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Director
MSc. MIGUEL Á. PIRAGAUTA
“Hay hombres que luchan un día y son buenos. Hay otros que luchan un año y son mejores. Hay
quienes luchan muchos años, y son muy buenos. Pero hay los que luchan toda la vida, esos son
los imprescindibles”.
Bertolt Brech
Este trabajo va dedicado a todas aquellas personas cercanas a mí que fueron un apoyo constante
durante estos años en la universidad. De igual forma esta dedicatoria concierne a aquellas personas
que hicieron difícil mi camino, porque demostrarles que si podía cumplir mis objetivos pese a las
adversidades, resultó ser una motivación aún más fuerte para mí.
Una dedicatoria especial a mi familia y a mi prometida Adriana Calderón, una investigadora cuyas
enseñanzas y apoyo afectivo están muy relacionadas con la finalización exitosa de este proyecto.
AGRADECIMIENTOS
La realización de este trabajo fue posible gracias a múltiples personas que de forma directa o
indirecta intervinieron en su realización:
La Universidad Distrital Francisco José de Caldas, por haberme dado una formación integral como
Licenciado en Biología a través de sus docentes y sus espacios.
A mi director, el docente Miguel Á. Piragauta MSc. por confiar en mí y en mi trabajo, por abrirme
las puertas del laboratorio de Microbiología de la Facultad del Medio Ambiente y Recursos
Naturales, por su asesoría y dirección.
A los laboratoristas Oscar Romero y Aleyda Ariza, por su guía, sus consejos durante el desarrollo
del trabajo y su apoyo frente a la realización del mismo.
A los estudiantes Cesar Romero y Diego Castañeda, quienes aportaron valiosa información y
experiencia durante mi estadía en el laboratorio a través de su proyecto.
A la docente Gloria Stella Acosta Peñaloza MSc., quien amablemente dio su apoyo como revisora
y evaluadora de este proyecto y me guio en las encrucijadas con las cuales los científicos solemos
enfrascarnos.
He mencionado a grosso modo solo a algunas personas, pido por ello disculpas a aquellos que no
mencioné, pues sus aportes también fueron importantes para el éxito de este proyecto.
CONTENIDO
RESUMEN .................................................................................................................................... 10
ABSTRACT ................................................................................................................................... 10
1. INTRODUCCIÓN ..................................................................................................................... 11
2. MARCO REFERENCIAL ........................................................................................................ 13
2.1. IMPORTANCIA DE LOS MICROORGANISMOS Y LAS COLECCIONES
MICROBIOLÓGICAS. ........................................................................................................... 13
2.2. CONSERVACIÓN DE MICROORGANISMOS. .......................................................... 14
2.2.1. Conservación a corto plazo. .......................................................................................... 14
2.2.2. Conservación a mediano plazo. Criopreservación. ....................................................... 14
2.2.3. Conservación a largo plazo. .......................................................................................... 15
2.2.3.1. Liofilización. .......................................................................................................... 15
2.2.3.2. Control de calidad de un producto liofilizado. ....................................................... 20
2.2.3.3. Equipamiento para liofilizar. .................................................................................. 21
3. OBJETIVOS .............................................................................................................................. 22
3.1. OBJETIVO GENERAL .................................................................................................... 22
3.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS ........................................................................................... 22
4. METODOLOGÍA ...................................................................................................................... 23
4.1. FASE INICIAL. ................................................................................................................. 23
4.1.1. Acervo Microbiano. ...................................................................................................... 23
4.1.2. Elección de los protectores. .......................................................................................... 23
4.1.2.1. Crioprotectores. ...................................................................................................... 23
4.1.2.2. Lioprotectores......................................................................................................... 23
4.2. FASE INTERMEDIA 1..................................................................................................... 24
4.2.1. Evaluación de la eficacia del método de conservación. ................................................ 24
4.2.1.1. Viabilidad. .............................................................................................................. 24
4.2.1.2. Estabilidad Morfológica. ........................................................................................ 25
4.2.1.3. Pureza. .................................................................................................................... 25
4.2.2. Recuperación de los microorganismos. ........................................................................ 25
4.2.3. Criopreservación. .......................................................................................................... 26
4.2.3.1. Precriopreservación. ............................................................................................... 26
4.2.3.2. Preparación del inóculo bacteriano y ejecución de la criopreservación................. 26
4.2.4. Liofilización. Etapa 1. ................................................................................................... 26
4.2.4.1. Preliofilización y preparación del inóculo bacteriano. ........................................... 26
4.2.4.2. Ejecución de la liofilización. .................................................................................. 26
4.2.4.3. Posliofilización (Rotulado y almacenaje). ............................................................. 27
4.2.5. Rehidratación o Reconstitución. Etapa 2. ..................................................................... 29
4.3. FASE INTERMEDIA 2..................................................................................................... 29
4.3.1. Liofilización definitiva.................................................................................................. 29
4.3.1.1. Preliofilización y preparación del inóculo bacteriano. ........................................... 29
4.3.1.2. Ejecución de la liofilización. .................................................................................. 30
4.3.1.3. Posliofilización. ...................................................................................................... 30
4.3.1.4. Rehidratación. ........................................................................................................ 30
4.3.2. Control de calidad de la liofilización y ajustes técnicos. .............................................. 30
4.3.2.1. Propiedades físicas generales. ................................................................................ 30
4.3.2.2. Contaminación. ...................................................................................................... 30
4.3.2.3. Tiempo de redisolución o reconstitución. .............................................................. 31
4.3.3. Pruebas adicionales. ...................................................................................................... 31
4.3.3.1. Prueba de higroscopicidad másica. ........................................................................ 31
4.3.3.2. Prueba de estabilidad acelerada.............................................................................. 31
4.3.4. Control de esterilidad. ................................................................................................... 32
4.3.4.1. Medios. ................................................................................................................... 32
4.3.4.2. Ambiente. ............................................................................................................... 32
4.3.4.3. Técnicas de siembra y manipulación de elementos. .............................................. 32
4.4. FASE FINAL...................................................................................................................... 32
4.4.1. Base de datos................................................................................................................. 32
4.4.2. Fichas de resumen. ........................................................................................................ 33
4.4.3. Revisión de etiquetas y logística del banco de cepas en el Freezer. ............................. 33
4.4.4. Formatos de control del banco de liofilizados. ............................................................. 33
4.4.5. Manual de procedimientos. ........................................................................................... 33
5. RESULTADOS .......................................................................................................................... 34
5.1. RECUPERACIÓN DE LOS MICROORGANISMOS Y EVALUACIÓN DE LA
CRIOPRESERVACIÓN. ......................................................................................................... 34
5.2. CARACTERÍSTICAS MACRO Y MICROSCOPICAS DE LAS CEPAS DE
ESTUDIO. ................................................................................................................................. 35
5.3. EVALUACIÓN DE LA LIOFILIZACIÓN. PRUEBA DE ESTABILIDAD
NATURAL. ............................................................................................................................... 38
5.3.1. Viabilidad y selección del lioprotector general. ........................................................... 38
5.3.2. Aspecto físico del liofilizado. ....................................................................................... 41
5.4. LIOFILIZACIÓN DEFINITIVA. .................................................................................... 41
5.5. CONTROL DE CALIDAD DE LA LIOFILIZACIÓN. ................................................ 42
5.5.1. Propiedades físicas generales. ....................................................................................... 42
5.5.2. Contaminación. ............................................................................................................. 45
5.5.3. Tiempo de redisolución................................................................................................. 45
5.6. PRUEBAS ADICIONALES. ............................................................................................ 46
5.6.1. Prueba de higroscopicidad másica. ............................................................................... 46
5.6.2. Prueba de estabilidad acelerada. ................................................................................... 47
5.7. PROCESO DE DATADO Y DOCUMENTACIÓN. ...................................................... 47
5.7.1. Base de datos................................................................................................................. 47
5.7.2. Fichas de resumen. ........................................................................................................ 47
5.7.3. Revisión de etiquetas y logística del banco de cepas en el Freezer. ............................. 47
5.7.4. Formatos de control del banco de liofilizados. ............................................................. 48
5.7.5. Manual de procedimientos de conservación. ................................................................ 48
6. ANÁLISIS DE RESULTADOS ................................................................................................ 49
7. CONCLUSIONES ..................................................................................................................... 54
8. RECOMENDACIONES ........................................................................................................... 55
9. REFERENCIAS ........................................................................................................................ 56
10. BIBLIOGRAFÍA ..................................................................................................................... 60
11. ANEXOS .................................................................................................................................. 62
LISTA DE FIGURAS
Figura 8. Tasa de supervivencia (BSR) o viabilidad, de las cinco (5) cepas bacterianas de
estudio luego de la descongelación .................................................................................... 35
Figura 14. Comparación entre las BSR de los liofilizados de Fase intermedia 1 y la
liofilización definitiva, por cepa bacteriana. .................................................................... 41
Figura 15. Transición física de liofilizados conforme se realizaron los ajustes. ..................... 45
Figura 16. Contenido de agua absorbida (%) en función del tiempo por parte del
lioprotector general en viales y crioviales. ........................................................................ 46
Tabla 6. Formatos de control del banco de liofilizados y cepario madre de liofilizados. ...... 33
Tabla 13. Lioprotectores con mejores resultados por cepa con base en el indicador de
viabilidad. ............................................................................................................................ 41
RESUMEN
ABSTRACT
Life is not possible without the intervention of microorganisms and, given its importance, have
been created to preserve biological collections and they can be used in different fields of science
and technology. Exists variety of methods of preservation, in this work was determined the state
of cryopreservation five bacterial strains by viability testing, standardizing and further
implementing the system freeze-drying, taking as a starting point to them, evaluating them against
three protective compounds. An evaluation of preservation methods on the basis of three indicators,
viability, morphological stability and purity was performed; finding cryopreservation system
implemented in the laboratory is optimal and glycerol 67% v/v works for almost all strains for long
periods of time; sucrose 10% w/v lyoprotectant proved to be the best of the three evaluated,
designating it as a general lyoprotectant for the laboratory. It was created a manual for conservation
laboratory strains, including cryopreservation and freeze-drying protocols and safety of
themselves. This work contributes to the field of microbiology conservation and is a stepping stone
for registration Gene Bank Microbiology Laboratory of the Faculty of Environment and Natural
Resources of the University District Francisco Jose de Caldas (CM-UDFJC) before the relevant
national and international institutions.
1. INTRODUCCIÓN
Debido a esto, se han creado colecciones biológicas, como método para preservar la
diversidad microbiana fuera de su nicho. Las colecciones de cultivos microbianos están
representadas a nivel nacional por el Instituto Alexander von Humboldt, y a nivel internacional por
la Federación Mundial de Colecciones de Cultivos (WFCC), en donde existen actualmente
2´520.200 microorganismos en 711 colecciones de 71 países registrados en el Centro Mundial de
Datos de Microorganismos (WDCM). Para Colombia solo existen dos colecciones legalmente
registradas ante la WFCC en la WDCM: el CIAT (Rhizobium Collection America) de código
WDCM 536 y la CM-PUJ (Colección de Microorganismos de la Pontificia Universidad Javeriana)
de código WDCM 857 (WFCC, 2015).
No obstante, varias universidades del país, instituciones públicas o privadas que desarrollan
proyectos relacionados con ciencias biológicas, poseen colecciones microbiológicas aun no
registradas en la WFCC pero si ante el Instituto Alexander von Humboldt, como es el caso de la
Universidad de los Andes (representada por el CIMIC) y la Universidad Nacional de Colombia
(IBUN); en otros casos las colecciones están en proceso de registro o en formación como en la
Universidad Distrital Francisco José de Caldas (CM-UDFJC), entre otras.
Martínez & Mayorga (2013) desarrollaron las bases del Banco Genético en el Laboratorio
de Microbiología de la Facultad del Medio Ambiente y Recursos Naturales de la Universidad
Distrital Francisco José de Caldas (CM-UDFJC, siglas de la colección microbiológica), utilizando
la refrigeración como método primario implementando y estandarizando además el sistema de
criopreservación.
