UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE ZACATECAS

“Francisco García Salinas”

UNIDAD ACADÉMICA DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

“ANÁLISIS DE GENES IMPLICADOS EN LA RUTA NRF2 EN

LÍNEAS CELULARES PROVENIENTES DE CÁNCER
HUMANO”

TESIS

PARA OBTENER EL NIVEL DE

LICENCIADA EN BIOLOGÍA

PRESENTA

ALEJANDRA SERRANO PUENTE

ZACATECAS, ZAC. FEBRERO, 2020.

 UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE ZACATECAS
“Francisco García Salinas”

UNIDAD ACADÉMICA DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

“ANÁLISISDE GENES IMPLICADOS EN LA RUTA NRF2

EN LÍNEAS CELULARES PROVENIENTES DE CÁNCER
HUMANO”

TESIS

PARA OBTENER EL NIVEL DE

LICENCIADA EN BIOLOGÍA

PRESENTA

ALEJANDRA SERRANO PUENTE

DIRECTORES DE TESIS:
Dra. Gretel Mendoza Almanza
Dr. Edgar León Esparza Ibarra

ZACATECAS, ZAC. FEBRERO, 2020.

 AGRADECIMIENTOS

Quiero agradecer a la Universidad Autónoma de Zacatecas, mi Alma mater por

acogerme como uno más de sus estudiantes y poner al alcancé de mi mano una carrera
universitaria.

A la Unidad Académica de Ciencias Biológicas por proveerme de excelentes

maestros, acompañados de conocimientos y experiencias únicas.

A la Unidad Académica de Ciencias Químicas por abrirnos las puertas cuando

necesitamos de su apoyo en el desarrollo experimental del trabajo propuesto.

Al laboratorio de Biología Molecular y Biotecnología de la UNAM por su apoyo de

igual manera en el desarrollo experimental del proyecto.
 DEDICATORIA

A mis padres Argelia Puente García y Humberto Serrano Rodríguez, por guiarme
durante mi vida para poder ser la persona que soy hoy en día, a mis hermanos Yoshelin,
Yazhlem e Iván por acompañarme en mis horas de trabajo y en la motivación a mi
proyecto.

A mis abuelos Antonia Rodríguez Rodríguez, Rubén Serrano González y Ma.

Elena García Saucedo por haber sido mis primeros maestros, por creer en mí y siempre
darme su amor y su apoyo incondicional.

A mis compañeros de Laboratorio Luis Burciaga Hernández y Jared Limones

González porque cada logro fue gracias a nuestro trabajo en colaboración.

A la Dra. Gretel Mendoza Almanza, por haber despertado en mi persona el gusto por
la investigación y por alimentar día a día mi confianza en el laboratorio.

A mis demás compañeros de laboratorio y amigos por su apoyo incondicional,

gracias.
Contenido
Índice de Ilustraciones: ....................................................................................... 1

Indice de Tablas.................................................................................................. 2

Indice de Graficas ............................................................................................... 3

Resumen ............................................................................................................ 4

Abstract ............................................................................................................... 5

I. Introducción .................................................................................................. 6

II. Antecedentes ............................................................................................... 7

II.I Biología Molecular y sus avances hacia una visión diferente al Cáncer ..... 8

II.II. Ciclo Celular y el Cáncer ........................................................................ 10

II.II.I Fase G1 ................................................................................................. 11

II.II.II Fase S .................................................................................................. 13

II.II.III Fase G2 ............................................................................................... 13

II.II.IV Fase M ................................................................................................ 14

II.III. ¿Cómo se relacionan el ciclo celular y el cáncer? ................................. 15

II.IV Apoptosis ............................................................................................... 17

II.V. Estrés Oxidativo .................................................................................... 19

II.VI. NRF-2/KEAP ........................................................................................ 20

II.VII. AKT ...................................................................................................... 22

II.VIII. PI3K ................................................................................................... 23

II.IX. Angiogénesis y metástasis ................................................................... 24

II.X. Panorama General del Cáncer ............................................................... 25

II.XI Cáncer de mama .................................................................................... 27

II.XI.I. Genes implicados en el Cáncer de Mama .......................................... 30

II.XII. Cáncer Cérvico Uterino ........................................................................ 32

II.XIII. Cáncer Colorectal................................................................................ 33

II.XIII.I. GENES IMPLICADOS EN EL CANCER DE COLON ........................ 34

 II.XIV. Leucemia ............................................................................................ 35

II.XV. Estudio de Líneas Celulares: ............................................................... 36

III. Justificación ............................................................................................ 38

IV. Hipótesis: ................................................................................................ 39

V. Objetivos: ................................................................................................... 40

Objetivo general ............................................................................................ 40

Objetivos Específicos: ................................................................................... 40

VI. Materiales y Métodos .............................................................................. 41

VI.I. Muestras ................................................................................................ 41

VI.II. Procesamiento de las muestras ............................................................ 43

VI.II.I. Cultivo de Líneas Celulares ................................................................. 43

VI.II.II. Extracción de RNA por Kit Quick RNA Mini Prep ZyMo ...................... 43

VI.II.III. Digestión de DNA por DNAsa ............................................................ 44

VI.II.IV. Síntesis de la Cadena de cDNA......................................................... 44

VI.II.V. PCR control GAPDH ........................................................................... 45

VI.II.VI. PCR en tiempo Real .......................................................................... 45

VII. Resultados .............................................................................................. 48

VII.I. Cultivos celulares: ................................................................................. 48

VII.IV. PCR TIEMPO REAL ........................................................................... 50

VIII. Discusión ................................................................................................ 61

IX. Conclusiones .......................................................................................... 63

X. Literatura Citada: ........................................................................................64

Índice de Figuras:
Figura 1. Patrón de eventos moleculares relacionados con el desarrollo y
progresión del cáncer.......................................................................................... 7
Figura 2. Célula Sana a Cancerosa .................................................................... 9
Figura 3. Fases del ciclo celular ....................................................................... 11
Figura 4. Puntos de Restricción de Ciclinas. .................................................... 12
Figura 5. Fase M del ciclo celular ..................................................................... 14
Figura 6. Fase M del ciclo celular de la cual se obtendrán dos células hijas .... 18
Figura 7. Ruta de activación de NRF-2 ............................................................ 21
Figura 8. AKT ................................................................................................... 22
Figura 9. Grafico representativo de los tipos de Cáncer a Nivel Mundial ......... 26
Figura10. Casos de Cáncer en México ............................................................ 26
Figura 11. Estimado de Incidencia de Cáncer de 2018 hasta 2040 .................. 27
Figura 12. Grafica representativa de los casos de muertes estimadas por los
diversos canceres ............................................................................................. 32
Figura 13. SiHa .................................................................................................48
Figura 14. MDA MB 231 ................................................................................... 48
Figura 15. MDAMB 468 ....................................................................................48
Figura 16. Jurkat ...............................................................................................48
Figura 17. CASKI ..............................................................................................48
Figura 18. SW480 ............................................................................................ 48
Figura 19. Gel de Agarosa, muestras de RNA .................................................. 50
Figura 20. PCR GAPDH.................................................................................... 50

1
Indice de Tablas
Tabla 1. Genes Involucrados en el ciclo celular y cáncer 17
Tabla 2. Clasificaciones de los tipos de tumores mamarios y las patologías que se
expresan en base a su clasificación 30
Tabla 3. Líneas celulares 41
Tabla 4. Oligos Correspondientes a los Genes utilizados para la investigació 46
Tabla 5. Concentraciones y Purezas RNA Comprobación en Geles de Agarosa 49
Tabla 6. Expresión relativa de genes para el gen NRF2 51
Tabla 7. Expresión relativa de genes para el gen KEAP1 52
Tabla 8. Expresión relativa de genes para el gen AKT 53
Tabla 9. Expresión relativa de genes para el gen PI3K 54
Tabla 10. Expresión relativa de genes obtenida del método de Livak and Schmittgen,
2001 55
Indice de Graficas
Gráfico 1. Gráfica Global ..................................................................................56
Gráfico 2. Gen NRF2. .......................................................................................57
Gráfico 3. Keap1 ...............................................................................................58
Gráfico 4. AKT. .................................................................................................59
Gráfico 5. PI3K.................................................................................................. 60

3
 RESUMEN
En el desarrollo o la aparición de una neoplasia puede estar involucrado el estrés
oxidativo, el cual está regulado por la ruta NRF2 que al ser activada reduce la
inflamación y promueve la generación de antioxidantes. Por otro lado, contrario
a su rol regulador y protector, cuando alguno de sus genes está sobre-expresado
en las células confiere resistencia a las terapias y promueve la supervivencia de
células cancerosas. Por lo cual el objetivo principal de la investigación es evaluar
la expresión de los genes de la vía NRF2; NFE2L2, KEAP1 en líneas celulares
de diversos tipos de cáncer, así como la relación que guardan con la expresión
de los genes PI3K y AKT; para esto se extrajo RNA de las líneas celulares de
cáncer cervicouterino; de cáncer de mama; cáncer de colón y de leucemia. Así
como de la línea celular correspondiente a queratinocitos humanos. Se analizó
por gel de agarosa la integridad del RNA y se cuantificó en Nanodrop. A partir de
1 µg de RNA se sintetizó cDNA y se analizó la expresión de genes involucrados
en la ruta NFR2 mediante qPCR, donde se obtuvo como resultado que el gen
KEAP se sobre expresó en casi todas las líneas celulares a diferencia de NRF2
que no se sobre expresó en ninguna línea. Por otro lado, AKT se sobre expresó
en la mayoría de las líneas celulares a diferencia de PI3K. Con base en el tiempo
real, observamos la sobre expresión de los genes que se plantearon al inicio de
la investigación en diferentes líneas celulares, concluyendo que KEAP1 se sobre
expresa en la mayoría de las líneas celulares. La desregulación de este gen se
apreció sobre todo en cáncer cervicouterino y cáncer de mama, los dos tipos de
cáncer más mortales en la población femenina en el mundo.

Palabras clave: Cáncer, NRF2, PI3K, AKT, KEAP1, qPCR

4
 ABSTRACT
Oxidative stress may be involved in the development or appearance of a
neoplasm, which is regulated by the NRF2 pathway which, when activated,
reduces inflammation and promotes the generation of antioxidants. On the other
hand, contrary to its regulatory and protective role, when one of its genes is
overexpressed in cells, it confers resistance to therapies and promotes the
survival of cancer cells. Therefore, the main objective of the research is to
evaluate the expression of the NRF2 pathway genes; NFE2L2, KEAP1 in cell
lines of various types of cancer, as well as the relationship it protects with the
expression of the PI3K and AKT genes; for this, RNA was extracted from cervical
cancer cell lines; of breast cancer; colon cancer and leukemia. As well as the cell
line corresponding to human keratinocytes. The integrity of the RNA was
analyzed by agarose gel and quantified in Nanodrop. From 1 µg of RNA cDNA
was synthesized and the expression of genes involved in the NFR2 pathway was
analyzed using qPCR, where it was obtained that the KEAP gene was
overexpressed in almost all mobile lines unlike NRF2 that was not over He
expressed in no line. On the other hand, AKT was overexpressed in most mobile
lines unlike PI3K. Based on real time, we observe the overexpression of the
genes that were raised at the beginning of the investigation in different cell lines,
concluding that KEAP1 is overexpressed in most cell lines. Deregulation of this
gene was seen especially in cervical cancer and breast cancer, the two most
deadly types of cancer in the female population in the world.

Keywords: Cancer, NRF2, PI3K, AKT, KEAP1, qPCR

5
I. INTRODUCCIÓN
El cáncer es un proceso de crecimiento y diseminación incontrolado de células.
Puede aparecer prácticamente en cualquier lugar del cuerpo. El tumor suele
invadir el tejido circundante y puede provocar metástasis en puntos distantes del
organismo.

Los seres humanos están constantemente expuestos a diversos factores que

pueden llevar a desarrollar un cáncer. Los factores de riesgo de cáncer incluyen
la exposición a productos químicos u otras sustancias, como los cancerígenos
físicos que pueden ser la radiación ionizante y no ionizante (el radón o los rayos
UV) y los químicos tales como el humo de tabaco y otros contaminantes del aire
o los contaminantes del agua potable y los alimentos (las aflatoxinas o el
arsénico), otros indicadores como la edad y los antecedentes familiares (cáncer
heredado) también son englobados en estas categorías.

En el desarrollo o la aparición de una neoplasia puede estar involucrado el estrés

oxidativo, el cual está regulado por la ruta NRF2; el factor de trascripción NRF2
(Nuclear Factor Erythroid 2-related factor) es un potente activador transcripcional
que regula la expresión de diversos genes de enzimas detoxificantes y
antioxidantes. La primera evidencia de su papel en la protección contra el estrés
oxidativo proviene del estudio de Venugopal y Jaiswal en 1996, en el que se
demostró que la sobreexpresión del cDNA de Nrf1 y Nrf2 aumentaba la expresión
e inducción de NQO1 en respuesta a antioxidantes y xenobióticos; NRF2
previene además la carcinogénesis química cuando aumenta su capacidad
antioxidante y detoxificante, incluso en pacientes portadores del cáncer también
es beneficioso debido a que potencia la inmunidad contra él.

La ruta al ser activada reduce la inflamación y promueve la generación de

antioxidantes, por otro lado, contrario a su rol regulador y protector, NRF2 en
concentraciones elevadas en las células, tiene efectos deteriorantes, confiere
resistencia terapéutica y promueve la supervivencia de células cancerosas en un
entorno perjudicial.

6
II. ANTECEDENTES
La palabra “Cáncer” engloba entidades clínicas de diverso origen, tales como el
cáncer de mama, cérvico uterino, de colon, neuroblastoma, leucemias, entre
algunos de los que se pueden nombrar (Hanaban y Weinberg, 2000); desde el
comienzo de su estudio se encontró que los tejidos cancerosos están formados
por células de diferente morfología a la original, por lo cual se postuló que la
causa de la enfermedad proviene de lesiones en las células (Hajdu, 2004), y a
pesar de las diferentes manifestaciones de la enfermedad se ha encontrado un
patrón de eventos moleculares que se observa en la patología como las que se
mencionan en la Figura 1 (Hanaban y Weiberg, 2000):

Figura 1. Patrón de eventos moleculares relacionados con el desarrollo y progresión del cáncer

7
II.I Biología molecular y sus avances hacia una visión diferente al
Cáncer

El año de 1980 fue la era de la biología molecular, herramienta mediante la cual

se encontró que había genes implicados en el desarrollo del cáncer (Tannock, et
al., 2013); para que una célula se considere maligna le preceden una
acumulación de mutaciones en unos genes específicos, los cuales son la clave
molecular para entender las raíces del cáncer, estos genes están agrupados en
2 familias (Delgadillo-Villarroel y Ticona-Velasco, 2014):

La primera está integrada por los protooncogenes, los cuales dirigen la

proliferación y diferenciación celular como en el caso de las ciclinas, factores de
crecimiento, receptores, etc. (Brandan et al., 2014), cuando éstos mutan se
transforman en oncogenes los cuales dictan la multiplicación desorganizada de
las células, de modo que algunos de ellos potencian la maquinaria celular para
que sintetice de forma masiva determinados desencadenantes de la división
descontrolada (Sonnenschein y Soto, 2006).

