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MATERIALES Y MÉTODOS
3.1. EVALUACIÓN DE LAS METODOLOGÍAS PARA EL CONTROL

MICROBIOLÓGICO DE LOS TAPONES DE CORCHO
3.1.1. PREPARACIÓN DE TAPONES CONTROL
Se ensayaron diferentes métodos para inocular experimentalmente los tapones de corcho

con microorganismos que se aíslan frecuentemente de este substrato.
3.1.1.1. Microorganismos utilizados
Los microorganismos utilizados para preparar los tapones de corcho control, fueron
aislados previamente de tapones de corcho para vinos espumosos provenientes de
diversas fábricas elaboradoras de este producto en Catalunya. Los mismos se detallan en
la tabla 6.
Tabla 6. Microorganismos utilizados para la inoculación experimental de los tapones de

corcho controles.
Hongos filamentosos Levaduras Bacterias

Aspergillus niger (FVB 1) Rhodotorula glutinis (FVB 8) Bacillus cereus (FVB 9)
A. flavus (FVB 2)
A. fumigatus (FVB 3)
Rhizopus arrhizus (FVB 10)
Acremonium strictum (FVB 7)
Paecilomyces variotii (FVB 6)
Trichoderma viride (FVB 5)
Penicillium frequentans (FVB 4)
FVB: Colección de Cultivos de la Facultat de Veterinària de la Universitat Autònoma de Barcelona
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3.1.1.2. Tapones de corcho
Se procedió a la inoculación de una suspensión de los microorganismos a 270 tapones

de corcho para vinos espumosos, los cuales fueron obtenidos en diferentes fábricas de
tapones de corcho de Catalunya.
Previa a la inoculación, los tapones fueron introducidos en matraces de 250 ml de

capacidad (a razón de 2 tapones por cada matraz) y esterilizados en autoclave a 120 ºC,
una atmósfera de presión, durante 20 minutos. Tras la esterilización se comprobó que no
se alteraron las características físicas de los tapones siguiendo la Norma Catalana
Nº 010/95.
3.1.1.3. Suspensiones de conidios fúngicos, levaduras y bacterias
Se realizaron suspensiones celulares de los microorganismos aislados para inocularlos

posteriormente a los tapones de corcho estériles.
3.1.1.3.1. Suspensiones de conidios fúngicos y levaduras
A los cultivos puros de los hongos filamentosos mencionados anteriormente se les

agregaron 9 ml de solución fisiológica estéril y se procedió a agitar vigorosamente de
forma mecánica para favorecer el desprendimiento de los conidios. Las suspensiones
obtenidas se filtraron a través de doble gasa estéril, eliminando de esta forma otras
estructuras fúngicas y obteniendo sólo conidios en las suspensiones. Se comprobó bajo
el microscopio óptico, la ausencia de micelio y de otras estructuras fúngicas.
Posteriormente, se procedió a determinar el número de conidios por ml de la

suspensión, para lo cual se depositó una alícuota de la misma, previamente
homogeneizada, en la cámara de Bürker y se contaron los conidios en 80 cuadrados
como mínimo. El número de conidios/ml se obtuvo multiplicando el promedio de los
conidios contados por la superficie de la cámara y por la altura de la misma, este
resultado se multiplicó por 1000 para así obtener el número total de conidios/ml.
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Para realizar las suspensiones de levaduras, se tomaron colonias de los cultivos puros
con asa bacteriológica, se suspendieron en suero fisiológico estéril y se determinó el
número de células/ml de la manera antes descrita.
Se obtuvieron de esta forma, suspensiones del orden de 109 células/ml. Estas

suspensiones de diluyeron en suero fisiológico estéril hasta obtener concentraciones del
orden de 107 o de 105 células/ml.
3.1.1.3.2. Suspensiones de bacterias
Las suspensiones de bacterias se realizaron tomando colonias de los cultivos puros con
asa bacteriológica estéril las cuales se suspendieron en suero fisiológico estéril, se
comparó la turbidez obtenida con el tubo Nº 4 de la escala de Mc Farland.
Posteriormente, fueron diluidas en suero fisiológico estéril para obtener suspensiones de
células con concentraciones del orden de 107 o de105 células/ml.
3.1.1.4. Medios de cultivo
Los medios de cultivo utilizados fueron: agar extracto de malta al 2% adicionado de

30 ppm de clorhidrato de tetraciclina para el recuento y recuperación de hongos
filamentosos y de levaduras (AEM) y agar triptona soja (TSA) para el recuento y
recuperación de bacterias. A continuación se especifican la composición de cada uno
de ellos:
Agar extracto de malta al 2% Agar triptona soja
Extracto de malta 20 g Triptona 15 g

Glucosa 20 g Triptona de soja 5g
Peptona 1g Cloruro sódico 5g
Agar-agar 20 g Agar-agar 15 g
Agua destilada c.s.p. 1000 ml Agua destilada c.s.p. 1000 ml
Ajustar pH a 4,5 + 0,2. Esterilizar en Ajustar pH a 7,3 + 0,2. Esterilizar en

autoclave a 120ºC, 20 minutos. autoclave a 120ºC, 20 minutos
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3.1.1.5. Inoculación de los tapones
Se prepararon baterías de matraces (3 matraces por cada concentración a ensayar) que

contenían 2 tapones previamente pesados y esterilizados. A cada batería se le agregaron
las suspensiones microbianas preparadas a las concentraciones mencionadas
anteriormente, previo estudio de la viabilidad del inóculo inicial. En primer lugar, se
realizaron las pruebas con las suspensiones de concentración 107 células/ml y luego con
las suspensiones de concentración 109 o 105 células/ml.
A continuación se describen las metodologías utilizadas para la inoculación de los

tapones de corcho.
3.1.1.5.1. Inoculación por aerosol
Un grupo de baterías de matraces fue inoculado con las suspensiones de

microorganismos en forma de aerosol bajo campana de flujo laminar, impregnándolos
uniformemente.
3.1.1.5.2. Inoculación por inmersión
A otro grupo de baterías de matraces, se les agregó 20 ml de la mezcla de suspensiones

microbianas, a razón de 2 ml de suspensión de cada microorganismo. Los matraces así
preparados se colocaron en un agitador-incubador y se agitaron por 3, 6, 9 y 24 horas a
28 ºC y a 180 r.p.m. Al finalizar este tiempo se decantaron las suspensiones. A partir
del líquido decantado se realizaron diluciones decimales seriadas que se sembraron por
triplicado en AEM y TSA, se incubaron a 28 ºC por 3-5 días y 37 ºC por 24 horas,
respectivamente. Posteriormente se contaron las Unidades Formadoras de Colonia
(UFC)/ml, estableciéndose el promedio en cada dilución. Cada batería fue procesada
por triplicado y todos los ensayos se acompañaron de un control de esterilidad.
En un primer período se utilizaron mezclas formadas por las suspensiones de conidios

fúngicos de Aspergillus niger, A. flavus, A. fumigatus y Penicillium frequentans. En un
segundo período se utilizaron mezclas de todas las suspensiones de conidios fúngicos,
levaduras y bacterias. Cada una de estas mezclas se preparó respectivamente en
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concentraciones de 109, 107 o de105 células/ml y se mezcló igual volumen de cada una
de ellas (2 ml).
3.1.1.6. Recuento de los microorganismos recuperados
El recuento de los microorganismos recuperados se realizó por el método de las

diluciones decimales seriadas. A los tapones de corcho inoculados experimentalmente
se les agregó un volumen de suero fisiológico estéril que permitiera (según el peso de
los tapones) la primera dilución, los matraces así preparados, se agitaron
mecánicamente durante una hora, a 28 ºC y 120 r.p.m., para favorecer la separación de
los microorganismos de los tapones de corcho.
A partir de esta dilución se realizaron las siguientes en forma decimal seriada; 0,1 ml
fueron sembrados en AEM al 2% adicionado de antibióticos con el fin de cuantificar los
hongos filamentosos y las levaduras e igual cantidad en TSA para la cuantificación de
bacterias, las placas se incubaron a 28 ºC por 3-5 días y 37 ºC por 24 horas
respectivamente. Este ensayo se realizó por triplicado.
Al finalizar la incubación se llevó a cabo el recuento de las UFC/tapón y la

determinación del porcentaje de recuperación de microorganismos en cada tapón,
aplicando las siguientes fórmulas:
% Recuperación = 100% - % Reducción
%Reducción Tapones = UFC inoculados/tapón – UFC detectadas/tapón x 100

UFC inoculados/tapón
UFC inoculados/tapón = UFC inóculo inicial – UFC inóculo final (después del lavado)
% Reducción inóculo = UFC/ml (inóculo inicial) – UFC/ml (inóculo final) x 100

UFC/ ml (inóculo inicial)
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A continuación se esquematiza el procedimiento de laboratorio realizado para la preparación de
los tapones de corcho controles.
Aislamiento e identificación Cultivo puro +

microorganismos a partir de S.F. estéril Agitación
tapones de corcho
Filtración (Hongos filamentosos)

Gasa estéril
Suspensión conidios, levaduras y bacterias
Determinación de concentración
Aplicación a tapones (Aerosol) Aplicación a tapones (inmersión)
Agitación 3-6-9-24 horas 28ºC.
Decantar suspensión Cuantificación UFC/ml

Suspensión decantada
Lavar tapones con S.F. estéril-1 hora – 28ºC.
Diluciones seriadas
Sembrar
AEM al 2% + antibiótico 28ºC 3-5 días......... Hongos
TSA 37ºC 24 horas............ Bacterias
Recuento UFC/tapón y determinación de % de recuperación de microorganismos
Esquema 3. Procedimiento de laboratorio para la preparación de tapones controles
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3.1.2. EVALUACIÓN DE LOS MÉTODOS UTILIZADOS PARA EL ANÁLISIS
MICROBIOLÓGICO DE LOS TAPONES DE CORCHO
3.1.2.1. Inoculación de los tapones de corcho control
Fueron inoculados tapones de corcho para vinos espumosos durante 6 horas por el
método de inmersión, con mezclas de suspensiones de conidios fúngicos, levaduras y
bacterias a concentraciones de 102 células/ml.
Las mezclas de microorganismos estaban formadas por suspensiones de conidios de

Aspergillus niger, A. flavus, A. fumigatus, Penicillium frequentans, Trichoderma viride,
Paecilomyces variotii, Acremonium strictum y células de Rhodotorula glutinis y
Bacillus cereus; las cuales fueron aplicadas a los tapones de corcho a razón de 2 ml cada
una.
A estas mezclas no se adicionó ninguna especie del grupo de los Zigomycetes, con la
finalidad de evitar que su crecimiento invasivo impidiera el recuento de los demás
microorganismos.
3.1.2.2. Ensayos realizados para evaluar el método de referencia
Los diferentes parámetros establecidos por la Norma Catalana Nº 0.20/95 para el

control microbiológico de tapones de corcho para vinos espumosos fueron ensayados en
los tapones de corcho control, de igual forma estos parámetros fueron modificados a fin
de establecer las comparaciones respectivas.
Los parámetros objeto de estudios fueron: soluciones de lavado, tiempo y velocidad de

lavado, medios de cultivo, tiempos y temperaturas de incubación. Cada uno de ellos se
probó en forma individual y se mantuvieron los demás constantes. Se tomaron en cuenta
los mejores resultados en cada caso para continuar con la prueba siguiente. Cada uno de
los ensayos se realizó 6 veces con tres réplicas cada uno y se acompañó de sus
respectivos controles de esterilidad.
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3.1.2.2.1. Prueba de las soluciones de lavado
Para llevar a cabo las pruebas de las soluciones de lavado, se introdujeron 2 tapones
control en un matraz que contenía 100 ml de suero fisiológico estéril. De igual forma
otros 2 tapones control se sumergieron en un matraz que contenía 100 ml de solución
estéril Ringer _.
Los matraces así preparados se agitaron mecánicamente a 150 r.p.m. por 60 minutos.
Culminado este tiempo, las soluciones de lavado fueron filtradas al vacío sobre filtros
estériles de nitrocelulosa (Lida) de 47 mm de diámetro y 0,45 µm de diámetro de
porosidad. Los filtros se retiraron asépticamente y se colocaron sobre la superficie de
los medios de cultivo Plate Count Agar (PCA) y Sabouraud Dextrosa Agar (SDA)
adicionado de 3 ppm de clorhidrato de tetraciclina. Las placas de PCA se incubaron a
37 ºC durante 24 horas para el recuento de bacterias y las placas de SDA se incubaron a
28 ºC durante 3-5 días para el recuento de hongos filamentosos y levaduras.
3.1.2.2.2. Prueba de la velocidad de lavado
Para realizar esta prueba, se agitaron mecánicamente durante 60 minutos a 100, 150 y
200 r.p.m., matraces que contenían dos tapones controles cada uno, sumergidos en 100
ml de solución Ringer _ estéril o en 100 ml de suero fisiológico estéril.
El procesado posterior de los tapones control siguió de la misma forma que fue descrita
en el apartado anterior.
3.1.2.2.3. Prueba del tiempo de lavado
Se colocaron 2 tapones de corcho en matraces que contenían 100 ml de las soluciones

de lavado antes mencionadas y se agitaron a 150 r.p.m. por 5, 10, 15, 30, 45 y 60
minutos. El procesado posterior se siguió según lo descrito en el apartado 3.1.2.2.1.
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3.1.2.2.4. Prueba de los medios de cultivo
Los tapones de corcho control sumergidos en las soluciones de lavado (suero fisiológico
o Ringer _ estériles) se agitaron durante 30 minutos a 150 r.p.m., las soluciones de
lavado fueron filtradas como se indica en el punto 3.1.2.2.1. Tras la filtración al vacío,
los filtros fueron colocados asépticamente sobre diferentes medios de cultivo para el
posterior recuento de los microorganismos recuperados.
Para el recuento de las bacterias se utilizaron los medios de cultivo Plate Count Agar
(PCA) y Triptona de Soja Agar (TSA); para el recuento de hongos filamentosos y
levaduras se usaron los medios de cultivo Sabouraud Dextrosa Agar (SDA), Extracto de
Malta Agar (AEM); WL Nutritivo Agar (WLN) y Rosa de Bengala Agar (RBA).
A continuación se detalla la composición de los medios de cultivo no descritos

anteriormente:
Plate Count Agar Sabouraud Dextrosa Agar
Peptona 5,0 g Glucosa 40 g

Extracto de levadura 2,5 g Peptona 5g
Dextrosa 1,0 g Peptona de carne 5g
Agar-agar 15,0 g Agar-agar 15 g
Agua destilada c.s.p. 1000 ml Agua destilada c.s.p. 1000 ml
pH del medio: 7,0 + 0,2 pH del medio: 5,6 + 0,2

Esterilizar a 121ºC por 15 minutos. Esterilizar a 120 ºC por 20 minutos.
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WL Nutritivo Agar Rosa de Bengala Agar
Extracto de levadura 4,000 g Peptona 5,00 g
Triptona 5,000 g Dextrosa 10,00 g
Dextrosa 50,000 g Fosfato potásico 1,00 g
Fosfato monopotásico 0,550 g Sulfato magnésico 0,50 g
Sulfato magnésico 0,125 g Rosa de bengala 0,05 g
Cloruro cálcico 0,125 g Agar-agar 10,00 g
Cloruro férrico 0,002 g Agua destilada c.s.p. 1000 ml
Sulfato manganosos 0,002 g Cloranfenicol 0,50 g
Cloruro potásico 0,425 g
Verde bromocresol 0,022 g pH del medio: 7,2 + 0,2
Agar agar 20,000 g Esterilizar a 121 ºC por 20 minutos
Agua destilada c.s.p. 1000 ml
pH del medio: 5,5 + 0,2

Esterilizar a 121 ºC por 15 minutos
3.1.2.2.5. Prueba del tiempo de incubación
Los tapones de corcho control fueron procesados siguiendo los pasos del apartado
anterior. Los filtros se colocaron sobre los medios de cultivo TSA para el recuento de
bacterias y sobre SDA para el recuento de hongos filamentosos y levaduras incubándose
a 37 ºC y 28 ºC respectivamente por 24, 48, 72, 96 y 120 horas.
3.1.2.2.6. Prueba de la temperatura de incubación
Finalmente, se probaron diferentes temperaturas de incubación de los filtros sobre los

medios de cultivo antes mencionados, estas fueron 35, 37 y 39 ºC para el recuento de
bacterias y 25, 28 y 30 ºC para el recuento de hongos.
3.1.2.3. Cálculo de las UFC/tapón
Los recuentos totales de las UFC en cada uno de los filtros se dividieron entre el
número de tapones ensayados en cada matraz, obteniéndose de esta forma las
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UFC/tapón. Estos cálculos se realizaron tanto para todos los microorganismos en las
mezclas aplicadas como para las especies de cada uno de ellos presentes en cada una de
las mezclas.
UFC/tapón = UFC/ filtro

N
N= Número de tapones
3.1.2.4. Comparación de metodologías
Se prepararon tapones de corcho control utilizando el método del inmersión con la

finalidad de aplicarles diferentes metodologías y comparar los recuentos de los
microorganismos recuperados.
Las metodologías empleadas fueron:
a) Las establecidas por la Norma ISO 10718:1993.

