Resumen

Espectrofometría: Espectros de absorción y cuantificación colorimétrica de

biomoléculas

La espectroscopia ultravioleta visible en particular logra cuantificar las biomoléculas en

solución y en muestras biológicas con el empleo, su fundamento se debe a la capacidad de
las moléculas para absorber radiaciones entre ellas las radiaciones dentro del espectro
invisible. Las longitudes de onda de las radiaciones que una molécula puede. las moléculas
pueden absorber energia luminosa y almacenarla en forma. de energia interna y se origina
un salto desde un estado energético. basal o fundamental e1 a un estado de mayor energia
estado excitado e2. Solo se absorberá la energia que permita el salto al estado excitado ya
que la molécula tiene una serie de estados excitados o bandas que la distingue del resto
de moléculas. Como consecuencia la absorción que a distintas longitudes de onda presenta
una molécula (esto es su espectro de absorción) constituye una señal de identidad de la
misma. Por último, la molécula en forma excitada libera la energia absorbida hasta el estado
energético fundamental. En espectroscopia el termino luz no solo se aplica a la forma visible
de. en espectrofotometría de absorbancia se utilizan las regiones del. ultravioleta u cercano
de 195 400 nm y el visible 400 780 nm.

La región u se define como el rango de longitudes de onda de 195 a 400. es una región de
energia muy alta. heteroátomos tienen su máxima absorbancia en la región u por lo que
esta. diversos factores como pH concentración de sal y el. disolvente que alteran la carga
de las moléculas provocan desplazamientos. en la región visible apreciamos el color visible
de una solución y que. corresponde a las longitudes de onda de luz que transmite no que
absorbe. por tanto, para realizar mediciones de absorción es necesario utilizar la longitud
de onda en la que absorbe luz la solución coloreada. la fuente de radiación visible suele ser
una lampara de tungsteno y no. proporciona suficiente energia por debajo de 320
nm. transmitancia y absorbancia. Cuando un rayo de luz de una determinada longitud de
onda. de un compuesto químico que absorbe luz o cromóforo el. la transmitancia t de una
sustancia en solución es la relación entre la. cantidad de luz transmitida que llega al detector
una vez que ha atravesado la muestra ti y la cantidad de luz que incidió sobre ella ido y se
representa. la transmitancia nos da una medida física de la relación de intensidad. la
relación entre t y la. concentración no es lineal, pero asume una relación logarítmica
inversa.

La absorbancia a es un concepto más relacionado con la muestra puesto. que nos indica la
cantidad de luz absorbida por la misma y se define como él. determinada longitud de onda
y entonces a vale log 10.La cantidad de luz absorbida dependerá de la distancia que
atraviesa la luz a través de la solución del cromóforo y de la concentración de este. Esta ley
expresa la relación entre absorbancia de luz monocromática de longitud de onda fija y
concentración de un cromóforo en solución. la absorbancia de una solución es directamente
proporcional a su concentración a mayor número de moléculas mayor interacción de la luz
con. ellas también dependen de la distancia que recorre la luz por la solución a. igual
concentración cuanto mayor distancia recorre la luz por la muestra más. moléculas se
encontrará y por último depende de una constante de cada cromóforo. unidades de
concentración molar o un submúltiplo apropiado se denomina. molecular del soluto la
concentración de la disolución se expresa en otras. luz agregación de moléculas cambios
del medio etc.

La instrumentación para la medición de absorbancias de la luz visible y. ultravioleta

espectrofotómetro u visible. la medición de absorbancia de la luz por las moléculas se
realiza en unos. una fuente de energia radiante lampara de deuterio y tungsteno.

La longitud de onda filtros prismas redes de difracción. luz y longitud de onda a la que se
va a realizar la medida. se mide primero la absorbancia del disolvente conocido como
blanco y al. intensidad incidente y transmitida sean iguales y por tanto la absorbancia.

La obtención de un espectro de absorción. el espectro de absorción es una representación

grafica que indica cantidad de. luz absorbida a diferentes valores a partir de una solución
diluida de un compuesto cuya absorbancia máxima. absorbancia a diferentes longitudes de
onda frente a un blanco que contenga el disolvente de la solución de la muestra a
caracterizar a partir del espectro de absorción se obtendrá el valor de la que el compuesto
presenta la mayor. absorbancia Max. el espectro de absorción de un cromóforo depende
fundamentalmente de la. estructura química de la molécula.

No obstante hay una gran cantidad de factores que originan variaciones en moléculas
vecinas y la orientación de los cromóforos vecinos y cada uno continuación se muestran
como ejemplo los espectros de absorción de hits. ellas el valor de absorbancia. Estos
valores de absorbancia se representan en el eje de abscisas eje de x y los de concentración
en el eje d. concentración se corresponde con un incremento lineal en la absorbancia zona.
 Estructura química de cada uno de los reactivos
p-nitrofenol 4 amino-
antipirina

NaOH Tampón
fosfato

Nitrito
potásico
Flavín
mononucleótido
(FMN)

Ditionito sódico. Sulfanilamida

Glucosa Dicloruro de
N-naftol-1-
etilendiamino

Glucosa oxidasa Ácido

clorhídrico

Peroxidasa Fenol

Preparación de los reactivos recomendada por proveedores

p-nitrofenol Para preparar el m‐nitrofenol por un procedimiento satisfactorio se
recomienda aplicar la diazorreacción a la m‐nitroanilina. El
2,4dinitrofenol suele obtenerse como producto intermedio en la
preparación del ácido pícrico por nitración del clorobenceno.