La segunda familia está integrada por los genes supresores de tumores también
conocidos como genes supresores, que en el organismo sano controlan la
proliferación celular (Brandan et al., 2014). Ellos, por tanto, son reguladores
negativos de crecimiento y cuando no están presentes en la célula o se
encuentran inactivos a causa de mutaciones, las células dejan de crecer
normalmente y adquieren propiedades proliferativas anormales, características
de las células tumorales (Hernández y Hernández-Méndez, 2014).

El cáncer puede parecer una sola enfermedad, pero detrás de este padecimiento
hay más de 1000 desordenes diferentes ocurriendo en las funciones de las
células y los tejidos (Bozzone, 2007), puede tener origen en mesenquima,
epidérmico, melanocítico, células T, venoso, etc (Palomar-Llatas, et al., 2008).
La organización mundial de la salud cataloga al cáncer como una enfermedad
multifactorial debido a los factores genéticos y ambientales (OMS, 2011);
mediante una serie de estudios realizados a lo largo de los años se ha llegado a
identificar muchos agentes cancerígenos como factores de riesgo que pueden
encontrarse en el entorno (Sánchez, 2013), como los cancerígenos físicos como
pueden ser la radiación ionizante y no ionizante como el radón o los rayos UV y

8
los químicos tales como el humo de tabaco y otros contaminantes del aire, el
asbesto, y los contaminantes del agua potable y los alimentos como las
aflatoxinas o el arsénico (OMS, 2011). Los efectos cancerígenos en las personas
son el resultado de la exposición repetida y en distintos lugares a lo largo de la
vida al aire, agua, alimentos y radiación, particularmente en el entorno de trabajo
(Meza-Junco et al., 2006).

Dando como resultado a lo anterior, el cáncer se desarrolla a partir de la

acumulación y selección sucesiva de alteraciones genéticas y epigenéticas, que
permiten a las células sobrevivir, replicarse y evadir mecanismos reguladores de
apoptosis, proliferación y del ciclo celular (Willingham et al., 2004) (Figura 2).

Figura 2. Célula Sana a Cancerosa. Proceso mediante el cual una célula de un tejido cualquiera,
empieza a prolifera, hasta la progresión del Cáncer. Tomada de: https://seom.org/informacion-
sobre-el cancer/que-es-el-cancer-y-como-se-desarrolla?showall=1

El cuerpo cuenta con una gran diversidad de mecanismos mediante los cuales
las células desempeñan su trabajo, particularmente la regulación de estos

9
mecanismos ayuda a la productividad de las células tal como su diferenciación,
especialización, inclusive su muerte o proliferación (Bozzone, 2007).

Basado en diversos estudios se puede observar que la mayoría de los canceres

de varios tipos, al no invadir desde el exterior, a menudo derivan directamente
de los tejidos normales en los cuales son descubiertos y, aun así, los tumores
son capaces de moverse invadiendo sitios anatómicos muy alejados del lugar
donde se produjo el tumor original, llamándole pues a estos asentamientos
nuevos “metástasis”, determinando también así los grados de la lesión
(Weinberg, 2014).

Para poder entender el mecanismo de acción del cáncer y su progresión es

necesario conocer el ciclo celular y los efectos de la desregulación de los genes
involucrados en la vía. La célula entonces, puede tomar dos caminos; la
formación de una célula sana o bien una célula cancerígena que desarrollará la
enfermedad en el tejido sano.

II.II. Ciclo celular y el cáncer

El cáncer tiene como base una división celular descontrolada y su desarrollo y

progresión suelen estar ligados a una serie de cambios en los reguladores del
ciclo celular (López-Marure, 2003).

El ciclo celular es una serie de pasos ordenados mediante los cuales una célula
crece, duplica su material genético y se divide para dar lugar a un par de células
hijas (Murray y Kirscher, 1989); el ciclo celular se divide en una serie de fases
progresivas (Figura 3) denominadas G1, S, G2 y M (Megías et al., 2017).

10
 Figura 3. Fases del ciclo celular, este es el proceso mediante el cual la célula crece y
se divide para la formación de células hijas sanas obtenido de:
https://www.blogdebiologia.com/ciclo-celular.html

II.II .I Fase G1

La fase G1 es la primera parte del ciclo celular, en esta etapa la célula empieza
su crecimiento y puede responder al efecto de factores estimuladores o
inhibidores de la proliferación (Israels e Israels, 2000), durante esta fase la célula
comprueba las condiciones externas e internas y decide si continuar con el ciclo
celular o no, no todas las células terminan su ciclo, algunas se quedan en la
misma fase como en un estado de quiescencia. Cuando la célula queda detenida
en fase G1 en forma quiescente se dice que está en fase G0 (Megías et al.,
2017). Desde los estados de quiescencia y de célula diferenciada en algunos
tipos celulares se puede volver a retomar el ciclo celular, dentro de G1 la célula
pasa por decisiones importantes, y todos están regulados mediante puntos de
control (Israels e Israels, 2000) (Megías et al., 2017).

Las moléculas que están en la base de los puntos de control, y por tanto de la
progresión del ciclo celular, son las quinasas dependientes de ciclinas o CdKs
("Cyclin dependent kinases"), una vez activadas son las responsables de
fosforilar numerosos sustratos, entre los que se encuentran los inhibidores del
avance del ciclo celular, permitiendo así que el ciclo progrese (Murray y Kirscher,
1989).

11
 Las ciclinas más importantes para el avance del ciclo celular son cuatro: las A,
B, D y E (Las ciclinas D y E son importantes para el avance de la fase G1), los
complejos CdK/ciclina D y Cdk/ciclina E actúan fosforilando al factor de
transcripción Rb (retinoblastoma), que forma parte del último punto de control de
la fase G1, este último punto de control en el que se fosforila a Rb se le denomina
punto de restricción. Las ciclinas A y B son proteínas de control que se unen aun
compledo Cdk2 para la progresión de la fase S del ciclo celular (Sánchez-
Carreon, 2015).

La mayoría de las células de un organismo adulto no están en permanente

proliferación debido a que existen inhibidores de las Cdk/ciclinas de la fase G1
(López-Marure, 2003). Hay diversos tipos de inhibidores y uno de ellos es el p53,
un factor de transcripción que se encuentra dañado en numerosos tipos de
cánceres. Cuando hay daño del DNA celular, estrés celular, cambios de pH u
otras alteraciones celulares, aumenta la concentración de p53 y provoca la
activación del gen p21, el cual a su vez impide la fosforilación de Rb, y por tanto
la célula no comienza la fase S (Lomanto-Díaz, 2003; López-Marure, 2003;
Megías et al., 2017) (Figura 4).

Figura 4. Puntos de Restricción de Ciclinas. Los elementos centrales de este punto de restricción
son la Cdks-ciclina, la molécula Rb y el factor E2F. Rb, en la fase G1 temprana, está defosforilado
y unida a los factores E2F, esta unión inhibe la expresión de los genes que permiten la entrada en
el ciclo S y por tanto el avance del ciclo celular. Obtenida de: https://mmegias.webs.uvigo.es/5-
celulas/8-g1.php

12
II.II.II Fase S

Esta etapa se caracteriza por la síntesis, duplicación o replicación del material

genético; los cromosomas de las células que han iniciado el ciclo celular cuentan
solo con una cromátida, en esta etapa cada cromosoma se duplica, es decir,
cada hebra de ADN origina una copia idéntica, quedando ahora cada cromosoma
constituido por dos cromátidas (Lomanto-Díaz, 2003).

El proceso clave de la replicación del ADN ocurre durante la fase S (síntesis) del
ciclo celular, momento en el cual las histonas (H1, H2a, H2b, H3 y H4) y otras de
las proteínas asociadas al ADN son sintetizadas tales como los ADN
polimerasas, ligasas, topoisomerasas, entre otras (Israels e Israels, 2000).

II.II.III Fase G2

La fase S del ciclo celular da paso a la fase G2, la cual termina con la entrada en
la mitosis, en la fase G2 se acumulan progresivamente aquellas moléculas cuyas
actividades serán necesarias durante la fase M, durante esta etapa, sin embargo,
se verifica si ha habido errores durante la replicación del ADN y si se ha
producido su duplicación completa (Blomen y Boonstra, 2017).

Si en la fase de verificación, son encontrados defectos, el ciclo se detendrá hasta

que los daños sean reparados o el ADN sea completamente copiado; los errores
no detectados pasarán irremediablemente a las células hijas (Pardo, 2005).
Durante la fase G2 la célula también aumentará en tamaño y los centrosomas,
duplicados durante la fase S, se dirigirán a lugares opuestos de la célula para
formar posteriormente el huso mitótico (Pardo 2005).

El fin de la fase G2 está mediado por la quinasa dependiente de ciclina (CdK)

tipo 1 y por la ciclina B1 (la ciclina B1 se sintetiza durante la fase S tardía), es
este complejo, más otras proteínas quinasas y fosfatasas, son las que
determinan si la célula entrará en la fase M, es decir, es un punto de control
(Wanke y Kutay, 2013).

13
II.II.IV Fase M

La fase M (mitosis), es la división celular en la que una célula progenitora se

divide en dos células idénticas, esta fase se subdivide en profase, metafase,
anafase, telofase y citocinesis (Lagunas-Cruz et al., 2014) Figura 5).

Figura 4 Fase M del ciclo celular de la cual se obtendrán dos células hijas y dependiendo de
las mutaciones puede ser una célula sana o bien una célula cancerígena.
https://mmegias.webs.uvigo.es/descargas/atlas-celula-08-ciclo-celular.pdf

El punto conocido como G2/M ocurre antes de la división celular, en este punto
se debe evitar el inicio de la mitosis cuando el DNA ha sufrido algún daño previo
durante G1, S o en G2.

El estrés genotóxico activa a los sistemas ATM/ATR, el cual forma un complejo

molecular con para la reparación del ADN (El sistema ATM/ATR también activa
y acumula a p53 lo que resulta en la activación de p21, un inhibidor del complejo
Cdk2/ciclina E, lo que bloquea el ciclo) (Zapata, 2001), conduciendo a la
fosforilación y activación de las cinasas CHK1 y CHK2, seguido de la fosforilación
de Cdc25C (Quezada, 2007).

La entrada a la mitosis se detiene cuando la fosfatasa Cdc25c es retenida en el

citoplasma por la proteína 14-3-3, que impide su acción sobre el complejo
fosforilado Ciclina B/ (CDC2) CDK1 (Lagunas-Cruz et al., 2014).

14
El sistema ATM/ATR también activa el sistema de señales p53 que contribuye a
mantener a las células en G2, al retener en el citoplasma mediante la proteína
14-3-3 a la cinasa CDK1 (CDC2) (Quezada, 2007), por otro lado, se observa el
efecto de p21, que reduce la fosforilación de RB y evita que E2F se libere para
mediar la expresión de Ciclina B y CDC2 (Iorio, 2005).

La proteína p21 también se une al complejo Ciclina B/CDC2 (CDK1) para impedir
la entrada a la mitosis, GADD45, otra proteína de la vía de p53, también se puede
unir al complejo Ciclina B/CDC2 (CDK1) para inhibirlo, en esta fase actúa el
complejo ciclina B/CDK1 o MPF (promotor de la fase M), el cual es activado por
la cinasa Polo y translocado al núcleo en prometafase coincidiendo con la
desintegración de la membrana nuclear (Miettienen et al., 2001).

La citocinesis es mediada por la ciclina B y es la fase en la que se lleva a cabo

la separación de las células hijas. Ocurre solo después del término de la mitosis,
pues ambos procesos están vinculados (Miettienen et al., 2001), la ciclina B,
cuando no es degradada por carecer de la secuencia de reconocimiento por el
complejo APC (Regulador del ciclo celular), arresta a las células en anafase y no
se procede a la citocinesis, marcando el final del ciclo celular (Quezada, 2007).

II.III. ¿Cómo se relacionan el ciclo celular y el cáncer?

Las células normales poseen puntos de control G1 y G2; sin embargo, las células
cancerosas son a menudo afectadas en el punto de control G1, debido a las
mutaciones o alteraciones en los reguladores clave de este puesto de control
(Tan et al., 2014). Presidiendo el funcionamiento del ciclo celular, está el sistema
de vigilancia de la proteína p53, que está constantemente comprobando el
rendimiento de todos los procesos del ciclo celular y, en particular, los
relacionados con la síntesis de ADN, este sistema es sensible al estrés celular
de fuentes externas tales como la radiación, que a menudo resulta en daño al
ADN (Zentella et al., 1996; Besson et al., 2008).

Si el daño en el ADN no es demasiado grave, la detención del ciclo celular

inducida por p53 se produce, mientras que se repara el daño, sin embargo, si el
daño es grave, la célula es impulsada hacia la senescencia o la apoptosis
inducida por p53 (Tan et al., 2014; Besson et al., 2008; Tang et al., 2002), ya que

15
interacciona directamente con la endonucleasa AP y la ADN polimerasa que
están implicados en la reparación por escisión (Tang et al., 2002).

p53 también induce ciertas proteínas, como GADD45 que colaboran en la

reparación del ADN, si el daño se repara correctamente, p53 estimula la síntesis
de Mdm2, activando su autodestrucción y la progresión en el ciclo celular
(Spurges et al., 2006).

Si el daño no puede ser reparado, la célula puede entrar en apoptosis o en

senescencia, ambos inducidos por p53. La proteína ataxia telangiectasia mutada
(ATM), también puede ser activada e iniciar la respuesta de daño genético, dicha
respuesta inhibe la reparación del ADN (Tan et al., 2014).