b) El método de las diluciones decimales seriadas.
c) El método Sistema Miliflex-100.
Así mismo, se compararon los resultados obtenidos al aplicar la metodología propuesta

en este trabajo utilizando tapones de corcho para vinos espumosos y tapones de corcho
para vinos tranquilos.
3.1.2.4.1. Norma ISO 10718:1993
A los tapones controles se les aplicó la metodología establecida por el International

Standarization Organism ISO 10718:1993 para el control microbiológico de este
producto. Las diferencias básicas de esta Norma con la Norma Catalana 0.20/95 es la
utilización de caldo de extracto de malta acidificado con ácido tartárico y adicionado de
etanol como solución de lavado y un tiempo de lavado de 24 horas.
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3.1.2.4.2. Método de las diluciones decimales seriadas
Los tapones de corcho control pesados previamente, fueron inoculados por el método de
inmersión con 20 ml de las suspensiones de microorganismos en concentración de
109 células/ml (A razón de 2 ml de cada suspensión) y se realizaron diluciones
decimales seriadas a partir de esta concentración, como se indica en el apartado 3.1.1.6.
3.1.2.4.3. Método Sistema Miliflex-100
Este sistema utiliza una bomba al vacío al cual se le adosa la unidad Miliflex-100 que
está compuesta por un embudo de 100 ml de capacidad, que posee el filtro estéril de
ésteres de celulosa de 0,45 µm de porosidad, después de la filtración de la solución de
lavado de los tapones de corcho, la unidad se coloca sobre la cámara que contiene el
medio de cultivo semisólido (Caldo m-TGE para el recuento total de bacterias y otros
microorganismos aerobios o Caldo m-GREEN para el recuento de hongos filamentosos
y levaduras), se aplica presión para seccionar el embudo, se cierra la cámara de cultivo
y se incuba bajo las condiciones establecidas para cada medio de cultivo.
A continuación se detalla la composición de los medios de cultivo mencionados.
Caldo m-TGE Caldo m-GREEN
Ampollas de plástico de 2 ml Ampollas de plático de 2 ml

Triptona 10 g Peptona 1,0 g
Extracto de carne 6g Extracto de levadura 1,0 g
Dextrosa 2g Dextrosa 3,0 g
Agua destilada c.s.p. 1000 ml Sulfato potásico 0,5 g
pH: 7,0 + 0,2 Sulfato de magnesio 0,5 g
Incubar a 28-30 ºC por 48-96 horas Diastasa 0,1 g
Tiamina 0,1 g
Verde de bromocresol 0,05 g
Agua destilada c.s.p. 1000 ml
pH 4,6 + 0,2
Incubar a 28-32 ºC por 48-96 horas
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3.1.2.4.4. Método aplicado a diferentes tapones de corcho
Se compararon las UFC/tapón de los microorganismos recuperados cuando se utilizaron

tapones de corcho para vinos espumosos y tapones de corcho para vinos tranquilos.
Se colocaron 2 tapones control si eran para vinos espumosos y 4 tapones si eran para
vinos tranquilos, en matraces que contenían 100 ml de solución Ringer _ estéril, se
agitaron a 150 r.p.m. por 30 minutos, concluido este tiempo las soluciones se filtraron y
los filtros fueron sembrados sobre SDA y TSA a 28 ºC por 3-5 días y 37 ºC por 24 horas
respectivamente. Las UFC/tapón fueron calculadas según el apartado 3.1.2.3.
3.2. RECUENTO, AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE MICROORGANISMOS

EN MUESTRAS DE TAPONES DE CORCHO
3.2.1. Muestras de tapones de corcho
Fueron recolectadas en condiciones asépticas 12 muestras de tapones de corcho

terminados y adicionados de un recubrimiento de silicona, en diferentes fábricas de
tapones de corcho para vinos espumosos y vinos tranquilos de Catalunya, cada muestra
estaba compuesta por 100 tapones de corcho, 6 muestras correspondían a tapones para
vinos tranquilos y 6 muestras a tapones para vinos espumosos.
Las muestras fueron transportadas al laboratorio en forma aséptica para evitar el

aumento de la microbiota ya existente.
3.2.2. Procesado de las muestras
Los tapones de corcho fueron colocados de forma aséptica en matraces que contenían
100 ml de Ringer _ o suero fisiológico estériles (2 en el caso de tapones para vinos
espumosos y 4 si eran para vinos tranquilos), se agitaron a 150 r.p.m. por 30 minutos,
las soluciones de lavado se filtraron al vacío y los filtros se sembraron sobre TSA, SDA,
RBA y Agar Mc Conkey (para determinar la presencia de Enterobacterias), se
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incubaron a 37 ºC por 24 horas para el recuento bacterias y a 28 ºC por 3-4 días para el
recuento de hongos filamentosos y levaduras
Al cabo de este tiempo se procedió al recuento de las UFC en cada placa y los cálculos
de las UFC/tapón se realizó como se indica en el punto 3.1.2.3.
3.2.3. Aislamiento de hongos filamentos, levaduras y bacterias
Se tomaron con asa bacteriológica estéril, colonias representativas de los

microorganismos que crecieron sobre los filtros sembrados en los medios de cultivo
antes mencionados y se resembraron en tubos de ensayo con los medios de cultivo TSA
para el aislamiento de bacterias y SDA o AEM al 2% para el aislamiento de hongos
filamentosos y levaduras, se incubaron a las temperaturas y tiempos ya establecidos, el
procedimiento se repitió hasta obtener cultivos puros.
3.2.4. Identificación de los microorganismos aislados
3.2.4.1. Identificación de hongos filamentosos
La identificación de los hongos filamentosos se llevó a cabo a través de la observación

de las características macroscópicas y microscópicas de los mismos, siguiendo las
claves establecidas por Domsch et al en 1980, Samson et al en 1984 y Pitt y Hocking en
1985. En el caso de los géneros Penicillium y Aspergillus, éstos se sembraron, además,
sobre placas de Czapek con tres puntos de siembra equidistantes a fin de facilitar su
identificación, la cual se realizó considerando las características descritas por Domsch
et al en 1980, Pitt en 1985, Ramírez en1982, Raper y Fennell en 1965, Raper y Thom en
1949 y Samson et al en 1984.
3.2.4.2. Identificación de levaduras
La identificación de las levaduras se efectuó mediante la observación de las

características macroscópicas de las colonias sobre AEM o SDA (color, textura
aspecto), y de las características microscópicas, tomando en cuenta los caracteres de
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multiplicación vegetativa (formación de pseudomicelio o micelio verdadero) y las
características de las células (forma, tipo de gemación de los blastoconidios).
Así mismo, se les aplicaron pruebas de asimilación de fuentes de carbono, mediante el

sistema API 20 C AUX, el cual está compuesto de 20 cúpulas conteniendo substratos
deshidratados de diferentes azúcares que permiten realizar 19 pruebas de asimilación (la
cúpula 0 corresponde al control negativo). Las cúpulas fueron inoculas con un medio
semisólido que contenía 100 µl de suspensión de la levadura a probar con densidad
óptica igual al tubo Nº 2 de la escala de Mc Farland, las cámaras fueron incubadas por
24-72 horas a 30 ºC. Las lecturas se realizan con la visualización del crecimiento de la
levadura debido a su capacidad de utilizar el substrato correspondiente y la
identificación del microorganismo, comparando los resultados obtenidos con la tabla de
identificación.
Los azúcares ensayados por este método son: Glucosa, glicerol, 2-ceto-D-gluconato,
L-arabinosa, D-xilosa, adonitol, xilitol, galactosa, inositol, sorbitol, α-metil-D-
glucosida, celobiosa, lactosa, maltosa, sacarosa, trehalosa, melezitosa y rafinosa.
3.2.4.3. Identificación de bacterias
Las bacterias se identificaron tomando en cuenta sus características morfológicas y

tintoriales, así mismo se les efectuaron las pruebas bioquímicas especificadas por
Barrow y Feltham en 1993 y se compararon los resultados obtenidos con las tablas de
identificación de los autores antes mencionados y con el Bergey´s Manual of Systematic
Bacteriology editado por Holt en 1986.
Además, las Enterobacterias y otros bacilos Gram-negativos fueron identificados por el

sistema API 20 E, el cual consta de 20 microtubos que contienen substratos
deshidratados para las pruebas bioquímicas específicas para estos microorganismos. Las
baterías se inoculan con las suspensiones bacterianas y se incuban durante 18-24 horas a
35-37 ºC, realizando la lectura de los resultados tras este período de incubación.
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3.3. ACTIVIDAD ENZIMÁTICA DE LOS MICROORGANISMOS AISLADOS
3.3.1. Suspensiones de microorganismos
Se realizaron suspensiones de conidios fúngicos y de levaduras en concentración de

106 células/ml en suero fisiológico estéril, a partir de cultivos puros en AEM con 7 días
de incubación a 28 ºC y suspensiones de bacterias de densidad óptica igual a los tubos
5-6 de la escala de Mc Farland, a partir de cultivos en TSA incubados por 24 horas a
37 ºC.
3.3.2. Actividad enzimática
Se evaluó la actividad enzimática de los microorganismos mediante el sistema

API ZYM, con el cual se pueden estudiar 19 actividades enzimáticas a través de 20
cúpulas preparadas con substratos enzimáticos tamponados.
Las enzimas investigadas por orden numérico se detallan a continuación:
1. Control negativo 11. Fosfatasa ácida

2. Fosfatasa alcalina 12. Naftol-A-S-BI-fosfohidrolasa
3. Esterasa (C1) 13. α-galactosidasa
4. Esterasa lipasa (C8) 14. β-galactosidasa
5. Lipasa (C14) 15. β-glucorosidasa
6. Leucina arilamidasa
16. α-glucosidasa
7. Valina arilamidasa
17. β-glucosidasa
8. Cistina arilamidasa
18. N-acetil-β-glucosaminidosa
9. Tripsina
19. α-manosidasa
10. α-quimotripsina
20. α-flucosidasa
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Se añadieron 65 µl de las suspensiones celulares en cada cúpula, se incubaron las
galerías a 37 ºC para las bacterias y a 28 ºC para los hongos filamentosos, durante 4
horas. Al finalizar este tiempo, se añadió una gota del reactivo API ZYM A y una gota
del reactivo API ZYM B en cada cúpula.
La lectura de los resultados se efectúa de acuerdo a la intensidad del color de la

reacción. Los resultados pueden semicuantificarse, correspondiendo 0 a una reacción
negativa, 1 a la formación de 5 nanomoles, 2 a 10 nanomoles, 3 a 20 nanomoles, 4 a 30
nanomoles y 5 a 40 o más nanomoles.
3.4. ACTIVIDAD INHIBITORIA DE LOS MICROORGANISMOS AISLADOS
3.4.1. Método de los discos
Se realizaron cultivos de las especies de hongos filamentosos y levaduras en placas de

AEM, por 3-5 días a 28 ºC y cultivos de suspensiones bacterianas con densidad óptica
igual al tubo Nº1 de la escala de Mc Farland en placas de TSA, por 24 horas a 37 ºC.
Culminado este tiempo, se cortaron discos de 6 mm de diámetro de estos cultivos que

fueron colocados sobre placas de petri de AEM o TSA a los cuales, previamente, se les
había sembrado por superficie con asa de Digraslky, suspensiones celulares en
concentración de 106 células/ml de todos los microorganismos.
Se colocaron dos discos de cada microorganismo, uno haciendo contacto por la zona del
desarrollo microbiano y otro haciendo contacto por la zona del medio de cultivo, con la
finalidad de probar la actividad inhibitoria del microorganismo, en cada placa también
se colocaron discos que sólo contenían medio de cultivo. Simultáneamente, se
sembraron placas control que poseían sólo las suspensiones de los microorganismos,
con el fin de comprobar su viabilidad.
Las placas fueron incubadas, proporcionando las condiciones adecuadas para el

crecimiento de los microorganismos sembrados por superficie, es decir, a 28 ºC por 3-5
días si se trataba de hongos filamentosos y levaduras y a 37 ºC por 24 horas si se trataba
49
de bacterias. Al finalizar este tiempo, se midieron los halos inhibitorios producidos, de
la siguiente manera: Se midieron los diámetros de los halos inhibitorios totales, se
restaron a éstos los diámetros de los discos y el resultado se dividió entre dos. Los
resultados se expresaron en milímetros (mm).
Estas pruebas también se realizaron con hongos filamentosos que son frecuentemente
aislados de tapones de corcho para vinos, pero que no fueron encontrados en las
muestras analizadas. Estos fueron: Aspergillus flavus (FVB 3), Penicillium frequentans
(FVB 4), Rhizopus arrhizus (FVB 10), Paecilomyces variotii (FVB 6) y Acremonium
strictum (FVB 7), pertenecientes a la colección de cultivos de la Facultat de Veterinària
de la Universitat Autónoma de Barcelona.
3.4.2. Cromatografía en capa fina
Se realizaron cromatografías en capa fina a partir de cultivos puros de los hongos

filamentosos con mayor actividad inhibitoria.
Para ello, se utilizaron cromatofolios de silica gel Merck(Ref: 1.0553), previamente

activados a 105 ºC durante 90 minutos. En los cromatofolios activados se colocaron
durante 1 minuto, los discos de los microorganismos estudiados, por sus dos caras,
acompañados de discos control (sólo medio de cultivo), a una distancia de 1 cm del
borde inferior de la cromatoplaca. Se secaron las huellas con secador automático.
Los cromatolofolios se introdujeron en una cubeta de vidrio saturada con una mezcla de
reactivos. Se ensayaron mezclas con las siguientes composiciones:
Cloroformo/Acetato de etilo/Acido acético glacial (6:3:1),

Benceno/Metanol/Acido acético glacial (24:2:1), (98:8:4) y (12:1:0,5)
Cloroformo/Metanol (98:2).
Los cromatofolios fueron retirados de la cubeta a los 90 minutos o cuando el frente del
solvente llegaba a los 4 cm del borde superior de las cromatoplacas, éstos fueron
secados mecánicamente.
50
La lectura de los cromatofolios se realizó observando las huellas cromatográficas de los
discos de microorganismos bajo luz ultravioleta con longitudes de onda de
254 y 365 nanómetros.
Posteriormente, se realizaron cromatografías de los microorganismos que revelaron

huellas cromatográficas bien definidas, éstas fueron separadas, repitiendo numerosas
veces los discos de cada microorganismo en cada cromatofolio, los cuales fueron
introducidos en cubeta de vidrio con una mezcla de Benceno/Metanol/Acido acético
glacial en proporción 96:6:2, a excepción de Fusarium moniliforme para el cual se
utilizó una mezcla de Cloroformo/Acetato de etilo/Acido acético glacial en proporción
60:30:10, las condiciones de tiempo fueron iguales a las ya descritas, las bandas se
recuperaron y se depositaron en tubos de centrífuga que contenían los solventes
mencionados, se centrifugaron por 5 minutos a 10000 r.p.m. El sobrenadante resultante,
fue separado del sedimento y colocado en otro tubo de centrífuga.
Se cortaron discos de papel de filtro de 0,5 cm de diámetro, los cuales se esterilizaron en

autoclave a 121 ºC por 20 minutos. Estos discos se impregnaron con los extractos de los
microorganismos que habían sido separados y fueron depositados en placas que
contenían los microorganismos, sembrados por agotamiento en superficie, contra los
cuales habían presentado actividad inhibitoria. Se incubaron a 28 ºC durante por 48
horas si se trataba de hongos filamentosos y levaduras y a 37 ºC por 24 horas si se
trataba de bacterias. Finalmente se midieron los halos inhibitorios, de la forma antes
descrita.
3.5. METABOLISMO SECUNDARIO DE LOS MICROORGANISMOS AISLADOS
3.5.1. Producción de Micotoxinas
Se escogieron entre los hongos filamentosos aislados aquellos que según la bibliografía,
en su metabolismo secundario son capaces de producir micotoxinas. Estos fueron:
Alternaria alternata, Penicillium citrinum, Fusarium moniliforme y Fusarium solani.
Se realizaron cultivos en placas de Petri de los microorganismos antes mencionados,

durante 7 días a 28 ºC, de los cuales se extrajeron discos de 6 mm de diámetro, los
51
discos fueron colocados sobre cromatofolios activados contactando con éstos sólo su
cara de medio de cultivo, a 2 cm del borde inferior del cromatofolio, durante un minuto.
De igual forma se colocaron al lado de cada disco 10 µl de los controles de las

micotoxinas específicas para cada microorganismo. Las micotoxinas ensayadas fueron:
! Acido tenuazoico (TA),

! Tentoxina (TEN),
! Alternariol (AOH),
! Altenueno (ALT),
! Altertoxina I (ATX-I)
! Alternariol monometil éter (AME)
Descritas como elaboradas y acumuladas por Alternaria alternata.
! Citrinina. Descrita como elaborada y acumulada por Penicillium citrinum.
! Fumonisina B1. Descrita como elaborada y acumulada por Fusarium moniliforme y

Fusarium solani.
Se prepararon controles de las micotoxinas de Alternaria alternata a las

concentraciones de 30 ng/10 µl de alcohol etílico para alternariol, alternariol monometil
éter, altenueno y altertoxina y de 50 ng/10 µl de alcohol etílico para ácido tenuazoico y
tentoxina. Los controles de las micotoxinas de Penicillium citrinum, y de las especies de
Fusarium estudiadas (citrinina y Fumonisina B1 respectivamente) fueron preparados a
una concentración de 25 µg/ml de cloroformo, los controles utilizados fueron:
! Acido tenuazoico (Sigma, Ref. 3408)

