LABORATORIO GENÉTICA (BIOCIENCIAS ll)

ENZIMAS DE RESTRICCIÓN

DANIEL ANDRES MORENO ANZOLA 20181081

JUAN ORLANDO SALAS NARVAEZ 20181085

DOCENTE ADRIANA GIL

UNIVERSIDAD DE SANTANDER

SEPTIEMBRE 30, 2020

 1. Introducción

Las enzimas de restricción son proteínas que se unen al ADN de una manera muy
específica que también pueden denominarse nucleasas de restricción,que tienen
actividad de endonucleasas(que pueden realizar cortes en interior de la secuencia
de nucleótidos del ADN); las nucleasas que cortan los enlaces fosfodiéster del ADN
de cadena doble, reconociendo un patrón de secuencia específica de nucleótidos,
que cortan ese punto en concreto llamado sitio o diana de restricción o en un sitio no
muy alejado de este, todo dependiendo de la enzima que son de origen bacteriano,
y se nombran con tres letradas del género y especie de la bacteria de la que se
aislaron originalmente, seguidas a veces por una letra más, que identifica el serotipo
(variante antigénica de la bacteria) y, finalmente, por un número romano que las
identifica cuando en una misma variante se hayan encontrado varias enzimas con
distinta especificidad, generando cortes en el ADN, que son útiles para iniciar una
clonación celular o acelular, que sirven para el análisis de ADN, o para la detección
de polimorfismos,aunque las enzimas de restricción a pesar de ser distintas y
provenir de diferentes especies, este mecanismo es usado para defenderse de ADN
extrangero, teniendo diferentes 3 tipos de enzimas que tendrán diferentes
características, y son las Tipo I y III, reconocen la secuencia específica (secuencia
diana) pero cortan a una distancia distinta del sitio de reconocimiento y usando ATP
para poder desplazarse en el ADN, SAM y el Mg++ como cofactores y la capacidad
de metilar y restringir, pero, la diferencia que existe entre la tipo I y la tipo III, es que
el primero tendrá el corte al alzar y la tipo III tendrá su corte entre 25 a 27 pb río
arriba o río abajo de la secuencia de restricción, siendo inespecíficas a diferencia
de la Tipo II, que reconocen la secuencia específica, y siempre corta entre los
mismos nucleótidos, el fragmento de restricción siempre varia, es de un tamaño
entre 4 a 6 nucleótidos y con frecuencia parcialmente palindrómica (que se lee igual
de izquierda a derecha y viceversa), el mecanismo de corte de ADN se realiza en el
rompimiento de la cadena de fosfodiester en la doble hebra y usando como cofactor
el Mg++, dado lugar a dos tipos de extremos que son Romos o Cohesivos, y
algunos ejemplos de las enzimas bacterianas tipo II implicadas en estos procesos:
 2. METODOLOGÍA DE LA ENZIMA DE RESTRICCIÓN NCOI

Una enzima de restricción, en este caso la ​NCOI, corta una sección de interés
cohesivamente del ADN, más específicamente la secuencia palindrómica
C/CATGG, Ahora introduciéndonos más a fondo en este proceso de digestión
molecular, enfoquemonos en el gen blanco, que ya están marcados por los sitios de
reconocimiento enzimático, el objetivo principal es utilizar las enzima de restricción,
para insertar el gen en el plásmido.

1. cortamos por separado con la enzima NOCI el fragmento del gen y el

plásmido. Este paso produce fragmentos con extremos cohesivos.

2. tomamos el fragmento del gen y el plásmido linearizado (abierto) y los

combinamos con ADN ligasa. Los extremos cohesivos de ambos fragmentos
se unen por apareamiento complementario de bases.

3. Una vez que los une la ligasa, los fragmentos se convierten en un solo
fragmento de ADN sin interrupciones. El gen blanco ya se ha insertado en el
plásmido y tenemos un plásmido recombinante.

A continuación presentaremos los procesos de digestión a nivel de laboratorio paso

a paso:

1. en este primer paso rotulamos los tubos, con el fin de diferenciar, genes
específicos mutados y el respectivo plásmido

2. En este paso agregaremos 4,3 ul de agua.

3. después añadiremos 0,5 ul de buffer

4. agregar 0,2 ul de enzima ​NCOI, como mucho cuidado, manteniendo su

respectiva temperatura, y mezclar suavemente para evitar la inactivación de
la enzima
 5. agregar el adn obtenido de las muestras a los tubos, con ayuda de una
puntera.