El incremento de p53 inhibe la progresión de G1 a S en células con ADN dañado

y por medio de este mecanismo se previene la acumulación de ADN dañado en
las generaciones siguientes (Zhou y Elledge, 2000). Además, la detención del
ciclo celular vía incremento de la proteína p53 confiere una ventaja proliferativa
a las células vecinas que no tienen dañado su ADN y que presentan bajos niveles
de p53 (Tan et al., 2014).

Así que si la proteína p53 funciona normalmente constituye un sistema muy

eficaz en la protección de la integridad del ADN del organismo (Kastan y Bartek,
2004).

El supresor tumoral p53 es un factor de transcripción que regula el metabolismo,

las señales de estrés, la supervivencia celular, el control del ciclo celular y la
estabilidad del genoma mientras que las funciones de la proteína pRb (localizado
en el cromosoma 9p21) y de su vía reguladora, radica en que es diana molecular
crítica en la progresión maligna (Kastan y Bartek, 2004; Zhou y Elledge, 2000).

El producto del gen retinoblastoma (pRb) en su estado hipofosforilado se une al

factor de trascripción E2F, cuando el pRb5 libera a E2F lo lleva a la trascripción
de genes críticos para la progresión de células de la fase G1 a la fase S del ciclo
celular (Zhou y Elledge, 2000).

La alteración en la función de Rb se puede deber a una mutación del gen p16

que se relaciona con el ciclo celular, y su principal función es la inhibición de las
cinasas dependientes de ciclinas 4 y 6, lo cual evita la fosforilación de la pRb e

16
impide la progresión del ciclo celular desde la fase G1 a la fase S (Kastan y
Bartek, 2004).

Las alteraciones del gen p16 pueden dar lugar a la falta de proteínas, o a
proteínas no funcionales (como las que se nombran en la tabla 1), perdiendo la
célula este importante mecanismo de control del ciclo celular (Sperka et al.,
2016).

Tabla 1. Genes Involucrados en el ciclo celular y cáncer

Categoría Gen Función Alteración

I c-ras, c-myc, c-abl, c-Src, Factores de Aumento de su
c-fas, c-jun, c-ets trascripción y función
transducción
II p53, Rb, APCI, MPCI, Puntos de control Degradación o
p16, p21, p27 de ciclo celular. perdida de la función
Crecimiento y
proliferación
III a) Bcl-2, bax Inhiben apoptosis Expresión ganancia
b) p53, c-myc, Inducen apoptosis de la función
factores solubles Degradación o
como TNF y Fas perdida de la función

Tabla 1. Modificado de: https://www.scielosp.org/article

La acumulación de mutaciones, el incremento en la actividad del ciclo celular, la

pérdida de la efectividad en los mecanismos de reparación del daño al ADN así
como la disminución en la muerte celular; llevan a la selección de una clona con
características de célula cancerígena capaz de evadir los mecanismos
apoptóticos.

II.IV Apoptosis
La apoptosis es el suicidio celular que interviene en la embriogénesis, en el
recambio celular de los tejidos y en la eliminación de células infectadas, mutadas
o dañadas (Gupta, 2000). La diferencia morfológica con la necrosis es que en la

17
apoptosis se produce la fragmentación de ADN mientras se mantiene la
integridad de la membrana hasta estadios tardíos de la muerte celular (Gupta,
2001) (Figura 6).

Figura 5. Fase M del ciclo celular de la cual se obtendrán dos células hijas y dependiendo de
las mutaciones puede ser una célula sana o bien una célula cancerígena.
https://mmegias.webs.uvigo.es/descargas/atlas-celula-08-ciclo-celular.pdf

La diferencia bioquímica entre la apoptosis y la necrosis es que el primero es

dependiente de energía y de la síntesis de nuevas proteínas, mientras que en la
necrosis falla el aporte de energía y la síntesis de proteínas se interrumpe
(Ivanchuck, 2004).

En el proceso de apoptosis se distinguen varias fases: en la fase D1 se producen

los mecanismos moleculares que inician el fenómeno; en la fase F se fragmenta
el ADN; en la fase D2 se produce la destrucción nuclear y citoplásmica, y los
restos son fagocitados por macrófagos (Solé et al., 1995). Los procesos
morfológicos y bioquímicos que caracterizan a la apoptosis están mediados por
“efectores de muerte celular” como las caspasas (proteasas cisteínicas) (Gupta,
2000; Gupta, 2001).

Pero para que estos efectores actúen es necesario que el balance vida-muerte
se rompa por la interacción de los “activadores de muerte celular”, extracelulares
o intracelulares, ya sean las integrinas, factores de crecimiento o bien las
proteínas Bcl-2 involucradas en el control de la apoptosis, convergiendo al fin
estas dos señales para la activación de las caspasas (Burgés-Gasión, 2005).

18
Las células cancerosas son capaces de evadir la apoptosis y dividirse
continuamente a pesar de sus desregulaciones, la pérdida del supresor tumoral
p53 es una causa común ya que la inactivación de la proteína p53 hace que la
célula sea incapaz de sentir el daño del ADN que genera la apoptosis (Hanahan
y Weinberg, 2000).

Los miembros de la familia anti-apoptótica Bcl-2 e IAPs (proteínas inhibidoras de

apoptosis que inhabilitan la apoptosis) se sobreexpresan y contrarrestan las
acciones anti-apoptóticas de las proteínas BH3 (iniciadores de la via apoptotica)
(Vo y Lettai, 2010). Bcl-2 es capaz de unirse a Bax y Bak, previniendo la
formación de poros, también puede inhibir proteínas BH3, previniendo
respuestas al daño del ADN y evitar la muerte celular a pesar de los daños, estas
proteínas en conjunto con la división celular continua, conducen al crecimiento
tumoral (Wong, 2011).

El cáncer al ser una enfermedad multifactorial que ha obligado a los

investigadores a estudiarla desde distintas perspectivas de origen y progresión

Uno de los fenómenos más estudiados es la desregulación en el ciclo celular, la

evasión de la apoptosis etc., un enfoque diferente en los factores intrínsecos que
desencadenan la enfermedad y que ha tomado relevancia en los últimos tiempos
es el estrés oxidativo, ya que todas las funciones fundamentales se llevan a
través de un proceso de óxido reducción, tomándose como una posibilidad más
para la investigación en cáncer.

II.V. Estrés Oxidativo

La homeostasis de la oxidación-reducción como el control de pH, es fundamental
para la vida (Königsberg-Fainstein, 2007). Prácticamente todos los procesos
fundamentales desde la bioenergética hasta el metabolismo y las funciones
vitales tienen que ver con un proceso redox (Kobayashi et al., 2006).
El estrés oxidativo es un término utilizado desde 1956 para hacer referencia a la
adición de peróxido de hidrogeno (H2O2) a los eritrocitos (Helmut et., al, 2017).

El Estrés Oxidativo (EO) aparece en las células y tejidos cuando existe una
perturbación del equilibrio entre las sustancias pro-oxidantes y antioxidantes, en

19
términos químicos, el EO es un aumento en la reducción del potencial celular o
una disminución en la capacidad reductora de los pares redox (Viada-Pupo et.,
al, 2017).

La homeostasis de la oxidación-reducción como el control de pH, es fundamental

para la vida; prácticamente todos los procesos fundamentales desde la
bioenergética hasta el metabolismo y las funciones vitales tienen que ver con un
proceso redox (Sen et al., 2000), los seres humanos, están constantemente
expuestos a un sin número de agresiones originadas por toda clase de estímulos
tales como las infecciones microbianas y virales, los xenobióticos, las toxinas
provenientes de la dieta y la hipoxia (Sies y Jones, 2007); los cuales inducen la
formación de moléculas oxidantes y electrófilas que tienen la capacidad de dañar
a las biomoléculas del organismo y por lo cual la célula ha desarrollado
programas dinámicos para contender contra el estrés causado por las moléculas
oxidantes y electrófilas, constituyendo el primer grado de protección contra los
xenobióticos (Königsberg-Fainstein, 2007).

La principal ruta que tiene que ver con el estrés oxidativo es NRF2, en
homeostasis NRF2 se encuentra ligado a Keap1 en el citoplasma de la célula, si
no está unido a Keap1 la molécula se vuelve inestable y se podría mover al
núcleo, pero al estar ligado NRF2 pasa al proteosoma para poder ser destruido
y degradado o bien reciclado, pues bien, al pasar al núcleo de la célula hace
unión a los elementos de Respuesta Antioxidante (ARE)

II.VI. NRF-2/KEAP
Para poder comprender el rol que tiene NRF2, hay que remontarse a los “ARE:
Antioxidant Response Element”; que regulan a nivel transcripcional enzimas
citoprotectoras en respuesta al estrés químico, se encuentran en los promotores
de los genes que codifican enzimas de detoxificación (Nguyen, et. al, 2009). La
actividad de NRF2 está regulado en parte por la proteína KEAP1 actino asociado,
que actúa mediante la unión y la inmovilización del factor de transcripción en el
citoplasma; la activación de NRF2 se da en respuesta a las señales de estrés
que se cree que resulta de una interrupción en esta asociación (Nguyen, et. al,
2009) (Figura 7).

20
 Figura 6.Ruta de activación de NRF-2 y los diferentes escenarios mediante los cuales se puede
activar la ruta, donde NFR-2 en homeostasis está ligado a KEAP, si no está ligado a KEAP se
vuelve una molécula inestable y se podría mover al núcleo, al entrar al núcleo se une con los
ARE y se activa la transcripción de genes para encimas cito protectoras

Por lo tanto, NFR-2 es un activador transcripcional que pertenece a la familia de

los factores transcripcionales CapnCollar (Königsberg-Fainstein, 2007); la
actividad de NRF2 está regulada por KEAP1, que promueve la ubiquitinación y
la posterior degradación de NRF2 en condiciones normales y libera la actividad
inhibida de NRF2 tras la exposición a factores externos e internos, tales como
radiación (Murakami y Motohashi, 2015).

La activación de NRF2 en las células cancerosas confiere resistencia terapéutica

y capacidad tumorigénica, lo que incrementa su progresión maligna (Murakami
y Motohashi, 2015). Las mutaciones somáticas de los genes KEAP1 y NRF2 son
algunas de las principales causas de la activación constitutiva de NRF2
(Kitomura y Motohashi, 2018).
Otros genes de interés debido a su interacción de la ruta son el complejo
PI3K/AKT o vía de supervivencia celular que regula una serie de procesos
biológicos que incluyen el crecimiento celular, la diferenciación, la apoptosis y la
transformación neoplásica, y ya que en algunas enfermedades según varios
artículos se ha demostrado que NRF2 puede ser activado por este complejo.

21
II. VII. AKT
AKT codifica una serina / treonina quinasa que tiene un dominio con homología
a la Pleckstrina regulador corto de carboxilo terminal. Hay tres miembros de la
familia AKT (AKT1, AKT2 y AKT3) (Rodriguez-Viciana, 1994).

AKT se activa mediante un mecanismo regulador dual que requiere tanto la

translocación a la membrana plasmática como la fosforilación en Thr308 y
Ser473. La generación de PIP3 en la parte interna de la membrana plasmática,
después de la activación de PI3K, recluta AKT por interacción directa con su
dominio de PH (El dominio PH es una secuencia peptídica de 100 a 120
aminoácidos que fue reconocida por primera vez en la plecstrina y que forma
parte de muchas proteínas transductoras de señales), (Figura 8) (Sanhueza-
Chávez, 2007).

Figura 7. AKT es un efector clave de la fosfatidilinositol 3-quinasa (PI3K) y nodo esencial de esta
cascada de señales que regula múltiples procesos celulares tales como el crecimiento, la
transformación, la diferenciación y la supervivencia, contiene cuatro dominios para su
activación. Obtenida de (Sanhueza Chávez, 2007)

En la membrana, otra serina / treonina quinasa que contiene el dominio PH

denominada proteína-quinasa dependiente de 3-fosfoinositida-1 (PDK1) fosforila
AKT en Thr308. La fosforilación de Thr308 es necesaria y suficiente para la
activación de AKT27 (sin embargo, la activación máxima requiere fosforilación
adicional en Ser473 por PDK2, una quinasa que se ha caracterizado
bioquímicamente, pero cuya identidad molecular permanece indeterminada. La
exploración secuencial del genoma humano revela que no hay homólogos de
PDK1, lo que indica que PDK2 probablemente pertenece a una clase diferente
de quinasas (Sun et al., 2001).

Los modelos adicionales de activación de AKT incluyen autofosforilación en el

sitio de PDK2 y oligomerización ayudada por la leucemia de células T1 (TCL1),

22
el producto de un oncogén que se sobre expresa en leucemias de células T con
translocaciones 14q32-129,30 (Vivianco, Sawyer, 2002).

Las principales consecuencias biológicas de la activación de AKT que son

relevantes para el crecimiento de células cancerosas se pueden colocar en tres
categorías: supervivencia, proliferación (mayor número de células) y crecimiento
(mayor tamaño de células) (Li et al., 2006). Se ha identificado la activación de
AKT en adenocarcinoma gástrico, el cáncer de mama, de ovarios, de páncreas,
de próstata y de pulmón.

II.VIII. PI3K
PI3K se convirtió por primera vez en un foco de atención en el campo de la
investigación del cáncer a mediados de la década de 1980, cuando se hizo
evidente que la actividad de PI3K estaba física y funcionalmente asociada con la
actividad transformadora de los oncogenes virales, como la tirosina quinasa SRC
y el antígeno medio poliomavirus1 (Li y Zhu, 2002). Los detalles moleculares de
la historia comenzaron a desarrollarse, quedó claro que las PI3K eran
heterodímeros con subunidades reguladoras y catalíticas separadas, y que la
subunidad reguladora p85 de PI3K era un sustrato de fosfoproteína de tirosinas
quinasas citoplasmáticas receptoras (Graff, 2002). La p85 se asocia
directamente con las tirosinas quinasas activas a través de la interacción física
de su dominio SH2 con residuos de fosfotirosina, en el contexto de una secuencia
consenso YXXM, en la quinasa (Woodget, 2005). En algunos casos, la
interacción p85-RTK es indirecta y ocurre a través de fosfoproteínas intermedias,
como los sustratos del receptor de insulina irs1 e irs2 (Vivianco, Sawyer, 2002).
Los PI3K de clase I, catalizan la fosforilación de los lípidos que contienen inositol,
conocidos como fosfatidilinositoles (PtdIns), en su posición 3 (Vivianco, Sawyer,
2002).