Para la realización de estos fines, el trabajo fue dividido en cuatro fases, comenzando por los
criterios de elección de los microrganismos y los lioprotectores, seguido de la evaluación de los
métodos de preservación, utilizando tres indicadores: viabilidad, estabilidad morfológica y pureza;
posteriormente, una tercera fase de ajustes a la liofilización para lograr un producto fiable y
funcional a largo plazo, utilizando como indicadores las propiedades físicas generales, la
posibilidad de contaminación en el proceso y el tiempo de redisolución; finalmente, una cuarta
fase, que corresponde al proceso de documentación, este incluye la revisión y modificación de la
base de datos, la elaboración de nuevas etiquetas y formatos de control para los productos
liofilizados, así como de fichas resumen para cada trabajo presente en la colección y finalmente la
elaboración del manual de procedimientos. Con lo anterior se encontró que el sistema de
criopreservación desarrollado por Martínez & Mayorga (2013) es eficiente, y permite porcentajes
de recuperación bastante altos, incluso superiores al 90% luego de dos años; sin embargo, no todas
las cepas logran sobrevivir durante tanto tiempo a las condiciones en las que están expuestas por
este método. De otro lado se determinó la sacarosa al 10% como el mejor lioprotector para bacterias
en general (aunque el lioprotector siempre obedece a las características propias de cada organismo)
y se estandarizó el sistema de liofilización.
2. MARCO REFERENCIAL
Los microorganismos al igual que otros seres vivos, poseen una única e irremplazable
secuencia de ADN, por lo que su desaparición implicaría la pérdida irreversible de un conjunto
único de información (Olalde Portugal & Aguilera Gómez, 1998), de ahí la gran importancia en la
creación de comités, comisiones, federaciones y grupos de microbiología como: World Federation
for Culture Collection (WFCC), International Union of Microbiological Societies (UMIS) entre
otros, encargados del establecimiento y desarrollo de colecciones de cultivo para la conservación
ex situ de la diversidad microbiana que sostiene la vida en la tierra (WFCC, 2010b).
congelación) son técnicas de conservación a largo plazo (Perry, 1995; Weng et al., 2005) y otros
insisten su inclusión en las técnicas de conservación a mediano plazo (Morales-García et al., 2010).
Hubálek (2003), menciona una gran cantidad de factores que intervienen en la efectividad de
la criopreservación de microorganismos, desde las características propias del individuo (cepa,
especie, tamaño y forma de celda, fase de crecimiento al momento de congelar, composición de las
células, etc.), así como los factores antes (composición del medio de crecimiento, pH, temperatura
de incubación…), durante y posterior al proceso de criopreservación (densidad poblacional,
aditivos, temperatura y duración del almacenamiento…), e incluso en su descongelación.
“Los aditivos crioprotectores son compuestos químicos de gran afinidad por el agua y son
utilizados para disminuir los daños durante el proceso de congelación” (Gonzáles et al., 2006, pág.
16). Estos protectores se pueden clasificar según su peso molecular (bajo o alto) o según su tasa
y/o capacidad de penetración: los penetrantes, de bajo peso molecular, que desplazan el agua
intracelular evitando la formación de hielo (por ejemplo el glicerol), y los no penetrantes, de alto
peso molecular, que promueven la rápida deshidratación de la célula (por ejemplo los glúcidos)
(Hubálek, 2003).
2.2.3.1. Liofilización.
La liofilización consiste en la eliminación del agua de una sustancia congelada por
sublimación del hielo bajo alto vacío y a presiones muy bajas (Gonzáles et al., 2006) utilizando un
equipo llamado liofilizador. Si la liofilización es exitosa, se puede asegurar una viabilidad
posliofilización por varios años de los microorganismos, sin embargo, dicho éxito depende de
múltiples factores, entre otros, como los mencionados por Hubálek (2003) para la criopreservación
(puesto que la liofilización posee una etapa de congelación); así mismo el tiempo de liofilización,
los parámetros de liofilización, el medio, aditivo o lioprotector usado, tipo de liofilizador o
accesorio utilizado, influyen en el producto final.
16
a) Formulación.
Se entiende como la mezcla de células con cualquier solución protectora, que tras la
eliminación del disolvente, permita obtener un producto (liofilizado) deseado. La solución
protectora ayuda a sobrevivir a las bacterias el proceso de liofilización. Estas soluciones
pueden ser simples (soluciones de glúcidos) o complejas (sueros de animales) (Ops
Diagnostics, 2015).
b) Congelación.
La congelación es la primera etapa del método de liofilización, y uno de los más
importantes para el éxito de este. Su función consiste en obtener una matriz en donde esté
separado el disolvente de los solutos. Cuando se congela la formulación, el agua del medio
acuoso forma cristales de hielo en tanto que los solutos se limitan a la región intersticial
entre los cristales de hielo (Jennings, 2008), la matriz entonces formada disminuye el
movimiento del agua en la región intersticial a casi 0, además proporciona una estructura
con resistencia casi nula, al flujo de vapor de agua durante las etapas de secado (Jennings,
2008).
c) Secado primario.
Corresponde a la segunda etapa de la liofilización, además es la de más larga
duración. En este etapa, la presión se reduce y la temperatura de la formulación congelada
es elevada, dando lugar a la sublimación (Figura 3) y migración de vapor de agua (Grauer
et al., 2015) desde el congelado hacia el condensador del liofilizador. Sin embrago, dicha
temperatura (llamada temperatura de interface) debe estar por debajo de la temperatura
eutéctica, de colapso, de transición vítrea (Tg), para minimizar el daño de la muestra
(Adams, 2007).
18
Figura 3. Diagrama de fases mostrando el punto triple del agua. Se indican los requerimientos de presión
y temperatura que hacen posible la sublimación del agua durante la liofilización.
Fuente: Fetterolf, D. M. (2010). Lyophilization (pág. 19). Journal of Validation Technology, 18-23.
La etapa de secado primario finaliza “cuando todos los cristales de hielo se han
eliminado de la formulación, y el volumen ocupado por la torta resultante es equivalente a
la de la matriz congelada” (Jennings, 2008, pág. 6).
d) Secado secundario.
Es la tercera y última etapa de la liofilización. Al terminar el secado primario, se ha
eliminado el agua móvil de la muestra. Sin embargo, existe agua atrapada dentro del sólido
amorfo que es más difícil de eliminar (Fetterolf, 2010). La cantidad de agua es discutible,
ya que fluctúa en función de la temperatura y las características propias de los
19
constituyentes de la formulación, por ello algunos autores sugieren que oscila entre el 5-
10% w/w del producto seco (Jennings, 2008) o del 2-4% (Ops Diagnostics, 2015).
Según Ops Diagnostics (2015), esta etapa es relativamente corta, con una duración de
1 a 2 horas, aunque Grauer et al. (2015) indica que representa entre el 30-40% del tiempo
total del proceso; así mismo Fetterolf (2010) manifiesta que puede ser un proceso largo,
con una duración de hasta varios días. Esto resulta importante puesto que “la cantidad de
agua residente luego del secado, afecta la tasa de pérdida de viabilidad durante el
almacenamiento” (Grauer et al., 2015, pág. 16)
Figura 4. Descripción global del proceso de liofilización. De 1-3, Congelamiento (1-2 presión
atmosférica); de 3-4, secado primario; de 4-5, Secado secundario.
Fuente: Fetterolf, D. M. (2010). Lyophilization (pág. 19). Journal of Validation Technology, 18-23
20
e) Sellado y almacenamiento.
Terminado el proceso de secado secundario, se deben sellar los viales al vacío (de ser
posible) o de forma hermética tan pronto como sea posible, debido a que la torta actuará
como una esponja que absorbe vapor de agua del ambiente (Fetterolf, 2010), aunque
también es posible agregar al liofilizado un gas inerte (Adams, 2007), e incluso algunos
laboratorios depositan perlas de sílice.
f) Reactivación o rehidratación.
Es el proceso por el cual se restaura el liofilizado a su formulación original, esto
implica la adición de un volumen de diluyente conocido a la torta seca (Jennings, 2008;
Grauer et al., 2015). La dilución rápida (inferior a un minuto) y completa de una torta al
agregar el diluyente (Jennings, 2008), da cuenta de un correcto proceso de liofilización.
“Tiempos de reconstitución excesivamente largos, la pérdida de potencia, o la formación
de una solución turbia son indicios de un proceso de liofilización inadecuada o un mal
funcionamiento del equipo de liofilización” (Jennings, 2008, pág. 11).
La recuperación de las células, sin embrago, también se ve afectada por factores como
el volumen de diluyente (procurando sea el mismo usado previo a la liofilización), el tipo
de diluyente, su temperatura, su pH, la osmolaridad (Grauer et al., 2015), la potencia del
lioprotector (Jennings, 2008), entre otras propiedades de la solución resultante.
Ops Diagnostics (2015), indican que una tasa de supervivencia superior al 50% se
considera aceptable por muchos laboratorios.
Esta evaluación permite caracterizar las diferentes propiedades físicas, químicas y el efecto
que las condiciones de almacenamiento tendrán sobre dichas propiedades. Jennings (2008) y Ticó
G. (1987), recogen algunos de las tópicos a tener en cuenta para el control de calidad de un producto
liofilizado, por ejemplo, las propiedades generales físicas de la torta (color, volumen, temperatura
de transición, textura, porosidad, densidad, contracción o colapso, estado del vial, entre otras, que
en lo posible deben ser contrastadas con las de la formulación), su grado de higroscopicidad (la
capacidad del liofilizado de absorber agua atmosférica), la velocidad de redisolución o
reconstitución, la estabilidad (de la torta, el microorganismo o el lioprotector; evaluada de forma
natural o acelerada), nivel de humedad residual, posibles contaminantes, entre otras.
Figura 5. Esquema general de un liofilizador y sus componentes. En la imagen, el liofilizador usa una
cámara de secado Tray style sin estante de taponado de tipo industrial.
Tomado de http://slideplayer.com.br/slide/84760/ el 15 de Agosto de 2015.
22
3. OBJETIVOS
Diseñar y estandarizar los protocolos para el proceso de liofilización a partir de las cinco cepas
bacterianas trabajadas con el lioprotector que presente los mejores resultados.
23
4. METODOLOGÍA
La metodología general del presente trabajo fue dividida en cuatro fases, como es ilustrado en la
Figura 6:
Fase intermedia 1
Criterios de elección de los Evaluación de los métodos de Ajustes a la liofilización
microorganismos así como de conservación (criopreservación para la generación de
los lioprotectores a evaluar. y liofilización). protocolos.
Proceso de Datado
Fase final
Figura 6. Metodología. Aunque las cuatro fases de este trabajo siguen una secuencia lógica de eventos,
algunos procesos dentro de cada fase fueron realizados en conjunto con otra.
4.1.2.2. Lioprotectores.
Para la elección de los agentes protectores y sus concentraciones en %p/v (Tabla 1), se
tuvieron en cuenta diferentes estudios: en contraposición a Hensel (1994), se tomaron
concentraciones superiores al 9% de Glucosa (Merck, Darmstadt), de forma aleatoria. En cuanto a
las concentraciones de sacarosa (Merck, Darmstadt) se tuvo en cuenta los estudios de Zayed &
Roos (2004) y Palmfeldt, Radström, & Hahn-Hägerdal (2003). Para la leche descremada
(Proleche, Colombia) se tuvieron en cuenta los estudios de Palmfeldt et al. (2003). Dichos estudios
fueron tomados como referencia teórica, aunque los microorganismos en ellos especificados, no
correspondan con los del presente trabajo.
24
4.2.1.1. Viabilidad.
Para evaluar este indicador se utilizó:
a) Conteo directo con cámara de Neubauer 1/10mm (Boeco), siguiendo la metodología
planteada por Valencia Z. (2004). Sin embargo, para obtener el número de bacterias, se
utilizó la ecuación planteada por Bastidas (2015):
N° Total de bacterias contadas × 250000
No de bacterias/ml=
Fd* × N° de cuadrados contados
g o ml de muestra
*Fd: Factor de dilución =
g o ml de muestra + g o ml de diluyente
El conteo directo con cámara de Neubauer solo se realizó previamente al método de conservación
evaluado.
UFC/ml = N° de colonias × 1 × 1
Factor de dilución ml de muestra
Los cálculos y resultados fueron expresados siguiendo la metodología planteada por
Camacho et al., (2009) y solo para los casos especiales se utilizó los planteamientos del Instituto
de Salud Pública del Gobierno de Chile (2008). Estos conteos se realizaron pre y pos en la
liofilización, y solo pos a la criopreservación, en medio Standard Plate Count (SPC) (Oxoid,
England).
4.2.1.3. Pureza.
Para evaluar este indicador se tuvo en cuenta los resultados de la estabilidad morfológica en
cada conteo de células viables realizado por el método de conteo de microorganismos mediante
técnica de extensión superficial en placa.
De cada criovial se tomó un (1) ml con micropipeta, previamente agitado con Vórtex Genie
2T (Thomas Scientific) nivel 7 (≈2240rpm) por diez (10) segundos, diluyéndolo en un tubo con
nueve (9) ml de medio SMPG (Martínez & Mayorga, 2013). Dicho tubo fue rotulado como T01 y
posteriormente fue colocado en incubadora a 25 °C ± 1°C de 18-24 horas.
