7 eo CAPITULO vt Prueba del disco de optoquina |. PRINCIPIO. Determinar la sensbilidad de un microorganismo a la sustancia quimica optoguina, La sensibilidad a la optoguina prueba Ia fragilidad de la membrana celular bacteriana, OBJETIVO. (Véase también cap. 44) Eldisco de optoquina se utiliza de manera especifica para diferenciar entre Streptococcus pnewmoniae (sensible, S, Sens) y otras especies de Streptococcus dt- hemoliticos (viridans) (resistente, R); un método fenotipico. ML BIOQUIMICA. La optoquina es una sustancia quimica, clorhidrato de etilhidrocupteina (3). La etilhidrocuprefna, la base del disco de optoquina (13), es insoluble en agua (4, 17). Sin embargo, el clorhidrato de etilhidrocu- preina es completamente hidrosoluble (4). La optoquina es un derivado del alcaloide hidroquinina (13), {que se prepara por hidrogenaci6n, desmetilacién y etilacién de 1a quinina (17). om GHs0. z C 1 Nae Cs CClorhidrato de ethidrocupreina (optoquina) Cada disco de papel de filtro est impregnado con alrededor de 0,02 mL. de una dilucién acuosa 14,000 de la sustancia quimica (4, 7) secada a 37°C (4), Esta es la concentraci6n éptima de optoquina para la di- ferenciacién de S. pneumoniae (3). La optoquina tiene alrededor de 95% de sensibilidad espectfica para S. pneumoniae (3, 11, 18) y es bacteriostitica a una concentracién 1:500,000 a 1:100.000 (13). Las otras, especies de a-Streptococcus requieren una concentracién 1:5,000 (0 mayor) para inhibir el crecimiento (11, 16). Las eéhulas de S. pneumoniae se lisan debido a los cambios en la tensiGn superficial y se produ- ce una zona de inhibicién por el contacto con la optoquina (11). IV. PROCEDIMIENTO ‘A. Inoculacién del microorganismo a ser probado 1. Colonia pu 2. Medio: placa de agar con sangre al 5% a. Recomendado: sangre de oveja.340 Pruebas bioguimicas individuaies ’. Alternativa: sangre humana antigua (banco de sangre). Deben utilizarse placas de agar con sangre ppara la comprobaciGn de la opioquina, ya que todas las especies de Streptococcus son microorga- nismos exigentes y requieren el agregado de elementos de enriquecimiento para el desarrollo. 3. Método de inoculacién para obtener el maximo crecimiento; dos opciones a. Subcultivo en caldo con tripticasa y soja (TSB); una tinea colonia (1) Incubacién: 35°C, 18-24. Q) Aplicacién dei microorganismo (a) Hisopo estéril. (b) Sembrar con el hisopo toda la placa de agar con sangre en las cuatro direcciones. b. Inoculacisn directa (1) Colonia nica, (2) Estriar toda la placa de agar con sangre con un ansa de inoculacién en las cuatro direcciones. (3) Siembra en estrias en las cuatro direcciones. Si van a probarse varios microorganismos pa- ra la sensibilidad a la optoquina, una dnica placa de agar con sangre puede dividirse en cua- tro cuadrantes (base de la placa) para cuatro determinaciones separadas. A Marcar una placa de agar con sangre en cuatro cuadrantes sobre la mitad inferior de la placa, la que contiene el medio. Antes de la inoculacién, marcar cada cuadrante de la base de manera apropiada para evitar una confusin en la interpretacién de los resultados, No intentar utilizar més de cuatro discos por placa. El uso de una placa en cuadrantes atin requiere una siembra en estrias para lograr un crecimiento maximo. B. Disco de optoquina (5 ug) 1. Productos comerciales disponib) a. Difco: Bacto-Differentiation b. BBL: Taxo P discs (2) 2. Conservacién: refrigerador (4-10°C); frascos con tapa a rosca. ; contienen alrededor de 5 j1g/disco. s, optochin (Discos para la diferenciacién de opiauits) (8). Bowers y Jeffries (4) establecieron que los discos de optoquina son estables durante 9 meses, refrige~ rados (4°C) 0 conservados a temperatura ambiente (25°C). Sin embargo, se recomienda que sean conser- -vados en refrigerador mientras no estén en uso. De manera periédica se les debe realizar un control de ca~ lidad y deben ser retirados del uso cuando demuestran un resultado negativo o reacciones débiles con una cepa sensible conocida de S. pneumoniae. Si los discos preparados por los fabricantes no reaccionan de ‘manera apropiada, como se evidencia por el control de calidad, el lote completo puede ser devuelto a la compania para su teemplazo. 