El sustrato primario in vivo es PtdIns P2 (en adelante denominado PIP2), que se

convierte en PtdInsP3 (denominado PIP3). Las PI3K de clase I constan de dos
subgrupos, IA e IB, que transmiten señales de tirosina quinasas y receptores
acoplados al G-proteico, respectivamente. Los PI3K de clase IA son los que
están involucrados en la oncogénesis (Li y Zhu. 2002).

23
La actividad catalítica de PI3K está estrechamente regulada en las células
normales por diversos mecanismos. Un complejo preformado, inactivo p85-p110
está presente en el citoplasma de las células en reposo, listo para la activación
en respuesta a las señales apropiadas (Vivianco, Sawyer, 2002).

La actividad de la proteína Nrf2 puede ser modulada por modificaciones post-

traduccionales, como fosforilaciones en serinas y treoninas por diversas cinasas
como fosfatidilinositol 3-cinasa (PI3K). La fosforilación por estas enzimas al
parecer facilita la disociación de Nrf2 de Keap1 y su posterior translocación.
Como respuesta al estrés oxidativo, la cascada de señalizaciones mediada por
PI3K produce la despolimerización de los microfilamentos de actina, facilitando
la translocación nuclear de Nrf2 (Murakami y Motohashi, 2015), lo que significaría
que PI3K potencia la respuesta celular, ya sea en apoptosis, ciclo celular o
traslación.
Para la proliferación del cáncer hace falta además de una desregulación en el
ciclo celular, o en los genes, la angiogénesis, esta juega un papel importante ya
que através de la creación de vasos sanguineos nuevos, es como las celulas
dañadas pueden migrar a otros organos o tejidos del organismo para asi crear
una metástasis, un cancer metastásico es una de las principales causas de
muerte al no haber una deteccion tempra ya que muchas veces se desconoce el
origen y por cual es mas complicado el tratamiento.

II.IX. Angiogénesis y metástasis

La angiogénesis se refiere a la formación de nuevos vasos sanguíneos a partir
de un sistema de vasos ya existente, esta se lleva a cabo principalmente por los
siguientes pasos (Ferrara y Kerbel, 2005; Martinez-Esquerro y Herrera, 2006):

Las células endoteliales (ECs) precursoras dan origen a los vasos sanguíneos,
se ensamblan formando un laberinto vascular primitivo de capilares pequeños
(vasculogénesis), después el plexo vascular se expande de manera progresiva
debido al nacimiento de los vasos; el cual se remodela formando una red
vascular altamente organizada de vasos grandes que se ramifican en vasos
pequeños (Ferrara, 2002).

24
Los canales recién formados por ECs, son cubiertos por pericitos y células de
músculo liso, las cuales regulan la contracción y dilatación de los vasos
sanguíneos, proporcionando resistencia y permitiendo la regulación de la
perfusión de los vasos (Yancoupolous, 2000). Las células neoplásicas tienen
incrementado su metabolismo y, por ende, requieren de mayor aporte de
oxígeno; en las mismas existen genes que codifican factores que estimulan la
angiogénesis tumoral, que es el primer requisito necesario para iniciar la cascada
metastásica (Fernandez et al., 2004).

La metástasis se puede definir como la capacidad que tienen las células

malignas de abandonar el tumor primario, migrar e implantarse en los tejidos de
un órgano a distancia, proliferando y formando nuevos tumores (Arvelo y
Poupon, 2001). Sin embargo, solo una célula de entre diez mil que logre
introducirse al torrente sanguíneo o linfático podrá asentarse para desarrollar un
foco metastásico, para lo cual (Cano-Ballesteros, 2012).

La célula maligna debe desprenderse de sus vecinas y “navegar” por el espacio

intercelular y atravesar la membrana basal (degradación de matrices), esta debe
introducirse al vaso sanguíneo o linfático (migración celular, para después
sobrevivir al ataque de la respuesta inmune (respuesta inmune), atravesar
nuevamente la pared vascular y “anidar” en otro tejido que muchas veces no es
igual al que provenía (Fernandez et al., 2004).

II.X. Panorama General del Cáncer

Hoy en día un tema recurrente en los problemas de salud a nivel mundial es el
cáncer, según las estadísticas de la Agencia Internacional para la investigación
en Cáncer, mundialmente contamos con una población de 7,632,819,272 de
habitantes de los cuales 18,078,957 son diagnosticados con algún tipo de cáncer
y mueren alrededor de 9,555,027 personas por la enfermedad que o bien han
sobrellevado la patología con una prevalencia de 5 años, o simplemente se
suman a las estadísticas al tener una detección tardía de la enfermedad y por
ende la muerte.

El cáncer de mama (CaMa), según la “Agencia Internacional para Investigación

en Cáncer” encabeza la lista de causas de muertes a nivel global en ambos

25
sexos, con una incidencia de 1,930,389 de casos nuevos en una categoría de
edad de los 5 hasta los 79 años y con una moralidad de 520,723 mujeres al año
(GCO, 2018) (Figura 9).

Índices estimados de cáncer en el mundo en 2018, ambos sexos en edades de 5 hasta 79 años

Mama

Próstata

Pulmón

Colon

Cérvico Uterino

Estomago

Hígado

Útero

Tiroides

Ovario

Figura 8. Grafico representativo de los tipos de Cáncer a Nivel Mundial para ambos sexos en
una edad de 5 hasta 75 años, obtenido de: https://gco.iarc.fr/today/online-analysis-multi-
bars?v=2018&mode=cancer

Comparando las estadísticas mundiales con México, se observa que la tendencia

mundial se repite, ya que la principal causa de muerte en México es el cáncer de
mama con 27, 283 nuevos casos detectados al año y generando 6,884 muertes
por año esto hasta el 2018 (Figura 10).

Número de Nuevos Casos en 2018, ambos sexos, todas las Edades en México

Mama

Próstata

Otros Canceres Colon

Tiroides

Cérvico uterino

Figura 9. Casos de Cáncer en México en ambos sexos en todas las edades, obtenido de:
https://gco.iarc.fr/today/data/factsheets/populations/484-mexico-fact-sheets.pdf

26
La visión a futuro no es muy esperanzadora ya que se espera que para el año
2040, los casos de cáncer en ambos sexos, sigan incrementándose (Figura 11).

Figura 10. Estimado de Incidencia de Cáncer de 2018 hasta 2040 en ambos sexos, obtenido de:
https://gco.iarc.fr/tomorrow/graphic-line

Dados los índices alarmantes a nivel mundial, así como nacional y dado que el
cáncer representa una de las causas de mortalidad más significativas, analizar
genes involucrados con la ruta del estrés oxidativo en líneas celulares
provenientes de diferentes tipos de cáncer, permitirá obtener un panorama más
general del papel de esta ruta en el desarrollo del cáncer.

II.XI Cáncer de mama

En el mundo incluyendo México, el cáncer de mama ocupa en la actualidad el
primer lugar en incidencia en neoplasias malignas en las mujeres, representa
14.3% de todos los casos de cáncer, con un incremento de 1.5% anual a nivel
mundial (Miaja y Moral, 2019).

Sin embargo, en los países de economía emergente este incremento es de

alrededor del 5% (Miaja y Moral, 2017). El grupo de edad más afectado se
encuentra entre los 40 y los 59 años de edad, los factores asociados al desarrollo
de cáncer de mama son biológicos como: sexo femenino, el envejecimiento
antecedentes personales o familiares de cáncer de mama en madre, hijas o
hermanas, antecedentes de hallazgos de hiperplasia ductal atípica, imagen
radial o estrellada, así como carcinoma lobulillar in situ por biopsia, vida
menstrual mayor a 40 años (menarca antes de los 12 años y menopausia
después de los 52 años), la densidad mamaria, ser portador conocido de los
genes BRCA1 o BRCA2 (DeSantis, 2014).

27
Hay factores ambientales, entre los que se encuentran, exposición a radiaciones
ionizantes, principalmente durante el desarrollo o crecimiento (in utero, en la
adolescencia) o tratamiento con radioterapia en tórax (Villareal-Garza et al.,
2013); factores de riesgo relacionados con los antecedentes reproductivos como
la nuliparidad, primer embarazo a término después de los 30 años de edad,
terapia hormonal en la perimenopausia o posmenopausia por más de cinco años
(DeSantis, 2014) o factores de riesgo relacionados con estilo de vida, como una
alimentación rica en carbohidratos y baja en fibra, dieta rica en grasas tanto
animales como ácidos grasos trans, la obesidad, principalmente en la
posmenopausia, sedentarismo, consumo de alcohol o tabaquismo (Fredholm et
al., 2009).

La clasificación histopatológica de los carcinomas mamarios de acuerdo con la

Organización Mundial de la Salud (OMS) se divide en no invasores (in situ),
invasores y otros (enfermedad de Paget del pezón).

Aproximadamente 75-80% de los cánceres son invasivos esta característica les

da a las células la capacidad de penetrar alrededor de los canales linfáticos y
vasculares dando metástasis (Schmidt, 2015). El tipo histológico más frecuente
es el carcinoma ductal invasor que representa el 70 al 80%, el segundo más
común es el lobulillar invasor (5-10%), difícil de diagnosticar por su diseminación
difusa en vez de formar una masa (Reyna y Lee, 2014).

Otros tipos de cáncer menos comunes son el tubular, medular, mucinoso y

papilar, el carcinoma ductal in situ (CDIS) permanece confinado al sistema de
conductillos de la mama sin penetrar la membrana basal, aproximadamente el
30 al 50% de las pacientes con CDIS desarrollara carcinoma ductal en un periodo
de 10 años (Fredholm et al., 2009).

El carcinoma lobulillar in situ (CLIS) se origina del lobulillo terminal ductal,

pudiéndose distribuir de forma difusa por la mama, las mujeres con CLIS tienen
un riesgo de hasta el 30% de desarrollar cáncer de mama invasor, más
frecuentemente ductal, presentándose con la misma frecuencia en ambas
mamas, por lo que se considera un factor de riesgo más que un precursor de
cáncer de mama (Martín et al., 2015).

28
La enfermedad de Paget es relativamente rara, representa aproximadamente el
1% de los cánceres de mama, afectando el complejo areola pezón (Villareal-
Garza et al., 2013).

Dentro de la clasificación molecular y genética del cáncer de mama el cáncer

más agresivo y difícil de detectar debido a las técnicas que se utilizan en él, es
el triple negativo o CMTN.

El CMTN es un concepto dentro de la oncología que nace luego que se

reconocieran los diferentes perfiles genéticos del cáncer de mama, luego de la
identificación del subtipo basal del cáncer de mama, se observó, durante la
evaluación con paneles de inmunohistoquímica, que un grupo de ellos, además,
se caracterizaba por la ausencia de expresión de los receptores de estrógeno,
de progesterona y del receptor 2 del factor de crecimiento epidérmico humano
(HER2) (Vilagran-Fraguell et al., 2016).

Entonces se requiere de la triple negatividad de estos marcadores para poder

identificar esta enfermedad, el fenotipo triple negativo reúne a un grupo de
enfermedades con conductas biológicas diferentes, de epidemiologia no
claramente precisada, pero que comparten un abordaje diagnóstico y terapéutico
similar (Kojima et la, 2011).

A los tumores derivados del epitelio mamario se les conoce genéricamente con
el nombre de carcinomas y los derivados de la mesénquima como sarcomas, y
pueden ser ordenados los tumores benignos y malignos más comunes
(Uematsu, 2009) (Tabla 2).

29
Tabla 2 Clasificaciones de los tipos de tumores mamarios y las patologías
que se expresan en base a su clasificación

Clasificación Patologías
Tumores benignos  Fibroadenoma mamario
 Tumor phyllodes
 Papiloma
canalicular/Intracanalicular
 Papilomatosis Múltiple
Displasias mamarias  Condición fibroquística
 Adenosis mamaria
Padecimientos Infecciosos e  Absceso mamario
inflamatorios  Mastitis del puerperio
 Ectasia de los conductos
 Enfermedad de Mondor
Miscelánea  Ginecomastia
 Hiperplasia virginal
 Galactocele
Tumores Malignos  Carcinoma mamario
 Sarcoma de mama

Tabla 3 obtenido de Consenso Mexicano sobre diagnóstico y tratamiento del cáncer

mamario

II.XI.I. Genes implicados en el Cáncer de Mama

En los últimos años se han descrito diversos genes relacionados con el cáncer
de mama tales como BRCA1 y BRCA2 (el nombre viene del inglés breast cancer
o cáncer de pecho) (parece que por ahora son los más importantes, aunque no
se descartan otros genes BRCA X) (Torrades, 2003). Estos dos genes se asocian
particularmente con el cáncer de mama hereditario, pero existen otros genes
como Rb, p53 y NF-1 que se pueden encontrar mutados tanto en cánceres de tipo
esporádico como hereditario (Cardenas-Sánchez et al., 2013)

Aunque no se han identificado todos los genes o mutaciones relacionadas con

este tipo de cáncer, se han encontrado algunas regiones cromosómicas

30
comunes en el cáncer de mama, algunos genes mutados y otros desregulados.
Se trata de distintos genes con funciones muy distintas como factores de
crecimiento, moléculas que actúan como señales intracelulares, reguladores del
ciclo celular y moléculas de adhesión (Torrades, 2003).

Las primeras evidencias de que existía un gen dominante de la susceptibilidad

al cáncer de mama surgieron en 1984 mediante un modelo estadístico utilizado
por Williams y Anderson a partir del estudio de 200 familias (Williams y Anderson,
1984).

Este primer estudio, junto a otros posteriores, pusieron en evidencia que las
mutaciones en el gen BRCA1 daban lugar a la aparición de síndrome de cáncer
de mama y ovario en el 90% de los casos (el 45% sólo de mama) (Martín et al.,
2015).

Se localizó otro gen relacionado con esta susceptibilidad que se identificó como
BRCA2, los estudios del gen BRCA2 han puesto en evidencia que es el
responsable del 35% de los cánceres de mama hereditarios en mujeres (Miaja y
Moral, 2019).

Los primeros estudios epidemiológicos llegaron a atribuir el 90% de los casos de

cáncer de mama hereditario a los genes BRCA, mientras que estudios recientes
cifran esta prevalencia entre el 45 y el 68% (Kojima et la, 2011).

Se han descrito alrededor de 600 mutaciones distintas en el gen BRCA1 y más

del 75% dan origen a una proteína truncada, este gen se halla ubicado en el
brazo largo del cromosoma 17 (17q21) y codifica para una proteína encargada
de regular el proceso de reparación del ADN (Cepeda-Castilla, et al., 2008).