4.2.3. Criopreservación.
4.2.3.1. Precriopreservación.
Pasado el tiempo de incubación, se realizó evaluación de la eficacia del método de
conservación al tubo T01, con el fin de determinar el número de células totales y viables de la
muestra. El conteo en Cámara de Neubauer se realizó solo hasta el final de los procedimientos de
preservación, por lo cual una vez preparadas las diluciones, estas fueron llevadas a nevera a 4°C ±
1°C, para evitar la generación de nuevas células.
Este procedimiento se realizó en cabina de flujo laminar (Esco biotech) para evitar la
contaminación del medio, procurando además, no sobrepasar veinte (20) minutos (Martínez &
Mayorga, 2013), desde la extracción de la alícuota de T01 y la congelación, esto con el fin de evitar
la generación de nuevas células.
Con el fin de que la concentración de lioprotector en el interior del criovial fuera lo más
exacta posible al adicionarle la alícuota del tubo T03, se utilizaron las siguientes ecuaciones para
su preparación:
27
Con un aforo de volumen total de un (1) ml en el criovial tapado (alícuota más protector), se
agitó con Vórtex nivel 2 (≈640rpm) por siete (7) segundos para su homogenización.
Posteriormente, a los crioviales se les retiraron las tapas plásticas y fueron tapados con Parafilm
(Pechiney, PM-996) esterilizado, realizando seis (6) perforaciones concéntricas en la superficie
con aguja hipodérmica 21G x 1½”. Los crioviales fueron congelados en nitrógeno líquido por
15min aproximadamente, depositados en los flask y llevados a un liofilizador (ModulyoD, Thermo
Scientific) de 24-48 horas, a una presión inferior a 0,266 mbar (200mTorr) y a una temperatura
inferior a -45°C, usando el colector múltiple (manifold).
Terminado el proceso, se retiraron los viales del liofilizador y fueron trasladados a la cámara
de flujo laminar para evitar contaminación de las muestras; allí se les retiró el Parafilm, se les tapó
con tapas estériles y se les rotuló.
Nivel de riesgo Biológico: Se utilizó una escala de colores para la clasificación de los
microorganismos infecciosos por grupos de riesgo (Tabla 3), con base al manual de
bioseguridad en el laboratorio de la OMS (2005). “Esta clasificación por grupos de riesgo
28
es exclusivamente para el trabajo de laboratorio” (OMS, 2005, pág. 1). El grupo de riesgo
biológico solo aparece en las muestras liofilizadas, no en las criopreservadas, ya que éstas
tienen rótulos distintos.
Posterior al proceso de rotulado, los crioviales fueron almacenados en una caja con
recubrimiento interno de espuma de poliuretano, a temperatura ambiente y protegido de la luz.
Tabla 3. Código de colores propuesto según la clasificación de los microorganismos infecciosos por
grupos de riesgo de la OMS.
C.C.* en
Grupos de riesgo Descripción
CM-UDFJC
Grupo de riesgo 1 Microorganismos que tienen pocas probabilidades de
Riesgo individual y provocar enfermedades en el ser humano o los animales.
poblacional escaso o nulo.
Grupo de riesgo 2 Agentes patógenos que pueden provocar enfermedades
Riesgo individual humanas o animales pero que tienen pocas probabilidades
moderado, riesgo de entrañar un riesgo grave para el personal de
poblacional bajo. laboratorio, la población, el ganado o el medio ambiente.
Agentes patógenos que suelen provocar enfermedades
Grupo de riesgo 3
humanas o animales graves, pero que de ordinario no se
Riesgo individual elevado,
propagan de un individuo a otro. Existen medidas
riesgo poblacional bajo.
preventivas y terapéuticas eficaces.
Agentes patógenos que suelen provocar enfermedades
Grupo de riesgo 4 graves en el ser humano o los animales y que se
Riesgo individual y transmiten fácilmente de un individuo a otro, directa o
poblacional elevado. indirectamente. Normalmente no existen medidas
preventivas y terapéuticas eficaces.
Agentes desconocidos. Para su manipulación referirse al
Grupo de riesgo
manual de bioseguridad en el laboratorio de la OMS
desconocido
(2005).
Nota: *Código de Color. Fuente: Adaptado de OMS. (2005). Manual de bioseguridad en el laboratorio
(pág. 1). Ginebra: Ediciones de la OMS. Recuperado de http://www.who.int/csr/resources/publications
/biosafety/CDS_CSR_LYO_2004_11SP.pdf
29
Los crioviales fueron rehidratados con 1ml de Buffer agua peptonada 0,1% a 37°C, tomando
el tiempo de reconstitución, luego incubados a 25°C ± 1°C por 30min y agitada con Vórtex nivel
2 (≈640rpm) por 7s. Posteriormente, se realizó evaluación de la eficacia del método de
conservación. El indicador de viabilidad se evaluó solo con el método de conteo de
microorganismos mediante técnica de extensión superficial en placa.
Con base a los resultados anteriores y utilizando como criterio la más alta BSR con cada
lioprotector entre las tres series durante la prueba de estabilidad natural para cada cepa, se eligió el
lioprotector y la concentración de éste, que permitió obtener un mayor número de células viables
posliofilización y que ofreció además una menor variación durante la prueba, para la liofilización
definitiva de las cepas en estudio. Dicho lioprotector se estableció además como el lioprotector
general para las bacterias del banco de liofilizados y el cepario madre de liofilizados, del Banco
Genético del laboratorio de microbiología de la Facultad del Medio Ambiente y Recursos Naturales
de la Universidad Distrital Francisco José de Caldas (CM-UDFJC).
Sobre la base de los datos obtenidos en los procedimientos anteriores, con el ánimo de
generar un protocolo funcional, aumentar el porcentaje de viabilidad a largo plazo, la estabilidad
de los liofilizados y dado que para esta etapa se partió de cultivos puros sobre medios sólidos, se
realizaron variaciones en los procesos de preliofilización, liofilización y posliofilización, para la
liofilización definitiva y almacenaje de los viales en el banco de liofilizados y el cepario madre de
liofilizados.
El proceso de destape parcial y congelación se realizó en cámara de flujo laminar para evitar
al máximo la contaminación. El transporte de los viales desde la cámara de flujo laminar al
liofilizador se hizo en recipiente de poliestireno expandido cerrado conteniendo nitrógeno líquido,
para evitar contaminación y descongelación.
4.3.1.3. Posliofilización.
Cada vial fue debidamente rotulado posterior al proceso de liofilización. Dos viales,
designados como trabajo (T) y stock (S), fueron almacenados en el banco de liofilizados (anexo 2)
a temperatura ambiente. Un tercer vial fue almacenado en el cepario madre de liofilizados (Lf)
(anexo 3) que se encuentra en el interior de una nevera a 4°C ± 1°C.
4.3.1.4. Rehidratación.
El cuarto vial de cada cepa fue rehidratado de la misma forma que los crioviales en el proceso
de rehidratación de la etapa 2 y por ende las mismas condiciones de almacenamiento.
Adicionalmente se compararon los resultados con los obtenidos en la etapa 2 para verificar posibles
cambios en la viabilidad al partir de un medio sólido.
4.3.2.2. Contaminación.
Se observaron las placas sembradas cada vez que se realizaron pruebas de viabilidad, en
búsqueda de colonias no pertenecientes a las bacterias de estudio.
31
Los viales fueron rehidratados con 1ml de Buffer agua peptonada 0,1% a 37°C, luego
incubados a 25 °C ± 1°C por 30min y agitada con Vórtex nivel 2 (≈640rpm) por 7s. Posteriormente,
se realizó evaluación de la eficacia del método de conservación midiendo viabilidad con el método
de conteo de microorganismos mediante técnica de extensión superficial en placa.
32
4.3.4.1. Medios.
Se realizó control de esterilidad al agua peptonada (Oxoid, England) (en solución de
rehidratación y para las diluciones seriadas), al caldo SMPG, al medio SPC, a las soluciones
lioprotectoras y al glicerol anhidro; dejándolos en incubación en las mismas condiciones de las
siembras de 24-48 horas luego de su esterilización. Se determinó como indicador de contaminación
cambios ópticos (turbidez u opacidad) en los medios líquidos y presencia de colonias en medios
sólidos.
4.3.4.2. Ambiente.
a) Nevera de almacenamiento de los medios y protectores.
El proceso de control de ambiente se realizó con medio SPC dejando una caja de Petri
abierta en el interior de la nevera (Thermolab, 14-E0107) evitando pasar por encima de
estas al abrir las cajas. El periodo de exposición fue de 15 a 30 minutos, dejándolos en
incubación de 24-48 horas en las mismas condiciones de incubación de las cepas de trabajo.
5. RESULTADOS
A raíz de la evaluación de la eficacia del método de conservación en cada criovial por cepa,
se recuperaron del Freezer las cepas CM-CR004, CM-CR006, CM-CR007 y CM-CR010 utilizando
el criovial SS (semistock) de cada uno. En cuanto a CM-CR005, se utilizaron los cinco (5)
crioviales dispuestos en el Freezer, pero no fue posible recuperarla, por lo cual fue reemplazada
por CM-CR009, la sexta mejor respecto al criterio de elección de cepas.
Con los datos del proceso precriopreservación de las cepas de interés correspondientes a la
colección de colorantes, consignados en el trabajo de Martínez & Mayorga (2013), en conjunto con
los datos de viables poscongelación del presente trabajo, se calculó la BSR para cada cepa (Tabla
7). Se encontró que los porcentajes de BSR son superiores al 70% luego de dos (2) años de estar
en criopreservación (Figura 8), salvo CM-CR005.
Al comparar los datos de la BSR obtenidos en este trabajo con los datos del trabajo de
Martínez & Mayorga (2013) (sólo se compararon los datos de la cepa CM-CR010, ya que las demás
cepas no figuran en su trabajo) se encontró un porcentaje inferior de recuperación
poscriopreservación por parte de las autoras, por lo cual se revisó la metodología, encontrando un
error metodológico al calcular la BSR en su trabajo. Usando los datos de “resultados prueba de
viabilidad poscongelación, tabla 19” (en Martínez & Mayorga, 2013, pág. 54), se corrigió la BSR
para esta cepa, evidenciando ser la cepa más resistente al proceso de criopreservación, entre las
evaluadas, con alrededor de 6.6% de caída luego de dos años en el Freezer (Tabla 7 y Figura 8).
100,0
90,0
80,0
70,0
Supervivencia
60,0
50,0
40,0
30,0
20,0
10,0
0,0
CM-CR004 CM-CR005 CM-CR006 CM-CR007 CM-CR009 CM-CR010
Porcetaje 72,5 0,0 75,2 88,3 76,3 91,6
Figura 8. Tasa de supervivencia (BSR) o viabilidad, de las cinco (5) cepas bacterianas de estudio luego
de la descongelación. CM-CR010 corresponde a la cepa con mayor porcentaje de recuperación (número de
células viables).
Las microfotografías tomadas a cada cepa, usando la coloración de Gram, al igual que las
fotografías de las características macroscópicas, fueron anexadas a la base de datos del Banco
Genético.
36
Características Descripción
Borde o Margen Entero. En medio muy húmedo es digitado.
Frente a luz Brillante
Forma Circular. A más de 48 horas y con medio húmedo, es irregular.
Convexa. Colonias con más de 48h y distantes unas de otras (pocas
Elevación
colonias), umbonadas.
Color Blanco.
Tamaño Pequeño (18-24h)
Superficie Lisa
Consistencia Cremosa
Grado de
Semitransparente en zona externa.
Transparencia
Pigmentación o
No
cromogénesis
Olor Mentol
Hemolisis No registra
Medio/T(°C) SPC/25°C
Características Descripción
Borde o Margen Fuertemente ondulado
Frente a luz Brillante
Forma Circular; a más de 72 horas, se irregulariza.
En meseta y ligero hundimiento central (cráter). En colonias con más
Elevación
de 72h, ligera elevación del cráter.
Beige. Conforme envejece la colonia, toma una coloración blancuzca
Color
de tonalidad café en el centro.
Tamaño Pequeña (18-24h)
Superficie Ligeramente rugosa
Consistencia Cremosa
Grado de
Opaca. Semitransparente en el borde solo en colonias de 18-24h.