3. Aplicacién de los discos a. De manera aséptica, con pinzas flameadas con alcohol, extraer un disco de optoquina y aplicar cen el centro de una placa de agar con sangre sembrada como se indicé antes o en un cuadrante. () No colocar cerca del borde de ta placa. ) Aplicar una suave presi6n sobre el disco de modo tal que se adhiera ala superficie de la pla- a, peto no presionar demasiado hacia abajo como para sumergirlo en el medio.Prueba del disco de optoquina 341 b. Puede colocarse una gota de agua destilada estéril sobre el disco después de Ia aplicacién. Bo- ‘wen y col. (3) mostraron que 1a zona de inhibicién de un microorganismo sensible tiene un dis- metro de 2-3 mm mis grande con los discos hiimedos que con los discos deshidratados. La hu- medad permite que 11 optoquina difunda en e1 medio con més rapidez. ‘c. Mantener tapado el envase de los discos siempre que no se use. C. Incubacién 1. Placa invertida (Ja tapa hacia abajo). 2. Jarra con vela; aumento al 3-5% de CO, (10). V. MICROORGANISMOS UTILIZADOS PARA EL CONTROL DE CALIDAD A. Sensible (S, sen): Streptococcus pneumoniae ATCC 33400 B. Resistente (R): Enterococcus fuecalis ATCC 19433 VI. RESULTADOS ‘Véanse figuras 31-1 a 31-3 (Apéndice 1) para los resultados fotogrificos color. Vl. INTERPRETACION (Nota: El didémetro del disco y el halo de inhibicién deben ser determinados antes de realizar la inter- pretacién (11). Medir desde el borde del disco.) ‘A. Sensible (S):identicnion presuntiva de. peumoniae Crecimicnto inhibido alsededor del disco a, Disco de 6 mm (BBL): halo de 14 mm o mayor. b. Disco de 10 mm (Difco): halo de 16 mm o mayor. . SicI halo es mas pequefio, realizar procedimientos altemativos (p.¢)., solubilidad en bilis, com- probaciones serol6gicas) 2. Zona clara alrededor del disco. 3. Alfa (a) hemélisis B. Resistente (R): otras especies de Streptococcus. 1. Crecimiento no inhibido alrededor del disco. 2, Crecimiento hasta el disco y alrededor del mismo. EL tamaito del balo de inhibi separacién nitido (3, 10), mnustrado por S. pneumoniae varia Ue 15 a 30 mun con un bode de vi |. PRECAUCIONES A. Deben utilizarse los términos sensible 0 resistente para las interpretaciones de la prueba en disco de ‘optoquina. Son aceptables las abreviaturas S y R para denotar los resultados con tal que el laboratorio les haya explicado con anterioridad a los médicos que realizan las indicaciones el significado de di- chas abreviaturas. Nunca utilizar positivo (+) 0 negativo (-) para indicar los resultados de la optoqui- nna, Un resultado positivo no explica de manera suficiente el significado; podrfa indicar crecimiento in- hiido o simplemente que el microorganismo crece en agar con sangre pero no acitia con Ia optoquina. B. La prucha de la optoguina s6lo se utiliza para diferenciar S. pneumoniae c1-hemolitico de otras espe~ cies o-hemoliticas de Streptococcus (viridans). Sin embargo, si se tienen dudas acerca del patron he- molitico exhibido por una posible especie de Streptococcus, realizar una prueba de optoquina. Las es- pecies de o-Streptococcus y 8. pnewmoniae a menudo son dificiles de diferenciar por la morfologia en la coloracién de Gram y por la morfologia de la colonia y por esto requieren la realizacién de prue- bas