La proteína BRCA1 interviene en las fases S y G2 del ciclo celular por lo que
cuando se produce un daño en el ADN, la proteína BRCA1 se hiperfosforila y se
relocaliza en los sitios de síntesis de ADN, formando un complejo con otras
proteínas como la BRCA2 y la Rad51, encargadas de reparar el daño al ADN
asociado a la replicación (García et al., 2005).

El gen BRCA1 regula los genes para encontrar y reconocer el daño del ADN y
se cree que induce la expresión de genes reparadores que trabajan para reducir

31
el daño y ayudar a la replicación del ADN, este gen se expresa en las células de
los distintos epitelios del organismo durante el desarrollo (Kojima et la, 2011).

II.XII. Cáncer Cérvico Uterino

El Cáncer Cervicouterino (CaCu) según la Agencia Internacional para la
Investigación en Cáncer, coloca al cáncer cervicouterino como el segundo caso
de muertes en mujer de entre 5 y 75 años de edad con 7869 casos nuevos
anualmente y con una mortalidad de 4,121 mujer por año (Figura 12).
Número Estimado de Muertes en 2018, américa latina y el caribe, México, Honduras, todos los
canceres, mujeres en edades de 5 hasta 79 años
Mama

Otros Canceres
Cérvico Uterino

Pulmón

Ovario Colon

Hígado Estomago

Figura 11. Grafica representativa de los casos de muertes estimadas por los diversos canceres,
obtenida de https://gco.iarc.fr/today/data/factsheets/populations/484-mexico-fact-

Una infección persistente de virus del papiloma humano (VPH) es el factor

etiológico principal en el desarrollo de esta neoplasia (Lizano-Soberón et. al.,
2009). Actualmente se conocen cerca de 100 tipos diferentes del virus de los
cuales al menos 14 son conocidos como oncogénicos, siendo los tipos 16 y 18
los causantes de un 70% de las lesiones precancerosas e inductores del cáncer
en sí (OMS, 2018).

La neoplasia intraepitelial cervical (NIC) es una lesión precursora del cáncer del
cuello uterino, se caracteriza por alteraciones de la maduración de la célula y

32
anomalías nucleares y se han subdividido en tres grados según su extensión y
gravedad NIC I, NIC II y NIC III (Sarduy-Nápoles, 2008); si la displasia está
confinada al tercio inferior del epitelio estamos en presencia de una NIC I también
conocida como neoplasia intraepitelial cervical de bajo grado (NIC-BG) (Sarduy-
Nápoles, 2008); si implica los dos tercios inferiores se denomina NIC II y si las
anomalías nucleares afectan a más de dos tercios de todo el espesor del epitelio
están en presencia de una NIC III (Sarduy-Nápoles, 2008). Estas dos últimas
denominaciones en conjunto se conocen también como neoplasia intraepitelial
cervical alto grado (NIC -AG) (Sarduy-Nápoles, 2008).

En la mayor parte de los carcinomas como el de cérvix o el hepático, el ADN viral

se puede encontrar en las células huésped, diversos estudios han comprobado
que no solo por la presencia del VPH las células van a transformarse en
cancerígenas esto debido a como se desarrollé la neoplasia en el huésped, ya
que no todas las mujeres infectadas por VPH desarrollan lesiones de alto grado
(Sarduy-Nápoles, 2008).

II.XII. I. Genes implicados en el cáncer cervicouterino

Actualmente se sabe de más de 500 genes involucrados en la carcinogénesis

cervical mediante mecanismos de metilación, amplificación genética,
mutaciones, polimorfismo y cambios en el nivel de expresión (Agarwal et al.,
2011). Con frecuencia en el cáncer de cérvix se activan por amplificación
protooncogenes como EGFR, MYC (8q24), ERBB2 (17q11.2-12), CCND1
(11q13), HRAS (11q15.5) y cIAP1 (11q22) (Lida et al., 2011), Otro oncogén que
se sobreexpresa en el tumor cervical es BCL-2 en dependencia del grado de las
lesiones cervicales (Protrka, 2011).

II.XIII. Cáncer colorectal

El cáncer colorrectal (CCR) es el tercer cáncer más común en todo el mundo y
una de las principales causas de mortalidad relacionada con el cáncer, con
1,284,000 casos en el mundo, mientras que en México se desarrollan alrededor
de 10.457 casos nuevos por año, provocando 5700 muertes por año (GCO,
2018). El cinco por ciento de los casos recién diagnosticados en los Estados
Unidos se deben a mutaciones genéticas hereditarias, como la poliposis

33
adenomatosa familiar o el síndrome de Lynch que es reconocido como un
síndrome hereditario de patrón autosómico dominante de penetrancia
incompleta, en el cual hay mutación en los genes reparadores del ADN, y un 20%
adicional de los casos ocurre en personas con antecedentes familiares de la
enfermedad (Coant, et. al., 2018). Por lo que, el 75% de los casos de cáncer de
colon restante, se cree que ocurren esporádicamente. Estos carcinomas
esporádicos se desarrollan a través de la acumulación de modificaciones
genéticas como la activación de oncogenes o la inactivación de supresores
tumorales y alteraciones epigenéticas adicionales, que conducen a la activación
de programas oncogénicos (Coant, et. al., 2018).

II.XIII.I. Genes implicados en el cáncer de colon

Los genes que participan en el desarrollo de cáncer colorrectal (CCR) se dividen

en dos clases: genes supresores de tumor como lo pueden ser APC, DCC y
TP53 y oncogenes, como K-RAS y CTNNB110.

Los genes supresores de tumor codifican para proteínas que inhiben la

proliferación celular o promueven la apoptosis, estos genes a menudo son
inactivados durante la carcinogénesis colorrectal; los oncogenes son versiones
activadas de protooncogenes, los cuales inducen la proliferación celular.

Una vez activados, los oncogenes pueden acelerar el crecimiento celular y

contribuir a la formación del tumor, hay dos mecanismos independientes que
pueden conducir al desarrollo del CCR: el primero es iniciado por la inactivación
mutacional del gen supresor de tumor APC, el cual es responsable de la poliposis
adenomatosa familiar (FAP) y de aproximadamente el 85% de los CCR
esporádicos, algunos de estos carcinomas se desarrollan tras la activación
mutacional de β-catenina (CTNNB1) (actividad normalmente regulada por APC).

El segundo mecanismo es iniciado a través de la inactivación de una familia de

genes supresores de tumor involucrados en la reparación del daño al ADN,
conocidos como genes MLH1 y el gen de segregación posmeiótica aumentada
de tipo 2 (PMS2), se han encontrado mutaciones en estos genes tanto en

34
individuos con CCR esporádico como hereditario y mutaciones en
aproximadamente el 15% de los CCR esporádicos.

Se ha descrito además inactivación mutacional de otros genes supresores de

tumor como DPC4/SMAD4 y activación mutacional de oncogenes como COX-2,
los cuales están presentes en etapas tardías de la formación del CCR

II.XIV. Leucemia
En todo el mundo el cáncer infantil y adolescente amenaza con rebasar las
patologías infecciosas, como una de las principales causas de mortalidad
relacionada con enfermedades en los niños (Henao-Valencia y Martínez-
Quiroaga, 2019). Según la IARC (incidencia mundial reportada de cáncer infantil)
está aumentando, de 165.000 a 215.000 casos nuevos por año para los niños
de 14 años o menos y 85.000 casos nuevos para adolescentes de 15-19 años
(Henao-Valencia y Martínez-Quiroaga, 2019).

La leucemia es el tipo de cáncer más común en niños y adolescentes, leucemia

es el término general que se usa para referirse a algunos tipos distintos de cáncer
de la sangre. Existen cuatro tipos principales de leucemia: Leucemia linfoblástica
(linfocítica) aguda (ALL, por sus siglas en inglés) Leucemia mieloide (mielógena)
aguda (AML, por sus siglas en inglés) Leucemia linfocítica crónica (CLL, por sus
siglas en inglés) Leucemia mieloide (mielógena) crónica (CML, por sus siglas en
inglés).

Estos cuatro tipos de leucemia tienen una característica en común: comienzan

en una célula en la médula ósea, la célula sufre un cambio y se vuelve un tipo
de célula leucémica (Walter, 2012).

La leucemia más común en adultos con más de 97% de los casos es la leucemia
mieloide aguda en la cual se han identificado alteraciones cromosómicas, como
t (8:21) en el (CBF-AML) (RUNX1-RUNX1T1)9 o la t (15:17) (PML-RAR), cuyas
consecuencias son la formación de proteínas quiméricas que trastornan el
proceso normal de maduración de los precursores mieloides, asimismo, la
mutación de genes relacionados con la proliferación y la diferenciación celular
(Tonks et al., 2007).

35
Los tipos de mutaciones que se presentan en la leucemia mieloide aguda se
pueden clasificar en I, II, y III las primeras engloban las vías proliferativas,
mientras que las mutaciones de clase II están relacionadas con la hematopoyesis
y las de clase III con mutaciones en la regulación exigentica. (De Kourchoski y
Abdul, 2016).

La Leucemia Aguda agrupa diversas enfermedades que tienen en común la

transformación neoplásica de células hematopoyéticas, en leucemias pediátricas
de linaje de células B, las translocaciones t(12;21) (TEL-AML / ETV6-RUNX1),
t(1;19) (E2A-PBX1 / TCF3-PBX1) y t(9;22) (BCR-ABL) y las fusiones que
involucran al gen MLL (principalmente MLL-AF4) son las anomalías genéticas
mejor caracterizadas y de mayor frecuencia. En promedio, ETV6-RUNX1 se ha
reportado en el 25% (rango de 3-45%) de los casos, seguido por TCF3-PBX1
(13%), BCR-ABL (3-5%) y MLL-AF4 (6.0%) (Jimenez-Morales, et al., 2016).

Debido a que es difícil obtener las muestras frescas de pacientes con cáncer,
una alternativa benéfica para el investigador, son las líneas celulares, que se han
convertido en la herramienta funcional, no invasiva y de fácil obtención para el
desarrollo de investigaciones como la presente.

II.XV. Estudio de Líneas Celulares:

Los científicos han desarrollado metodologías para aislar células y obtener
poblaciones celulares homogéneas, que pueden ser incluso mantenidas y
multiplicadas in vitro.

Los cultivos celulares son esenciales en la investigación científica, ya que

permiten estudiar los procesos que ocurren en las células, así como la
investigación sin utilizar modelos animales o humanos (Sergetin, E., 2008).

El cultivo de tejidos y células comenzó en 1907 con un experimento diseñado

para esclarecer una controversia en el área de la neurobiología. El investigador
Dr. Ross Harrison, quien trabajaba en la Universidad Johns Hopkins, publicó un
breve, pero crítico artículo: “Observaciones de la fibra nerviosa viva en
desarrollo”, que introdujo exitosamente una nueva técnica, el cultivo de tejidos,
para demostrar experimentalmente cómo se originan las fibras nerviosas
(Corning, 2002). Los experimentos originales con fibras nerviosas se basaron en

36
el cultivo de pequeños fragmentos de tejidos, llamados “explantos”. Utilizando
técnicas asépticas, Harrison tomó fragmentos del tubo neural (tejido embrionario
precursor del sistema nervioso) de un embrión de rana, y lo depositó en una gota
de líquido linfático fresco (“medio de cultivo”) de rana colocada sobre un
cubreobjetos estéril (Corning, 2002). Una vez que la linfa coaguló, invirtió el
cubreobjetos sobre un portaobjetos de vidrio que poseía una depresión, creando
así un cultivo en gota suspendida, técnica utilizada por los microbiólogos para
estudiar las bacterias (Corning, 2002). Luego de periódicas observaciones al
microscopio, pudo describir el desarrollo de fibras nerviosas in vitro a partir de
las neuronas presentes en el tejido extirpado. Así, además de argumentar
sólidamente la “doctrina neural”, resolvió los problemas básicos del cultivo
celular, como el medio, la observación y la contaminación (Corning, 2002).

Desde 1885 con el primer cultivo de células de embrión de pollo se abrió una
oportunidad de estudio sin el uso de un modelo biológico como tal, llegando a
desarrollarse poco a poco hasta lograr obtener el banco de líneas celulares que
el investigador tiene a su disposición.

37
 III. Justificación:
El cáncer ha sido un problema de salud recurrente a lo largo de los años, es una
enfermedad multifactorial que puede afectar a cualquier clase social o raza, no
distingue entre género o cantidad de años, según las estadísticas al año mueren
9,555,027 de personas, y se espera que en los próximos años aumente la
detección de casos por lo cual este trabajo de investigación planea estudiar la
ruta NRF2 con relación al cáncer. La expresión de NRF2 está fuertemente ligado
al desarrollo del cáncer por lo que es importante conocer los niveles de expresión
de los genes de la ruta, saber cómo se están comportando la expresión en cada
tipo de cáncer, con la finalidad de encontrar un blanco en terapias o en
diagnostico a futuro.

38
 IV. Hipótesis:

El desarrollo y progresión del cáncer está relacionado con la desregulación en

la expresión de genes involucrados en vías celulares importantes como la vía
NRF2 y PI3K/AKT. Estos genes se sobre expresarán en algunos tipos de cáncer
y en otros no lo harán ya que su progresión y desarrollo está ligado a otras vías
celulares.

39
 V. Objetivos:
Objetivo general:

Evaluar la expresión de los genes de la vía NRF2; NRF2, KEAP1 en líneas celulares de
diversos tipos de cáncer, así como la relación que guardan con la expresión de los genes PI3K
y AKT.

Objetivos Específicos:

 Determinar la presencia y los niveles de NRF2 en las distintas líneas celulares y

observar su presencia en las diferentes líneas celulares
 Comparar los niveles de NFE2L2, KEAP 1, PI3K Y AKT respectivamente y como es que
se encuentran expresados en las distintas líneas celulares.

40
 VI. Materiales y Métodos
VI.I. Muestras

Se usaron diversas líneas celulares de mama, colon, cérvico uterino y leucemia.

Las líneas celulares fueron donadas por la Dra. Leticia Rocha Zavaleta del
instituto del Instituto de Investigaciones Biomédicas de la UNAM, tres líneas
celulares de cáncer cervicouterino, cuatro líneas de cáncer de mama, tres líneas
de cáncer de colon, una línea de leucemia y una línea de queratinocitos como
control (Tabla 3).