Transparencia
Pigmentación o
No
cromogénesis
Olor No registra
Hemolisis No registra
Medio/T(°C) SPC/25°C
38
70,00
60,00
50,00
40,00
30,00
20,00
10,00
-
Leche Leche Leche
Glucosa Glucosa Glucosa Sacarosa Sacarosa Sacarosa
descremada descremada descremada
10% 11,7% 27% 4% 10% 15%
10% 15% 20%
BSR en serie A - - - 59,87 - 53,01 59,58 68,12 -
BSR en serie B - - - 36,19 30,76 45,57 51,00 50,39 36,19
BSR en serie C 30,76 36,19 - 36,19 30,76 34,18 34,18 58,73 47,23
Figura 9. Tasa de supervivencia (BSR) de la cepa CM-CR004 en las distintas concentraciones de los
tres lioprotectores evaluados. El número de UFC/ml antes de la desecación fue de 6 x108. Se observa que
la leche descremada 15% como mejor protector y leche descremada 10% como segundo mejor protector.
39
BSR en CM-CR006
70,00
60,00
50,00
Supervivencia
40,00
30,00
20,00
10,00
-
Leche Leche Leche
Glucosa Glucosa Glucosa Sacarosa Sacarosa Sacarosa
descremada descremada descremada
10% 11,7% 27% 4% 10% 15%
10% 15% 20%
BSR en serie A 41,73 49,62 58,50 61,19 64,15 57,31 54,30 41,73 45,13
BSR en serie B 30,46 - - 41,73 47,43 50,51 47,73 - -
BSR en serie C - - - 30,46 51,47 46,22 - - -
Figura 10. Tasa de supervivencia (BSR) de la cepa CM-CR006 en las distintas concentraciones de los
tres lioprotectores evaluados. El número de UFC/ml antes de la desecación fue de 7,3 x108. Se observa a
Sacarosa 10% como mejor protector y a Sacarosa 15% como segundo mejor protector.
BSR en CM-CR007
100,00
90,00
80,00
70,00
Supervivencia
60,00
50,00
40,00
30,00
20,00
10,00
-
Leche Leche Leche
Glucosa Glucosa Glucosa Sacarosa Sacarosa Sacarosa
descremada descremada descremada
10% 11,7% 27% 4% 10% 15%
10% 15% 20%
BSR en serie A 91,49 86,64 65,49 97,12 96,77 87,35 90,26 91,66 86,48
BSR en serie B 84,72 - 61,81 - 84,74 - 84,13 80,52 80,86
BSR en serie C 85,57 74,72 61,93 - 92,72 - 86,04 82,02 84,14
Figura 11. Tasa de supervivencia (BSR) de la cepa CM-CR007 en las distintas concentraciones de los
tres lioprotectores evaluados. El número de UFC/ml antes de la desecación fue de 1,25 x1010. Se observa
a sacarosa 10% como mejor protector y a glucosa 10% como segundo mejor protector.
40
BSR en CM-CR009
80,00
70,00
60,00
Supervivencia
50,00
40,00
30,00
20,00
10,00
-
Leche Leche Leche
Glucosa Glucosa Glucosa Sacarosa Sacarosa Sacarosa
descremada descremada descremada
10% 11,7% 27% 4% 10% 15%
10% 15% 20%
BSR en serie A 54,94 46,09 46,09 66,41 64,01 69,87 55,85 54,40 51,86
BSR en serie B 44,15 - - 63,73 60,83 62,12 49,41 40,83 -
BSR en serie C - - - - - 75,19 40,83 - 40,83
Figura 12. Tasa de supervivencia (BSR) de la cepa CM-CR009 en las distintas concentraciones de los
tres lioprotectores evaluados. El número de UFC/ml antes de la desecación fue de 1,15 x109. Se observa
a Sacarosa 15% como mejor protector y la leche descremada 10% como segundo mejor protector.
BSR en CM-CR010
100,00
90,00
80,00
70,00
Supervivencia
60,00
50,00
40,00
30,00
20,00
10,00
-
Leche Leche Leche
Glucosa Glucosa Glucosa Sacarosa Sacarosa Sacarosa
descremada descremada descremada
10% 11,7% 27% 4% 10% 15%
10% 15% 20%
BSR en serie A 82,05 - 63,03 95,21 86,34 82,07 81,53 80,22 83,32
BSR en serie B 64,24 - - 79,11 83,12 80,96 77,52 69,07 79,95
BSR en serie C 66,97 - - - 82,30 79,98 79,19 81,13 75,39
Figura 13. Tasa de supervivencia (BSR) de la cepa CM-CR010 en las distintas concentraciones de los
tres lioprotectores evaluados. El número de UFC/ml antes de la desecación fue de 6,5 x109. Se observa a
Sacarosa 10% como mejor protector y a Sacarosa 15% como segundo mejor protector.
41
Tabla 13. Lioprotectores con mejores resultados por cepa con base en el indicador de viabilidad.
Cepa Mejor Lioprotector
CM-CR004 Leche descremada 15%
CM-CR006 Sacarosa 10%
CM-CR007 Sacarosa 10%
CM-CR009 Sacarosa 15%
CM-CR010 Sacarosa 10%
Al comparar la viabilidad del cuarto vial de cada cepa bacteriana en la liofilización definitiva
con su homólogo de la etapa 2 (es decir, los liofilizados rehidratados en el mismo intervalo de
tiempo), se encontraron diferencias significativas, de aumento o disminución, de hasta el 22%,
indicado la existencia de variaciones en la viabilidad según el punto de partida de la formulación
(medio liquido SMPG vs medio sólido SPC) como lo muestra la Figura 14.
BSR comparativa
100,00
Puntos porcentuales
90,00
80,00
70,00
60,00
50,00
40,00
30,00
20,00
10,00
-
CM-CR004 CM-CR006 CM-CR007 CM-CR009 CM-CR010
Figura 14. Comparación entre las BSR de los liofilizados de Fase intermedia 1 y la liofilización
definitiva, por cepa bacteriana. Las cepas CM-CR004 y CM-CR006 fueron rehidratadas según el intervalo
temporal de la Serie A, en tanto que CM-CR007, CM-CR009 y CM-CR010 se rehidrataron según la Serie
B (ver Tabla 4).
42
Estos datos dieron cuenta de falencias en el proceso de liofilización y los mismos sirvieron
para realizar un seguimiento con miras a generar un protocolo efectivo y funcional de liofilización.
Se puede observar en la Figura 15 el proceso de transición conforme se realizaron los ajustes hasta
terminar en un producto físicamente aceptable. Sin embargo, pese a que a las propiedades físicas
de los liofilizados en la fase intermedia 1, con los cuales se realizó la evaluación de la liofilización
y la prueba de estabilidad natural, no eran los más adecuados, se decidió proseguir con ellos,
apoyado por los resultados de Vemulapalli, Bhonsle, & Kumar (2015) y dado que en la primera
rehidratación (Serie A) se obtuvo un buen nivel de recuperación de microorganismos, además el
tiempo de estudio era de tan solo dos meses, tiempo suficiente para evaluar los lioprotectores.
Figura 15. Transición física de liofilizados conforme se realizaron los ajustes. De izquierda a derecha
liofilizados de: prueba de estabilidad natural, liofilización definitiva, prueba de estabilidad acelerada.
5.5.2. Contaminación.
Se encontró contaminación durante la rehidratación de los viales de la serie A de la cepa CM-
CR006, en tanto que las siembras preliofilización no presentaban contaminación alguna, por ello
se tomaron tres viales más que iban a ser rehidratados en la serie B, encontrado colonias ajenas a
la cepa mencionada. Por tal motivo todos los liofilizados fueron descartados y reiniciado el proceso
para una nueva liofilización de esta cepa.
0,1
0,09
0,08
AUMENTO DE PESO (W%)
0,07
0,06
0,05
0,04
0,03 y = 0,0365ln(x) + 0,0058
0,02 R² = 0,9647
0,01
0
0 10 20 30 40 50 60
% vial (5,18055g)* 0 0,0724 0,0772 0,0782 0,0840 0,0869 0,0849
% Criovial (1,9018g)* 0 0,0079 0,0158 0,0315 0,0473 0,0578 0,0605
Promedio 0 0,0401 0,0465 0,0549 0,0656 0,0724 0,0727
Figura 16. Contenido de agua absorbida (%) en función del tiempo por parte del lioprotector general
en viales y crioviales. El aumento porcentual en el peso de la muestra corresponde a la cantidad de agua
absorbida por parte del lioprotector. La ecuación presentada pertenece a la línea de tendencia logarítmica,
de los valores promedio entre ambos tipos de viales y su coeficiente de determinación. *Peso inicial de los
viales y crioviales en la prueba.
47
Base de datos del Banco Genético del Laboratorio de Microbiología de la Facultad del
Medio Ambiente y Recursos Naturales de la Universidad Distrital Francisco José de Caldas.
6. ANÁLISIS DE RESULTADOS
López T. & Torres (2006) indican que las colonias corresponden al crecimiento de una única
línea celular, por tanto las características morfológicas observadas son constantes y constituyen la
primera instancia para la correcta identificación preliminar. Sin embargo, estos mismos autores
señalan que estas características no son únicas, ya que bacterias diferentes pueden expresar colonias
similares, como sucedió con CM-CR007 y 010, por ello fue preciso observar las características
morfológicas microscópicas (en lo posible deben incluirse otras pruebas como las cristal y
bioquímicas) de las cepas, pero, dada la simplicidad de las descripciones microscópicas de
Rodríguez (2013), no se tuvo como principal referencia de identidad. Aunque la morfología de la
colonia depende considerablemente de la composición del medio de cultivo y las condiciones de
incubación, cuando éstas son controladas, suelen ser invariables, teniendo, por lo general, un valor
diferencial considerable (Díaz, 2009), por lo tanto, se tomaron estas características como las
principales para la evaluación de los indicadores de estabilidad morfológica y pureza.
López T. & Torres (2006) indican que “los medios sólidos impiden el posible movimiento
de los individuos de la colonia y favorece su agrupamiento” (pág. 2). Sin embargo, se observaron
algunas variaciones, las cuales fueron causadas por la humedad presente en el medio. Esto se
observó más en las cepas CM-CR007 y 010 que, al revisar los datos de Martínez & Mayorga (2013)
y Rodríguez (2013), estas bacterias presentaban motilidad positiva y dado el medio húmedo,
tendían a formar colonias extendidas (Tablas 7 y 12) como lo indican López T. & Torres (2006)
en bacterias móviles; en tanto que sin niveles altos de humedad, las colonias eran circulares y solo
se irregularizaban en función del tiempo (envejecimiento de la colonia). Esto derivó en la
observación y descripción de características macroscópicas en diferentes tiempos y diferentes
niveles de humedad, como son descritas en las Tablas 8, 9, 10, 11 y 12, para evitar los falsos
positivos al buscar posibles contaminantes.
50
Luego de un periodo de aproximadamente sesenta (60) días que duró la prueba de estabilidad
natural, se observó que en general, de los tres lioprotectores, los resultados más bajos se obtuvieron
con glucosa en todas sus concentraciones. Esto tiene su explicación en las propiedades reductoras
que poseen los monosacáridos, ya que, como lo menciona Cox, C. S. (citado por Hensel, 1994) los
efectos letales de la desecación se han atribuido a reacciones amino-carbonilo entre las proteínas
de la membrana celular y azúcares reductores que aumentan, conforme avanza la deshidratación
(glicación); si las proteínas de membrana integrales o citosólicas se ven dañadas de forma
irreversible durante el secado, tendría un efecto negativo sobre la viabilidad (Leslie et al., 1995),
impidiendo la reconstitución de forma adecuada de las bacterias y por ende, generando muerte
celular. Sin embargo, las cepas CM-CR007 y 010 mostraron sorpresivamente una BSR bastante
alta, especialmente en la concentración más baja, incluso, para CM-CR007, la glucosa al 10% se
erige como el segundo mejor protector. Es probable que estas dos cepas presenten una
configuración diferente de sus proteínas de membrana que impida la reacción amino-carbonilo o
que las cepas cuenten con un mecanismo extra, que proteja a las proteínas de membrana o
citosólicas durante el secado (un enmascaramiento de sus proteínas).
Es conocido que en general los disacáridos, mejoran las tasas de supervivencia y aunque el
tipo de protector depende del microorganismos, la sacarosa es uno de los compuestos que se ha
descrito, funciona en una amplia gama de microorganismos (Morgan, Herman, White, & Vesey,
2006), esto puede corroborarse en los resultados de las Figuras 9 a 12 y la Tabla 13.