! Tentoxina (Sigma, Ref. T8099)
! Alternariol (Sigma, Ref. A1312)
! Altenueno (Sigma, Ref. A4437)
! Altertoxina I (Sigma, Ref. A1437)
! Alternariol monometil éter (Sigma, Ref. A3171)
52
! Citrinina (Sigma, Ref. C2513)
! Fumonisina B1 (Sigma, Ref. F1147)
La cromatografía se llevó a cabo en una mezcla de Benceno/Metanol/Acido acético

glacial en proporción 96:6:2 para Alternaria alternata, siguiendo la metodología
utilizada por Fábrega et al 2000 y una mezcla Cloroformo/Metanol 50:50 para
Penicillium citrinum, Fusarium moniliforme y Fusarium solani, como modificaciones
de los métodos descritos por Montani et al en 1988 para la deteccción de citrinina y por
Voss et al en 1990 para la detección de fumonisina B1 . Los cromatofolios fueron
secados y su posterior lectura se realizó de la forma antes descrita.
3.6. ANÁLISIS ESTADÍSTICO
Los resultados se analizaron estadísticamente por medio del análisis de varianza de un

factor (ANOVA) y las variaciones significativas entre los grupos estudiados fueron
determinadas mediante un análisis post-hoc de Student-Newman-Keuls. Los cálculos se
realizaron mediante el programa SPSS 6.1.2.
53
4. RESULTADOS
4.1. RESULTADOS DE LA EVALUACIÓN DE LAS METODOLOGÍAS PARA

EL CONTROL MICROBIOLÓGICO DE LOS TAPONES DE CORCHO
Los resultados de la evaluación de las metodologías utilizadas para el control

microbiológico de tapones de corcho para vinos, se especifican en los resultados
obtenidos en la preparación de tapones control y en los resultados obtenidos en la
evaluación de diferentes metodologías de control microbiológico de estos productos
utilizando los tapones control preparados.
4.1.1. PREPARACIÓN DE LOS TAPONES CONTROL
Los resultados obtenidos después de aplicar los diferentes métodos de inoculación

experimental, con diferentes suspensiones de microorganismos a diferentes
concentraciones y tiempos de incubación, se especifican a continuación.
4.1.1.1. Inoculación de tapones control por aerosol
El recuento de los microorganismos recuperados al aplicar las diferentes mezclas de

éstos por el método de aerosol, fue menor de diez (10) en la primera dilución de todas
las concentraciones de inóculos utilizadas.
4.1.1.2. Inoculación de tapones control por inmersión
El método de contaminación de los tapones por inmersión, proporcionó resultados que

variaron según el tipo, tiempo de aplicación y concentración del inóculo.
55
En la Figura 3, se muestra la relación existente entre el tiempo de inoculación y el
recuento de las Unidades Formadoras de Colonia por tapón (UFC/tapón) en los tapones
de corcho y las Unidades Formadoras de Colonia por mililitro del líquido decantado
(UFC/ml del líquido decantado), cuando el inóculo estaba formado por una mezcla de
Aspergillus niger, A. flavus, A. fumigatus y de Penicillium frequentans (1:1:1:1), a
concentración de 107 UFC/ml.
tapón
3 líquido decantado
Recuento x 106
0
3 6 9 24
tiempo (Horas)
Figura 3. Recuento de las Unidades Formadoras de Colonia por tapón

(UFC/tapón) y de las Unidades Formadoras de Colonia por ml del líquido
decantado (UFC/ml del líquido decantado) de Aspergillus y de Penicillium en
función del tiempo de incubación
56
En la Tabla 7, se indican los porcentajes de recuperación de estos microorganismos en
la mezcla antes mencionada, tanto en los tapones como en el líquido decantado en
función del tiempo de incubación.
Tabla 7. Porcentaje de recuperación en la mezcla de concentración 107 UFC/ml de

Aspergillus y de Penicillium en líquido decantado y en los tapones en función del
tiempo de incubación.
Porcentaje de Recuperación (%)

Tiempo (Horas) Líquido decantado Tapón
3 10,0 0,6
6 0,9 35,8
9 5,4 0,3
24 0,2 0,0
El recuento de las UFC/tapón y las UFC/ml del líquido decantado de todas las especies
de microorganismos aplicados a una concentración de 107 UFC/ml, en función del
tiempo de incubación, se indica en la Figura 4.
57
8
7 tapón
6 líquido decantado
Recuento x 106
5
4
3
2
1
0
3 6 9 24
Tiempo (Horas)

(UFC/tapón) y de las Unidades Formadoras de Colonia por ml del líquido
decantado (UFC/ml del líquido decantado) de los microorganismos en función del
tiempo de incubación
58
En la Tabla 8, se señalan los porcentajes de recuperación de todas las especies de
microorganismos tanto en el líquido decantado como en los tapones de corcho en
función del tiempo de incubación, cuando se aplicaron las mezclas a una concentración
de 107 UFC/ml.
Tabla 8. Porcentaje de recuperación de todas las especies de microorganismos en el

líquido decantado y en los tapones en función del tiempo de incubación.

Tiempo (Horas) Líquido decantado Tapón
3 22,5 10,9
6 7,5 44,9
9 58,7 19,2
24 0,0 0,0
Los porcentajes de recuperación de hongos filamentosos, levaduras y bacterias

aplicados por inmersión durante seis (6) horas de incubación, se indican en la Tabla 9.
Tabla 9. Porcentaje de recuperación de hongos filamentosos, levaduras y bacterias a las

seis (6) horas de inoculación partiendo de una concentración inicial de 107 UFC/ml.
Microorganismo Porcentaje de Recuperación (%)

Hongos filamentosos 41,7
Levaduras 1,9
Bacterias 0,7
59
En la Tabla 10, se muestra el porcentaje de recuperación individual de los
microorganismos aplicados por inmersión a los tapones de corcho en un período de seis
(6) horas de incubación. Cabe mencionar que A. fumigatus y P. variotii no fueron
recuperados.
Tabla 10. Porcentaje de recuperación individual de los microorganismos a las seis (6)
horas de inoculación, partiendo de una concentración inicial de 107 UFC/ml.
Microorganismo Porcentaje de recuperación (%)

Trichoderma viride 14,4
Aspergillus niger 9,8
Rhizopus arrhizus 9,8
Penicillium frequentans 2,6
Acremonium strictum 2,6
Aspergillus flavus 2,6
Rhodotorula glutinis 1,9
Bacillus cereus 0,7
60
El recuento de las UFC/tapón de la mezcla de Aspergillus y de Penicillium tras la
inoculación de los tapones durante seis (6) horas con una suspensión de 109 UFC/ml de
estos microorganismos, se representa en la Figura 5.
4,5
4 A.niger
A.flavus
3,5
A.fumigatus
P.frequentans
UFC/tapón x 108
2,5
1,5
0,5

(UFC/tapón) en la mezcla de Aspergillus y de Penicillium en los tapones inoculados
con una suspensión de 109 conidios/ml.
61
En la Figura 6, se señala el recuento de las UFC/tapón en la mezcla antes mencionada,
cuando se aplicó un inóculo de 105 UFC/ml.
14
A.niger
12
A.flavus
A.fumigatus
10
P.frequentans
3
UFC/tapón x 10

(UFC/tapón) en la mezcla de Aspergillus y de Penicillium en los tapones inoculados
con una suspensión de 105 conidios/ml
62
En la tabla 11, se indican los porcentajes de recuperación de la mezcla de Aspergillus y
de Penicillium en los tapones inoculados durante seis (6) horas con suspensiones de
109 o de 105 UFC/ml.
Tabla 11. Porcentaje de recuperación en la mezcla de Aspergillus y de Penicillium en

los tapones inoculados con suspensiones de 109 o de 105 UFC/ml

Microorganismo Inóculo 109 conidios/ml Inóculo 105 conidios/ml
Aspergillus niger 19,7 7,2
A. flavus 6,5 4,1
A. fumigatus 4,3 1,4
Penicillium frequentans 4,3 2,8
63
En la Figura 7, están representados los resultados obtenidos en el recuento de las
UFC/tapón de todas las especies de microorganismos cuando éstos fueron inoculados
durante seis (6) horas con una suspensión de 109 UFC/ml.
10
9
Hongos filamentosos
8
Levaduras
7
Bacterias
UFC/tapón x 108

(UFC/tapón) de todas las especies de microorganismos en los tapones inoculados
con una suspensión de 109 células/ml.
64
El recuento de las UFC/tapón de todas las especies de microorganismos inoculados en
suspensiones de 105 UFC/ml, se muestra en la Figura 8.
20
18
Hongos filamentosos
16
Levaduras
14
UFC/tapón x 103
Bacterias
12
10
8
6
4
2
0
Figura 8. Recuento de las UFC/tapón de todas las especies de microorganismos en

los tapones inoculados con una suspensión de 105 células/ml.
En la tabla 12 se señala el porcentaje de recuperación de los hongos filamentosos,

levaduras y bacterias cuando se aplicaron las suspensiones a concentraciones de
109 o de 105 UFC/ml.
Tabla 12. Porcentaje de recuperación de todos los microorganismos en los tapones

inoculados con suspensiones de 109 o de 105 células/ml

Microorganismos Inóculo 109 células/ml Inóculo 105células/ml
Hongos filamentosos 39,6 8,9
Levaduras 4,1 1,8
Bacterias 4,1 5,0
65
4.1.1.3. Resultados del análisis estadístico en la preparación de los tapones de
corcho control
Los resultados del análisis estadístico de los datos correspondientes a los recuentos de
las UFC/tapón y UFC/ml del líquido decantado, tanto en las mezclas de Aspergillus y de
Penicillium como en las mezclas de todos los microorganismos en función del tiempo
de inoculación, de la concentración del inóculo y de los microorganismos recuperados,
se detallan en las Tablas 13-19.
Tabla 13. p-valores para el ANOVA de los recuentos de las UFC/ml del líquido
decantado de la mezcla de Aspergillus y de Penicillium inoculados a una concentración
de 107 UFC/ml en función del tiempo de incubación.
Tiempo de incubación (Horas)

3 6 9 24
3 . ** ** **
6 . NS NS
9 . NS
24 .
Significación: *p < 0.05, **p < 0,01, ***p < 0.001

NS: No significativo
66
Tabla 14. p-valores para el ANOVA de los recuentos de las UFC/ml del líquido
decantado de todas las especies de microorganismos inoculados a una concentración de
107 UFC/ml en función del tiempo de incubación

3 6 9 24
3 . *** ** *
6 . * *
9 . *
24 .

Tabla 15. p-valores para el ANOVA de los recuentos de UFC/tapón de Aspergillus y de

Penicillium inoculados a una concentración de 107 UFC/ml en función del tiempo de
incubación

3 6 9 24
3 . ** ** *
6 . *** *
9 . *
24 .

67
Tabla 16. p-valores para el ANOVA de los recuentos de UFC/tapón de todas las
especies de microorganismos inoculados a una concentración de 107 UFC/ml en función
del tiempo de incubación

3 6 9 24
3 . *** ** *
6 . ** *
9 . *
24 .

Tabla 17. p-valores para el ANOVA de los recuentos de las UFC/tapón de Aspergillus y
de Penicillium inoculados a una concentración de 109 UFC/ml a las 6 horas de
incubación
Microorganismos
1 2 3 4
1 . ** *** **
2 . NS NS
3 . NS
4 .

1: Aspergillus niger 2: Aspergillus flavus 3: Aspergillus fumigatus 4: Penicillium frequentans
68
Tabla 18. p-valores para el ANOVA de los recuentos de UFC/tapón de Aspergillus y de
Penicillium inoculados a una concentración de 105 UFC/ml a las 6 horas de incubación
Microorganismos
1 2 3 4
1 . * *** **
2 . ** NS
3 . NS
4 .

1: Aspergillus niger 2: Aspergillus flavus 3: Aspergillus fumigatus 4: Penicillium frequentans
Tabla 19. p-valores para el ANOVA de los recuentos de las UFC/tapón de Hongos
filamentosos, levaduras y bacterias inoculados a concentraciones de
109 o de 105 UFC/ml a las 6 horas de incubación.
Microorganismos
1 2 3
1 . ** **
2 . NS
3 .

1: Hongos filamentosos 2: Levaduras 3: Bacterias
69
4.1.2. RESULTADOS DE LA EVALUACIÓN DE LAS METODOLOGÍAS
UTILIZADAS
4.1.2.1. ENSAYOS REALIZADOS PARA EVALUAR EL MÉTODO DE REFERENCIA
Los recuentos de las Unidades Formadoras de Colonia por tapón (UFC/tapón) y el

porcentaje de recuperación individual de los microorganismos que formaban las
mezclas con las cuales se prepararon previamente los tapones de corcho control se
detallan a continuación.
Cabe destacar que los porcentajes de recuperación individual de los microorganismos

no superaron en ningún caso el 10 %.
4.1.2.1.1. Prueba de las soluciones de lavado
Los resultados obtenidos después de ensayar Suero fisiológico estéril o Solución Ringer
_ estéril como soluciones de lavado de los tapones de corcho control, se resumen en la
Figura 9.
23 PCA
Recuento UFC/tapón
SDA
22
21
20
SF Ringer 1/4
Soluciones de lavado

(UFC/tapón) en los medios de cultivo PCA y SDA en función de la solución de
lavado
PCA: Plate Count Agar SDA: Sabouraud Dextrosa Agar SF: Suero Fisiológico
70
En las Figuras 10 y 11, se representa el porcentaje de recuperación de todos los
microorganismos previamente inoculados a los tapones de corcho, cuando se utilizó
Suero fisiológico estéril o Solución Ringer _ estéril como solución de lavado,
respectivamente.
9
8
Porcentaje de recuperación
7 PCA
SDA
6
5
4
3
2
1
0
1 2 3 4 5 6 7 8 9
Microorganismos
Figura 10. Porcentaje de recuperación, en PCA y SDA, de todos los

microorganismos en función de Suero fisiológico como solución de lavado
PCA: Plate Count Agar SDA: Sabouraud Dextrosa Agar
1: Aspergillus niger 2:Aspergillus flavus 3: Aspergillus fumigatus 4: Penicillium frequentans

5: Trichoderma viride 6: Paecilomyces variotii 7: Acremonium strictum 8: Rhodotorula glutinis
9: Bacillus cereus
71
9
8
Porcentaje de Recuperación
7 PCA
SDA
6
0
1 2 3 4 5 6 7 8 9
Microorganismos
Figura 11. Porcentaje de recuperación, en PCA y SDA, de todos los

microorganismos, en función de Ringer _ como solución de lavado
1: Aspergillus niger 2: Aspergillus flavus 3: Aspergillus fumigatus

4: Penicillium frequentans 5: Trichoderma viride 6: Paecilomyces variotii
7: Acremonium strictum 8: Rhodotorula glutinis 9: Bacillus cereus
72
4.1.2.1.2. Prueba de la velocidad de lavado
Los resultados obtenidos después de ensayar las diferentes velocidades de lavado (100,
150 y 200 r.p.m), se señalan en la Figura 12.
25
PCA
SDA
20
Recuento UFC/tapón
15
10
0
100 150 200
Velocidad de Lavado (r.p.m)
Figura 12. Recuento de las Unidades Formadoras de Colonia/tapón (UFC/tapón)

de los microorganismos, en los medios PCA y SDA, en función de la velocidad de
lavado (r.p.m)
73
Los porcentajes de recuperación, en PCA y SDA, de cada uno de los microorganismos
inoculados a los tapones de corcho, en función de las diferentes velocidades de lavado,
se indican en las Figuras 13 y 14 respectivamente.
7 100 r.p.m.
150 r.p.m.
6
200 r.p.m.
5
0
1 2 3 4 5 6 7 8 9
Microorganismos
Figura 13. Porcentaje de recuperación individual de los microorganismos, en SDA,

en función de la velocidad de lavado
SDA: Sabouraud Dextrosa Agar

74
9
100 r.p.m.
8
150 r.p.m.
7
200 r.p.m.
6
5
4
3
2
1
0
1 2 3 4 5 6 7 8 9
Microorganismos
Figura 14. Porcentaje de recuperación individual de los microorganismos, en PCA,

en función de la velocidad de lavado (100,150 y 200 r.p.m)
PCA: Sabouraud Dextrosa Agar

4.1.2.1.3. Prueba del tiempo de lavado
Los recuentos de las Unidades Formadoras de Colonia por tapón (UFC/tapón) de los
microorganismos, después de aplicar diferentes tiempos de lavado (5, 10, 15, 30, 45 y
60 minutos), se indican en la Figura 15.
75
30
PCA
25 SDA
Recuento UFC/tapón
20
15
10
0
5 10 15 30 45 60
Velocidad de lavado (minutos)
Figura 15. Recuento de las Unidades de Formadoras de Colonia por tapón