Tabla 4 Líneas celulares utilizadas para el estudio, acomodadas según el tipo de carcinoma
al que pertenecen

Líneas Celulares:
Cáncer Cérvico CaSki
Uterino SiHa
HeLa
Cáncer de Mama HCC1806
HCC70
MDA MB468
MDA MB 231
Cáncer de Colón SN620
CaCo-2
SW480
Leucemia Jurkat
Células Sanas HaCat

CaSki:
Línea celular humana, proveniente de tejido epitelial de cérvix, que pertenecieron
a una mujer de 40 años de edad caucásica.
SiHa:
Línea celular humana, proveniente de tejido epitelial cervical de un carcinoma de
grado II, infectadas con virus del papiloma humano, perteneciente a una mujer
asiática de 55 años de edad.

41
 HeLa:
Línea celular humana, proveniente de tejido epitelial cervical infectado con Virus
del Papiloma Humano, de paciente con adenocarcinoma de 31 años de edad de
ascendencia negra.
HCC1806
Línea celular humana, proveniente de tejido glandular mamario proveniente de
mujer de 60 años de ascendencia negra. /
HCC70
Línea celular humana, proveniente de tejido glandular mamario y conductos,
proveniente de una mujer de ascendencia negra de 49 años.
MDA MB468
Línea celular humana, proveniente de tejido glandular mamario de un sitio con
metástasis, proveniente de una mujer de 51 años de edad de ascendencia negra.
MDA MB231
Línea celular humana, proveniente de tejido glandular mamario de un sitio con
metástasis, proveniente de una mujer de 51 años de edad caucásica.
SW 620
Línea celular humana, proveniente de un sitio con metástasis del colon de un
hombre de 51 años de edad caucásico.
CaCo-2
Línea celular humana, proveniente de un adenocarcinoma colon rectal de un
hombre de 72 años de edad caucásico.
Sw 480
Línea celular humana, proveniente de un adenocarcinoma colon rectal de un
hombre de 50 años de edad caucásico.
Jurkat
Línea Celular humana, proveniente de sangre periférica, de linfocitos T con
leucemia, de un hombre.

42
VI.II. Procesamiento de las muestras
VI.II.I. Cultivo de Líneas Celulares

Todas las líneas celulares se cultivaron en frascos de 75 cm2 en medio RPMI,

con 10% de suero bovino fetal de Invitrogen, y con Antibiótico/Antimicótico de
Invitrogen, al 1%. Los cultivos se incubaron a 37ºC con atmósfera humidificada
conteniendo un 5% de CO2. Las células se mantuvieron en crecimiento
exponencial mediante la realización de subcultivos dos veces por semana
retirando el medio de cultivo suplementado y realizando 3 lavados con 5 mL PBS
1x pH 7. Posteriormente las células se disociaron con 500 µL de Tripsina de
Invitrogen 0.25% 1x, No. de Catálogo 15050-057 más 1500 µL de Verseno pH
7.0, con una incubación de 5 min a 37ºC. Posteriormente las células se
concentraron por centrifugación a 2500 rpm por 5 min.

VI.II.II. Extracción de RNA por Kit Quick RNA Mini Prep ZyMo

Se utilizó el Kit Quick-RNA MiniPrep de ZYmo, para la extracción de RNA a los

viales con las células previamente crecidas se les adicionó 300µl del Buffer de
Lisis, se centrifugó el vial a 14,000 rpm durante 30 segundos, después se
transfirió el líquido a una columna de purificación amarilla o filtro se centrifugó
una vez más a 14,000rpm durante 30 segundos, al sobrenadante que paso por
la columna, se le agregó un volumen de etanol al 100%, se mezcló bien y se
incubo durante 1 min.
Después de la incubación, se pasó el contenido a una columna de purificación
verde o columna de Spin rápido, y se centrifugó a 14,000rpm por 30 segundos,
se descartó el sobrenadante y a la columna se le agregaron 400µL de buffer de
lavado y se centrifugó a 14,000rpm durante 30 segundos, se incubo 1 min y se
volvió a centrifugar a 14,000rpm, 30 segundos.
En un tubo se prepararon 5µL de DNAsa y 75µL de Buffer de Digestión por
reacción, del contenido del tubo, se adicionaron 80µL a cada uno de los viales,
para después ser incubados a Temperatura Ambiente durante 15 minutos.
Después de la incubación se colocaron 400µL de RNA Prep Buffer a la columna
y de centrifugó a 14,000rpm por 30 segundos y se descartó el sobrenadante.

43
A la columna se le adicionaron 700µL de RNA wash buffer, se incubó durante 2
minutos y se centrifugó a 14,000rpm durante 2 minutos para asegurar que todo
el líquido ha sido removido.
La columna finalmente se transfirió a un tubo libre de RNAsas, se eluyó el RNA
con 36µl de agua libre de DNA/RNAsas.

VI.II.III. Digestión de DNA por DNAsa

Para eliminar el DNA que pudiera estar contaminando las muestras se realizó
una digestión del DNA contaminante con DNAsa de Thermoscientific de
Termofisher, a los tubos con el RNA previamente extraído se les añadió 1µL de
Buffer de DNAsa 10x, 1µL de DNAsa I y 10µL de agua, se incubaron a 37º por
30 minutos, después de la incubación a cada tubo se le adiciono 3µl de EDTA
(50Mm), para después ser incubadas a 65º por 10 minutos. Las muestras se
guardaron a -70º hasta su utilización.

VI.II.IV. Síntesis de la Cadena de cDNA

Toda la preparación se hizo en hielo, se utilizó el kit RevertAid H Minus First

Strand cDNA Synthesis Kit. Del RNA extraído se tomaron 15µL a los cuales se
les adicionó 1.2µL de primers random hexamer y 1.8µL de agua, el vial se incubó
durante 5 minutos a 65º, para después añadirle 6µl de 5x Buffer de reacción,
1.5µL de Ribo look, 3µL de dNTP Mix y 1.5 µL de retro transcriptasa.
Se utilizó un control interno de RNA, proporcionado por el kit, al cual se le
adicionó 1 µL de RNA proveniente del kit, 0.5 µL de primer y 4.5 µL de agua.
Para las muestras se realizó un mix que contenía 6 µl de buffer de reacción 5x,
1.5 µL de Ribo Look, 3 µL de dNTP Mix y 1.5 µL de retro transcriptasa, para cada
una de las muestras. Para el control positivo se realizó un mix con 2 µL de buffer
de reacción 5x, 0.5 µL de Ribo Look, 1µL de dNTP Mix y 0.5 µL de retro
transcriptasa.
Los viales se colocaron en un termociclador para generar tres reacciones: 1) 5
minutos a 25º, 2) 60 minutos a 45º y 3) 5 minutos a 70º.

44
VI.II.V. PCR control GAPDH

Para la PCR de control se utilizó un PCR master Mix de Thermoscientific de

Thermofisher. Los productos obtenidos de la formación de cDNA se almacenaron
a -70° hasta su uso, se descongelaron y se prosiguió haciendo un mix que
contenía: 2 µL de cDNA de RT, 5 µL de Buffer PCR 10x, 0.1 µL de dNTP Mix 10
mM, 3 µl de MgCl₂ 25 mM, 1.5 µL de primer F (GAPDH) y R (GAPDH), 5
µL de Taq Polimerasa y 35.5µL de Agua.
Como control, se utilizó GAPDH, se realizó un mix que contenía 2µL de GAPDH
50ng/µL, 1 µL Oligo dT (Hexamero), 4µL de buffer de reacción 5x, 1 µL de Ribo
look RNAsa, 2 µL de dNTP mx 10 mM, 1 µL de Reverse Transcript y 9 µL de
agua. Se programó el termociclador a 94° por 3 min, 35 ciclos de 94° por 30
segundos, 58° por 30 seg y 72° por 45 seg.

VI.II.VI. PCR en tiempo Real

A partir de la síntesis de cDNA, se llevó a cabo la reacción de PCR cuantitativo,

la cual es empleada para detectar y cuantificar las moléculas de cDNA presentes
en la muestra a partir de cebadores o primers específicos.

La cuantificación se realizó a partir de un análisis de fluorescencia que proviene

del reactivo SYBR GREEN, el cual se utiliza como colorante para la
cuantificación del ADN bicentenario o de sondas tipo Taqman las cuales son
sondas de hidrólisis diseñadas para incrementar la especificidad de la PCR
cuantitativa.
El análisis se realizó en el termociclador fasta 7500 real time qPCR de Thermo
Scientific, el cual es capaz de detectar en tiempo real la fluorescencia que es
equivalente al número de veces que se ha amplificado el producto.

En la tabla 4 se presentan los oligos utilizados para analizar los genes

específicos de nuestro interés:

45
 Oligos
Tabla 5. Oligos Correspondientes a los Genes utilizados para la investigación
Name Sequence Scale Purification PRODUCTO TM
Nrf2 forward ATAGCTGAGCCCAGTATC 25nm STD 125 57.5
Nrf2 reverse CATGCACGTGAGTGCTCT 25nm STD 125 57.5
KEAP1 forward CCGGGAGTACATCTACATGC 25nm STD 143 57.5
KEAP1 reverse TGATGCAGGCGTGGAAG 25nm STD 143 57.5
PI3K forward GGCTTGGACCGAATGCT 25nm STD 148 58
PI3K reverse TTGTTGAAGGCTGTGGC 25nm STD 148 58
AKT forward GCTGAAGAGATGGAGGTGTC 25nm STD 107 57
AKT reverse AGGATCACCTTGCCGAAAG 25nm STD 107 57

La mezcla de reacción se realizó utilizando el kit Máxima SYBR Green/ROX

qPCR Master Mix (2x). El cual se utilizó bajo las siguientes condiciones:

La mezcla de reacción total que se analizó, contenía: 1µL de cDNA, 1µL de

primer forward (5mM), 1µL de primer reverse (5mM), 3µL de agua y 6µL del kit
Maxima SYBR Green/ROX qPCR Master Mix (2x).

Cada muestra se analizó por duplicado en tubos individuales de 0.1µL marca

AbGene con tapa.

El termociclador fue programado con las siguientes condiciones

 95ºC por 10 minutos

 95ºC por 15 segundos
 57.5ºC por 1 minuto

Para la curva de disociación se programó que se hiciera de manera continua,

seguida por las condiciones:

 95ºC 15 segundos
 57.5ºC por 1 minuto
 95ºC 15 segundos

El análisis de CT se llevó a cabo por el software del equipo, y el cálculo de

expresión relativa se llevó a cabo por el método de Livak and Schmittgen, 2001

46
 ∆CT
R = 2[CT sample – CT control] R = 2

R = 2–[∆CT sample – ∆CT control]

R = 2–∆∆Ct

VI.II.VII Análisis Estadísticos:

La evaluación de la expresión de genes, es una técnica que se utiliza para

comparar la expresión que tienen los genes de una muestra con los genes base,
para determinar si existen variaciones entre uno y otro.

Una vez que se obtuvieron los resultados del delta delta ct, se analizó por
pruebas
El análisis estadístico se llevó a cabo con el software GraphPad Prism versión
6.0 para Windows, GraphPad Software, (San Diego, California, USA). Utilizando
el método de Mann-Whitney, se consideraron diferencias estadísticamente
significativas con un valor de p<0.05.
Se consideran significativos los valores obtenidos que fueron mayores a 1. Para
determinar la cantidad expresada de cada gen se realizó la siguiente operación
con el fin de determinar la cantidad de gen expresado por línea celular.

CT problema –CT control = ΔCT

ΔCT problema – ΔCT control= ΔΔCT

ΔΔCT= Expresión del gen por línea

Rn=2- ΔΔCT

El análisis de Ct se llevó a cabo por el software del equipo, y el cálculo de

expresión relativa se llevó a cabo por el método de Livak and Schmittgen, 2001.

47
 VII. Resultados

VII.I. Cultivos celulares:

Las líneas celulares cultivadas crecieron según lo esperado representándose en

las fotografías (Figura 12 a 18), donde podemos apreciar sus diversas
morfologías,
SIHA MDA-MB-231 MDA-MB-468

Figura 17SiHa Figura 16MDA MB 231 Figura 15MDAMB 468

JURKAT CASKI SW480

Figura 14Jurkat Figura 13CASKI Figura 12SW480

48
VII.II Extracción de RNA, Concentración y Pureza de las muestras La
extracción del RNA proveniente de las líneas celulares a través del kit Quick- RNA
mini prep fue exitoso, representándose en las siguientes concentraciones
y purezas obtenidas de nanodrop (Tabla 5):

Tabla 6 Concentraciones y Purezas RNA Comprobación en Geles de Agarosa

Línea Celular Concentración: 260/280

ng/µl
Cáncer CaSki 154.1 1.79
Cervicouterino SiHa 134.9 1.91
HeLa 237.7 1.89
Cáncer de HCC1806 318.4 1.86
Mama HCC70 152.8 1.95
MDA MB 468 116.6 1.90
MDA MB 231 130.6 1.85
Cáncer de SN620 189.4 1.77
Colon CaCo-2 153.3 1.82
SW480 159.8 1.63
Leucemia Jurkat 108.4 1.85

En un gel de agarosa con bromuro de etidio se corrieron las 11 muestras de RNA

obtenidas de las líneas celulares para comprobar que el RNA podía ser
procesado, en la fotografía (Figura 19) se pueden apreciar las sub unidades del
ribosoma, en dos bandeos en cada una de las muestras, lo que indica que el
RNA, es funcional para la investigación, al no haber degradaciones y tener un
intenso bandeo comprobamos que obtuvimos las concentraciones necesarias
para el estudio.

49
 1 2 3 4 5 6

Figura 18 Gel de Agarosa, muestras de RNA

VII.III. Gel de PCR control GAPDH

Se realizó la PCR control a partir de un fragmento de 150pb del gen GAPDH

Figura 20. PCR GAPDH

VII.IV. PCR TIEMPO REAL

Se realizó una PCR en tiempo real con los oligos correspondientes a los genes
de la ruta de estrés oxidativo NRF2/KEAP 1 y dos más que se relacionan con la
ruta AKT/PI3K, dando como resultados los datos de la expresión colocados en
las tablas 6, 7, 8 y 9.