Para que un protector funcione, éste debe proteger la bicapa lipídica y para ello, debe existir
dentro y fuera de las células (Leslie et al., 1995; Palmfeldt et al., 2003); el tiempo antes del secado
limita el ingreso del protector a menos que las bacterias se encuentren en la fase de transición de
membrana, ya que en ésta se hace permeable y el protector fluye en contra del gradiente de
concentración (Leslie et al., 1995), reemplazando el agua intracelular, lo cual se conoce como la
hipótesis de agua de repuesto (Palmfeldt et al., 2003). Si esto se cumple, la concentración
intracelular será alta y el tiempo antes de la congelación y el secado debe ser corto, por lo tanto la
cantidad metabolizada es extremadamente pequeño (Leslie et al., 1995) y los productos polares
extracelulares serán mínimos.
Además, tanto la glucosa y la sacarosa están dentro de la categoría de protectores que forman
matrices de vidrio amorfo, este estado vítreo:
“Induce la viscosidad suficiente dentro y alrededor de una célula para detener la movilidad
molecular a un mínimo. El vidrio amorfo inerte también es capaz de retener los productos de
desecho liberados por las células dentro de la estructura de vidrio antes de la congelación, lo que
significa que no permanecen para concentrar e iniciar cambios electroquímicos irreversibles en la
membrana plasmática durante el almacenamiento”. (Morgan et al., 2006, pág. 186)
51
La retención de residuos polares por parte de estas estructuras macromoleculares, es otra propiedad
que permite alcanzar mayor resistencia a la perdida de viabilidad celular tanto en la liofilización
como en la criopreservación.
Pese a las buenas propiedades de la sacarosa, no se obtuvieron buenos resultados por parte
de todas las cepas ante esta, un ejemplo claro es la cepa CM-CR004, la cual, de hecho, ante los
glúcidos puros utilizados (glucosa y sacarosa) no presentó resultados aceptables. Morgan et al.
(2006), mencionan (teniendo como referencia la investigación de Buitink et al.) que la leche
descremada es un lioprotector eficiente debido a que las proteínas presentes en esta sustancia, son
más estables y juegan un importante papel en la formación del estado vítreo, lo cual induce a pensar,
que una óptima mezcla de proteínas y azucares permite una protección más eficiente. Esta
posibilidad correspondería a los resultados obtenidos, donde la concentración de los componentes
de la leche descremada serían propicios para la cepa CM-CR004, en tanto que para las demás cepas
serían más bajas o más altas de lo propicio. Resulta inconveniente entonces que la leche
descremada utilizada indica el porcentaje de glúcidos y proteínas que la componen, pero no
establece cuales son estos, pudiendo ser positivos o negativos para la liofilización.
En general, los cultivos líquidos ofrecen un mayor número de células viables (Ops
Diagnostics, 2015), sin embargo, la viabilidad depende múltiples factores, incluyendo la fase de
crecimiento en que se encentren los microorganismos. El medio SMPG está diseñado para limitar
el crecimiento de las bacterias al agotarse rápidamente la fuente de carbono (glucosa); una bacteria
de rápido crecimiento, entrará en fase estacionaria en un lapso de 24-48 horas en este medio, una
de lento crecimiento, al cabo del mismo tiempo, estará en fase log; no obstante en el medio SPC,
los nutrientes tardan más tiempo en agotarse y por tanto al cabo de 24-48 horas, todas las bacterias
estarán en fase log. Las cepas CM-CR007 y 010 son cepas de rápido crecimiento, mientras que
CM-CR004, 006 y 009 son de crecimiento un poco más lento (datos obtenidos del conteo con
cámara de Neubauer no incluidos en el presente estudio).
Morgan et al., 2006 indican que la fase estacionaria induce variedad de estados fisiológicos
en las bacterias, relacionado generalmente con la privación de carbono y el agotamiento de las
fuentes de nutrientes disponibles, desencadenando una respuesta ante el estrés para permitir la
supervivencia de la población celular. Esta misma respuesta se observa ante condiciones como la
52
desecación y las temperaturas menos propicias para su crecimiento, por ello es considerada la mejor
fase de crecimiento para lograr mayores tasas de supervivencia en la liofilización. Sin embargo, la
fase de crecimiento óptima para la supervivencia en la desecación es dependiente en gran medida
del tipo de organismo (Morgan et al., 2006, pág. 185). Lo anterior en contraste con los resultados
de la Figura 14, indica que CM-CR007 y 010 tuvo una tasa de supervivencia mejor en medio
líquido al encontrarse en fase estacionaria cuando fue liofilizada, en tanto que en medio solido se
encontraba en fase log; así mismo las cepas CM-CR004, 006 y 009 aumentaron su tasa de
supervivencia debido a que se encontraban en la fase log temprana. No obstante se desconoce la
tasa de supervivencia de estas cepas en la fase estacionaria, pudiendo ser mayor o menor.
Las Tablas 15 y 16 que resumen las características tenidas en cuenta para los diferentes
liofilizados, muestran que el color, textura, brillo y fractura de viales, están dentro de los
parámetros esperados de acuerdo a lo establecido por Jennings (2008) en una liofilización correcta
con las formulaciones utilizadas, no obstante se detectaron variaciones posliofilización
(almacenaje) en el aspecto de la torta y el encogimiento de algunos viales. Inicialmente se pensó
en una falla durante el tiempo de almacenamiento, dado que los liofilizados más afectados fueron
de las series B y C, sin embargo al encontrar un liofilizado de la serie A de la cepa CM-CR004 y
los resultados de la prueba de estabilidad acelerada, se determinó que la causa de fallo yacía en la
obtención de humedad por parte del producto liofilizado. La prueba de higroscopicidad (Figura 16)
muestra que un vial sellado al vacío absorbe humedad inmediatamente al ser expuesto al ambiente,
y dado que los viales usados en la prueba de estabilidad acelerada y de estabilidad natural no fueron
sellados al vacío, estos habían absorbido humedad desde el momento mismo en que fueron tapados
al terminar la liofilización; esto sucede debido a que la sacarosa es altamente higroscópica (de igual
forma la glucosa pero con un grado de higroscopicidad más bajo que la sacarosa) debido a la
53
“facilidad que tienen sus iones hidroxilo de establecer puentes de hidrógeno con el agua” (Badui
Dergal, 2006, pág. 73). “Para reducir el número de moléculas de agua el proceso de liofilización y
el sellado de los viales al vacío debe haber sido exitoso y así obtener un producto con el contenido
de humedad deseado” (Grauer et al., 2015, pág. 78), por lo cual se descarta la utilización del
instrumento manifold para la liofilización cepas en el Banco Genético.
Ops Diagnostics (2015) sugiere que los viales utilizados en la liofilización siempre deben ser
de vidrio, ya que el vapor de agua atmosférico se puede difundir a través de los tubos de plástico y
por ende las muestras secas terminarían absorbiendo agua. Esto se comprobó con la utilización de
crioviales, que no solo absorbieron vapor de agua por no ser sellados al vacío, sino que además en
la serie C, casi todos los liofilizados con formulaciones de leche descremada dañados presentaban
cambios de coloración (la presencia de humedad se ve marcada por el cambio a una coloración
oscura como lo muestra la Tabla 15), o una marcada reducción en el volumen respecto al volumen
inicial de los mismos, observable en las formulaciones de sacarosa y glucosa (independientemente
de la concentración). Esto también se ve correlacionado con la pérdida de viabilidad de los
liofilizados correspondientes (Figuras 9 a 13) ya que como como menciona Jennings (2008), la
humedad es la principal responsable en la pérdida de viabilidad en el producto liofilizado,
reduciendo la vida útil de los organismos. La obtención de agua, implica un retroceso del proceso
de liofilización, el daño de la matriz formada, el flujo de los residuos extracelulares polares, es
decir la reactivación del organismo, ya que el agua constituye el solvente universal que apoya la
actividad bioquímica, el metabolismo (Adams, 2007); finalmente la muerte celular al agotarse esta.
Al elegir la sacarosa como lioprotector general del banco de liofilizados, hay que tener en
cuenta las recomendaciones de Zayed & Roos (2004), quienes indican que el uso de solo sacarosa
no preserva la viabilidad durante el almacenamiento a largo plazo, se sugiere en múltiples estudios
además, el uso concomitante de mezclas de lioprotectores y el almacenamiento a 4°C ± 1°C en la
oscuridad (Ops Diagnostics, 2015).
Se siguió los procedimientos de documentación establecidos por Martínez & Mayorga (2013)
para la criopreservación y la elaboración de los nuevos protocolos de liofilización, encontrando
como lo menciona Gonzáles et al. (2006), que es necesario contar con sistemas de documentación
eficiente, además contar con duplicados de la información en medios físicos y magnéticos, evitado
la perdida de información (Montes de Oca et al., 2008) y el rápido acceso a la misma.
54
7. CONCLUSIONES
De acuerdo a la evaluación del método de conservación realizada con los tres indicadores
(viabilidad, pureza y estabilidad morfológica), la sacarosa es el mejor lioprotector de los tres
evaluados, siendo la concentración al 10%p/v la más óptima. No obstante, su alto grado de
higroscopicidad resulta el mayor inconveniente para el almacenamiento a largo plazo, por ello es
indispensable que cada vial usado sea sellado herméticamente y al vacío. El segundo mejor
protector corresponde a la leche descremada, aunque no se determinó la concentración más óptima.
En cuanto a la glucosa, al comparar los resultados de Hensel (1994) y el presente trabajo, se observa
que, pese a no ser un buen lioprotector, concentraciones de glucosa entre el 6% y el 10% p/v son
funcionales, aunque por lo general el porcentaje de supervivencia es menor al 50%.
Es importante mantener actualizado los diferentes medios físicos y magnéticos donde reposa
la información de las colecciones y los microorganismos en ellos, dado que estos datos son vitales
para la existencia del Banco Genético y la información se puede perder.
La falta de la identificación hasta cepa (al menos hasta género) de los microorganismos
presentes en el banco genético, limita la información para entender los fenómenos relacionados a
los procesos de conservación y mejorar las tasas de supervivencia de cada individuo.
55
8. RECOMENDACIONES
Existen parámetros que afectan la viabilidad del producto liofilizado que no fueron tenidos en
cuenta en este trabajo o que fueron tratados superficialmente, como la edad del cultivo, la
concentración celular, entre otros. Se propone el estudio de los parámetros faltantes como eje inicial
para realizar ajustes al protocolo de liofilización con el fin de lograr altas tasas de supervivencia
durante un mayor tiempo de almacenaje.
La prueba de estabilidad acelerada presenta una excelente oportunidad para analizar datos a largo
plazo, pero casi no hay estudios al respecto con microorganismos, por ello se sugiere la creación
de un modelo matemático para que sea funcional esta prueba, lo cual generaría datos muy
importantes de supervivencia en el tiempo.
Es necesaria la creación de una plataforma online del banco genético una vez este cuente con la
identificación de los organismos contenidos, así mismo, es necesario un programa especializado
para la base de datos del banco genético distinto a Access, preferiblemente que obedezca a una
creación propia de la Universidad Distrital Francisco José de Caldas.
Es necesaria la creación de una pasantía anual para curaduría del Banco Genético, ya que existen
colecciones no registradas debido a que los investigadores donantes suelen pasar por alto el registro
de datos en la recepción de cepas. Además se necesita mantener y revisar las colecciones que se
encuentran almacenadas, como aquellas que sean donadas al Banco Genético en el futuro.
56
9. REFERENCIAS
Arcos, M. L., Ossa, F., & Díaz, T. E. (2004). Criopreservación de aislados nativos de la bacteria
ruminal Fibrobacter succinogenes. Revista Corpoica, 5(1), 60-63.
Badui Dergal, S. (2006). Química de los alimentos (Cuarta ed.). México: PEARSON
EDUCACIÓN.
Camacho, A., Giles, M., Ortegón, A., Palao, M., Serrano, B. & Velázquez, O. (2009). Técnicas
para el Análisis Microbiológico de Alimentos. (Segunda ed.). México: Facultad de
Química, UNAM.
Durães Sette, L., Pagnocca, F. C., & Rodrigues, A. (2013). Microbial culture collections as pillars
for promoting fungal diversity, conservation and exploitation. Fungal Genetics and
Biology, 60, 2-8. doi: 10.1016/j.fgb.2013.07.004
Gonzáles, R. A., de Oca Martínez, N. M., Riverón, Y., & Núñez, A. (2006). Aseguramiento de la
Calidad en las Colecciones de Cultivos Microbianos (monografía). Dirección de Calidad.
Centro Nacional de Sanidad Agropecuaria (CENSA), La Habana, Cuba.
57
Grauer, A., Grunberg, K., & Zardo, S. (2015). Puesta a punto de un protocolo de liofilización para
la creación de bancos bacterianos (Tesis de pregrado). Universidad ORT, Uruguay.