adicionales para la diferenciacién (optoquina o pruebas de solubilidad en bilis 0 ambas). No obs- tante, S. pneumoniae y todas las otras especies de Streptococcus, sin tomar en consideraci6n su patrén342 Pruebas bioquimicas individuales hemolitico, son catalasa negativos y esta determinacién debe realizarse antes de llevar a cabo una prue- ba de optoquina. CC. Bowen y col. (3) determinaron que no existe correlacién entre el tamafio de los halos de inhibicién exhi- bidos por S. pneumoniae y sus tipos serol6gicos. D. Cruickshank (7) destaca que en ocasiones pueden observarse unas pocas colonias esparcidas de S. pneumoniae resistentes a la optoquina en una amplia zona de inhibicin, Para asegurarse de que se dis- pponga de un cultivo puro, realizar subcultivos de las colonias resistentes en placas de agar con sangre y determinar lo siguiente: reacci6n de catalasa, morfologfa en la coloracién de Gram y morfologia de Ja colonia. Luego repetir la prueba de optoquina antes de realizar la interpretacién final. E, Cowan y Steel (6) establecieron que especies ocasionales de a-Streptococcus pueden exhibir una zo- nna muy pequefia (1-2 mm de diémetro) de inhibicin. Si el halo de inhibiciOn es menor de 14 mm, de- ben realizarse pruebas altemativas ya que algunos estreptococos no neumococos ni viridans y ciertos aerococos pueden mostrar pequefios halos de inhibicién (11). Bowers y Jeffries (4) establecieron que si la concentraci6n del clorhidrato de etilhidrocupreina uti- lizado para los discos es menor de 1:8,000, los microbiélogos sin experiencia pueden pasar por alto las pequefias zonas de inhibicién. Para el uso en el diagnéstico habitual se utiliza una concentracién de 1:4.000, lo cual brinda un amplio halo de inhibicién con S. pneumoniae para distinguirlo de las ce~ pas de a-Streptococeus insolubles en bilis que pueden exhibir un leve halo de inhibicién (5). Ragsdale y Sanford (15) mostraron que S. pneumoniae puede exhibir una dismimucién en el tama- fio del halo de inhibicién de la optoquina cuando las placas se incuban con CO, al 5%. El didmetro promedio del halo de inhibicin fue de 21,9 mm en las placas incubadas en aire atmosférico; en pre- sencia de CO, al 5%, el didmetro promedio fue de 16,3 mm. Sin embargo, los estreptococos son mi- croorganismos exigentes y el crecimiento inicial (metabolismo) se incrementa por la incubacién con al menos 2-3% de CO, Puede utilizarse una estufa de CO, o una jarra con vela que reemplaza parte del nitrégeno con CO. ‘Austrian y Collins (1) mostraron que 8% de las cepas de S. pneumoniae requieren una tensién de (CO, mayor que la aportada por la atmésfera para el aislamiento inicial en los medios en placas. Mar- tin y Niven (12) y Wright (19) demostraron que el CO, entra en la via metabélica para facilitar el cre- cimiento de S. prewmoniae por medio de una condensacién de un compuesto de un carbono con un compuesto de tres carbonos, lo que forma el écido oxalacético, el que a su vez es aminado para for- ‘mar écido aspértico. Cuando el Acido oxalacético esté ausente, los neumococos requieren un aumen- to de CO, para la sintesis de dcido aspirtico (12). Los neumococos requieren dcido oleico o un aumen- to de la tensién de CO, para su desarrollo en el medio con hidrolizado de caseina (12). Martin y Niven (12) mostraron que los estreptococos que se desarrollan en el medio con hidrolizado de casefna sin oleato pero que contiene dcido aspartico requieren CO, para el crecimiento. El incremento de CO; fue necesario para la sintesis de aspartato (12). Sin embargo, los mismos estudios demostraron que cuan- do el oleato y el dcido aspértico estaban presentes, no ocurra la s{ntesis de aspartato, ya que el aspar- ‘ato presente en el medio