50
 TABLA 6. Expresión Relativa de Genes para el Gen NRF2

Gen Linea CT Gen CT GAPDH ∆CT1 Cт Gen CT Gen ΔCT2 ΔΔCт Expresión
Problem celular Problema Problema EN GAPDH en (ΔCT1- relativa de
HACAT
a HaCat ΔCT2) genes

NRF2 CACO2 23.51996613 18.485 5.03496613 26.03936 29.5688 -3.52943995 8.564406079 0.003

NRF2 CASKI 20.43736267 16.1634 4.27396267 26.03936 29.5688 -3.52943995 7.803402625 0.004

NRF2 HCC1806 20.3456 17.3197 3.0259 26.03936 29.5688 -3.52943995 6.555339954 0.011

NRF2 HCC70 33.7785 28.1323 5.6462 26.03936 29.5688 -3.52943995 9.175639954 0.002

NRF2 HELA 25.1981 18.2618 6.9363 26.03936 29.5688 -3.52943995 10.46573995 0.001

NRF2 JURKAT N.D. N.D N.D N.D N.D N.D N.D N.D

NRF2 MDAMB231 23.082 17.4759 5.6061 26.03936 29.5688 -3.52943995 9.135539954 0.002

NRF2 MDAMB468 21.9846 17.469 4.5156 26.03936 29.5688 -3.52943995 8.045039954 0.004

NRF2 SIHA 21.4838 15.3135 6.1703 26.03936 29.5688 -3.52943995 9.699739954 0.001

NRF2 SW480 22.9924 17.8186 5.1738 26.03936 29.5688 -3.52943995 8.703239954 0.002

NRF2 SW620 23.5798 18.4608 5.119 26.03936 29.5688 -3.52943995 8.648439954 0.002

N.D. No Determinado

51
 TABLA 7. EXPRESION RELATIVA DE GENES PARA GEN KEAP 1

GEN LINEA CT GEN CT ∆CT1 CТ GEN CT GEN ΔCT2 ΔΔCТ (ΔCT1-ΔCT2) EXPRESION
PROBLEM CELULAR PROBLEMA GAPDH PROBLEMA GAPDH RELATIVA
A EN HACAT EN DEL GEN
HACAT
KEAP1 CACO2 27.95533752 18.0024 9.95293752 33.0668564 22.0776 10.9892564 -1.03631886 2.051
KEAP1 CASKI 23.99244308 14.9915 9.00094308 33.0668564 22.0776 10.9892564 -1.988312244 3.968
KEAP1 HCC1806 33.78149414 17.891 15.8904941 33.0668564 22.0776 10.9892564 4.901237756 0.033
KEAP1 HCC70 36.87123871 28.2027 8.66853871 33.0668564 22.0776 10.9892564 -2.320717676 4.996
KEAP1 HELA 26.85999298 15.8 11.059993 33.0668564 22.0776 10.9892564 0.070736597 0.952
KEAP1 JURKAT 36.93813324 19.6317 17.3064332 33.0668564 22.0776 10.9892564 6.317224503 0.013
KEAP1 MDAMB231 29.97324181 26.1628 3.81044181 33.0668564 22.0776 10.9892564 -7.178814578 144.890
KEAP1 MDAMB468 22.57585144 15.012 7.56385144 33.0668564 22.0776 10.9892564 -3.425404944 10.744
KEAP1 SIHA 23.85475159 14.9642 8.89055159 33.0668564 22.0776 10.9892564 -2.098721027 4.283
KEAP1 SW480 23.83197784 14.7302 9.10177784 33.0668564 22.0776 10.9892564 -1.88747854 3.700
KEAP1 SW620 23.87687302 15.2816 8.59527302 33.0668564 22.0776 10.9892564 -2.393983368 5.256

52
 TABLA 8. EXPRESION RELATIVA DE GENES PARA GEN AKT

GEN LÍNEA CT GEN CT ∆CT1 CТ GEN CT GEN ΔCT2 ΔΔCТ (ΔCT1- EXPRESION
PROBLEMA CELULAR PROBLEMA GAPDH PROBLEMA GAPDH EN ΔCT2) RELATIVA
EN HACAT HACAT DE GENES
AKT CACO2 24.90956688 18.0024 6.90716688 30.1402874 22.0776 8.0626874 -1.15552052 2.228

AKT CASKI 22.37760162 14.9915 7.38610162 30.1402874 22.0776 8.0626874 -0.676585674 1.598

AKT HCC1806 23.717659 17.891 5.826659 30.1402874 22.0776 8.0626874 -2.236028403 4.711

AKT HCC70 34.45197296 28.2027 6.24927296 30.1402874 22.0776 8.0626874 -1.813414438 3.515

AKT HELA 24.88239288 15.8 9.08239288 30.1402874 22.0776 8.0626874 1.019705484 0.493

AKT JURKAT 35.01745605 19.6317 15.3857561 30.1402874 22.0776 8.0626874 7.32311821 0.006

AKT MDAMB231 23.814 17.4759 6.3381 26.03936 29.5688 -3.52943995 9.867539954 0.001

AKT MDAMB468 20.15078354 15.012 5.13878354 30.1402874 22.0776 8.0626874 -2.92390386 7.589

AKT SIHA 22.805233 14.9642 7.841033 30.1402874 22.0776 8.0626874 -0.221670628 1.166

AKT SW480 18.97652817 14.7302 4.24632817 30.1402874 22.0776 8.0626874 -3.816359232 14.088

AKT SW620 20.5417347 15.2816 5.2601347 30.1402874 22.0776 8.0626874 -2.802552704 6.977

53
 TABLA 9.. EXPRESION RELATIVA DE GENES PARA GEN PI3K

GEN LINEA CT GEN CT ∆CT1 CТ GEN CT GEN ΔCT2 ΔΔCТ (ΔCT1- EXPRESION
PROBLEM CELULAR PROBLEMA GAPDH PROBLEMA GAPDH EN ΔCT2) RELATIVA
A EN HACAT HACAT DE GENES
PI3K caco2 25.87332726 18.0024 7.87092726 29.7519608 22.0776 7.67436075 0.196566501 0.873

PI3K CASKI 22.37220001 14.9915 7.38070001 29.7519608 22.0776 7.67436075 -0.293661594 1.226

PI3K HCC1806 23.1892 17.891 5.2982 26.03936 29.5688 -3.52943995 8.827639954 0.002

PI3K HCC70 35.41822815 28.2027 7.21552815 29.7519608 22.0776 7.67436075 -0.458832605 1.374

PI3K HELA 25.85646629 15.8 10.0564663 29.7519608 22.0776 7.67436075 2.382105539 0.192

PI3K JURKAT 32.46796417 19.6317 12.8362642 29.7519608 22.0776 7.67436075 5.161952019 0.028

PI3K mdamb231 37.77205276 26.1628 11.6092528 29.7519608 22.0776 7.67436075 3.93489201 0.065

PI3K mdamb468 22.31322861 15.012 7.30122861 29.7519608 22.0776 7.67436075 -0.373132147 1.295

PI3K SIHA 23.48925781 14.9642 8.52505781 29.7519608 22.0776 7.67436075 0.850681782 0.555

PI3K sw480 22.14617538 14.7302 7.41597538 29.7519608 22.0776 7.67436075 -0.25838537 1.196

PI3K sw620 22.82254791 15.2816 7.54094791 29.7519608 22.0776 7.67436075 -0.133412842 1.097

54
 Tabla 10. Expresión Relativa de Genes obtenida del método de Livak and Schmittgen, 2001

Líneas Celulares
Cáncer Cérvico Cáncer de Mama Cáncer de Colon Leucemia
Uterino
CasKi SiHa HeLa MDA MDA HCC1806 HCC70 SW620 CaCo2 SW480 JURKAT
MB321 MB468
NRF2 0.004 0.001 0.007 0.001 0.003 0.010 0.001 0.002 0.002 0.002 0
GENES

KEAP1 3.967 4.283 0.952 144.890 10.743 0.033 4.995 5.252 2.050 3.699 0.012
AKT 1.598 1.166 0.493 0.001 7.588 4.7110 3.514 6.976 2.227 14.087 0.006
PI3K 1.225 0.554 0.191 0.065 1.295 0.002 1.374 1.096 0.872 1.196 0.027
Cuadros marcados en color azul mostraron significancias para el análisis de genes

555
La expresión de los genes obtenida de la PCR en tiempo real se puede observar
en la gráfica 1, donde KEAP 1 tiene más de 144 réplicas en la línea MDA MB
231 proveniente de Cáncer de mama, en la gráfica global también se aprecia que
hay sobre expresión del mismo en la mayoría de las líneas celulares
exceptuando HeLa de cáncer cérvico uterino y Jurkat de leucemia, KEAP 1 es
un represor transcripcional lo que podría indicar que estaba ejerciendo su trabajo
al reprimir a NRF-2 gen al que está ligado en el citoplasma y que continuamente
ubiquitina para ser desechado.

AKT por otro lado es el segundo gen más expresado y con valores significativos,
lo cual era de esperarse ya que AKT regula múltiples procesos celulares tales
como el crecimiento, la transformación, la diferenciación y la supervivencia, al
ser células cancerosas, la presencia del gen se hace significativo.

Gráfico 1 Gráfica Global. En la gráfica se puede observar en rojo la expresión del gen AKT, en
Naranja PI3K, azul para KEAP1 y Verde para NRF-2, esto en comparación con GAPDH, donde el
gen más expresado tiene 144 réplicas y algunos de los genes no mostraron expresión

56
Si analizamos el gen que menos se expresó estaríamos hablando de NRF-2,
podemos observar la expresión de dicho gen en la gráfica 2 donde los valores
más significativos parecen ser en la línea celular de CaCu. CaSki, no se
considera sobre expresado dado que su valor está por debajo de 2, además
podemos observar que en general en las líneas celulares con este gen no se
mostró actividad representándose en barras apenas visibles pues lo valores
tienden de 0 a 0.004, indicando que la actividad de NRF2 esta normal.

*P=0.0879

Gráfico 2.Gen NRF2. Donde en azul se puede apreciar la expresión del gen sin significancia
mostrado en barras en azul.

El gen KEAP1 al mostrar mayor sobre expresión se considera uno de nuestros

genes de interés en el estudio, KEAP1 forma el complejo NRF2/KEAP1, sin la

57
correcta interacción entre NRF2 y KEAP1, NRF2 podría ingresar al núcleo de las
células y activar su actividad cito-protectora, podemos ver que en las líneas
celulares en donde tuvo mayor expresión KEAP 1, fue en dos de las tres líneas
usadas para el experimento y ambas corresponden a cáncer de mama, donde
se sobre expresa en mayor número de veces es en la línea MDA MB 231.

Gráfico 3Donde Keap1 es el gen que más se ha expresado en las líneas celulares representado
en barras amarillas

58
Los resultados del gen AKT muestran una sobre expresión en por lo menos 6 de
las 11 muestras de líneas celulares, haciéndolo el segundo gen que más
actividad mostró de los 4 seleccionados para el estudio, ya que al solo no
expresarse en las líneas de Cáncer Cérvico Uterino y en la línea de leucemia
podemos observar una sobre expresión en las líneas de cáncer de mama a
excepción de MDA MB 231 al tener una actividad no significativa, el
comportamiento de este gen en la PCR en tiempo Real puede ser observada en
la gráfica 4 la cual de forma visible nos muestra la sobre expresión del gen,
debemos considerar que es interesante la sobre expresión de AKT ya que en
conjunto con PI3K forman parte importante de la ruta apoptótica, AKT está
involucrado en procesos relacionados con el crecimiento y la supervivencia
celular, lo que hace evidente la sobre expresión del gen.

Gráfico 4Grafico 4. AKT. Sobre expresión del gen AKT en líneas celulares mostrando sobre
expresión marcado por barras rojas

59
PI3K forma parte del complejo con AKT, pero en la PCR tiempo real no mostró
resultados significativos en ninguna de las líneas celulares como se muestra en
el gráfico 5 representándose con barras visibles ya que la escala de los valores
es hasta 1.5 mostrando que, si hubo actividad del gen, mas no se sobre expresó
más de sus réplicas necesarias para ser consideradas significativas.

Grafico 5. Sobre expresión del gel PI3K en líneas celulares, sin valores significativos mostrando
mayor actividad en las líneas celulares de cáncer de mama y colon aún sin ser significativos.

60
 VIII. Discusión
De acuerdo al trabajo revisado de varios autores, se esperaría que se sobre
expresará en todas las líneas celulares NRF2, ya que NRF2 tiene dos vías de
acción: es una de las vías de defensa y supervivencia celular más importantes,
ya que Nrf2 puede proteger las células y los tejidos de una variedad de tóxicos y
carcinógenos al aumentar la expresión de varios genes cito protectores; los
estudios han demostrado que Nrf2 también puede proteger las células
cancerosas de los agentes quimioterapéuticos y facilitar la progresión del cáncer,
una explicación a los resultados bajos de NRF2 en el estudio en líneas celulares
podría deberse a que las células de estas líneas, no son células troncales, las
células troncales estarían relacionadas a la resistencia a quimioterapias,
mientras que las células cancerosas normales no lo están.

Dado a que KEAP1 es indispensable para la ubiquitinación y degradación de

NRF2 según el autor del artículo “The emerging role of the Nrf2–Keap1 signaling
pathway in cáncer”, la sobre expresión de KEAP 1 podría deberse a que hubo
una represión de NRF2 que como el mismo autor explica en el artículo genera o
puede generar una resistencia a quimioterapias o bien ayudar a la progresión de
las células cancerosas, ya que una vez que la célula ha sido expuesta a estrés
oxidativo KEAP1 se inactiva, y no puede represar a NRF2, y al estar presente en
el núcleo promueve la transcripción de genes, la codificación de enzimas
desintoxicantes y proteínas de estrés antioxidante.

Según el artículo “The Keap1–Nrf2 pathway: promising therapeutic target to

counteract ROS-mediated damage in cancers and neurodegenerative diseases”,
KEAP 1 en humanos consta de 27 cisteínas que actúan como sensores ROS en
la regulación del homeostasis celular, al estar probándose el gen en células
cancerosas, las cuales esta demás mencionar que la homeostasis en estas
células se ha perdido, haría evidente la sobre expresión del gen ya que después
de todo, la célula ha perdido sus capacidades originales, poniendo en alerta a
KEAP 1.

Por otro lado el artículo “Clinical and Pathological Characteristics of KEAP1- and
NFE2L2-Mutated Non–Small Cell Lung Carcinoma (NSCLC)” nos abre un
panorama a la mutación o posibles mutaciones que podría haber en KEAP 1 y

61
NRF2 ya que si se presenta una mutación en estos genes se promueven la
proliferación celular en tumores y también pueden participar causando
resistencia a la quimioterapia ya que la regulación negativa de NFE2L2 o la
sobreexpresión de KEAP1 desencadenan la sensibilidad a la quimioterapia, pero
dado a que en este estudio no se trabajaron mutaciones no se puede opinar
desde este punto de vista quedando la incógnita para futuros estudios.