Instituto de Salud Pública del Gobierno de Chile. (2008). Procedimiento recuento aerobios en
placa método bam online 2001. Recuperado el 2015, de Instituto de Salud Pública del
Gobierno de Chile: http://www.ispch.cl/lab_amb/doc/microbiologia_alimentos/PRT-
023.pdf
Ivshina, I. B., & Kuyukina, M. S. (2013). Turning Russian specialized microbial culture collections
into resource centers for biotechnology. Trends in Biotechnology, 31(11), 609-611.
doi:10.1016/j.tibtech.2013.08.002
Jennings, T. A. (2008). Lyophilization, Introduction and Basic Principles. New York: Informa
Healthcare USA, Inc.
Leslie, S. B., Israeli, E., Lighthart, B., Crowe, J. H., & Crowe, L. M. (1995). Trehalose and Sucrose
Protect Both Membranes and Proteins in Intact Bacteria during Drying. Applied and
environmental microbiology, 61(10), 3592–3597.
López T., L., & Torres, C. (2006). TRABAJO PRACTICO Nº 6, Identificación. Argentina:
Universidad Nacional del Nordeste.
Manzi, L. V., & Mayz, J. C. (2003). Valorando los microorganismos. Revista de la sociedad
Venezolana de microbiología, 23(1), 85-88.
Martínez Benítez, H. L., & Mayorga Burgos, L. P. (2013). Implementación de un sistema para el
mantenimiento de cepas de bacterias en el laboratorio de microbiología de la Facultad del
Medio Ambiente y Recursos Naturales de la Universidad Distrital Francisco José de
Caldas (Tesis de pregrado). Universidad Distrital Francisco José de Caldas, Bogotá,
Colombia.
Montes de Oca, N., Gonzáles, R. A., Riverón, Y., Nuñez, A., Villoch, A., & Rodríguez, N. (2008).
Establecimiento y desarrollo de la colección de cultivos del CENSA. Revista de Salud
Animal, 30(1), 17-24.
58
Morales-García, Y.-E., Duque, E., Rodríguez-Andrade, O., de la Torre, J., Martínez-Contreras, R.-
D., Pérez-y-Terrón, R., & Muñoz-Rojas, J. (2010). Bacterias Preservadas, una Fuente
Importante de Recursos Biotecnológicos. BioTecnología, 14(2), 11-29.
Moreira, T., Gutiérrez, A., & Delgado, H. (1994). Aspectos físicos relacionados con los aditivos
en el proceso de liofilización. Papel relevante de los carbohidratos. Biotecnología aplicada,
11(2), 113-119. Recuperado de
http://elfosscientiae.cigb.edu.cu/PDFs/Biotecnol%20Apl/1994/11/2/p%20113%20-
%20119%20.pdf
Morgan, C., Herman, N., White, P., & Vesey, G. (2006). Preservation of micro-organisms by
drying; A review. Journal of Microbiological Methods, 66(2), 183–193.
doi:10.1016/j.mimet.2006.02.017
Nireesha, GR., Divya, L., Sowmya, C., Venkateshan, N., Niranjan Babu, M., & Lavakumar, V.
(2013). Lyophilization/Freeze Drying - An Review. International journal of novel trends
in pharmaceutical sciences, 3(4), 87-98. Recuperado de
http://www.ijntps.org/File_Folder/0047.pdf
Olalde Portugal, V., & Aguilera Gómez, L. I. (1998). Microorganismos y Biodiversidad. Terra
Latinoamericana, 16(3), 289-292.
Ops Diagnostics. (2015, 27 de Agosto). Bacteria Freeze Drying Protocol. USA: Ops Diagnostics.
Recuperado de http://opsdiagnostics.com/notes/ranpri/rpbacteriafdprotocol.htm
Palmfeldt, J., Radström, P., & Hahn-Hägerdal, B. (2003). Optimisation of initial cell concentration
enhances freeze-drying tolerance of Pseudomonas chlororaphis. Cryobiology, 47, 21–29.
doi: 10.1016/S0011-2240(03)00065-8
Pírez, M., & Mota, M. (2006). Morfología y estructura bacteriana. En D. d. UdelaR., temas de
bacteriología y virología médica (Segunda ed., págs. 23-42). Montevideo, Uruguay:
Oficina del Libro FEFMUR.
Pontón, J., Moragues, M., Gené, J., Guarro, J., & Quindós, G. (2002). Hongos y Actinomicetos
Alergénicos. Bilbao: Revista Iberoamericana de Micología. Recuperado de http://hongos-
alergenicos.reviberoammicol.com
Sánchez L., L. C., & Corrales R., L. C. (2005). Evaluación de la congelación para conservación de
especies autóctonas bacterianas. NOVA, 3(4), 21-29.
Stromberg, P. M., Dedeurwaerdere, T., & Pascual, U. (2013). The heterogeneity of public ex situ
collections of microorganisms: Empirical evidence about conservation practices, industry
spillovers and public goods. Environmental Science and Policy, 33, 19-27.
doi:10.1016/j.envsci.2013.04.003
Ten Kate, K. (1995). Access to ex-situ Collections: Resolving the Dilemma?'. Global Biodiversity
Forum. Jakarta: IUCN.
Valencia Z., Hernando A. (2004). Manual de prácticas de microbiología básica (Primera ed.).
Colombia: Editorial Universidad Nacional.
Vemulapalli, V., Bhonsle, S., & Kumar, V. (2015). Effect of freezing rate on the morphology of the
freeze-dried product. Recuperado el 2015, de Pharmaceutics International, Inc.:
http://www.pharm-int.com: http://www.pharm-int.com/AAPS/Viswatej.pdf
Weng Alemán, Z., Díaz Rosa, O. E., & Álvarez Molina, I. (2005). Conservación de
microorganismos: ¿qué debemos conocer? Revista Cubana de Higiene y Epidemiología,
43(3), 1-4. Recuperado de http://www.redalyc.org/articulo.oa?id=223214847006
WFCC. (2010a). For the establishment and operation of collections of cultures of microorganisms
[Recomendaciones para el establecimiento y funcionamiento de colecciones de cultivos de
microorganismos]. Belgium: World Federation for Culture Collections, Executive Board.
Recuperado de http://www.wfcc.info/guidelines/
WFCC. (2015). WDCM (World Data Center for Microorganism), CCINFO: WDCM (World Data
Center for Microorganism), CCINFO Web Site. Recuperado de
http://www.wfcc.info/ccinfo/collection/col_by_country/c/57/
Zayed, G., & Roos, Y. H. (2004). Influence of trehalose and moisture content on survival of
Lactobacillus salivarius subjected to freeze-drying and storage. Process Biochemistry, 39,
1081–1086. doi: 10.1016/S0032-9592(03)00222-X
60
10. BIBLIOGRAFÍA
Burguet-Lago, N., Sierra-Prado, N., & Brito-Godoy, Lázaro C. (2012). Conservación de cepas
microbianas por el método de liofilización para el control microbiológico en Laboratorios
Liorad. Revista CENIC Ciencias Biológicas, 43(3), 1-4.
Burguet-Lago, N., Sierra-Prado & Acosta E., Miguel. (2014). Evaluación de una formulación para
la conservación de cepas de Pseudomona aeruginosa. Revista CENIC Ciencias Biológicas,
45(1), 51-56.
Falcon S., Carlos I. (2015, 20 de Marzo). Laboratorista químico [web log post]. Recuperado de
http://estudiantesenlaboratoristaquimico.blogspot.com.co/2014/08/morfologia-de-
colonias.html
Godínez, Silvia & Calderón, Marlene. (2008). Métodos alternativos para la preservación de hongos
filamentosos. Ciencia y Tecnología de Alimentos, 18 (2), 31-37. Recuperado de
http://www.oceandocs.org/bitstream/handle/1834/4895/Silvia%20Godines.pdf?sequence=
1
Keith, S. C. Jr. (1913). Factors influencing the survival of bacteria at temperatures in the vicinity
of the freezing point of water. Science, 37(6), 877-879. Recuperado de
http://www.jstor.org/stable/1637900?seq=2#page_scan_tab_contents
Parra Huertas, S. L., Pérez Casas, M. M., Bernal Morales, M., Suárez Moreno, Z., Castaño, M., &
Dolly. (2006). Implementación y evaluación de dos métodos de conservación y generación
de la base de datos del banco de cepas y genes del Instituto de Biotecnología de la
Universidad Nacional de Colombia (IBUN). NOVA, 4(5), 39-49.
Pehkonen K.S., Roos Y.H., Miao S., Ross R.P., & Stanton C. (2008). State transitions and
physicochemical aspects of cryoprotection and stabilization in freeze-drying of
Lactobacillus rhamnosus GG (LGG). Journal of Applied Microbiology, 104(6), 1732-1743.
doi:10.1111/j.1365-2672.2007.03719.x
Postgate, J. R., & Hunter, J. R. (1961). On the Survival of Frozen Bacteria. Microbiology, 26, 367-
378. doi: 10.1099/00221287-26-3-367
Sánchez de Prager, M., Marmolejo de la Torre, F., & Bravo O., Nelson. (2000). Microbiología
aspectos fundamentales. Cali, Colombia: Feriva S.A.
Sánchez S., Paulino. (2014). Aislamiento de una bacteria ruminal celulolítica y su capacidad para
mejorar la degradación in vitro de sustratos celulolíticos (Tesis doctoral). Colegio de
Postgraduados, Montecillos, Texcoco, Edo. De México.
U.S. Food and Drug Administration (FDA). (2001). Bacteriological Analytical Manual Online
USA: Center for Food Safety & Applied Nutrition. Recuperado de
http://www.fda.gov/Food/FoodScienceResearch/LaboratoryMethods/ucm2006949.htm
61
Valenzuela, Hans L. D., & Ortiz, Reynaldo L. R. (2007). Estabilidad de la glucosa oxidasa en
sistemas amorfos formados por los disacáridos sacarosa, maltosa y trehalosa. Química
Nova, 30(7), 1633-1637. Recuperado de
http://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0100-
40422007000700025&lng=en&tlng=es.
11. ANEXOS
Cepa CM-XX00Xa
En conjunto, las publicaciones de Valencia Z. (2004), Pírez & Mota (2006) y Díaz (2009), ofrecen
un amplia gama de características macroscópicas para bacterias y hongos. Este formato puede ser
adaptado para algas de igual forma. Es importante siempre señalar las condiciones en que se hace
la descripción, pues las características pueden variar en función de la edad del cultivo, la humedad
del medio, la temperatura de crecimiento, el pH…
a.
Código asignado para la cepa en la colección y la base de datos.
*Borde, superficie y forma son características diferentes, aunque algunos autores las combinen.
**Esta tabla no debe sobrepasar el tamaño de una hoja tamaño carta.
***Solo se debe poner fotografías de las características mencionadas en los formatos si son de muy
buena calidad, de lo contrario es mejor prescindir de ellas. Aun así, pueden ser anexadas a la base
de datos del Banco Genético (funcionan como referencia).
63
Bandeja de liofilizados.
Está hecha de poliestireno expandido, viene con 100 compartimientos individuales para un máximo
de 100 viales por bandeja.
20 40 60 80 100
10 30 50 70 90
11 31 51 71 91
01 21 41 61 81
F1 F2 F3 F4 F5 F6 F7 F8 F9 F10
65
J K L
8 16 24 8 16 24 8 16 24
1 9 17 1 9 17 1 9 17
F1 F2 F3 F1 F2 F3 F1 F2 F3
J: Hongos
K: Bacterias
L: Algas
F: Fila
Números: compartimento correspondiente a cada vial. La numeración va en zigzag.
66
Termómetro
Tapa de sello
hermético
Cámara
Viales interna
Malla de
Agua o s/n salina soporte
Organigrama de
la base de datos
Tablas de
datos
(equivalente a
los formatos
de registro con
información
más detallada)
68
Ubicación de la
presente ficha
Otras ubicaciones
de fichas
Resumen del
proyecto
Bioquímicas Otras
Microscópica Microscópica
Preliofilización Posliofilización
Caracterización
Macroscópica Macroscópica
Preliofilización Posliofilización
Observaciones
Preliofilización Posliofilización
Bioquímicas
Control
Pruebas Preliofilización Posliofilización
de
Cristal
Calidad
Otras Pruebas Preliofilización Posliofilización
Observaciones
Utilización de la cepa
por parte del
solicitante
Encargado del Cepario Recibe Autoriza
Nombre Nombre Firma
Firma Firma C.C.
C.C. C.C.
Nota. Registro fotográfico y demás información en la base de datos
73
Primera Edición
Editado por
Andrés V. Castañeda R.
Manual de procedimientos de conservación para el
Banco Genético del Laboratorio de Microbiología,
Facultad del Medio Ambiente y Recursos Naturales,
Universidad Distrital Francisco José de Caldas.
