ANALISIS MICROSCOPICO DE COMUNIDADES MICROBIANAS NO BASADAS EN TECNICAS DE

CULTIVO

Los ecólogos microbianos cuantifican las células en un hábitat microbiano par estimar la
abundancia relativa de las diferentes especies.

Por esto es necesario teñir las células

Los organismos en su ambiente natural también pueden detectarse analizando sus genes

Los genes que codifican el RNA ribosómico o enzimas que participan en algún tipo específico de la
fisiología son los objetos habituales de estos estudios

La genómica ambiental es un método para evaluar toda la dotación genética de un hábitat y pone
de manifiesto simultáneamente la biodiversidad y las capacidades metabólicas de la comunidad
microbiana.

Métodos generales de tinción

Existen diversos métodos adecuados para cuantificar microorganismos en muestras naturales

Aunque estos métodos no revelan la fisiología ni la filogenia de las células son fiables para contar
el número total de células.

Tinción fluorescente con colores que se unen a los ácidos nucleicos

Se pueden utilizar para teñir microrganismos de cualquier hábitat el DAPI (4,6 diamidino -2-
fenilindo es un colorante habitual para ello igual que el naranja de acridina. También se usa el
SYBR Green 1. Estos colorantes se unen al ADN y emiten una fuerte fluorescencia cuando se
exponen a la radiación ultravioleta (UV).

Lo que hace a las células presentes en la muestra fácil de ver y contar. Las células teñidas con DAPI
emiten fluorescencia azul, las teñidas con naranja de acridina naranja, o verde anaranjado y las
teñidas con SYBR verde emiten color verde.

Los colorantes que tiñen el ADN se usan mucho para contar microorganismos en muestras
ambientales, alimentarias y clínicas.

Así para muchas muestras desde las procedentes del suelo a las procedentes de un medio acuático
es posible obtener una estimación razonable de la cantidad de células presentes.

La tinción del ADN es un proceso inespecífico todos los microorganismos de la muestra se tiñeran
Si bien en principio esto parece deseable no necesariamente lo es. Por ejemplo, el DAPI y el
naranja de acridina no distinguen entre células vivas y muertas ni entre especies diferentes de
microorganismos de modo que no se puede utilizar para evaluar la viabilidad celular ni para
rastrear especies determinadas de microorganismos en un ambiente.

TINCION DE VIABLES

La tinción de viables diferencias las células vivas de las muertas de modo que aporta datos sobre la
abundancia y viabilidad al mismo tiempo. La base de la diferencia entre las células vivas y las
muertas radica en comprobar que la membrana citoplasmática está intacta.

Dos colorantes uno verde y uno rojo se añaden a la muestra el colorante verde penetra en todas
las células sean o no viables mientras que el colorante rojo que contiene yoduro de propidio
penetra solo en aquellas células cuya membrana citoplasmática no esta intacta y por lo tanto
están muertas. Con lo que se obtiene una evaluación de instantánea de la abundancia y la
viabilidad.

Proteínas fluorescentes para etiquetar células y genes reporteros

Las células bacterianas se pueden alterar mediante ingeniería genética para hacerlas
autoflorescentes se puede insertar un gen que codifica las proteínas fluorescentes en el genoma
de cualquier bacteria cultivada, las células emiten fluorescencia al observarlas con un microscopio
ultravioleta.

Con esto los ecólogos pueden estudiar la competencia entre el microbiota nativo y una cepa
introducida marca GFP y evaluar el efecto de las perturbaciones ambientales en la supervivencia
de la cepa introducida.

El marcaje con GFP se usa en estudios de las asociaciones simbióticas microbianas con plantas y
animales.