(UFC/tapón), en PCA y SDA, en función del tiempo de lavado
En las Figuras 16 y 17, se resumen los porcentajes de recuperación de cada una de las
especies de microorganismos inoculadas previamente a los tapones de corcho, en los
medios de cultivo PCA y SDA respectivamente, en función del tiempo de lavado.
76
4
3,5
3
2,5 Penicillium frequentans
2 Trichoderma viride
1,5 Paecilomyces variotii
1
0,5
0
5' 10' 15' 30' 45' 60'
Tiempo de lavado (minutos)
3,5
3
Acremonium strictum
2,5
2
Rhodotorula glutinis
1,5
1
Bacillus cereus
0,5
0
5' 10' 15' 30' 45' 60'
7
6 Aspergillus niger
5 Aspergillus flavus
4 Aspergillus fumigatus
3
2
1
0
5' 10' 15' 30' 45' 60'
Figura 16. Porcentaje recuperación individual de los microorganismos, en PCA, en

función del tiempo de lavado (5, 10, 15, 30, 45, 60 minutos)
PCA: Plate Count Agar
77
7
6
5
Aspergillus niger
4
Aspergillus flavus
3
Aspergillus fumigatus
2
1
0
5' 10' 15' 30' 45' 60'
3,5
3 Penicillium frequentans
2,5 Trichoderma viride
2 Paecilomyces variotii
1,5
1
0,5
0
5' 10' 15' 30' 45' 60'
6
5
4 Acremonium strictum
3 Rhodotorula glutinis
2 Bacillus cereus
1
0
5' 10' 15' 30' 45' 60'

en función del tiempo de lavado (5, 10, 15, 30, 45, 60 minutos)
78
4.1.2.1.4. Prueba de los medios de cultivo
Los recuentos de las Unidades Formadoras de Colonia por tapón (UFC/tapón), tras la
siembra de los filtros en los medios de cultivo Plate Count Agar (PCA), Sabouraud
Dextrosa Agar (SDA), WL Nutritivo Agar (WLN), Extracto de Malta Agar al 2 %
(AEM) y Rosa de Bengala Agar (RBA), se muestran en la Figura 18.
En la tabla 20, se señalan los porcentajes de recuperación individual de los

microorganismos inoculados a los tapones de corcho, en función de los diferentes
medios de cultivo utilizados.
30
25
PCA
Recuento UFC/tapón
20
TSA
WLN
15 SDA
AEM
RBA
10

(UFC/tapón) de los microorganismos en función de los medios de cultivo utilizados
PCA: Plate Count Agar TSA: Triptona de Soja Agar WLN: WL nutritivo Agar
SDA: Sabouraud Dextrosa Agar AEM: Agar Extracto de Malta al 2% RBA: Rosa de Bengala Agar
79
Tabla 20. Porcentaje de recuperación individual de los microorganismos en función del
medio de cultivo

Microorganismo PCA TSA WLN SDA AEM RBA
Aspergillus niger 6,0 6,9 7,6 6,9 7,0 7,2
A. flavus 2,3 2,1 2,7 2,6 2,0 2,6
A. fumigatus 4,6 3,1 0,9 2,1 2,3 2,1
Penicillium frequentans 1,1 1,1 2,4 3,4 2,0 1,7
Trichoderma viride 0.9 0,0 1,6 2,3 2,0 1,6
Paecilomyces variotii 2,6 0,6 1,3 1,1 1,8 2,4
Acremonium strictum 0,1 0,0 0,4 0,6 0,4 0,6
Rhodotorula glutinis 0,0 0,0 6,0 6,6 6,1 6,9
Bacillus cereus 1,6 8,2 0,0 0,0 0,0 0,0
PCA: Plate Count Agar TSA: Triptona de Soja Agar WLN: WL nutritivo Agar SDA: Sabouraud
Dextrosa Agar AEM: Agar Extracto de Malta al 2% RBA: Rosa de Bengala Agar
4.1.2.1.5. Prueba del tiempo de incubación
En la Figura 19, se indican los recuentos de las Unidades Formadoras de Colonia por
tapón (UFC/tapón), realizados en los cultivos de 24, 48, 72, 96 y 120 horas de
incubación en los medios de cultivo TSA y SDA.
30
25
Recuento UFC/tapón
20
TSA
15
SDA
10
0
24 48 72 96 120
tiempo de incubación

(UFC/tapón), en función del tiempo de incubación (24, 48, 72, 96, 120 horas)
TSA: Triptona Soja Agar SDA: Sabouraud Dextrosa Agar
80
Los porcentajes de recuperación individuales de los microorganismos, tras el cultivo de
los filtros sobre TSA y SDA, en función del tiempo de incubación, se señalan en las
Figuras 20 y 21.
6
5 Aspergillus niger
4 Aspergillus flavus
3 Aspergillus fumigatus
2
1
0
24h 48h 72h 96h 120h
Tiempo de incubación (horas)
5
4
Penicillium frequentans
3
Trichoderma viride
2
Paecilomyces variotii
1
0
24h 48h 72h 96h 120h
6
Acremonium strictum
4 Rhodotorula glutinis
Bacillus cereus
2
0
24h 48h 72h 96h 120h
Figura 20. Porcentaje de recuperación individual de los microorganismos, en TSA,

en función del tiempo de incubación (24, 48, 72, 96, 120 horas)
TSA: Triptona Soja Agar
81
10
8
Aspergillus niger
6
Aspergillus flavus
4
Aspergillus fumigatus
2
0
24h 48h 72h 96h 120h
Tiempo de incubación (minutos)
3,5
3 Penicillium frequentans
2,5 Trichoderma viride
2
Paecilomyces variotii
1,5
1
0,5
0
24h 48h 72h 96h 120h
7
6
5
Acremonium strictum
4
Rhodotorula glutinis
3
Bacillus cereus
2
1
0
24h 48h 72h 96h 120h

en función del tiempo de incubación (24, 48, 72, 96, 120 horas)
82
4.1.2.1.6. Prueba de la temperatura de incubación
Los recuentos de las Unidades formadoras de Colonia por tapón (UFC/tapón), obtenidos
después de la incubación a 35, 37 y 39 ºC para la recuperación de bacterias y a 25, 28 y
30 ºC para la recuperación de hongos filamentosos y levaduras, se muestran en la Figura
22.
22
Recuento UFC/tapón
TSA
21
20
19
35 37 39
temperatura incubación (ºC)
a)
30
SDA
25
Recuento UFC/tapón
20
15
10
0
25 28 30
Temperatura incubación (ºC)
b)
Figura 22. Recuento de las Unidades formadoras de Colonia por tapón

(UFC/tapón) de los microorganismos en función de la temperatura de incubación
a) Recuento de bacterias b) Recuento de hongos filamentosos y levaduras
TSA: Triptona Soja Agar SDA: Sabouraud Dextrosa Agar
83
En las Figuras 23 y 24, se muestran los porcentajes de recuperación individual de los
microorganismos en TSA y SDA respectivamente, en función de la temperatura de
incubación.
7
5 35 ºC
4 37 ºC
39 ºC
3
2
1
0
1 2 3 4 5 6 7 8 9
Microoganismos
Figura 23. Porcentaje de recuperación individual de los microorganismos, en TSA,

en función de la temperatura de incubación (35 ºC, 37 ºC, 39 ºC)
TSA: Triptona Soja Agar

84
Porcentaje de Recuperación 8
7
6
26 ºC
5 28 ºC
4 30 ºC
3
2
1
0
1 2 3 4 5 6 7 8 9
Microorganismos

en función de la temperatura de incubación (26 ºC, 28 ºC, 30 ºC)

85
4.1.2.2. Resultados del análisis estadístico en la evaluación de la metodología para
el control microbiológico de los tapones de corcho para vinos
Los resultados del análisis estadístico de los datos obtenidos al evaluar los parámetros
utilizados para el control microbiológico de los tapones de corcho para vinos, se
detallan en las Tablas 21-25.
Tabla 21. p-valores para el ANOVA de los recuentos de las UFC/tapón en Plate Count
Agar (PCA) en función del tiempo de lavado
Tiempo de lavado (Minutos)

5 10 15 30 45 60
5 . * * *** *** ***
10 . ** *** *** ***
15 . *** *** ***
30 . NS NS
45 . NS
60 .
Significación: * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001
Tabla 22. p-valores para el ANOVA de los recuentos de las UFC/tapón en Sabouraud
Dextrosa Agar (SDA), en función del tiempo de lavado
Tiempo de lavado (Minutos)

5 10 15 30 45 60
5 . * ** *** *** ***
10 . ** ** *** ***
15 . *** *** ***
30 . NS NS
45 . NS
60 .
86
Tabla 23. p-valores para el ANOVA de los recuentos de las UFC/tapón en Plate Count
Agar (PCA) y Sabouraud Dextrosa Agar (SDA) en función de la velocidad de lavado
Velocidad de lavado (r.p.m.)

100 150 200
100 . * *
150 . NS
200 .
Tabla 24. p-valores para el ANOVA de los recuentos de las UFC/tapón en Triptona Soja
Agar (TSA) en función del tiempo de incubación

24 48 72 96 120
24 . *** ** ** **
48 . ** ** **
72 . NS NS
96 . NS
120 .
87
Tabla 25. p-valores para el ANOVA de los recuentos de las UFC/tapón en Sabouraud
Dextrosa Agar (SDA) en función del tiempo de incubación

24 48 72 96 120
24 . *** *** *** ***
48 . ** ** **
72 . NS **
96 . **
120 .
No existen diferencias significativas en los recuentos de las UFC/tapón en Plate Count

Agar (PCA) y Sabouraud Dextrosa Agar (SDA) cuando se utilizaron suero fisiológico y
Solución Ringer _ como soluciones de lavado.
De igual manera, no se encontraron diferencias significativas en los recuentos de las

UFC/tapón cuando se probaron diferentes medios de cultivo.
Tampoco se encontraron diferencias significativas en los recuentos de las UFC/tapón

cuando se probaron diferentes temperaturas para la incubación de bacterias. Estos
mismos resultados se obtuvieron cuando se probaron diferentes temperaturas para la
incubación de hongos filamentosos y levaduras.
88
4.1.3. RESULTADOS DE LA COMPARACIÓN DE METODOLOGÍAS
4.1.3.1. Comparación de la metodología establecida por la Norma 0.20/95 y la

metodología propuesta en este estudio
Los porcentajes de recuperación de los microorganismos inoculados a los tapones de

corcho, al utilizar la metodología establecida por la Norma 0.20/95 y la propuesta en
este estudio, se indican en la Tabla 26.
Tabla 26. Porcentaje de recuperación de los microorganismos al comparar la Norma

0.20/95 y la metodología propuesta en este estudio

Bacterias Hongos filamentosos y levaduras
Metodologías PCA TSA SDA
0.20/95 1,6 _ 24
0.20/95 modificada _ 8,6 23
PCA: Plate Count Agar TSA: Triptona Soja Agar SDA: Sabouraud Dextrosa Agar
- : No es utilizado el medio de cultivo
4.1.3.2. Comparación de la metodología establecida por la Norma ISO 10718:1993

y la metodología propuesta en este estudio
Los recuentos de las Unidades Formadoras de Colonia por tapón, al aplicar la

metodología establecida por la Norma ISO 10718:1993, no se pudieron realizar debido
al crecimiento invasivo de todos los microorganismos en todas las placas de Petri.
89
4.1.3.3. Comparación del método de las diluciones seriadas decimales y la
En la Tabla 27, se señalan los porcentajes de recuperación de los microorganismos

cuando se comparó la metodología propuesta en este estudio con el método de las
diluciones seriadas.
Tabla 27. Porcentaje de recuperación de los microorganismos utilizando el método de

las diluciones decimales seriadas y el método propuesto en este estudio

Inóculo (células/ml) Diluciones decimales seriadas 0.20/1995 modificada
109 47,8 ND
7
10 44,9 ND
105 15,7 ND
102 0,0 25
ND: No determinado, debido a crecimiento excesivo
4.1.3.4. Comparación del método Sistema Miliflex-100 y la metodología propuesta

en este estudio
El porcentaje de recuperación de los microorganismos, al comparar el Método del

Sistema Miliflex-100 y el método propuesto en este trabajo, se indican en la Tabla 28.
Tabla 28. Porcentaje de recuperación de los microorganismos utilizando el Método

Sistema Miliflex-100 y el método propuesto en este trabajo

Microorganismos Miliflex-100 0.20/95 modificada

Levaduras 5,7 6,3
Bacterias 5,1 7,0
90
4.1.3.5. Metodología propuesta aplicada a diferentes tapones de corcho
En la Tabla 29, se muestran los porcentajes de recuperación de los microorganismos,

después de haber sido inoculados a tapones de corcho para vinos espumosos y tapones
de corcho para vinos tranquilos.
Tabla 29. Porcentaje de recuperación de los microorganismos en tapones de corcho para

vinos tranquilos y para vinos espumosos

Microorganismos Tapones vinos espumosos Tapones vinos tranquilos
Levaduras 6,5 7,5
Bacterias 7,2 9,1
91
4 .2. RESULTADOS DEL RECUENTO E IDENTIFICACIÓN DE HONGOS
FILAMENTOSOS, LEVADURAS Y BACTERIAS EN MUESTRAS DE TAPONES DE
CORCHO PARA VINOS TRANQUILOS Y VINOS ESPUMOSOS
4.2.1. Resultados del recuento de hongos filamentosos, levaduras y bacterias en

muestras de tapones de corcho para vinos espumosos y vinos tranquilos
En las Tablas 30 y 31 se muestran los recuentos de las Unidades Formadoras de Colonia

por tapón (UFC/tapón) en las muestras de tapones de corcho para vinos espumosos y
vinos tranquilos, respectivamente.
Cabe destacar, que en los medios de cultivo Triptona Soja Agar (TSA) y Mc Conkey
Agar, sólo hubo crecimiento de bacterias y en los medios de cultivo Sabouraud dextrosa
Agar y Rosa de Bengala Agar, sólo hubo crecimiento de hongos filamentosos y
levaduras
Tabla 30. Recuento de las Unidades Formadoras de Colonia por tapón (UFC/tapón) en
muestras de tapones para vinos espumosos
Recuentos de UFC/tapón
Muestra TSA MK SDA RBA
1 16 _ > 100 >100
2 24 _ >100 >100
3 6 _ >100 >100
4 22 1 >100 >100
5 4 _ 23 13
6 17 _ 22 15
- : No hubo crecimiento
>100: Recuentos mayores de 100 UFC en cada placa de Petri
TSA: Triptona Soja Agar MK: Mc Conkey Agar SDA: Sabouraud Dextrosa Agar
RBA: Rosa de Bengala Agar
92
Tabla 31. Recuento de las Unidades Formadoras de Colonia por tapón (UFC/tapón) en
muestras de tapones de corcho para vinos tranquilos
Recuentos de UFC/tapón
Muestra TSA MK SDA RBA
1 3 _ ND ND
2 3 _ ND ND
3 6 _ ND ND
4 3 _ ND ND
5 26 _ ND ND
6 8 _ ND ND
- : No hubo crecimiento
ND: No determinado, debido al crecimiento invasivo de Monilia sitophila
TSA: Triptona Soja Agar MK: Mc Conkey Agar SDA: Sabouraud Dextrosa Agar
RBA: Rosa de Bengala Agar
4.2.2. Resultados de la identificación de hongos filamentosos, levaduras y bacterias
Los resultados de la identificación de los hongos filamentosos, levaduras y bacterias

aisladas de las muestras de tapones de corcho para vinos tranquilos y vinos espumosos,
se presentan en las Tablas 32 y 33, respectivamente.
Tabla 32. Especies de hongos filamentosos, levaduras y bacterias aisladas de tapones de

corcho para vinos tranquilos

Monilia sitophila Rhodotorula glutinis Bacillus cereus
Trichoderma viride B. circulans
Aspergillus niger B. lentus
A. fumigatus B. firmus
B. pantothenticus
Nocardia sp
Agrobacterium sp
93
Tabla 33. Especies de hongos filamentosos, levaduras y bacterias aisladas de tapones de
corcho para vino espumoso

Alternaria alternata Rhodotorula glutinis Bacillus cereus
Penicillium citrinum Candida ciferri B. circulans
P. velutinum B. lentus
Aspergillus niger B. firmus
A. Fumigatus Micrococcus sp
Mucor plumbeus M. luteus
Trichoderma viride Agrobacterium sp
Fusarium solani Achromobacter sp
F. moniliforme Aeromonas sp
Monilia sitophila Erwinia herbicola
Acinetobacter lwoffii
Streptomyces sp
94
4.3. RESULTADOS DEL ESTUDIO DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA DE
LOS MICROORGANISMOS AISLADOS
Los resultados de la evaluación de la actividad enzimática de los microorganismos

aislados de los tapones de corcho, se especifican en las tablas 34 y 35. No se indican las
enzimas que no fueron detectadas en ningún caso.
Tabla 34. Actividad enzimática de los hongos filamentosos y levaduras aislados
Microorganismos A B C D E F G H I J K L M N Ñ
Alternaria alternata 3 2 1 0 2 0 0 1 2 1 1 0 3 5 4
Penicillium citrinum 0 1 0 0 1 0 0 1 1 0 0 0 0 1 2
P. velutinum 0 1 1 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 1
Aspergillus niger 1 1 1 0 1 1 1 2 2 0 1 0 0 3 3
A. fumigatus 1 2 1 0 1 0 0 5 5 0 0 0 0 5 4
Trichoderma viride 1 4 5 2 0 0 0 4 3 0 0 0 0 1 1
Mucor plumbeus 1 2 1 0 1 0 0 4 4 0 0 0 0 1 1
Fusarium solani 0 2 1 0 0 0 0 4 4 0 0 0 0 0 0
F. moniliforme 1 3 2 0 1 0 0 5 5 0 0 0 0 1 0
Monilia sitophila 5 2 2 0 4 1 0 5 5 0 1 1 1 5 0
Rhodotorula glutinis 0 2 1 0 5 1 0 2 2 0 0 0 0 0 0
Candida ciferri 1 2 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0
0 = Reacción negativa, 1 = 5 nanomoles, 2 = 10 nanomoles, 3 = 20 nanomoles, 4 = 3 nanomoles,