NaOH Cuando se diluya el hidróxido de sodio, este debe ser siempre

agregado al agua en cantidades reducidas. Nunca usar agua
caliente o agregar agua al hidróxido. El agua agregada al hidróxido
de sodio puede causar ebullición incontrolada y salpicaduras
violentas. Cuando se destapen contenedores con este material no
usar herramientas que produzcan chispas debido a la posibilidad de
existencia de hidrógeno gaseoso. Los contenedores de este
material pueden ser peligrosos debido a que retienen residuos de
producto.

Esta molécula funciona como grupo prostético y cofactor en varios

tipos de oxidorreductasas, incluyendo a la NADH deshidrogenasa,
Flavín y en algunos fotorreceptores biológicos para el color azul. En los
mononucleótido seres vivos es sintetizada por la enzima riboflavina quinasa.
(FMN)

Ditionito sódico. Evacuar a todo el personal del área de peligro. No aproximarse a el

área sin el equipo de respiración autónomo. Utilizar abundante agua
para contener el incendio. Asegurar diluir todo el producto. Evitar
contener el producto en recipientes cerrados durante el incendio.

Glucosa El material es estable bajo condiciones ambientales normales y en

condiciones previsibles de temperatura y presión durante su
almacenamiento y manipulación solo tiene Reacciones fuertes con:
Muy comburente, Nitrato, Permanganatos.

Glucosa oxidasa Úsense guantes adecuados. Adecuado es un guante de protección

química probado según la norma EN 374. Para usos especiales se
recomienda verificar con el proveedor de los guantes de protección,
sobre la resistencia de éstos contra los productos químicos arriba
mencionados.

Peroxidasa Reactividad válida en general para sustancias y mezclas orgánicas

combustibles: en caso de esparcimiento fino, en estado
arremolinado, debe contarse en general con peligro de explosión.

4 amino-antipirina Evitar la producción de polvo, Lavar las manos antes de las pausas
y al fin del trabajo. Manténgase lejos de alimentos, bebidas y
piensos. Reactividad El producto en la forma de entrega no es capaz
de producir una explosión de polvo; pero la acumulación de polvo
fino conduce a un peligro de explosión de polvo. El material es
estable bajo condiciones ambientales normales y en condiciones
previsibles de temperatura y presión durante su almacenamiento y
manipulación.
Tampón fosfato Incompatible con aleaciones de Cu. Corrosivo a los metales.
Corrosivo a los metales ferrosos y aleaciones. Contacte a su
representante de ventas o especialista metalúrgico para asegurar
compatibilidad con los equipos en contacto. Muy poco reactivo con
agentes oxidantes, agentes reductores, metales, álcalis, humedad.
No reacciona con material orgánico, combustible, ácidos.

Nitrito potásico Evitar que se levante polvo. Mantener lejos de llamas

descubiertas/del calor. Trabajar al aire libre/con
aspiración/ventilación o protección respiratoria. Conforme a la
normativa. Limpiar la ropa contaminada. Evitar cualquier
contaminación del producto. Limpiar/secar cuidadosamente la
instalación antes de usar. No tirar los residuos a la alcantarilla.
Mantener el embalaje bien cerrado

Sulfanilamida Los tipos de auxiliares para protección del cuerpo deben elegirse
específicamente según el puesto de trabajo en función de la
concentración y cantidad de la sustancia peligrosa. Debería
aclararse con el suministrador la estabilidad de los medios
protectores frente a los productos químicos.

Dicloruro de N- Mantener el recipiente herméticamente cerrado. Almacenar en un

naftol-1- lugar seco. Durante mucho tiempo a la lúz puede causar
etilendiamino descomposición. Hacer períodos de recuperación para la
regeneración de la piel. Protectores de la piel preventivos (cremas
de protección/pomadas) están recomendados.

Ácido clorhídrico Úsense guantes adecuados. Adecuado es un guante de protección

química probado según la norma EN 374. Para usos especiales se
recomienda verificar con el proveedor de los guantes de protección,
sobre la resistencia de éstos contra los productos químicos arriba
mencionados. Los tiempos son valores aproximados de mediciones
a 22 ° C y contacto permanente. El aumento de las temperaturas
debido a las sustancias calentadas, el calor del cuerpo, etc. y la
reducción del espesor efectivo de la capa por estiramiento puede
llevar a una reducción considerable del tiempo de penetración. En
caso de duda, póngase en contacto con el fabricante. Con un
espesor de capa aproximadamente 1,5 veces mayor / menor, el
tiempo de avance respectivo se duplica / se reduce a la mitad. Los
datos se aplican solo a la sustancia pura. Cuando se transfieren a
mezclas de sustancias, solo pueden considerarse como una guía.

Fenol Se debe contar con polietilenglicol de bajo peso molecular (PEG

300 o 400), en solución al 50%, o en su defecto con Glicerina, en
las proximidades de la zona de trabajo, para brindar atención
oportuna en caso de exposición de la piel.