Diseño y diagramación
Andrés Vicente Castañeda Rangel
avicent29@gmail.com
Autoría y Edición
Andrés Vicente Castañeda R.
2015
CONTROLES DE ESTERILIZACIÓN 23
Medios. 23
Ambiente. 23
Nevera de almacenamiento de los medios y protectores. 23
Cabina de flujo laminar. 23
Técnicas de siembra y manipulación de elementos. 24
ELIMINACIÓN DE RESIDUOS 24
Protección personal. 26
Procedimientos. 27
Áreas de trabajo. 27
Capacitaciones. 27
REFERENCIAS 28
IV
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Dilución en serie. 7
Figura 2. Conteo directo. 8
Figura 3. Conteo en bacterias. 8
Figura 4. Extensión de la muestra con el asa de Drigaslky. 10
Figura 5. Contador de colonias. 11
Figura 6. Rótulo opcional para tubos inclinados. 19
Figura 7. Rótulos para las cajas del Freezer. 19
Figura 8. Rótulos para los crioviales. 19
Figura 9. Rótulos creados para los viales liofilizados. 20
LISTA DE TABLAS
Tabla 1. Equipos y material a usar según proceso. 4
Tabla 2. Composición medio SMPG. 5
Tabla 3. Compuestos de macroelementos y microelementos. 5
Tabla 4. Reactivos, medios y protectores usados en los diferentes
métodos de conservación de microorganismos. 6
Tabla 5. Matriz para el conteo en Cámara de Neubauer. 9
Tabla 6. Código de colores propuesto según la clasificación de los
microorganismos infecciosos por grupos de riesgo de la OMS. 21
V
INTRODUCCIÓN
Este manual representa en conjunto el trabajo a través del tiempo de distintos
investigadores que con sus proyectos de investigación han sentado los pilares
para la formación del Banco Genético del Laboratorio de Microbiología,
Facultad del Medio Ambiente y Recursos Naturales, Universidad Distrital
Francisco José de Caldas (CM-UDFJC ), cuyo objetivo consiste en generar un
espacio dedicado a la conservación y suministro asequible de
microorganismos para docencia e investigación, que permita a la comunidad
académica de la Universidad Distrital Francisco José de Caldas fortalecer y
generar mayores aportes en conocimientos microbiológicos en las áreas de
biorremediación, biodegradación y biotecnológica para el país.
VI
Protocolos para la
conservación de
microorganismos
RECEPCIÓN DE CEPAS
Para que una cepa ingrese al Banco genético, debe contar con las siguientes
condiciones mínimas de recepción:
2
VERIFICACIÓN DE CEPAS
El personal encargado del Banco Genético, debe realizar una verificación de la
pureza de la cepa, esta debe efectuarse por medio de un aislamiento a partir del
cultivo de entrada, sobre una o más cajas de Petri con el medio de cultivo, el
tiempo y temperatura de incubación especificados por quien hace la donación.
Así mismo a partir de este subcultivo, se debe realizar la evaluación de la efica-
cia del método de conservación para verificar la información dada por el investi-
gador donante
3
EQUIPOS E INSTRUMENTAL
Se menciona en la Tabla 1 los principales materiales de laboratorio y equipos
que se requieren para los procesos de preservación.
4
MEDIOS, REACTIVOS Y PROTECTORES
El Banco Genético cuenta con medios, reactivos y protectores generales
definidos para los métodos de preservación, manutención y recuperación de
microrganismos. Estos se describen a continuación y se clasifican de acuerdo al
método de conservación en la Tabla 4.
Medios.
CALDO SMPG: Este medio es empleado para el crecimiento del inóculo inicial y
en la formulación de la criopreservación. Su composición se muestra en las
Tablas 2 y 3.
Tabla 2. Composición medio SMPG.
Compuesto Porcentaje
Macroelementos 7.6%
Microelementos 0.76%
Peptona 1%
Glucosa 0.1%
SPC (Standard Plate Count): Este medio se utiliza para la técnica de evaluación
de la eficacia del método de conservación. También puede ser utilizado para el
mantenimiento de las cepas.
5
Reactivos.
Tinción Gram: La batería de reactivos para la Tinción de Gram se utiliza en la
evaluación de la eficacia del método de conservación.
Alcohol acetona: Este reactivo se utiliza adicionalmente para limpiar la
cámara de Neubauer y la laminilla de cuarzo.
Agua destilada: Se utiliza en todos los procedimientos para la preparación de
medios, la descongelación y especialmente en la evaluación de la eficacia del
método de conservación.
Alcohol: Para desinfección en todos los procedimientos (70%) o para
mecheros (95%).
Aceite de inmersión: Se utiliza para la evaluación del método de conservación
durante las observaciones microscópicas.
Nitrógeno Líquido: Se utiliza para congelar las formulaciones en la liofilización
Protectores generales.
Crioprotector: Se utiliza glicerol anhidro para la criopreservación, en
proporción 67%v/v respecto al criovial.
Lioprotector: Se utiliza una solución de Sacarosa 10% p/v para las
formulaciones en la liofilización bacteriana. En hongos se utiliza leche
descremada al 12% p/v. No se tiene detalles de lioprotector óptimo en algas.
Agua destilada SI SI SI
Alcohol NO SI SI
Aceite de SI SI SI
inmersión
Nitrógeno Líquido NO NO SI
SMPG SI SI NO
SPC SI SI SI
Medios
AN SI OPCIONAL OPCIONAL
Medios OPCIONAL OPCIONAL OPCIONAL
específicos
Agua peptonada SI SI SI
Glicerol anhidro NO SI NO
Protector
Sacarosa NO NO SI
10%p/v
Nota: Dado que en la refrigeración, criopreservación y liofilización se realiza la
evaluación del método de conservación, se incluyen aquí los reactivos implicados en
dicha evaluación.
6
EVALUACIÓN DE LA EFICACIA DEL
MÉTODO DE CONSERVACIÓN
Indicador uno. Viabilidad.
Conteo directo con cámara de Neubauer (1/10mm):
Se parte de un tubo de dilución (Figura 1) cuando la carga microbiana del
cultivo inicial es muy alto, el cual tiene por lo general un tiempo de incubación
de 24-48 horas dependiendo del tipo de microorganismo.
Figura 1. Dilución en serie. Las pipetas o puntas de micropipeta deben ser estériles
usando una nueva en cada transferencia. El diluyente es agua peptonada al 0,1% p/v.
Agite el tubo de dilución seleccionado con Vórtex nivel 7 (≈2240rpm) por 5s,
tomando con una micropipeta una alícuota de 10µl y depositándola
suavemente (en vertical) al borde de la laminilla, dejando que se cargue por
capilaridad de forma homogénea (Figura 2-A). Posteriormente lleve al
microscopio, enfocando desde el menor aumento hasta él objetivo 40x, al
tiempo que ajusta la intensidad lumínica para poder observar las líneas de la
cámara y las células al tiempo.
7
Figura 2. Conteo directo. A. Utilización de la cámara de Neubauer: 1. posición de la
laminilla; 2. posición de la punta para el deposito de la muestra. B. esquema general de
la cámara de Neubauer. Adaptado de Bastidas (2015). http://www.celeromics.com/es/
resources/docs/Articles/Formula-Camara-Neubauer-Concentracion.pdf & Universitat de
Barcelona (2015). http://www.ub.edu/LabFisio/images/stories/FisAnimalBiologia/
Sangre/contadorToma.png
8
Es importante resaltar que las bacterias que estén unidas se contarán como
una. Una vez obtenido el número total de células, se realizaran los cálculos
correspondientes a los cuadros utilizados. Para obtener el número de bacterias,
se utiliza la ecuación planteada a partir de Bastidas (2015):
N° Total de bacterias contadas × 250000
N° de bacterias/ml=
Fd* × N° de cuadrados contados
g o ml de alícuota
*Fd: Factor de dilución = g o ml de alícuota + g o ml de diluyente
Tenemos un tubo con cultivo en medio líquido (10ml) de 36 horas, este será
nuestra muestra inicial. Se desea saber la cantidad de bacterias en el interior de
esta muestra y al observarla se ve bastante turbio el tubo, por lo cual se hacen
diluciones seriadas hasta 10-8 con alícuotas de 1ml en 9ml de diluyente. Se
realiza el procedimiento descrito en las páginas anteriores, haciendo un solo
conteo. Al organizar los datos en una matriz (Tabla 5) obtenemos que:
Tabla 5. Matriz para el conteo en Cámara de Neubauer.
Cuadro A B C D E Total Fd
Conteo 1 4 3 2 4 3 16 10-7
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Aplicando la ecuación para bacterias anteriormente mostrada tenemos que:
N° de bacterias/ml= 16 × 250000
10-7 × 5
= 8*1012 bacterias/ml
N° de células/ml= 16 × 10000
10-7 × 5
= 3,2*1011 células/ml
-Si se quieren datos más fiables, se pueden hacer hasta cinco conteos de la misma alícuota o
poner en la cámara cinco alícuotas diferentes y contarlas una vez cada una y luego promediar
las cifras.
-Al realizar el conteo en la cámara de Neubauer obtenemos el total aproximado de células
presentes en la dilución utilizada y depende esto en gran medida de nuestra objetividad al
diferenciar entre el microorganismo esperado y/o las impurezas que pueda contener la
muestra, por lo cual no es 100% exacto y no indica las células viables.
A B
90°
10
Deje secar por mínimo 15min y lleve a incubación en posición invertida
(excepto en siembra de algas donde se sugiere no invertir la caja). Según el tipo
de organismo, las condiciones de incubación para la lectura de las cajas son:
-La siembra por tubo, se hace por duplicado o triplicado a criterio del investigador.
-Generalmente se toman las diluciones 10-5, 10-6 y 10-7. Sin embargo, si se trata de cepas
descongeladas tome las diluciones 10-4, 10-5 y 10-6 o si son rehidratadas 10-3, 10-4 y 10-5.
-Para esterilizar el asa de Drigalsky introducirla en etanol 70%, flamear, esperar a que el
alcohol se consuma. Deje enfriar por 15s al aire en el interior de la cabina de flujo laminar, por
último palpe rápida y suavemente el medio con el asa por ambos lados (cuente hasta 10 por
cada lado) antes de empezar a extender, para enfriar totalmente.
-Puede usarse una siembra en profundidad u otro método para el conteo de viables en lugar
de la siembra en superficie. Sin embargo, los demás métodos de conteo limitan la evaluación
del indicador dos.
-Si al cabo de 30min las cajas no han secado, el medio tiene un exceso de humedad y debe
repetirse el procedimiento descartando las cajas en igual condición.
-Con la punta de la micropipeta no toque el medio.
-Siempre use guantes y desinféctelos constantemente durante los procedimientos.
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En esta prueba se cuentan las cajas con un rango de UFC entre 25-250, al
suponer que cada célula forma una colonia. Para el cálculo de UFC/ml utilizamos
una adaptación de la fórmula de Valencia Z.(2004):
N° de colonias
UFC/ml = (promedio entre las × Inverso del factor × Inverso del volumen
cajas por dilución) de dilución de alícuota
-La metodología y los criterios de elección de cajas así como el rango, son seguidas de
Camacho et al., (2009) y solo para los casos especiales (ejemplo, todas las placas por dilución
por encima o debajo de rango) se utiliza los planteamientos del Instituto de Salud Pública del
Gobierno de Chile (2008).
-Estos conteos se realizan pre y pos tanto en la liofilización como en la criopreservación.
-El inverso del volumen de alícuota corresponde a una medida de corrección obligatoria para
la siembra en superficie, ya que en la práctica se aumenta en 1/10 el factor de dilución al
sembrar 0,1ml (100µl) del tubo de dilución seleccionado.
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Tinción de Gram (características microscópicas).
Posterior al procedimiento anterior, se realice una “coloración de Gram de
tres (3) colonias diferentes para comprobar la compatibilidad morfológica con el
microorganismo esperado” (Sánchez & Corrales, 2005, pág. 24). En el caso de
hongos, realice una coloración simple con azul de metileno o coloraciones
diferenciales indicando el reactivo usado.
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RECUPERACIÓN DE LOS
MICROORGANISMOS
Criopreservados (Descongelamiento).
Se toma un criovial (Semistock preferiblemente), sometiéndolo a una
temperatura de 37°C (Arcos, Ossa, & Díaz, 2004) en baño serológico, con agua
destilada, hasta su descongelación, por aproximadamente 5min (Martínez &
Mayorga, 2013). Los crioviales se introducen en baño serológico una vez se llega
a la temperatura deseada, no antes.