5 > 40 nanomoles
A: Fosfatasa alcalina, B: Esterasa (C1), C: Esterasa lipasa (C8), D: Lipasa (C14), E: Leucina arilamidasa,
F: Valina arilamidasa, G: Cistina arilamidasa, H: Fosfatasa ácida, I: Naftol-A-S-BI-fosfohidrolasa,
J: α-galactosidasa, K: β-galactosidasa, L: β-glucoronidasa, M: α-glucosidasa, N: β-glucosidasa, Ñ
: N-acetil-β-glucosaminidasa
95
Tabla 35. Actividad enzimática de las bacterias aisladas
Microorganismo A B C D E F G H I J K
Bacillus cereus 0 2 2 1 0 1 0 1 1 0 0
B. circulans 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0
B. lentus 0 2 2 1 0 1 0 1 0 5 0
B. firmus 0 2 1 1 0 1 0 1 0 0 0
B. pantothenticus 1 2 1 5 1 0 0 1 0 1 0
Micrococcus sp 1 2 3 0 0 0 2 1 0 2 0
M. luteus 0 0 0 5 0 0 0 1 0 0 0
Nocardia sp 2 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0
Agrobacterium sp 0 1 1 1 0 0 0 2 0 0 0
Aeromonas sp 2 1 2 1 0 0 5 1 0 0 1
Erwinia herbicola 0 2 3 1 0 0 0 2 0 0 0
Acinetobacter lwoffii 0 2 1 1 0 0 0 1 0 0 0
Streptomyces sp 0 3 2 1 0 1 0 1 0 0 0
Achromobacter sp 1 1 1 1 0 0 0 2 0 0 0
0 = Reacción negativa, 1 = 5 nanomoles, 2 = 10 nanomoles, 3 = 20 nanomoles, 4 = 3 nanomoles,

5> 40 nanomoles
A: Fosfatasa alcalina, B : Esterasa (C 1 ), C: Esterasa lipasa (C 8 ), D : Leucina arilamidasa,

E: Valina arilamidasa, F : α-quimotripsina, G: Fosfatasa ácida, H : Naftol-A-S-BI-fosfohidrolasa,
I: β-galactosidasa, J: α-glucosidasa, K: β-glucosidasa
Los hongos filamentosos que presentaron mayor actividad enzimática, se ilustran en las
Figuras 25 - 28.
96
Figura 25. API ZYM de Alternaria alternata
Figura 26. API ZYM de Trichoderma viride
97
Figura 27. API ZYMde Mucor plumbeus
Figura 28. API ZYM de Monilia sitophila
98
4.4. RESULTADOS DEL ESTUDIO DE LA ACTIVIDAD INHIBITORIA DE
4.4.1. RESULTADOS DEL ESTUDIO DE LA ACTIVIDAD INHIBITORIA DE LOS

HONGOS FILAMENTOSOS Y LEVADURAS AISLADAS
Los resultados obtenidos al medir los halos inhibitorios producidos por los discos de
microorganismos, tanto cuando hacían contacto por el medio de cultivo como por la
zona del desarrollo miceliar, con los microorganismos sembrados por superficie en las
placas de Petri, así como su influencia sobre la esporulación de los hongos filamentosos,
se especifican en la Tablas 36 – 63.
Tabla 36. Actividad inhibitoria de Alternaria alternata contra hongos filamentosos

presentes en las muestras de corcho
Halo inhibitorio
Microorganismo Medio de cultivo (mm) Zona miceliar (mm) Esporulación
Aspergillus niger _ 3,0 NIE
Trichoderma viride 4,0 5,0 NIE
Penicillium citrinum _ 3,0 NIE
Penicillium velutinum 3,0 _ NIE
NIE: No Inhibe la Esporulación
-: No se observó actividad inhibitoria
Tabla 37. Actividad inhibitoria de Alternaria alternata contra bacterias
99
Halo inhibitorio
Microorganismo Medio de cultivo (mm) Zona miceliar (mm)
Nocardia sp 4,5 4,5
Erwinia herbicola 5,0 4,0
Agrobacterium sp 2,5 2,5
Bacillus firmus 6,0 6,0
Bacillus cereus 9,5 8,5
Bacillus lentus 8,0 6,0
Bacillus pantothenticus 4,5 5,0
Achromobacter sp 4,0 4,0
Acinetobacter lwoffii 1,5 2,5
Micrococcus luteus 6,0 7,0
Alternaria alternata no presentó actividad inhibitoria contra hongos filamentosos no

presentes en las muestras de corcho.
Tabla 38. Actividad inhibitoria de Penicillium citrinum contra hongos filamentosos y

levaduras presentes en las muestras de corcho
Halo inhibitorio
Aspergillus niger 4,0 _ NIE
Aspergillus fumigatus 7,0 4,0 NIE
Mucor plumbeus 6,0 4,5 NIE
Penicillium velutinum 3,0 3,5 IPE
Fusarium solani 3,0 3,0 NIE
F. moniliforme 3,5 4,0 NIE
Monilia sitophila 4,0 7,0 NIE
Rhodotorula glutinis _ 3,0 _
NIE: No Inhibe la Esporulación IPE: Inhibe Parcialmente la Esporulación -: No se observó actividad
inhibitoria
100
Tabla 39. Actividad inhibitoria de Penicillium citrinum contra hongos filamentosos no
Halo inhibitorio
Aspergillus flavus 6,0 4,0 NIE
Penicillium frequentans 5,0 3,0 NIE
Acremonium strictum 4,5 5,0 IPE
NIE: No Inhibe la Esporulación IPE: Inhibe Parcialmente la Esporulación
Tabla 40. Actividad inhibitoria de Penicillium citrinum contra bacterias
Halo inhibitorio
Nocardia sp 1,5 _
Achromobacter sp 2,5 _
Micrococcus sp 7,0 5,0
- : No se observó actividad inhibitoria
101
Tabla 41. Actividad inhibitoria de Aspergillus niger contra hongos filamentosos
Halo inhibitorio
Aspergillus fumigatus 4,0 _ NIE
Alternaria alternata 6,5 4,0 IPE
Fusarium moniliforme 5,5 _ NIE
Penicillium velutinum 3,0 3,5 IPE
Tabla 42. Actividad inhibitoria de Aspergillus niger contra hongos filamentosos no

Halo inhibitorio
Acremonium strictum 7,0 5,0 IPE
Aspergillus niger no presentó actividad inhibitoria contra hongos filamentosos no

102
Tabla 43. Actividad inhibitoria de Aspergillus niger contra bacterias
Halo inhibitorio
Nocardia sp 1,5 _
Agrobacterium sp 2,5 _
Acinetobacter lwoffii _ 3,5
Aeromonas sp 2,5 3,0
Tabla 44. Actividad inhibitoria de Trichoderma viride contra hongos filamentosos

Halo inhibitorio
Aspergillus niger _ 9,5 IPE
Penicillium citrinum 9,5 13,0 NIE
Penicillium velutinum _ 5,5 IPE
Fusarium moniliforme _ 5,0 NIE
Fusarium solani 8,0 8,0 NIE
Monilia sitophila _ 12,0 NIE
103
Tabla 45. Actividad inhibitoria de Trichoderma viride contra hongos filamentosos no
Halo inhibitorio
Acremonium strictum 7,0 14,5 NIE
Rhizopus arrhizus _ 14,0 IPE
Tabla 46. Actividad inhibitoria de Trichoderma viride contra bacterias
Halo inhibitorio
Erwinia herbicola _ 3,0
104
Tabla 47. Actividad de Mucor plumbeus contra hongos filamentosos y levaduras
Halo inhibitorio
Aspergillus niger _ _ IPE
Penicillium velutinum 6,5 6,5 ITE
Fusarium moniliforme 4,0 4,0 NIE
Rhodotorula glutinis 5,0 6,0 _
ITE: Inhibe Totalmente la Esporulación
Tabla 48. Actividad inhibitoria de Mucor plumbeus contra hongos filamentosos no

Halo inhibitorio
105
Tabla 49. Actividad inhibitoria de Mucor plumbeus contra bacterias
Halo inhibitorio
Nocardia sp _ 1,0
Streptomyces sp 6,0 6,5
Tabla 50. Actividad inhibitoria de Aspergillus fumigatus contra hongos filamentosos y

Halo inhibitorio
Rhodotorula glutinis 5,5 _ _
106
Tabla 51. Actividad inhibitoria de Aspergillus fumigatus contra hongos filamentosos no
Halo inhibitorio
Rhizopus arrhizus _ 5,0 NIE
Tabla 52. Actividad inhibitoria de Aspergillus fumigatus contra bacterias
Halo inhibitorio
Nocardia sp 3,5 1,5
107
Tabla 53. Actividad inhibitoria de Fusarium moniliforme contra hongos filamentosos y
Halo inhibitorio
Aspergillus niger _ 6,5 IPE
Penicillium velutinum 3,0 _ ITE
Rhodotorula glutinis 5,0 5,0 _
Tabla 54. Actividad inhibitoria de Fusarium moniliforme contra hongos filamentosos no

Halo inhibitorio
Aspergillus flavus 4,0 _ NIE
Rhizopus arrhizus 4,5 4,0 NIE
Acremonium strictum _ 3,0 NIE
108
Tabla 55. Actividad inhibitoria de Fusarium moniliforme contra bacterias
Halo inhibitorio
Nocardia sp 2,0 1,5
Tabla 56. Actividad inhibitoria de Fusarium solani contra hongos filamentosos

Halo inhibitorio
Aspergillus niger 2,5 2,5 NIE
NIE: No Inhibe la Esporulación IPE: Inhibe Parcialmente la esporulación
109
Tabla 57. Actividad inhibitoria de Fusarium solani contra hongos filamentosos no
Halo inhibitorio
Rhizopus arrhizus 4,0 3,5 NIE
Tabla 58. Actividad inhibitoria de Fusarium solani contra bacterias
Halo inhibitorio
Nocardia sp 1,5 _
110
Tabla 59. Actividad inhibitoria de Penicillium velutinum contra hongos filamentosos
Halo inhibitorio
Penicillium velutinum no presentó actividad inhibitoria contra hongos filamentosos no

Tabla 60. Actividad inhibitoria de Penicillium velutinum contra bacterias
Halo inhibitorio
Nocardia sp 1,5 _
Bacillus firmus 5,0 _
Bacillus lentus 6,5 _
Achromobacter sp 4,5 -
Acinetobacter lwoffii 2,5 _
Aeromonas sp 2,0 _
111
Tabla 61. Actividad inhibitoria de Rhodotorula glutinis contra hongos filamentosos
presentes y no presentes en las muestras de corcho
Halo inhibitorio
Presentes en corcho
Fusarium moniliforme 2,5 _ NIE
Penicillium velutinum _ _ IPE
No presentes en corcho
Tabla 62. Actividad inhibitoria de Rhodotorula glutinis contra bacterias
Halo inhibitorio
Microorganismo Medio de cultivo (mm) Crecimiento microbiano (mm)
Nocardia sp 1,5 1,5
112
Tabla 63. Actividad inhibitoria de Monilia sitophila contra hongos filamentos presentes
en las muestras de corcho
Halo inhibitorio
Se debe destacar que Monilia sitophila, no presentó actividad inhibitoria contra hongos
filamentosos no presentes en las muestras de corcho ni contra las bacterias aisladas de
estos. Así mismo, Candida ciferri, no presentó actividad inhibitoria contra ningún
microorganismo.
113
4.4.2. RESULTADOS DEL ESTUDIO DE LA ACTIVIDAD INHIBITORIA DE LAS
BACTERIAS AISLADAS
La actividad inhibitoria de las bacterias contra otros microorganismos aislados de las

muestras de corcho, fue analizada de la forma descrita en el punto 4.4.1, y se expresan
los resultados en las tablas 64- 75.
Tabla 64. Actividad inhibitoria de Nocardia sp contra bacterias
Halo inhibitorio
Microorganismo Medio de cultivo (mm) Crecimiento bacteriano (mm)
Tabla 65. Actividad inhibitoria de Nocardia sp contra hongos filamentosos
Halo inhibitorio
Microorganismo Medio de cultivo Crecimiento Esporulación
(mm) bacteriano (mm)
Penicillium citrinum _ _ IPE
Fusarium solani 2,0 4,0 IPE
114
Tabla 66. Actividad inhibitoria de Agrobacterium sp contra bacterias
Halo inhibitorio
Tabla 67. Actividad inhibitoria de Agrobacterium sp contra hongos filamentosos y

levaduras
Halo inhibitorio
Penicillium citrinum _ 4,0 NIE
Mucor plumbeus 5,5 3,0 IPE
115
Tabla 68. Actividad inhibitoria de Acinetobacter lwoffii contra bacterias
Halo inhibitorio
Micrococcus sp _ 5,5
Tabla 69. Actividad inhibitoria de Acinetobacter lwoffii contra hongos filamentosos
Halo inhibitorio
Trichoderma viride _ _ IPE
116
Tabla 70. Actividad inhibitoria de Achromobacter sp contra hongos filamentosos
Halo inhibitorio
Aspergillus niger 4,0 4,0 NIE
Penicillium citrinum _ _ IPE
Achromobacter sp, sólo presentó actividad inhibitoria contra Bacillus pantothenticus,

observándose un halo inhibitorio de 5,0 mm cuando estaba en contacto por el medio de
cultivo y de 4,0 mm cuando estaba en contacto por la zona de crecimiento bacteriano.
Tabla 71. Actividad inhibitoria de Bacillus lentus contra bacterias
Halo inhibitorio
Bacillus lentus no presentó actividad inhibitoria contra hongos filamentosos y

levaduras.
117
Tabla 72. Actividad inhibitoria de Aeromonas sp contra hongos filamentosos
Halo inhibitorio
Aspergillus niger 4,5 2,0 IPE
Trichoderma viride 3,0 2,5 IPE
IPE: Inhibe Parcialmente la Esporulación
Aeromonas sp, no presentó actividad inhibitoria contra bacterias.
Tabla 73. Actividad inhibitoria de Streptomyces sp contra hongos filamentosos
Halo inhibitorio
Trichoderma viride _ _ IPE
Streptomyces sp, no presentó actividad inhibitoria contra bacterias.
118
Tabla 74. Actividad inhibitoria de bacterias contra hongos filamentosos
Halo inhibitorio
Bacterias contra Hongos Medio de Crecimiento Esporulación
cultivo (mm) bacteriano (mm)
Micrococcus sp vs Aspergillus niger _ _ IPE
Erwinia herbicola vs Monilia sitophila _ 2,0 NIE
Bacillus pantothenticus vs Monilia sitophila _ 2,0 NIE
IPE: Inhibe Parcialmente la Esporulación
Tabla 75. Actividad inhibitoria de bacterias contra bacterias
Halo inhibitorio
Bacterias contra bacterias Medio de cultivo Crecimiento
Micrococcus sp vs Achromobacter sp 3,0 3,0
Erwinia herbicola vs Bacillus lentus _ 3,5
Bacillus circulans vs Nocardia sp 5,0 _
Bacillus cereus, Bacillus firmus y Micrococcus luteus no presentaron actividad

inhibitoria contra hongos filamentosos, levaduras ni bacterias.
En la Figuras 29 y 30 se ilustran algunas actividades inhibitorias de los

microorganismos aislados de los tapones de corcho.
119
Figura 29. Actividad inhibitoria de los microorganismos aislados
a ) Actividad inhibitoria de Aspergillus niger y Trichoderma viride contra
Aspergillus fumigatus (1), Mucor plumbeus (2), Penicillium citrinum (3),
Fusarium solani (4) y Fusarium moniliforme (5)
b) Actividad inhibitoria de Alternaria alternata y Penicillium citrinum contra
Micrococcus luteus (2), Bacillus firmus (V1) y Nocardia sp (V7)
120
Figura 30. Actividad inhibitoria de los microorganismos asilados
a) Agrobacterium sp (3) y Achromobacter sp (5) contra Penicillium citrinum (202)
b) Streptomyces sp (L5) y Acinetobacter lwoffii (4) contra Penicillium citrinum (202)
c) Nocardia sp (V7) y Bacillus circulans (8) contra Penicillium citrinum (202)
d) Nocardia sp (V7) contra Micrococcus luteus (2), Bacillus firmus (V1) y Bacillus
cereus (1)
121
4.5. RESULTADOS DE LAS CROMATOGRAFÍAS EN CAPA FINA
Se obtuvieron huellas cromatográficas de los discos de los hongos filamentosos y

levaduras aisladas, cuando se utilizó la mezcla Benceno/Metanol/Acido acético en
proporción 98:8:4.
Cabe destacar, que Candida ciferri, no presentó huellas cromatográficas con ninguno de
los solventes utilizados.
En las Figuras 31 y 32 se detallan los resultados de las cromatografías realizadas a los

hongos filamentosos y levaduras.
Frente del solvente
C 201 202 203 204 205
Figura 31. Cromatografía en capa fina de hongos filamentosos y levaduras aislados

de los tapones de corcho
C: Control (Agar extracto de malta al 2 %) 201: Alternaria alternata 202: Penicillium citrinum
203: Aspergillus niger 204: Trichoderma viride 205: Mucor plumbeus
122
Frente del solvente
C 206 207(B) 207(A) 209 L1
Figura 32. Cromatografía en capa fina de los hongos filamentosos y levaduras

aislados de los tapones de corcho
C: Control (Agar extracto de malta al 2 %) 206: Aspergillus fumigatus 207(B): Fusarium solani
207 (A): Fusarium moniliforme 209: Penicillium velutinum L1: Rhodotorula glutinis
123
En la tabla 76, se especifican los Rf obtenidos de las huellas cromatográficas de los
hongos filamentosos aislados de los tapones de corcho.
Tabla 76. Rf de huellas cromatográficas de los hongos filamentosos aislados
Microorganismo Rf
Alternaria alternata 0.07
0,10
0,15
0,20
0,24
0,50
0,54
Penicillium citrinum 0,11
Penicillium velutinum 0,16
Trichoderma viride 0,10
Fusarium moniliforme 0,12
124
4.6. RESULTADOS DE LA ACTIVIDAD INHIBITORIA DE LAS FRACCIONES DE
LOS HONGOS FILAMENTOSOS OBTENIDAS POR CROMATOGRAFÍA EN CAPA
FINA
Los resultados obtenidos de la actividad inhibitoria de las fracciones de los hongos

filamentosos obtenidas por cromatografía en capa fina se detallan en la Tabla 77.
Tabla 77. Actividad inhibitoria de las fracciones de los hongos filamentosos
Hongos filamentosos contra microorganismos Halo inhibitorio (mm)