Un dato interesante es la sobre expresión de AKT como ya se ha señalado

anteriormente este gen está encargado de procesos celulares como el
crecimiento, la transformación, la diferenciación y la supervivencia y dada a su
sobre expresión en la mayoría de líneas celulares es un blanco interesante a
trabajar en futuros proyectos, ya que se demuestra su sobreexpresión en la
mayoría de fenotipos cancerosos.

62
 IX. Conclusiones
El cáncer es un problema de salud global que no podemos dejar de lado.
Durante mucho tiempo se ha tratado de encontrar la cura para dicho
padecimiento, ya que el cáncer no discrimina entre sexo, edad, etnia, clase
social, etc… volviéndose un problema persistente para la sociedad, por lo cual
este tipo de proyectos que buscan conocer más a fondo las neoplasias aportan
a la comunidad científica un nuevo enfoque para futuros estudios; se plantearon
para esta investigación un objetivo general y tres objetivos específicos, los
resultados planteados en el desarrollo del proyecto nos dicen que el objetivo
general se cumplió ya que se evaluó la expresión de los genes de la vía NRF2;
NFE2L2, KEAP1 en líneas celulares de diversos tipos de cáncer, así como la
relación que guardan con la expresión de los genes PI3K y AKT mediante una
PCR en tiempo Real, donde los resultados cumplen los objetivos específicos
que se refieren a observar la desregulación de los genes en las diferentes líneas
de cáncer humano correspondientes para cáncer de mama, cáncer cérvico
uterino, cáncer de colon y leucemia, arrojando los datos que dichos genes se
sobre expresaron sobre todo en las líneas de cáncer de mama y cérvico uterino,
dos de los cánceres que según las estadísticas generan un total de
aproximadamente 80,000 muertes en la población femenina anualmente.
La hipótesis de la investigación señala que el desarrollo y progresión del cáncer
está relacionado con la desregulación en la expresión de genes involucrados en
vías celulares importantes como la vía NRF2 y PI3K/AKT; y que estos genes se
sobre expresarán en algunos tipos de cáncer y en otros no lo harán ya que su
progresión y desarrollo está ligado a otras vías celulares, dentro de los
resultados podemos observar que la línea celular de Jurkat no obtuvo sobre
expresión significativa de ninguno de los genes, lo cual indicaría que ciertamente
estos genes no están ligados a la progresión de todos los canceres sin embargo
KEAP 1 el más sobre expresado estaría ligado a cáncer de mama y cérvico
uterino, al haber mostrado más significancia en los datos resultantes.

63
 X. Literatura Citada:

1. . Kojima Y, Tsunoda H, Honda S, Kikuchi M, Kawauchi N, Yoshida A, et al.

2011. Radiographic features for triple negative ductal carcinoma in situ of the
breast. Breast Cancer.;18:213---20
2. Agarwal SM, Raghav D, Singh H. y Raghava GPS.2011. CCDB: a curated
database of genes involved in cervix cancer. Nucleic Acids Res.; 39: 975-9.
3. Arce, C., Bargalló, E., Villaseñor, Y., Gamboa, C., Lara, F., Pérez-Sánchez.,
V. y Villarreal P. (2015). Onco Guía; Cáncer de Mama. Instituto Nacional de
Cancerología. México D.F. 10pp
4. Arvelo F. y Poupon M. F. 2001. ASPECTOS MOLECULARES Y
CELULARES DE LA METASTASIS CANCEROSA. Laboratorio de Cultivo de
Tejidos y Biología de Tumores, Instituto de Biología Experimental, Facultad
de Ciencias, U.C.V., Apartado 47114, Caracas- Venezuela, 56pp.
5. Brandan, N., Aguirre, M. V., Todaro, J. S., Stoyanoff, T. R., Heitrich, M. O. y
García, D. M. 2014. Genética del Cáncer, Protooncogenes y Genes
supresores de tumores. Universidad Nacional del Nordeste, Facultad de
Medicina. 16pp
6. Burgués Gasión, J.P., Pontones Moreno, J.L., Vera Donoso, C.D., Jiménez
Cruz, J.F., & Ozonas Moragues, M. (2005). Mecanismos del ciclo celular y la
apoptosis implicados en las resistencias a los fármacos de uso intravesical
en el cáncer superficial de vejiga. Actas Urológicas Españolas, 29(9), 846-
859.
7. Cano-Ballesteros S. Universidad de Málaga Beneficiaria de una ayuda del
Programa de Prácticas de Laboratorio de la Asociación Española Contra el
Cáncer. España. (5) 138-139
8. Cardenas-Sanchez, J., Bargallo-Rocha, E., Erazo-Valle, A., Maafs-Molina E.
y Poitevin-Chacon, A. 2013. Consenso Mexicano sobre diagnóstico y
tratamiento del cáncer mamario. Colima, Mexico. 125pp.
9. Coant, N., García-Barros, M., Zhang, Q., Obeid, L.M., Y Hannun, Y. A. (2018).
AKT as a key target for growth promoting functions of neutral ceramidase in
colon cancer cells. Macmillan Publishers Limited, part of Springer Nature
2018. 12pp.
64
10. De Kouchkovsky I, Abdul-Hay M. Acute myeloid leukemia: a comprehensive
review and 2016 update. Blood Cancer J 2016;6(7): e441.
11. Esteller, M. 2008. Epigenetics in Cancer. New England Journal of Medicine,
358(11), 1148–1159.
12. Ferrara N, Kerbel R. 2005. Angiogenesis as a therapeutic target. Nature, 438:
967-974
13. Ferrara N: 2002. Role of vascular endothelial growth factor in physiologic and
pathologic angiogenesis: therapeutic implications. Semin Oncol, 29: 10-14
14. Fredholm H, Eaker S, Frisell J et al (2009) Breast cancer in young women:
poor survival despite intensive treatment. PLoS One 4(11): e7695
15. García N, Salamanca F, Astudillo-De la Vegas H, Curiel-Quesada E, Alvarado
I, Peñaloza R, et al. A molecular analysis by gene profiling reveals Bik/NBK
overexpression in sporadic breast tumor samples of Mexican females. BMC
Cancer 2005;5:93.
16. Graff J R. 2002. Expert Opin. Theor. Targets, 6, 103.
17. Gupta S. 2000. Molecular steps of cell suicide: an insight into immune
senescence. J Clin Immunol;20(4):229-239
18. Gupta S. 2001. Molecular steps of death receptor and mitochondrial pathways
of apoptosis. Life Sci;69(25- 26):2957-2964.
19. Hanahan D, Weinberg RA. 2000.The hallmarks of cancer. Cell 100: 57-70
20. Hanahan, D. y R.A. Weinberg. The hallmarks of cáncer Cell, 100 (2000),
pp. 57-70.
21. Henao-Valencia, L.F., y Martínez-Quiroga, S. L. (2019). Fundación María
José. Pontificia Universidad Javeriana y Facultad de Ciencias Económicas y
Administrativas. Bogotá, D.C. 84pp.
22. Hernández, M., Hernández-Menéndez, M. 2001. Los genes supresores de
tumores y el cáncer. Rev. Cubana Oncol; 17(1):65-71.
23. Imigo G., F., Mansilla S., E., Delama G., I., Poblete S., M., & Fonfach Z., C.
(2018). Clasificación molecular del cáncer de mama. Cuadernos De Cirugía,
25(1), 67-74.
24. Iorio, M.V, Ferracin, M., Liu C.G, Veronese A, Spizzo R, Sabbioni S, Magri
E, Pedriali M, Fabbri M, Campiglio M, Ménard S, Palazzo JP, Rosemberg A,
Musiani P, Volinia S, Nenci I, Calin GA, Querzoli P, Negrini M, Croce CM.

65
 2005. MicroRNA gene expression deregulation in human breast cancer.
Cancer Research.; 65; (16): 7065-7070.
25. Ivanchuk SM, Rutka JT. 2004. The cell cycle: accelerators, brakes, and
checkpoints. Neurosurgery;54(3):692-699
26. Jiménez-Morales, S., Hidalgo-Miranda, A., & Ramírez-Bello, J. (2017).
Leucemia linfoblástica aguda infantil: una aproximación genómica. Boletín
Médico Del Hospital Infantil de México, 74(1), 13–26.
27. Kitamura, H. y Motohashi H. 2018. NRF2 addiction in cancer cells. Cancer
Science. 109:900–911
28. Kobayashi A, Kang M, Watai Y, Tong KI, Shibata T, Uchida K, Yamamoto M
(2006) Oxidative and electrophilic stresses activate Nrf2 through inhibition of
ubiquitination activity of keap. Mol Cel Biol 26:221-229.
29. Königsberg-Fainstein, M. 2007. Nrf2: La Historia De Un Nuevo Factor De
Transcripción Que Responde A Estrés Oxidativo. 26(1): 18-25
30. Li Q y Zhu GD. 2002. Targeting Serine / Threonine Protein Kinase B / Akt and
Cell-cycle Checkpoint Kinases for Treating Cancer. Curr. Top. Med. Chem, 2,
939.
31. Li Q, Zhu GD, Gong J, Jonson E, Giranda V. et al. 2006.Discovery and SAR
of oxindole-pyridine-based protein kinase B/Akt inhibitors for treating cancers.
Bioor. & Med. Chem. Lett., 3424-3429.
32. Lida K, Nakayama K, Rahman MT, Rahman M, Ishikawa M, Katagiri A, et al.
EGFR gene amplification is related to adverse clinical outcomes in cervical
squamous cell carcinoma, making the EGFR pathway a novel therapeutic
target. Br J Cancer. 2011; 105: 420-7.
33. Martín, M., Herrero, A y Echavarria I., 2015. El cáncer de Mama, Arbor.
191(773). A234
34. Martínez-Ezquerro, J.D. y Herrera, L.A. 2006. ANGIOGÉNESIS:
VEGF/VEGFRs como Blancos Terapéuticos en el Tratamiento Contra el
Cáncer. Cancerología 1: 83-96
35. Meza-Junco, J., Montaño-Loza, A., y Aguayo-González, A., 2006. Bases
moleculares del cáncer, Instituto Nacional de Ciencias Médicas y Nutrición
Salvador Zubirán. Revista de Investigación Clínica, 58(1), 56-70.

66
36. Miaja Ávila, M y Moral de la Rubia, J. 2019. Distribución del Inventario Breve
de Síntomas (BSI-18) en una muestra de mujeres con cáncer de mama en
México. Revista de psicología de la salud 7(1), 287-305.
37. Miaja, M. y Moral, J. (2017). Validación del Inventario Breve de Síntomas
(BSI-18) en mujeres mexicanas diagnosticadas con cáncer de mama.
Psicooncología, 14(2-3), 307-24.
38. Palomar-Llatas F., Fornes-Pujalte, B., Díez-Fornes, P., Muñoz-Mañez, V,
Fernandez, L., Arantón-Areosa, y Coruña, A. Guía de actuación en lesiones
Oncológicas, Enfermería Dermatológica (4), 8pp.
39. Quezada, R.M.A. 2007. El ciclo celular, sus alteraciones en cáncer y como
es regulado en células troncales embrionarias. Contactos.; 65:5-12.
40. Reyna C, Lee MC (2014) Breast cancer in young women: special
considerations in multidisciplinary care. J Multidiscip Healthc 29(7):419–429
41. S.I. Hajdu. A note from history: the first tumor pathologist Ann Clin Lab
Sci, 34 (2004), pp. 355-356
42. Sarduy-Nápoles, M.R. 2008. Neoplasia Intraepitelial Cervical. Preámbulo del
cáncer cervicouterino (artículo no disponible rescatado de su versión en línea
en: http://bvs.sld.cu/revistas/gin/vol34_2_08/gin04208.htm)
43. Schmidt C (2015) Immunology: another shot at cancer. Nature
527(7578):S105–S107
44. Sen C.K., Sies, H y. Baeuerle P.A.2000. Antioxidant and Redox Regulation of
Genes, Academic Press, London, pp. 1–562.
45. Sies H y D. Jones, (2007) Oxidative stress, 2nd ed.,in: G. Fink (Ed.),
Encyclopedia of Stress, 3, Elsevier, Amsterdam45–48
46. Solé FJ, Chechile G, Algaba F, Villaviciencio H, Cordon C. 1995. Regulación
del ciclo celular. Bases moleculares de la carcinogénesis. In: Biología
molecular de los tumores urológicos. Madrid: Ene Ediciones;61-66.
47. Sonnenschein, C. y Soto, A. M. 2006. Carcinogenesis and Metastasis Now
in the Third Dimension—What’s in It for Pathologists? Am J Pathol; 168(2):
363–366.
48. Sun M, et al. 2001. AKT1/PKBa kinase is frequently elevated in human
cancers and its constitutive activation is required foroncogenic transformation
in NIH3T3 cells. Am. J. Pathol.159, 431-437

67
49. Uematsu T, Kasami M, Yuen S. Triple-negative breast cancer: correlation
between MR imaging and pathologic findings. Radiology. 2009;250:638---47.
50. Viada-Pupo, E., L. Gómez, Robles. y Campaña-Marrero. I. R. 2017. Estrés
Oxidativo. Correo Científico Médico De Holguín. (1) 1560-4381
51. Vilagran Fraguell, M., Sentís Crivillé, M., del Riego Ferrari, J., Andreu
Navarro, F. J., Dalmau Portulàs, E., Planas Roquerols, J., & Lluïsa Baré, M.
2016. Carcinoma de mama triple negativo. Heterogeneidad inmunofenotípica
y en el comportamiento farmacocinético. Radiología, 58(1), 55–63.
52. Villarreal-Garza C, Aguila C, Magallanes-Hoyos MC, Mohar A et al (2013)
Breast cancer in young women in Latin America: an unmet, growing burden.
Oncologist 18(Suppl):26–34.
53. Vivanco, I., y Sawyers, C. L., 2002. The Phosphatidylinositol 3-Kinsae-AKT
Patway in human cáncer. Nature Publishing Grup (2) 489-501.
54. Vo TT, Letai A. 2010. BH3-only proteins and their effects on cancer. Adv Exp
Med Biol. 687:49-63.
55. Walter, J. 2012. La Leucemia. Leukemia and Lymphoma society. New York.
33pp.
56. Wong RS. 2011. Apoptosis in cancer: from pathogenesis to treatment. J Exp
Clin Cancer Res. 30:87
57. Yancopoulos GD, Davis S, Gale NW, Rudge JS, Wiegand SJ, Holash J: 2000.
Vascular-specific growth factors and blood vessel formation. Nature, 407:
242-2

68
69