resultaba suficiente para el crecimiento. El mecanismo no es claro; no obs- tante, el 4cido oleico (oleato) oel incremento de CO, son necesarios para el crecimiento estreptocécico an. F, El crecimiento escaso de un aislamiento hace dificil la interpretacién precisa. El criterio minimo para ‘considerar S. pneumoniae sensible a la optoquina es por lo comin un halo de inhibicin de 14 a 16 ‘mm. mayor (medido desde el borde del disco). Si el halo de inhibicién es menor de 14mm, es apro- piado realizar una prueba de solubilidad en bilis para la confirmacién, Ragsdale y Sanford (15) recomiendan el aistamiento inicial de las especies de Streptococcus en presencia de una atmésfera de CO, al 5%, pero la incubacién para la sensibilidad a la optoquina en ‘una estufa con aire ambiente sin aumento de la tensidn de CO>. Luego, si no se observa crecimiento nel agar a temperatura ambiente, debe realizarse una prueba de solubilidad en bilis (12). Sila incu- bacién se realiza con una tensién aumentada de CO,, Ragsdale y Sanford (15) recomiendan la deter- ‘minacién estindar de los tamafios de los halos, Branson (5) recomienda realizar la prueba de sensibilidad a la optoquina en agar sangre con azida, ‘ya que los halos de inhibicién se definen con més claridad.. G. Se informaron aislamientos de S. pneumoniae resistentes a la optoquina, pero se encuentran en muy raras oportunidades (9, 14).REFERENCIAS: Austrian R, Collins P. Importance of carbon dioxi- dein the isolation of pneumococci. J Bacteriol 1966; 92(5):1281-1284. [BBL Manual of Products and Laboratory Procedures, ed, Cockeysville, MD: BBL Microbiology Systems, Division of Becton Dickinson and Company, 1988, Bowen MK, Thiele LC, Stearman BD, Schaub IG. ‘The optochin sensitivity test: A reliable method for identification of pneumococci. J Lab Clin Med 1957;49(4):641-642, Bowers EF, Jeflies LR. Optochin in the identification ‘of Sr, pneumoniae. j Clin Patol 1955;8 (1)58-60. Branson. MethodsinClinical Bacteriology. Spring- field IL: Charles C Thomas, 1972:39. ‘Cowan ST. Cowan & Stee!"s Manual for the Identi- fication of Medical Bacteria, ed 2. Cambridge: Cam- bridge University Press,1974:26-27. (Cruickshank R. Medical Microbiology, ed 11. Lon don: Livingstone, 1968166 Difco Supplementary Literature. Detroit: Difco La- oratories, 1968:81. Fenoll A, Martinez- Suarez JY, Munoz R, etal. Iden- tification of atypical strains of Strepiococcus pew: ‘moniae by a specific DNA probe. Eur J Clin Micro- biol Infect Dis 1990:9:396-401. Forbes BA, Sahn DF, Weissfeld AS. Bailey & Scott’s Diagnostic Microbiology, ed 10. St. Louis: CV Mosby, 1998442. 2 15. 16, Prueba del disco de optoquina 343 KonemanEW,AllenSD, JandaWM,etal.ColorAtlas & Textbook of Diagnostic Microbiology, ed 5. Pi- ladelphia: JB Lippincott, 1997:609, 1359. Martin WR, Niven CF Jr. Mode of CO, fixation by ‘theminute streptococci. JBacteriol 1966:79 2):295- 298. Moore HF . The action of ethylhydrocupreine (op- {ochin) on type strains of pneumococci in vitro and in-vivo, and on some other mic: isms in vitro. Exp Med 1915;22(3):269-285. ‘Munoz R, Fenoll A, Vicioso D, Casal J. Opto- chinresistant varianis of Streptococcus pneumo- niae, Diagn Microbiol Infect Dis 1989;13:63- 66. Ragsdale AR, Sanford JP. Interfering effect of in- cubation in carbon dioxide on the identification of ‘pneumococci by optochin dises. Appl Microbiol 1971;22(5):854-855. Smith DT. Conant NF, Willett HP. Zinssee’s Micro- biology. ed 14. New York: Appleton-Century-Crofts, 1968:728. ‘The Merck Index, ed7, Rahway, NJ:Merckand Com- pany, 1960:756. ‘Whitmore FC, Organic Chemistry. New York: Van Nostrand, 1937943, Wright DE. The metabolism of carbon dioxide by Sprococcs bovis. } Gen Microbiol 196022 G3) 13-7