Penicillium citrinum vs Micrococcus luteus 1,5
Fusarium moniliforme 1,0
Aspergillus niger vs Bacillus lentus 1,0

Nocardia sp 1,5
Trichoderma viride vs Bacillus firmus 1,5
Penicillium velutinum vs Achromobacter sp 6,5

Bacillus lentus 5,0
Fusarium moniliforme vs Erwinia herbicola 0,5

Agrobacterium sp 0,5
125
4.7. RESULTADOS DEL ESTUDIO DEL ESTUDIO DEL METABOLISMO
SECUNDARIO DE LOS MICROORGANISMOS AISLADOS
4.7.1. Resultados de la producción de micotoxinas
4.7.1.1. Resultados de la producción de micotoxinas de Alternaria alternata
En las Figuras 33 y 34 se muestran los resultados obtenidos del estudio de la producción

de micotoxinas por Alternaria alternata a través de cromatografía en capa fina.
Frente del solvente
201 TA 201 ATX-I 201 ALT 201 AOH 201
Figura 33. Cromatografía en capa fina de micotoxinas producidas por

Alternaria alternata.
201: Alternaria alternata TA: Acido tenuazoico ATX-I: Altertoxina I ALT: Altenueno
AOH: Alternariol
126
Frente del solvente
201 AME 201 TEN 201
Figura 34: Cromatografía en capa fina de micotoxinas producidas por

Alternaria alternata
201: Alternaria alternata AME: Alternariol monometil éter TEN: Tentoxina
127
Tabla 78. Actividad inhibitoria de las fracciones de Alternaria alternata
Fracción Microorganismo Halo inhibitorio (mm)

201 A vs Penicillium velutinum 0,5
Acinetobacter lwoffii 1,0
201 B vs Penicillium velutinum 2,5
Micrococcus sp 0,5
Bacillus pantothenticus 1,0
201 C vs Bacillus lentus 2,0
Nocardia sp 0,5
AOH vs Penicillium velutinum 1,0
Bacillus lentus 0,5
Bacillus cereus 1,0
Micrococcus luteus 3,5
Micrococcus sp 1,0
AME vs Aspergillus niger 1,5
Penicillium velutinum 1,5
Micrococcus sp 1,5
ALT vs Penicillium velutinum 0,5
Agrobacterium sp 1,5
Micrococcus luteus 0,5
Micrococcus sp 1,5
ALT-I vs Penicillium velutinum 0,5
Nocardia sp 1,0
Micrococcus sp 1,0
AOH: Alternariol AME: Alternariol monometil éter ALT: Altenueno ATX-I: Altertoxina I
128
4.7.1.2. Resultados de la producción de micotoxinas de Penicillium citrinum
Fusarium moniliforme y Fusarium solani
Los resultados de las cromatografías en capa fina, a través de las cuales se estudió la
producción de citrinina por Penicillium citrinum y la producción de Fumonisina B1 por
Fusarium moniliforme y Fusarium solani, se muestran en la Figura 35.
Frente del solvente
CM F 207(A) 207(B) CC 202
Figura 35. Cromatografía en capa fina de micotoxinas producidas por

Penicillium citrinum, Fusarium moniliforme y Fusarium solani
CM: Control (Agar extracto de malta al 2%) F: Control Fumonisina B 1
207A: Fusarium moniliforme 207B: Fusarium solani CC: Control Citrinina
202: Penicillium citrinum
129
130
5. DISCUSIÓN
La discusión de los resultados se ha dividido en tres partes: La primera parte

corresponde a la discusión de los resultados de la evaluación de las metodologías para el
control microbiológico de los tapones de corcho, la segunda parte corresponde a la
discusión de los resultados del recuento e identificación de los microorganismos
aislados de las muestras y la tercera parte se refiere a la discusión de los resultados de
la actividad metabólica de los microorganismos aislados.
5.1. DISCUSIÓN DE LOS RESULTADOS DE LA EVALUACIÓN DE LAS

METODOLOGÍAS PARA EL CONTROL MICROBIOLÓGICO DE LOS
TAPONES DE CORCHO
5.1.1. DISCUSIÓN DE LOS RESULTADOS DE LA PREPARACIÓN DE LOS

TAPONES CONTROL
Todos los microorganismos utilizados para la inoculación de los tapones de corcho

control forman parte de la microbiota de este producto y tienen gran importancia en la
calidad de los mismos y de los vinos en contacto con ellos (Calvo y Agut 1996, Danesh
et al 1997).
5.1.1.1. Discusión de los resultados de la inoculación de los tapones control por

aerosol
Los resultados al aplicar el método de inoculación por aerosol, demuestran que no es el

método apropiado para la preparación de tapones control, ya que los recuentos de las
Unidades Formadoras de Colonia/tapón (UFC/tapón) en todas las mezclas aplicadas
resultaron inferiores a 10.
131
5.1.1.2. Discusión de los resultados de la inoculación de tapones control por
inmersión
Cuando se aplicó el método de inoculación de los tapones de corcho por inmersión, se

observó que el mayor recuento de microorganismos (4 x 106 UFC/tapón) y como
consecuencia el mayor porcentaje de recuperación de éstos en los tapones de corcho
(35,8 %) se obtiene cuando los tapones de corcho están en contacto con el inóculo
formado por la mezcla de Aspergillus y de Penicillium a una concentración de
107 UFC/ml durante 6 horas. Este mayor porcentaje de recuperación en los tapones
coincidió con el bajo porcentaje de recuperación de microorganismos en el líquido
decantado, lo que puede ser debido a que en este período de tiempo una mayor cantidad
de microorganismos quede adherido al substrato.
Resultados semejantes se obtuvieron cuando el inóculo estaba formado por todas las
especies de hongos filamentosos, levaduras y bacterias estudiadas, en el mismo período
de tiempo y a la misma concentración. Se recuperaron en los tapones de corcho
7 x 106 UFC/tapón (44,9 %) y 1,2 x 106 UFC/ml (7,5 %) en el líquido decantado. Cabe
destacar que de este 44,9 % de microorganismos recuperados en los tapones, el 41,7 %
corresponde a hongos filamentosos.
Estos resultados indican que el tiempo óptimo en que los tapones de corcho deben estar
en contacto con el inóculo es de 6 horas, ya que se observa en ambos casos la relación
de los bajos porcentajes de recuperación de los microorganismos en el líquido
decantado con el porcentaje de recuperación más elevado de éstos, en los tapones de
corcho contaminados durante este período de tiempo, observándose diferencias
significativas de los recuentos de microorganismos cuando los tapones están en contacto
durante 6 horas con el inóculo y los recuentos obtenidos cuando se aplican otros
tiempos de inoculación (3, 9 y 24 horas).
Es de hacer notar que cuando los tapones de corcho estuvieron en contacto con el
inóculo durante 24 horas, el crecimiento de los microorganismos fue prácticamente nulo
con todos los inóculos ensayados. Una posible explicación de este hecho, sería las
propias características del substrato, ya que los microorganismos pueden haber
penetrado en las lenticelas y quedar atrapados dentro de ellas, tal como lo han
132
demostrado Calvo et al en 1993, Calvo et al en 1995 y Rocha et al en 1996 y por tanto
no se recuperan por el método de siembra aplicado.
En la recuperación individual de los microorganismos aplicados por inmersión en un

lapso de 6 horas, se observa que el mayor porcentaje de recuperación se obtuvo para
Trichoderma viride (14,4 %) y el menor porcentaje entre las cepas recuperadas
correspondió a Bacillus cereus (0,7 %). No se recuperaron Aspergillus fumigatus ni
Paecilomyces variotii.
El poder antagónico sobre otros hongos de Trichoderma viride, ha sido ampliamente

estudiado (Barron 1972). Este poder antagónico está determinado por las propiedades
antibióticas frente a otros hongos filamentosos y a bacterias Gram-positivas y Gram-
negativas que posee T. viride; y así mismo, por su habilidad saprofítica competitiva con
otros microorganismos (Domsch et al 1980). Estas características parecen favorecer su
crecimiento en detrimento del de otros microorganismos que componían la mezcla para
inocular los tapones de corcho.
La competitividad entre los microorganismos y la producción de sustancias inhibidoras

por algunos de ellos es común en cultivos mixtos (Mossel et al 1995), esto puede ser la
causa de que no fuera recuperado P. variotii y A. fumigatus en los tapones de corcho
después de la inoculación. Así también, cabe destacar, que al comparar el diámetro de
los conidios de los hongos filamentosos utilizados en los inóculos y que son descritos
por Samson et al en 1984, se pudo observar que los conidios de A. fumigatus tienen un
diámetro menor al de los conidios de los demás hongos filamentosos y que la superficie
lisa de los conidios de P. variotii, podría dificultar la adhesión al substrato de estos
microorganismos.
Aspergillus niger fue el microorganismo que se recuperó en mayor proporción cuando

se aplicaron mezclas de Aspergillus y de Penicillium en concentraciones de
109 y de 105 UFC/ml (4,5 x 10 8 y 13 x 103 UFC/tapón respectivamente),
correspondiendo estas cifras con los porcentajes de recuperación más elevados en
comparación a los otros hongos filamentos. Se observaron diferencias significativas
entre el recuento de A. niger con los otros microorganismos inoculados.
133
Este hongo filamentoso posee ligeras propiedades antagónicas a otros hongos (Domsch
et al 1980), lo que podría explicar su alto porcentaje de recuperación cuando se aplicó
una mezcla de Aspergillus y de Penicillium en concentraciones de
109 y de 105 UFC/ml.
Cuando se inocularon los tapones de corcho con una suspensión de 109 UFC/ml de
todas las especies de hongos filamentosos e igual concentración de levaduras y de
bacterias, se observó que el mayor recuento de UFC/tapón se obtuvo con los hongos
filamentosos (9,5 x 108 UFC/tapón) a diferencia de las levaduras y bacterias de las que
se obtuvo un recuento de 1 x 108 UFC/tapón en ambos casos. Existen diferencias
significativas entre el recuento de hongos filamentosos y el recuento de levaduras y
bacterias a esta concentración.
Se obtuvieron similares resultados cuando se inocularon los tapones de corcho con la

misma mezcla de microorganismos, pero a una concentración de 105 UFC/ml. El mayor
recuento de UFC/tapón corresponde a los hongos filamentosos (18 x 103 UFC/tapón).
Dado que los recuentos para las bacterias fue de 5 x 103 UFC/tapón y los recuentos para
las levaduras fue de 3,5 x 103 UFC/tapón, no existen diferencias significativas entre los
recuentos de estos microorganismos.
En consecuencia, puede resumirse que el mayor porcentaje de recuperación, lo obtienen

los hongos filamentosos cuando se aplicaron las suspensiones de todos los
microorganismos a concentraciones de 109 y de 105 UFC/ml (39,6 % y 8,9 %
respectivamente) y el menor porcentaje de recuperación (1,8 %) lo obtuvieron las
levaduras, cuando se aplicó el inóculo a una concentración de 105 UFC/ml.
La sensibilidad de las levaduras a sustancias antibióticas y productos metabólicos de

hongos filamentosos, sumado al invasivo crecimiento de estos últimos influye en la
competitividad de las levaduras cuando se encuentran en poblaciones microbianas
complejas, como es el caso de la microbiota del corcho (Danesh et al 1997), estas
circunstancias podrían ser la causa de la baja recuperación de Rhodotorula glutinis
cuando se aplicaron suspensiones de células de todos los microorganismos a diferentes
concentraciones.
134
Se debe destacar que se obtienen mejores porcentajes de recuperación cuando se aplican
a los tapones, inóculos a concentraciones elevadas, tanto en la mezcla de Aspergillus y
de Penicillium como en la mezcla de todos los microorganismos, por tanto puede
indicarse que existe una relación directa entre la concentración del inóculo y el
porcentaje de recuperación obtenido.
5.1.2. DISCUSIÓN DE LOS RESULTADOS DE LA EVALUACIÓN DEL MÉTODO DE

REFERENCIA
5.1.2.1. Prueba de las soluciones de lavado
Los recuentos de las UFC/tapón de los microorganismos cuando se utilizaron solución

fisiológica y solución Ringer _ como soluciones de lavado, tanto en Plate Count Agar
(PCA) como Sabouraud Dextrosa Agar (SDA), no presentaron diferencias
significativas. Esto quiere decir que ambas soluciones de lavado pueden ser utilizadas
indistintamente en la aplicación de la metodología de análisis microbiológico de este
producto.
El mayor porcentaje de recuperación se obtuvo para Aspergillus niger tanto en PCA

como en SDA con antibiótico, cuando se utilizó solución fisiológica o solución Ringer _
como soluciones de lavado. Así mismo, los menores porcentajes de recuperación fueron
para Acremonium strictum, Paecilomyces variotii y Aspergillus fumigatus, en ambos
medios de cultivo y con las dos soluciones de lavado. Bacillus cereus no fue recuperado
en SDA, en ningún caso, ya que este medio de cultivo adicionado de antibiótico es
selectivo para el aislamiento y diferenciación de hongos y además, debido a su bajo pH
y alta concentración de glucosa dificulta el crecimiento de las bacterias (Sancho et al
1989).
5.1.2.2. Prueba de la velocidad de lavado
No se observaron diferencias significativas en el recuento de los microorganismos

inoculados previamente a los tapones de corcho, cuando se utilizaron velocidades de
135
lavado de 150 o de 200 r.p.m., en ambos medios de cultivo (PCA y SDA). Se puede
observar que el recuento de las UFC/tapón es significativamente inferior cuando se
utiliza una velocidad de lavado de 100 r.p.m., tanto a partir de cultivos en PCA como en
SDA. Esto indica que velocidades de lavado superiores a 100 r.p.m. pueden favorecer el
desprendimiento de los microorganismos del substrato.
De igual forma que con las soluciones de lavado, A. niger, es el microorganismo que
obtiene el mayor porcentaje de recuperación en todas las velocidades de lavado
aplicadas. Los microorganismos con menor porcentaje de recuperación en PCA son
Acremonium strictum y Rhodotorula glutinis con las tres velocidades de lavado, en
SDA, Acremonium strictum tiene el menor porcentaje de recuperación y Bacillus cereus
no se recupera.
5.1.2.3. Prueba del tiempo de lavado
Se puede observar que se obtienen mayores recuentos de microorganismos a partir de

los 30 minutos de lavado y no se observan diferencias significativas en los recuentos de
las UFC/tapón a partir de este tiempo. Aplicando el tiempo de lavado propuesto en este
estudio se acortaría el tiempo de aplicación establecido por la Norma Catalana 0.20/95.
Los resultados obtenidos de la determinación de los porcentajes de recuperación de cada

uno de los microorganismos inoculados son comparables a los ya señalados para las
pruebas de las soluciones y velocidad de lavado.
5.1.2.3. Prueba de los medios de cultivo
Los recuentos de las UFC/tapón, tras la siembra de los filtros en los diferentes medios
de cultivo, se mantienen uniformes y no se observan diferencias significativas entre
ellos.
Cabe destacar que cuando se utilizó Triptona de Soja Agar (TSA) como medio de
cultivo, la totalidad del recuento a las 24 horas de incubación correspondió sólo a
bacterias. La composición de este medio a base de peptona de soja y peptona de caseína
136
aunada a un pH ligeramente alcalino, proporciona condiciones favorables para el
crecimiento y aislamiento de bacterias.
El recuento de las UFC/tapón en los diferentes medios de cultivo probados para el

aislamiento de hongos filamentosos y levaduras: Sabouraud Dextrosa Agar (SDA), WL
Nutritivo Agar (WLN), Extracto de malta Agar al 2 % (AEM) y Rosa de Bengala Agar
(RBA), indican que todos son apropiados para tal fin. Sin embargo, se puede observar
recuentos ligeramente más elevados en SDA y no se debe restar importancia al medio
RBA, ya que es un medio de cultivo específico para la determinación de hongos
filamentosos y levaduras en muestras de alimentos, que además inhibe el crecimiento
expansivo de Zygomycetes (Sancho et al 1989).
5.1.2.5. Prueba del tiempo de incubación
Se pudo observar que el tiempo óptimo de incubación es de 24- 48 horas para bacterias
y hongos, a partir de este tiempo algunos hongos filamentosos de crecimiento expansivo
no permiten la observación y el recuento de otros microorganismos.
El mayor porcentaje de recuperación en TSA a las 24 horas de incubación es para

