck), Agar Violeta Rojo neutro Bilis (Merck).
Las placas se incubaron a 35°C durante 24 horas. Se hicieron los correspondientes recuentos de las
colonias y se aislaron e identificaron las colonias sospechosas de ser Escherichia coli O157:H7.
Se analizaron 10 muestras de suelos provenientes de industrias diversas de la zona en las cuales se
investigó Coliformes Totales, Fecales y E. coli O157:H7.
Se hicieron diluciones decimales del suelo en agua destilada estéril y se sembraron en tubos que
contenían Caldo Fluorocult Brila con tubo Durham. Se incubaron a 35°C durante 48 horas. De tubos
positivos para coliformes se hicieron estriados en Agar Mac Conkey Sorbitol (Difco) y Fluorocult E.
coli O157:H7 Agar (Merck), se incubaron a 35°C durante 24 horas. Se aislaron e identificaron las co-
lonias sospechosas de ser E. coli O157:H7.
Finalmente se procedió a realizar la serología correspondiente a todas aquellas colonias aisladas de
los distintos agares que demostraron tener un esquema de fermentación similar al de E. coli.

RESULTADOS
Muestras de agua

N° DE N° DE N° DE MUESTRAS
TIPO DE AGUA N° DE N° DE N° DE MUESTRAS MUESTRAS QUE CONTIENEN
ANALIZADA MUESTRAS MUESTRAS MUESTRAS QUE QUE E. coli O157:H7
ANALIZADAS APTAS NO APTAS CONTIENEN CONTIENEN
COLIFORMES E. coli
TOTALES

AGUA DE POZO (i)

118 87 (74%) 31 (26%) 23 (19,5%) 4 (3,38%) 0 (0%)

AGUA SUPERFICIAL
TRATADA (i) 103 74 29 (28,1%) 10 (9,7%) 1 (0,97%) 0 (0%)
(71,8%)

AGUA DE
ARROYOS (ii) 26 0 26 (100%) 26 (100%) 26 (100%) 0 (0%)

AGUA DEL RIO

PARANA (ii) 38 0 38 (100%) 38 (100%) 38 (100%) 0 (0%)

AGUA DE LAGOS
(ii) 18 0 18 (100%) 18 (100%) 18 (100%) 0 (0%)

EFLUENTES
LIQUIDOS 17 6 (35,3%) 11 (64,7%) 10 (58,8%) 8 (47%) 0 (0%)
INDUSTRIALES (iii)

AGUAS DE PILETAS
DE NATACION (iiii) 173 154 (89%) 19 (11%) 13 (7,4%) 1 (0,57%) 0 (0%)

( ) Porcentajes referidos al número total de muestras analizadas.

Las condiciones de Apto o Inapto desde el punto de vista microbiológico para los distintos tipos de
agua se asignaron de acuerdo a las reglamentaciones vigentes según:
(i) Código Alimentario Argentino.
(ii) Environmental Protection Agency. Water Quality Criteria Documents, Availability. USA. 1980.
(iii) Normas vigentes en la provincia de Santa Fe, Argentina, para el vertido de líquidos residuales. Ley
8711/80 - Control de la Contaminación, Cap. XII, art. 41.
(iiii) Decreto N° 38.871 de la Dirección General de Bromatología del Municipio de Rosario. Argentina.
La denominación “agua superficial tratada” se refiere a que ha recibido un tratamiento de potabiliza-
ción convencional

Muestras de aire

N¨ DE N¨ DE N¨ DE
N° DE MUESTRAS QUE MUESTRAS QUE MUESTRAS QUE BACTERIAS AISLADAS EN LA
MUESTRAS CONTIENEN CONTIENEN CONTIENEN MAYORÍA DE LAS MUESTRAS
ANALIZADAS COLIFORMES E. coli E. coli O157:H7 PERTENECIENTES A LA FLORA DE
TOTALES ACOMPAÑAMIENTO
Klebsiella pneumoniae
Pseudomonas aeruginosa
25 21 (84%) 21 (84) 0 (0%) Plesiomonas shigelloides
Proteus mirabilis
Aeromonas hydrofila

Muestras de suelo

N° DE N¨ DE N¨ DE N¨ DE
MUESTRAS MUESTRAS QUE MUESTRAS QUE MUESTRAS QUE BACTERIAS AISLADAS EN LA
ANALIZADAS CONTIENEN CONTIENEN CONTIENEN MAYORÍA DE LAS MUESTRAS
COLIFORMES E. coli E. coli O157:H7 PERTENECIENTES A LA FLORA DE
TOTALES ACOMPAÑAMIENTO
Acinetobacter calcoaceticus
10 10 (100%) 3 (30%) 0 (0%) var. anitratus
Pseudomonas spp.

DISCUSION
La ausencia de Escherichia coli O157:H7 en las muestras analizadas podría obedecer tanto a facto-
res ambientales como a inhibiciones competitivas por parte de la flora de acompañamiento. El ganado
vacuno excreta de por sí grandes cantidades de este serotipo con sus heces, evidentemente el curso
receptor de éstas debería contenerlo. Puede ocurrir que las condiciones ambientales permitan posi-
blemente que la bacteria se encuentre en forma viable, pero no cultivable. Su transmisión a través del
agua todavía sigue siendo un mecanismo no dilucidado aún, aunque a modo de reflexión, si se
transmitiera fácilmente a través del agua debería haber más casos notificados y de acuerdo a releva-
mientos epidemiológicos no los hay.
 BIBLIOGRAFIA
(1) Cahoon FE, Thompson JS. Frecuency of Escherichia coli O157:H7 isolation from stool specimens.
Can J Microbiol 31:915, 1987.

(2) Bell BP, Goldoft M, Griffin PM, et al. A multistate outbreak of Escherichia coli O157:H7 associated
bloody diarrhea and hemolytic uremic syndrome from hamburgers: the Washington experience. JAMA
1994; 272:1349-53.

(3) Rivas M. Escherichia coli productor de verocitotoxina en alimentos de origen animal. VII Congreso
Argentino de Microbiología. Buenos Aires. 1995.

(4) American Public Health Association. Standards Methods for the Examination of Water and Was-
tewater, APHA, 18th. ed., New York, 1992.

(5) Environmental Protection Agency. Federal Register. Rules and Regulations USEPA, Air quality cri-
teria documents. vol. 50, N° 224:25345-25348. USA. 1989.

(6) Szabo RA, Todd EC, Jean A. Method to isolate E. coli O157:H7 from food. J. Food Prot., 10: 768 -
772. 1986.

(7) Lake-Associated Outbreak of Escherichia coli O157:H7. Illinois, 1995. Centers for Disease Control
and Prevention. Morbidity and Mortality Weekly Report MMWR 45(21):437-444, 1996.

(8) Holt JG, Krieg NR, Sneath PH, Staley JT, Williams ST. Bergey’s Manual of Determinative Bacte-
riology 9th ed., Baltimore, Williams & Wilkins, 1994.