Del criovial se toma 1ml con micropipeta, previamente agitado con Vórtex
nivel 7 (≈2240rpm) por 10s, diluyéndolo en un tubo con 9ml de medio SMPG
(Martínez & Mayorga, 2013). Dicho tubo se designa como T01 (primer
subcultivo) y posteriormente es puesto en incubadora a 25 °C ± 1°C de 18-24
horas.
-Estos procedimientos aplican para todo tipo de microorganismos a menos que el investiga-
dor donante sugiera otros métodos de recuperación.
-La solución de rehidratación puede ser reemplazada por caldo nutritivo (en menor medida) o
la mismo solución lioprotectora de la formulación.
-En el momento en que solo quede un criovial/vial disponible de la cepa, se debe recuperar la
cepa y volver a realizar todo el procedimiento de conservación a partir de este.
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REFRIGERACIÓN
Se implementa el método de resiembra continua; en este, el microorganismo
se siembra en un medio adecuado (selectivo o no) y posterior a su crecimiento,
es almacenado a 4°C, donde se mantiene para su uso, resembrándolo en un
lapso de tiempo no superior a un mes (Morales-García et al., 2010) cuando es
utilizado, para su almacenado nuevamente. Se debe tener en cuenta los
siguientes parámetros:
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CRIOPRESERVACIÓN
Precriopreservación.
En el interior de la cabina de flujo laminar, tomar cinco crioviales a los cuales
se les retira las tapas sin tocar el interior de estas o dejarlas sobre la cabina.
Posteriormente son llenados con 1200µl de glicerol estéril anhidro usando una
pipeta y nuevamente son cerrados.
Después, agitar el tubo T02 con Vórtex nivel 7 (≈2240rpm) por 15s, tomando
luego cinco alícuotas de 600µl, depositadas en cada criovial, para aforar un
volumen final de 1800µl (Martínez & Mayorga, 2013). Se rotulan los crioviales y
se realiza Vórtex nivel 7 (≈2240rpm) por 5s para su homogenización.
Inmediatamente después de este proceso se almacenan los crioviales en el rack
correspondiente según la colección, a una temperatura de -85°C ± 1°C.
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LIOFILIZACIÓN
Preliofilización y preparación del inoculo bacteriano.
Desde medio sólido.
Partiendo de un cultivo de entre 24-48 horas en medio sólido, se toman 4
asadas con abundante crecimiento microbiano, inoculando un tubo (designado
como T03) con 10ml de lioprotector general. Posteriormente se debe agitar con
Vórtex nivel 7 (≈2240rpm) por 45s.
Ejecución de la liofilización.
Desde medio sólido.
Del tubo T03, como inóculo inicial para el proceso de liofilización y
previamente agitado con Vórtex nivel 7 (≈2240rpm) por 15s, se extraen cuatro
alícuotas de 1ml, que se depositan en cuatro viales de vidrio posteriormente
tapados con tapón de división. Cada vial se agita con Vórtex nivel 2 (≈640rpm)
por 7s para su homogenización evitando el contacto con el tapón.
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Con un volumen total de 1ml, cada vial se agita con Vórtex nivel 2 (≈640rpm)
por 7s para su homogenización evitando el contacto con el tapón. Los viales
(indistintamente si se parte de medio sólido o líquido) se destapan parcialmente
y se congelan en nitrógeno líquido en recipiente de poliestireno expandido
cerrado por ≥15min para ser llevados al liofilizador, de 24-48 horas, a una
presión inferior a 0,266 mbar (200mTorr) y a una temperatura inferior a -45°C.
Posliofilización.
Luego del desmonte y sellado al vacío de los viales, cada vial debe ser
rotulado y puesto un sello de aluminio con el crimper, posterior al proceso de
liofilización. Los viales de trabajo (T) y stock (S) son almacenados en el banco de
liofilizados a temperatura ambiente. El tercer vial (Lf) se almacena a 4°C ± 1°C en
el cepario madre de liofilizados. El cuarto vial es rehidratado en un lapso de 0
horas a 5 días, realizando evaluación de la eficacia del método de conservación
para saber si fue o no exitosa la liofilización. Por último se debe llenar el registro
FLf-02. PROCESO DE LIOFILIZACIÓN, culminado el proceso.
-Recuerde realizar evaluación de la eficacia del método de conservación pre y posliofilización.
Consignar estos datos en la base de datos del banco de cepas.
-Se debe realizar Vórtex cada vez que se vaya a extraer una alícuota.
-Los mejores resultados en la liofilización se han obtenido con microrganismos en fase
estacionaria. Si se desconoce el tiempo necesario para entrar en esta fase, se recomienda en
agares tiempos de crecimiento alrededor de 48 horas, y en caldo SMPG un rango de 24-48h.
-Algunos microorganismos como hongos suelen requerir más tiempo del estipulado para su
total congelamiento, tener este dato de ser posible.
-El tiempo de liofilización varía según la formulación. Para una formulación con Sacarosa 10%
36 horas es lo ideal.
-Debe usarse el accesorio para liofilización Tray style con estante de taponado para sellar los
viales al vacío y de forma hermética.
-Los tapones de división deben quedar parcialmente destapados para permitir la sublimación
del agua, de lo contrario no será posible la liofilización y pueden incluso quebrarse.
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RÓTULOS
Refrigeración.
Dado que la refrigeración constituye un método de corto plazo, no se
requieren rótulos especiales para este método de conservación. Sin embargo, es
imprescindible que el tubo de agar inclinado contenga la siguiente información,
con marcador permanente indisoluble en agua o con la siguiente ficha:
Fecha de ingreso:__________________________
Medio:___________________________________
Cepa:____________________________________
Código:__________________________________
Criopreservación.
Las Figuras 7 y 8 corresponden a los rótulos de colección usados en las cajas
del Freezer y los rótulos para cada cepa criopreservada.
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Liofilización.
-Los rótulos de las cajas del Freezer, los crioviales y los viales deben ser impresos en papel
adhesivo.
-Los rótulos deben colocarse antes de su almacenamiento, especialmente los crioviales, ya
que una vez congelados, el adhesivo no funciona.
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Tabla 6. Código de colores propuesto según la clasificación de los microorganismos
infecciosos por grupos de riesgo de la OMS.
-En la base de datos del Banco Genético se encuentran los formatos en el programa WORD
de forma tal que solo se modifique los datos, pero el formato y tamaño de letra sea igual
para todos los rótulos.
-Las etiquetas de liofilización y criopreservación deben imprimirse en papel adhesivo.
-Este procedimiento aplica para todo tipo de microorganismos.
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Protocolos de
seguridad en los
procedimientos de
conservación y en
el laboratorio
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CONTROLES DE ESTERILIZACIÓN
Todos los medios, reactivos y soluciones lioprotectoras deben ser
esterilizados en autoclave a 121°C y 210kPa por 20min a menos que las
especificaciones del fabricante indiquen que se utilice otro método de
esterilización; las puntas de micropipetas, los viales, crioviales y sus respectivas
tapas, deben ser esterilizadas en las mismas condiciones de presión y
temperatura mencionadas en un tiempo de 15min. Los materiales de metal y
vidrio restante (como cajas de Petri y pipetas), pueden ser esterilizados en
horno a 160°C por 120min.
Medios.
Realizar control de esterilidad al agua peptonada (en solución de
rehidratación y para las diluciones seriadas), al caldo SMPG, al medio SPC, a las
soluciones lioprotectoras y al glicerol anhidro; dejándolos en incubación en las
mismas condiciones de las siembras de 24-48 horas luego de su esterilización.
Son indicadores de contaminación cambios ópticos (turbidez u opacidad) en los
medios líquidos y presencia de colonias en medios sólidos.
Ambiente.
Nevera de almacenamiento de los medios y protectores.
El proceso de control de ambiente se realiza con medio SPC (u otro que sea
igual a los medios usados) dejando una caja de Petri abierta en el interior de la
nevera (en el nivel usado para almacenar el material del respectivo proyecto),
evitando pasar por encima de las cajas al abrirlas. El periodo de exposición va de
15 a 30 minutos, dejándolos en incubación de 24-48 horas en las mismas
condiciones de incubación de las cepas de trabajo. Se recomienda que con un
número superior de cinco colonias en el control, se desinfecte el área de
almacenamiento para disminuir los riesgos de contaminación.
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Técnicas de siembra y manipulación de elementos.
Aunque la mayor parte del trabajo se desarrolle en el interior de una cabina
de flujo laminar, hay que procurar mantener un adecuado control de asepsia en
el trabajo, siguiendo no solo los protocolos de uso de la cabina, sino además un
riguroso uso de elementos de protección como guantes y tapabocas. Los
guantes puestos y las micropipetas deben ser desinfectados constantemente
con alcohol 70% al inico, durante y al final del trabajo con cada cepa.
ELIMINACIÓN DE RESIDUOS
Con base en el manual de bioseguridad de la OMS (2005), los residuos se
pueden clasificar en cinco grupos. La eliminación de residuos en el laboratorio
de microbiología no es ajeno a las normas nacionales e internacionales
estipuladas, por ello , los desechos se dispondrán de la siguiente forma:
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Material contaminado (potencialmente infeccioso) para ser
eliminado.
Fuera del material corto-punzante contaminado anteriormente mencionado,
todos los desechos producidos en cajas de Petri, tubos de ensayo, frascos
Schott, crioviales y viales inoculados, deben ser desactivados mediante
autoclave a 121°C y 210Kpa por 15 minutos, posterior a este proceso se
descartará el contenido de las cajas de Petri disponiéndolos en bolsas rojas para
residuos peligrosos. Por otra parte los desechos líquidos deberán ser dispuestos
en los tanques de almacenamiento especiales para residuos de este tipo
facilitados por el PIGA.
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BIOSEGURIDAD
El laboratorio de microbiología de la Facultad del Medio Ambiente se
encuentra clasificado en el nivel de Bioseguridad 2, es decir que puede albergar
microorganismos del grupo de riesgo dos, estos son:
“Agentes patógenos que pueden provocar enfermedades humanas o animales
pero que tienen pocas probabilidades de entrañar un riesgo grave para el personal de
laboratorio, la población, el ganado o el medio ambiente. La exposición en el
laboratorio puede provocar una infección grave, pero existen medidas preventivas y
terapéuticas eficaces y el riesgo de propagación es limitado” (OMS, 2005, pág. 1).
Protección personal.
El personal se debe lavar las manos luego de manipular materiales
contaminantes, luego de quitarse los guantes y antes de retirarse del
laboratorio.
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Procedimientos.
Está estrictamente prohibido pipetear con la boca, se deben utilizar
pipeteadores mecánicos.
Áreas de trabajo.
Las superficies de trabajo se descontaminan como mínimo una vez por día
y luego de todo derrame de material contaminante.
En las zonas de trabajo estará prohibido comer, beber, fumar, aplicar
cosméticos, manipular lentes de contacto o almacenar alimentos en áreas
de trabajo.
En la superficie de trabajo no deben depositarse en ningún momento ropa
u objetos personales.
Capacitaciones.
Los encargados del Banco genético y del laboratorio deberán estar
capacitados para que aplique el presente manual de una forma más eficaz
y así reducir riesgos en el proceso.
Se dictaran capacitaciones que desarrollen todo lo descrito en el presente
manual, incluyendo el uso y manejo de los registros y bases de datos para
asegurar su uso adecuado, así como de las maquinas y elementos del
laboratorio.
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REFERENCIAS
Arcos, M. L., Ossa, F., & Díaz, T. E. (2004). Criopreservación de aislados nati-
vos de la bacteria ruminal Fibrobacter succinogenes. Revista Corpoica, 5
(1), 60-63.
Camacho, A., Giles, M., Ortegón, A., Palao, M., Serrano, B. & Velázquez, O.
(2009). Técnicas para el Análisis Microbiológico de Alimentos.
(Segunda ed.). México: Facultad de Química, UNAM.
Sánchez L., L. C., & Corrales R., L. C. (2005). Evaluación de la congelación para
conservación de especies autóctonas bacterianas. NOV A , 3(4), 21-29.
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Anexos y formatos
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30
31
BANCO DE LIOFILIZADOS
32
CEPARIO MADRE DE LIOFILIZADOS
33
FORMATO PARA CARACTERÍSTICAS MACROSCÓPICAS
DE LAS CEPAS.
34
FORMATO DE LAS FICHAS RESUMEN.
35
FORMATOS DE CONTROL DE LA SECCIÓN
LIOFILIZACIÓN.
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37
38
39
FORMATOS DE CONTROL DE LA SECCIÓN
CRIOPRESERVACIÓN.
40
41
42
43
44
45