Bacillus cereus y en SDA, sigue siendo para Aspergillus niger.
5.1.2.6. Prueba de la temperatura de incubación
No se observaron diferencias significativas en el recuento de las bacterias y en el

recuento de los hongos filamentosos y levaduras cuando se incubaron a diferentes
temperaturas, por lo que se puede utilizar 37 ºC + 2 ºC y 28 ºC + 2 ºC, como
temperaturas de incubación en TSA para bacterias y en SDA para hongos,
respectivamente.
Los mayores porcentajes de recuperación en SDA, al igual que a lo largo de todos los
ensayos, se obtiene para A. niger. Las posibles causas de este hecho, pueden radicar en
las características de los conidios de este hongo filamentoso, lo que le facilita su
137
adhesión al substrato y a las propiedades antagónicas a otros microorganismos, que ya
fueron comentadas.
5.1.2.7. Resumen de los resultados de la evaluación del método de referencia
Después de analizar los resultados obtenidos en la evaluación del método de referencias

(Norma Catalana 0.20/95), se puede indicar, a modo de resumen, que la metodología
propuesta en el presente estudio, para el análisis microbiológico de tapones de corcho
para vinos, es la siguiente: Se pueden utilizar solución fisiológica estéril o solución
Ringer _ estéril como solución de lavado, lavar los tapones por 30 minutos a 150 o 200
r.p.m., los filtros se deben sembrar sobre TSA a 37 ºC + 2 ºC por 24 horas para la
recuperación y recuento de bacterias y sobre SDA a 28 ºC + 2 ºC por 48 horas para la
recuperación y recuento de hongos filamentosos y levaduras.
5.1.3. DISCUSIÓN DE LOS RESULTADOS DE LA COMPARACIÓN DE

METODOLOGÍAS
5.1.3.1. Comparación de la metodología establecida por la Norma 0.20/95 y la

Al comparar los resultados obtenidos al aplicar la metodología establecida por la Norma

0.20/95 y la metodología propuesta en este estudio, se observa que se obtienen mayores
porcentajes de recuperación de las bacterias cuando se aplica la metodología propuesta.
Sin embargo, se observa que los porcentajes de recuperación de hongos filamentosos y
levaduras son semejantes en las dos metodologías.
Básicamente la diferencia entre ambos métodos es la utilización de diferentes medios de

cultivo para la recuperación de las bacterias. A pesar de que los dos medios de cultivo
utilizados, Plate Count agar (PCA) en la Norma 0.20/95 y Triptona de soja agar (TSA)
en la metodología propuesta, son medios de cultivos básicos para la recuperación y
recuento de bacterias, el menor porcentaje de recuperación de estos microorganismos en
PCA se puede deber a que la concentración peptona y dextrosa de este medio de cultivo
138
puede favorecer el crecimiento de hongos filamentosos y levaduras en detrimento del
crecimiento de las bacterias.
5.1.3.2. Comparación de la metodología propuesta por la Norma ISO 10718:1993 y

la metodología propuesta en este estudio
El crecimiento invasivo de todos los microorganismos, en especial de los hongos

filamentosos, impidió el recuento de éstos sobre las placas de medios de cultivo, cuando
se aplicó la metodología establecida por la Norma ISO 10718:1993 para el análisis
microbiológico de los tapones de corcho para vinos.
Estos resultados se pueden deber al hecho de que la mencionada Norma utiliza extracto
de malta añadido de ácido tártarico y etanol como solución de lavado (con el propósito
de investigar la presencia de microorganismos capaces de crecer en medio alcohólico y
ácido como son los vinos) y un tiempo de lavado de 24 horas. El extracto de malta es un
medio líquido de enriquecimiento para hongos que unido al largo tiempo de lavado,
facilita el desarrollo de los hongos y en consecuencia, aumenta considerablemente el
número de microorganismos existentes en las muestras, obteniéndose de esta forma
resultados irreales.
Así mismo, se debe tener en cuenta la importancia que tiene la presencia de otros
microorganismos que no son capaces de desarrollarse en los vinos, por su poca
capacidad de supervivencia en medios alcohólicos, pero sí en los tapones y cuyos
productos metabólicos pueden contaminar los vinos en contacto con ellos y que
aplicando la metodología propuesta por la Norma no pueden ser detectados.
El recuento y la diversidad de especies de hongos filamentosos encontrados en vinos y

sus respectivos tapones de corcho indican una mayor frecuencia en los tapones de
corcho que en los vinos y la deteccción de compuestos organoclorados en los últimos se
encuentra relacionado con el grado de colonización del tapón por los hongos
filamentosos (Navascués 1998).
139
5.1.3.3. Comparación del método de las diluciones decimales seriadas y la
Cuando se comparan ambas metodologías, se puede observar que se obtienen

porcentajes de recuperación aceptables en el método de las diluciones decimales
seriadas con inóculos a concentraciones elevadas de microorganismos
(109 y 107 células/ml), no así, en la metodología propuesta, ya que el crecimiento
invasivo de los hongos filamentosos sobre los filtros impide el recuento de las
UFC/tapón a estas concentraciones.
En cambio, se observa que es posible realizar los recuentos de microorganismos con la

metodología propuesta, cuando los inóculos tienen una baja concentración de
microorganismos (102 células/ml de inóculo), en comparación con la nula recuperación
de microorganismos (0 %) por el método de las diluciones decimales seriadas.
Estos resultados corresponden con los principios de cada uno de los métodos, ya que
uno diluye la carga microbiana presente en las muestras y el otro concentra a través del
filtrado sobre membranas los microorganismos presentes, por lo que se recomienda la
utilización del método de las diluciones decimales seriadas para muestras muy
concentradas y el uso de la metodología propuesta en este estudio para muestras poco
contaminadas, que debe ser lo adecuado en tapones de corcho para uso enológico.
5.1.3.4. Comparación del método Miliflex-100 y la metodología propuesta en este

estudio
Los porcentajes de recuperación de los microorganismos inoculados a los tapones de

corcho, son semejantes cuando se aplican ambas metodologías, esto se debe a que
también son semejantes en los parámetros que utilizan para el análisis microbiológico,
diferenciándose sólo en la composición de los medios de cultivo utilizados, lo cual no
afecta los resultados obtenidos, por lo que los dos métodos pueden ser utilizados para el
análisis microbiológico de tapones de corcho para vinos.
140
5.1.3.5. La metodología propuesta aplicada a diferentes tipos de tapones de corcho
Como se ha explicado anteriormente, los tapones de corcho para vinos tranquilos

provienen de un proceso de fabricación diferente a los tapones de corcho para vinos
espumosos, por lo que se ha creído apropiado aplicar la metodología propuesta a los dos
tipos de tapones a fin de establecer la aplicabilidad de esta metodología a los dos tipos
de muestras.
No se observan diferencias significativas entre los porcentajes de recuperación de los

microorganismos cuando se aplica la metodología propuesta a los tipos de tapones de
corcho.
5.2. DISCUSIÓN DE LOS RESULTADOS DEL RECUENTO E

IDENTIFICACIÓN DE LOS MICROORGANISMOS EN MUESTRAS DE
CORCHO PARA VINOS TRANQUILOS Y VINOS ESPUMOSOS
5.2.1. RECUENTO DE HONGOS FILAMENTOSOS, LEVADURAS Y BACTERIAS EN

LAS MUESTRAS DE TAPONES DE CORCHO
Los recuentos de las UFC/tapón de las bacterias en las muestras de tapones para vinos
espumosos oscilaron entre 4 y 24 UFC/tapón, valores que se ajustan a los límites
aceptables por la Norma Catalana 0.10/95 para este producto (< 30 UFC/tapón). Cabe
resaltar, el crecimiento de 1 UFC/tapón en la muestra Nº 4, sembrada en Agar
Mc Conkey, lo que indica la presencia de Enterobacterias en esta muestra.
Los recuentos de las UFC/tapón de hongos filamentosos y levaduras en estas muestras

fueron superiores a 100, en 4 de las 6 muestras y en las dos restantes los recuentos
fueron superiores a 10 UFC/tapón, el cual es el límite aceptable por la mencionada
Norma. Estos resultados demuestran que los elevados recuentos de microorganismos en
estos productos pueden estar originado en las características del proceso de producción
de los mismos, ya que no se incluye el lavado de los tapones semielaborados.
141
En cuanto a los recuentos de las UFC/tapón de las bacterias en las muestras de tapones
de corcho para vinos tranquilos, se observa que también se encuentran dentro de los
límites de aceptabilidad por la Norma Catalana y que éstos coinciden en la mayoría de
las muestras con los resultados obtenidos por Calvo y Agut en 1996, Navascués en 1998
y Pi en 1997.
Se debe destacar que la muestra Nº 2 estaba adicionada de SO2, sustancia utilizada para
retrasar el crecimiento de microorganismos en los tapones de corcho, pero los resultados
obtenidos en los recuentos de los microorganismos en esta muestra no difieren con los
obtenidos en la mayoría de las muestras, estos resultados concuerdan con los resultados
obtenidos por Davis et al en 1982 en los cuales la adición de SO2 no influye en la
disminución de la micobiota presente en los tapones de corcho para vinos.
A pesar de que a simple vista, se observó que la cantidad de hongos filamentosos era
menor en las muestras de tapones para vinos tranquilos, el crecimiento de
Monilia sitophila impidió el recuento de las UFC/tapón en la totalidad de las muestras.
Monilia sitophila es un hongo filamentoso, común en suelo y vegetales, cuyo micelio

vegetativo caracterizado por hifas erectas y laxas, crece extremadamente rápido,
ocupando las placas de cultivo en pocos días (Barron 1972, Ellis y Ellis 1985).
5.2.2. IDENTIFICACIÓN DE HONGOS FILAMENTOSOS, LEVADURAS Y

BACTERIAS
Los hongos filamentosos y levaduras aisladas de las muestras de tapones de corcho para
vinos espumosos y vinos tranquilos corresponden con los descritos por diversos autores
como pertenecientes a la micobiota del corcho.
Estos hongos filamentosos y levaduras también son aislados de suelo, aire, diversas
materias vegetales en descomposición, son importantes contaminantes de alimentos y
algunas especies son patógenas de plantas y animales, incluido el hombre (Barron 1972,
142
Cosalari et al 1995, Domsch et al 1980, Frazier y Westhoff 1993, Pitt y Hocking 1985,
Ramírez 1982, Samson et al 1984).
Cabe destacar, que no se evidenció Penicillium frequentans, uno de los hongos

filamentosos, reportado por algunos autores (Castera-Rossignol 1983, Lefebvre
et al 1983, Schaeffer et al 1978), como el más frecuentemente aislado de este substrato.
Sin embargo, la ausencia de Penicillium frequentans en las muestras procesadas en este
estudio coincide con lo reportado por Navascués en 1998.
Se observó una mayor diversidad de especies de hongos filamentosos y levaduras en las

muestras de tapones para vinos espumosos que en las muestras de vinos tranquilos, que
puede estar originada por la falta de lavado de este producto, como ya se comentó.
Las levaduras aisladas pertenecen a los géneros Rhodotorula y Candida, estos grupos de
microorganismos fueron descritos por Bureau et al en 1974 como causantes de gustos
anormales en champañas.
De igual forma, se observó una mayor diversidad de especies bacterianas en las

muestras de tapones para vinos espumosos, destacando las especies de Bacillus
(B. cereus, B. firmus, B. lentus, B. circulans, B. pantothenticus), presentes en la mayoría
de las muestras, tanto de tapones para vinos espumosos como para vinos tranquilos.
Bacillus es un género bacteriano formado por bacilos Gram-positivos formadores de

endosporas muy resistentes a condiciones adversas. Su hábitat es el suelo y juega un
papel importante como contaminante de alimentos y también es conocido como
productor de enfermedades en el hombre (Andersson et al 1995, Dufrenne et al 1994,
Frazier y Westhoff 1993, Holt 1986).
Las restantes bacterias aisladas de los tapones de corcho, corresponden a una de

variedad de cocos Gram-positivos (Micrococcus sp y M. luteus), cocos Gram-negativos
(Acinetobacter lowffii), Bacilos Gram-positivos (Nocardia sp y Streptomyces sp) y
Bacilos Gram-negativos (Agrobacterium sp, Achromobacter sp y Aeromonas sp),
incluyendo en este último grupo a Erwinia herbicola, que correspondió a la
Enterobacteria aislada en Mc Conkey. En su totalidad, estas bacterias son aisladas del
143
medio ambiente (agua, suelos, plantas); sin embargo, pueden ser patógenas para el
hombre, animales y plantas (Barrow y Felthman 1993, Frazier y Westhoff 1993,
Krovacek et al 1995, Merino et al 1995).
Cabe destacar que Streptomyces sp es conocido como un microorganismo que degrada

la lignina por medio de mecanismos oxidativos que involucran desmetilaciones de
anillos aromáticos, sus rupturas y ataques oxidativos sobre cadenas fenilpropiónicas,
produciendo finalmente guayacol, con el consabido “sabor a corcho” de los vinos. Sin
embargo, la descomposición química de la lignina, también puede ser responsable de
bajas concentraciones de guayacol en los vinos madurados (Pettey y Crawford 1984,
Simpson 1990).
De forma general, la acidez, el contenido en carbohidratos, la concentración de etanol,

la concentración de taninos, la cantidad de dióxido de azufre y la ausencia de aire en los
vinos en contacto con los tapones de corcho y en consecuencia con los microorganismos
mencionados anteriormente, hace improbable el desarrollo de éstos, pero sin embargo,
debe tenerse en cuenta que algunos microorganismos como bacterias acéticas (oxidan el
alcohol a ácido acético), bacterias lácticas (producen ácido a partir de glucosa y
fructosa), levaduras silvestres (procedentes de las uvas utilizadas para elaborar el mosto)
y algunos hongos filamentosos (Mucor, Penicillium y Aspergillus), son capaces de
originar alteraciones en los vinos. Las alteraciones observadas con mayor frecuencia
son: Agriado, turbidez, ennegrecimiento y pardeamiento al aire (Frazier y Westhoff
1993, Ubeda y Briones 1999).
Así mismo, la relación que existe entre la presencia de distintas cepas de Penicillium y
las concentraciones de compuestos organoclorados como el 2,4,6-tricloroanisol en los
tapones de corcho con el “gusto a corcho” en los vinos están ampliamente
documentada; sin embargo, debe tenerse en cuenta que el 2,4,6-tricloroanisol también
puede ser originado por la degradación de compuestos fenólicos por parte de otros
hongos como pueden ser: Paecilomyces varitii y Phanerochaete chrysosporum (Joshi y
Gold 1993, Valli y Gold 1991, Whitfield et al 1991b).
144
5.3. DISCUSIÓN DE LOS RESULTADOS DE ACTIVIDAD METABÓLICA DE
A continuación se discutirán los resultados obtenidos del estudio de la actividad

enzimática, de la actividad inhibitoria y de la producción de micotoxinas
5.3.1. DISCUSIÓN DE LOS RESULTADOS DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA DE

5.3.1.1. Actividad enzimática de los hongos filamentosos y levaduras aislados
Las enzimas producidas por todas las especies de hongos filamentosos y levaduras
aislados fueron: esterasa (C1 ), esterasa lipasa y naftol- A-S-BI-fosfohidrolasa, son
producidas por la mayoría de ellos: Fosfatasa alcalina y β-glucosidasa.
Las esterasas son enzimas extracelulares producidas por hongos filamentosos, levaduras
y bacterias, las cuales actúan rompiendo los enlaces ésteres, atravesando polisacáridos
de la pared celular y la lignina y de ese modo permite que la pared celular donde actúan
se haga más accesible a la acción de las hidrolasas, las cuales actúan hidrolizando
compuestos de altos pesos moleculares como carbohidratos y proteínas (Christov y
Prior 1993, Mc Dermid et al 1997, Smith 1983).
Las lipasas son enzimas lipolíticas originadas, entre otros, por microorganismos, cuya
propiedad más importante es la hidrólisis de ésteres de ácidos grasos, para la obtención
de energía y crecimiento celular. Pueden ser producidas por hongos filamentosos y
levaduras, entre ellos destacan las especies de Aspergillus, Penicillium, Mucor,
Rhizopus y Candida. En el ámbito industrial las lipasas son utilizadas para elaborar
diferentes sabores y fragancias (Balcâo et al 1996, Mannesse et al 1997, Talon et al
1996).
En la degradación de la celulosa a glucosa, juega un papel primordial la β-glucosidasa.

Esta enzima se encuentra asociada a la celulasa, la cual es un complejo enzimático
145
formado por endo y exoglucanasas que son indispensables para la completa hidrólisis de
la celulosa (Dass et al 1997, Pedraza-Reyes y Gutierrez-Corona 1997, Ratledge 1994,
Sternberg 1976).
Los hongos filamentosos que presentaron mayor actividad enzimática fueron:

Alternaria alternata, Aspergillus niger y Monilia sitophila.
Se debe resaltar la marcada actividad fosfatasa ácida y naftol-A-S-BI-fosfohidrolasa

(40 nanomoles) que se detectó en Aspergillus fumigatus, Fusarium moniliforme y
Monilia sitophila.
Como se ha indicado anteriormente, los tapones de corcho representan un substrato

adecuado para el crecimiento de los hongos filamentosos y levaduras aislados de las
muestras y si sumamos a esta característica la elevada actividad enzimática presentada
por estos microorganismos, se puede esperar que la calidad de los tapones de corcho se
vea afectada.
Mención especial merece Monilia sitophila, este hongo filamentoso es considerado un

contaminante indeseable tanto de las planchas de corcho como de los tapones ya
terminados, debido a su crecimiento invasivo, esta característica aunada a su marcada
actividad hidrolasa, fosfatasas y β-glucosidasa hace que el crecimiento de este
microorganismo deba ser controlado.
5.3.1.2. Actividad enzimática de las bacterias aisladas
La actividad enzimática de las bacterias aisladas, se caracterizó por una moderada

producción de naftol-A-S-BI-fosfohidrolasa por parte de todas las especies, seguida de
la producción de leucina arilamidasa, esterasa (C1) y esterasa lipasa.
La bacteria que mayor actividad enzimática presentó fue Aeromonas sp; este resultado
coincide con la caracterización enzimática, por el sistema API ZYM, de Aeromonas
146
aislada del medio ambiente por Waltman et al en 1982 y con la actividad enzimática
descrita para ese microorganismo por Merino et al en 1995.
Cabe destacar que ninguno de los microorganismos aislados presentaron las siguientes
actividades: tripsina, α-manosidasa y β-manosidasa.
5.3.2. DISCUSIÓN DE LOS RESULTADOS DE LA ACTIVIDAD INHIBITORIA DE

Como ya se ha mencionado, la microflora presente en los tapones de corcho es variada y

compleja. La presencia o ausencia de ciertos microorganismos en este substrato va a
depender de diversos factores, entre ellos se pueden mencionar: la humedad, la
temperatura, la velocidad de crecimiento y las relaciones de sinergismo o antagonismo
que se pueden dar entre ellos (Adams y Moss 1997).
Así mismo, la producción de metabolitos como enzimas, antibióticos y toxinas pueden

influir en la capacidad de unos microorganismos para inhibir el crecimiento de otros.
5.3.2.1. Actividad inhibitoria de los hongos filamentosos y levaduras aisladas
Los resultados obtenidos demuestran que los hongos filamentosos aislados de las
muestras que poseen mayor actividad contra otros hongos filamentosos y levaduras
presentes en los tapones de corcho son Penicillium citrinum y Trichoderma viride,
destacando esta última, por su capacidad adicional de inhibir parcialmente la
esporulación de Aspergillus niger y de Penicillium velutinum y por la producción de
halos inhibitorios de mayor tamaño cuando estaba en contacto por su zona miceliar con
los otros microorganismos.
Trichoderma viride, es un hongo filamentoso que se caracteriza por un crecimiento

extremadamente rápido (colonias de 4,5 a 7,5 cm en 5 días) y especialmente por su
actividad antagonista y parasitaria para otros hongos filamentosos, levaduras y
bacterias; particularmente contra Fusarium solani y especies de Mucor y Rhizopus
147
(Domsch et al 1980, Samson et al 1984), lo que coincide con los resultados obtenidos
en este estudio. Así mismo, Trichoderma viride ejerce su capacidad inhibitoria
produciendo compuestos con actividad antibiótica y antifúngicas tales como la
tricodermina, tricotecina y la tricotoxina A (Samson et al 1984).
Igualmente, Penicillium citrinum también ha sido descrito como un hongo filamentoso

con actividad antagonista contra hongos y bacterias y como productor de metabolitos
con propiedades fungistáticas y antibióticas como son la citrinina y la sideramina
(Samson et al 1984).
De manera general, se observa que la mayoría de los hongos filamentosos y levaduras

aisladas de las muestras presentan actividad inhibitoria contra los hongos filamentosos
no presentes en las muestras, destacando T. viride, seguido de P. citrinum, A. niger,
F. moniliforme y F. solani. Ésta puede ser la causa por la cual no se aislaron Penicillium
frequentans, Aspergillus flavus, Acremonium strictum y Rhizopus arrhizus en las
muestras, a pesar de que forman parte de la micobiota del corcho.
El hongo filamentoso que resultó ser más sensible a la actividad inhibitoria de otros
hongos filamentosos fue Penicillium velutinum, ya que además de observarse halos
inhibitorios, su capacidad esporulativa se ve afectada parcial o totalmente en la mayoría
de los casos. De modo contrario, T. viride resultó ser el hongo filamentoso más
resistente a la actividad inhibitoria de los otros hongos.
Los hongos filamentosos y levaduras que presentaron mayor actividad inhibitoria contra
las bacterias fueron: Penicillium citrinum y Mucor plumbeus, seguidos de Alternaria
alternata, Fusarium solani y Rhodotorula glutinis; sin embargo, todos los hongos, a
excepción de Candida ciferri, tienen actividad inhibitoria contra las bacterias aisladas.
Las especies del género Bacillus, particularmente B. lentus y B. cereus son los más
sensibles a la actividad inhibitoria de los hongos filamentosos. En el caso contrario, se
encuentra Aeromonas sp, la cual resultó ser la bacteria más resistente.
148
5.3.2.2. Actividad inhibitoria de las bacterias aisladas
La escasa actividad inhibitoria de las bacterias aisladas contra los hongos filamentosos y
levaduras se observó de forma general en comparación con los resultados obtenidos de
la actividad inhibitoria de estos últimos contra las bacterias.
Sin embargo, se observó que Agrobacterium sp, fue la bacteria que presentó mayor
actividad inhibitoria contra los hongos filamentosos y levaduras. Así mismo, se debe
destacar, que la actividad inhibitoria de algunas bacterias, se caracterizó por inhibir
parcialmente la capacidad de esporulación de algunos hongos filamentosos en contacto
con ellas; particularmente, A. niger y T. viride se muestran sensibles en su capacidad de
esporulación.
La mayor actividad inhibitoria contra otras bacterias, la presentaron Nocardia sp y

Agrobacterium sp. Por el contrario, Bacillus cereus, B. firmus y Micrococcus luteus no
presentaron actividad inhibitoria contra hongos filamentosos, levaduras ni bacterias.
Se debe resaltar, la poca actividad inhibitoria de Monilia sitophila (sólo contra A. niger
y A. fumigatus), así como también su resistencia ante los demás microorganismos. Los
resultados obtenidos demuestran que este microorganismo no produce halos inhibitorios
en la mayoría de los microorganismos enfrentados a ella, pero tampoco se observa que
éstos influyan en su crecimiento, lo que indica que existe una competencia por el
espacio, evidenciada por su crecimiento invasivo. Esta característica ha de tomarse en
cuenta, ya que este hongo filamentoso se encontró presente en todas las muestras
analizadas en este estudio.
5.3.3. DISCUSIÓN DE LOS RESULTADOS DE LAS CROMATOGRAFÍAS EN CAPA

FINA
El objetivo de esta prueba fue investigar la producción de compuestos por parte de los
hongos filamentosos y levaduras, que difundieran al medio de cultivo y posteriormente
determinar la actividad inhibitoria de los mismos frente a otros microorganismos.
149
Las huellas cromatográficas obtenidas tras la realización de las cromatografías en capa
fina de los discos de cultivos fúngicos, revelaron la separación de 7 fracciones con
diferentes Rf originadas por Alternaria alternata y una fracción originadas de cada una
de las siguientes especies: Penicillium citrinum, Aspergillus niger, Trichoderma viride,
Fusarium moniliforme y Penicillium velutinum. Se observó una fracción común a todas
las especies probadas que correspondió al control (disco de agar extracto de malta al
2 %).
No se observaron huellas cromatográficas de Mucor plumbeus, Aspergillus fumigatus,

Fusarium solani, Rhodotorula glutinis ni Candida ciferri.
5.3.3.1. Actividad inhibitoria de las fracciones de los hongos filamentosos obtenidas

por cromatografía en capa fina
La actividad inhibitoria de las fracciones producidas por los hongos filamentosos contra
otros microorganismos, resultó ser bastante menor a la obtenida cuando se pusieron en
contacto directo los discos de los microorganismos frente a las cepas en estudio.
Estos resultados se pueden deber, a que la cantidad de inóculo, en este caso fue menor,
ya que no estaban presentes los hongos filamentosos y la concentración de las
sustancias difundidas al medio del cultivo pudo ser más baja.
Sin embargo, estas fracciones presentaron actividad inhibitoria contra los

microorganismos que ya habían mostrado su sensibilidad ante los discos de los hongos
filamentosos ensayados, a excepción de Erwinia herbicola y Agrobacterium sp que no
mostraron sensibilidad ante los discos de Fusarium moniliforme, pero sí frente a la
fracción originada por él.
150
5.3.4. DISCUSIÓN DE LOS RESULTADOS DE LA PRODUCCIÓN DE
MICOTOXINAS
5.3.4.1. Producción de micotoxinas de Alternaria alternata
Al comparar las 7 fracciones de Alternaria alternata obtenidas por cromatografía en

capa fina con los controles de ácido tenuazoico, altertoxina I, alternariol, alternariol
monometil éter y tentoxina, se puede observar que la cepa de A. alternata aislada sólo
produce: altertoxina I, altenueno, alternariol y alternariol monometil éter. Las 3
fracciones restantes no fueron identificadas y fueron denominadas 201A, 201B y 201C.
A. alternata no produjo ácido tenuazoico ni tentoxina, en las condiciones

experimentales de este estudio. La producción de tentoxina está condicionada a una
cantidad limitada de fosfato en el medio de cultivo (Ramm et al 1994), lo que ha podido
influir en estos resultados.
El ácido tenuazoico, es descrito por Stinson et al en 1980, como una micotoxina que
puede ser producida en cultivos por numerosas especies de Alternaria aisladas de
diversas fuentes y es considerado como la sustancia tóxica más importante de A.
alternata, aunque su producción se ve influenciada por la concentración de nitrógeno en
el medio de cultivo. Sin embargo, la A. alternata aislada en este estudio no produjo
ácido tenuazoico.
De forma general, la producción de micotoxinas por A. alternata se encuentra

condicionada a una alta actividad de agua, a la temperatura de incubación, el pH del
substrato y el tipo de substrato en el cual crece el microorganismo (Burroughs et al
1976, Magan et al 1984)
Al analizar los resultados obtenidos de la actividad inhibitoria de las fracciones de

A. alternata, se puede observar que estas coinciden con la actividad inhibitoria de los
discos de cultivo de este microorganismo.
151
Así mismo se debe destacar que las micotoxinas producidas tienen actividad inhibitoria
sobre diversos microorganismos, especialmente el arternariol y el altenueno ejercen su
acción inhibitoria sobre una mayor cantidad de hongos filamentosos y bacterias que
alternariol monometil éter y altertoxina I. Los microorganismos más sensibles a la
acción inhibitoria de las micotoxinas producidas por Alternaria alternata fueron:
Penicillium velutinum, Bacillus pantothenticus, Acinetobacter sp y Micrococcus sp.
5.3.4.2. Producción de micotoxinas por Penicillium citrinum, Fusarium moniliforme

y Fusarium solani
Los resultados obtenidos demuestran la producción in vitro de citrinina por Penicillium

citrinum y de fumonisina B1 por Fusarium moniliforme, ya que las fracciones separadas
por cromatografía en capa fina de estos hongos, coinciden con los controles para tales
micotoxinas. Fusarium solani no produjo fumonisina B1.
La citrinina posee propiedades antibióticas, bacteriostáticas, antifúngicas y

antiprotozoarias (Franco et al 1996), por lo que es posible que la actividad inhibitoria
que presentan los discos de Penicillium citrinum cuando hacían contacto con otros
microorganismos, por la zona del medio de cultivo, se deba a la difusión de la citrinina
producida al medio de cultivo.
Al igual que las micotoxinas producidas por A. alternata, la producción de citrinina y de

fumonisina B1 dependen de la actividad de agua (F. moniliforme no produce
fumonisinas a una actividad de agua por debajo de 0,87), el pH del medio, la
temperatura y el período de incubación de Penicillium citrinum y Fusarium moniliforme
(Alberts et al 1990, Montani et al 1988, Sweeney y Dobson 1998, Wheeler et al 1991).
152
153
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3.

3.1. EVALUACIÓN DE LAS METODOLOGÍAS PARA EL CONTROL

3.1.1. PREPARACIÓN DE TAPONES CONTROL

Se ensayaron diferentes métodos para inocular experimentalmente los tapones de corcho

3.1.1.1. Microorganismos utilizados

Tabla 6. Microorganismos utilizados para la inoculación experimental de los tapones de

Hongos filamentosos Levaduras Bacterias

Se procedió a la inoculación de una suspensión de los microorganismos a 270 tapones

Previa a la inoculación, los tapones fueron introducidos en matraces de 250 ml de

3.1.1.3. Suspensiones de conidios fúngicos, levaduras y bacterias

Se realizaron suspensiones celulares de los microorganismos aislados para inocularlos

3.1.1.3.1. Suspensiones de conidios fúngicos y levaduras

A los cultivos puros de los hongos filamentosos mencionados anteriormente se les

Posteriormente, se procedió a determinar el número de conidios por ml de la

Se obtuvieron de esta forma, suspensiones del orden de 109 células/ml. Estas

3.1.1.3.2. Suspensiones de bacterias

3.1.1.4. Medios de cultivo

Los medios de cultivo utilizados fueron: agar extracto de malta al 2% adicionado de

Agar extracto de malta al 2% Agar triptona soja

Extracto de malta 20 g Triptona 15 g

Ajustar pH a 4,5 + 0,2. Esterilizar en Ajustar pH a 7,3 + 0,2. Esterilizar en

Se prepararon baterías de matraces (3 matraces por cada concentración a ensayar) que

A continuación se describen las metodologías utilizadas para la inoculación de los

3.1.1.5.1. Inoculación por aerosol

Un grupo de baterías de matraces fue inoculado con las suspensiones de

3.1.1.5.2. Inoculación por inmersión

A otro grupo de baterías de matraces, se les agregó 20 ml de la mezcla de suspensiones

En un primer período se utilizaron mezclas formadas por las suspensiones de conidios

3.1.1.6. Recuento de los microorganismos recuperados

El recuento de los microorganismos recuperados se realizó por el método de las

Al finalizar la incubación se llevó a cabo el recuento de las UFC/tapón y la

% Recuperación = 100% - % Reducción

%Reducción Tapones = UFC inoculados/tapón – UFC detectadas/tapón x 100

% Reducción inóculo = UFC/ml (inóculo inicial) – UFC/ml (inóculo final) x 100

Aislamiento e identificación Cultivo puro +

Filtración (Hongos filamentosos)

Suspensión conidios, levaduras y bacterias

Aplicación a tapones (Aerosol) Aplicación a tapones (inmersión)

Agitación 3-6-9-24 horas 28ºC.

Decantar suspensión Cuantificación UFC/ml

Lavar tapones con S.F. estéril-1 hora – 28ºC.

Recuento UFC/tapón y determinación de % de recuperación de microorganismos

Esquema 3. Procedimiento de laboratorio para la preparación de tapones controles

3.1.2.1. Inoculación de los tapones de corcho control

Las mezclas de microorganismos estaban formadas por suspensiones de conidios de

3.1.2.2. Ensayos realizados para evaluar el método de referencia

Los diferentes parámetros establecidos por la Norma Catalana Nº 0.20/95 para el

Los parámetros objeto de estudios fueron: soluciones de lavado, tiempo y velocidad de

3.1.2.2.2. Prueba de la velocidad de lavado

3.1.2.2.3. Prueba del tiempo de lavado

Se colocaron 2 tapones de corcho en matraces que contenían 100 ml de las soluciones

A continuación se detalla la composición de los medios de cultivo no descritos

Plate Count Agar Sabouraud Dextrosa Agar

Peptona 5,0 g Glucosa 40 g

pH del medio: 7,0 + 0,2 pH del medio: 5,6 + 0,2

pH del medio: 5,5 + 0,2

3.1.2.2.5. Prueba del tiempo de incubación

3.1.2.2.6. Prueba de la temperatura de incubación

Finalmente, se probaron diferentes temperaturas de incubación de los filtros sobre los

3.1.2.3. Cálculo de las UFC/tapón

UFC/tapón = UFC/ filtro

3.1.2.4. Comparación de metodologías

Se prepararon tapones de corcho control utilizando el método del inmersión con la