6. Ya por último proseguiremos a incubar por una 1 hora a 37 C

La enzima ​NCOI, acompañadas de otras enzimas de restricción​, se mezcla

suavemente y como ya había mencionado, se incuba a 37 C por una hora.
posteriormente, se realizó un análisis electroforético en gel de agarosa al 1% teñido
con BrEt para comparar el patrón de restricción obtenido con el patrón de restricción
estimado mediante este proceso.

DISCUSIÓN

Una analogía que vamos a poder encontrar entre las enzimas de restricción son las
siguientes, generalmente son 3 tipos de enzimas de restricción, las cuales pues
vamos a encontrar, que son la tipo I, la tipo II y la tipo III, lo que caracteriza a cada
una es de que su especificidad en la secuencia de restricción, y los cofactores que
usarán para realizar la metilación y la restricción en la molécula del ADN; iniciando
la Tipo 1 que es una sola enzima con 3 subunidades (2 para la metilación y 1 de
reconocimiento), ya que tiene una cantidad de recepción corta y una modificación
que es la metilación, pues, ella al reconocer la secuencia específica o la secuencia
diana en el ADN, ella va a cortar al azar en sitios distintos del sitio de
reconocimiento, ya sea río arriba o río abajo, y ella nos deja un tipo de corte
cohesivo, lo cual van a hacer uso de una molécula de ATP para poder moverse en
el ADN, desde el lugar de reconocimiento al sitio de corte (más o menos entre unos
1000 pares aproximadamente), y además el usar el Sam (s-adenosilmetionina) y el
Mg++ como cofactores, esta tendrá una similitud con la enzima tipo III qué es una
enzima oligomérica que realizará todas las actividades enzimáticas (restricción y
metilación). Ella tiene cómo función la restricción y modificación en una molécula del
ADN dentro de las bacterias, pero la similitud que ella tiene con la tipo I, es el
reconocimiento de sitios de restricción o las secuencias diana que necesitaran ATP,
magnesio ++, Sam como cofactores, que no van a cortar en el sitio de
reconocimiento, pero la diferencia de la tipo I será el corte al azar, esta cortará a 25
a 27 Pb lejos del sitio de reconocimiento, y dejando extremos cohesivos; Ya
diferencia con la Tipo II, que solo tiene una actividad de restricción a diferencia de
las otros dos tipos de enzimas que llevan a cabo la metilación, el corte en la tipo II
es efectuado en el sitio de reconocimiento, o bien cerca del sitio, por lo que el corte
es conciso y predecible, pudiendo generar 2 extremos en los cortes como Romos y
Cohesivos, haciendo que se caracterice por su especificidad en el corte de los sitios
de restricción, pudiendo generar secuencias Palindrómicas (que se puede leer de
izquierda a derecha o de derecha izquierda), y también algo de lo que se puede
diferir de la tipo II a las tipos I y III, será el requerimiento de magnesio como
cofactor y no harán uso de la molécula de ATP para el desplazamiento de la misma
en la molécula de ADN. Ellas son demasiado utilizadas para el Clonamiento de
genes, van ayudar a hacer mapas de restricción de un plásmido o de un
bacteriófago, otra aplicación que podemos encontrar en las enzimas de restricción,
es que van a ayudar a fragmentar el ADN genómico, para la separación de
electroforesis o la de (SOUTHERN BLOT), también va a llevarse la generación de
fragmentos para ser usados como sondas marcadas de “SOUTHERN Y
NORTHERN” BLOTTING y la generación de fragmentos para ser clonados en los
vectores apropiados haciendo uso de la tecnología del ADN recombinante, donde se
agrupan varias técnicas empleadas en un laboratorio, para hacer la manipulación de
las de las moléculas del ADN, con el fin de estudiarlas y dar una introducción a
genes extraños en el material genético en otra célula que se usará para hacer
cultivos celulares, en donde se usarán enzimas de restricción en los vectores de
clonación (eucariotas y procariotas), que pueden cultivarse en condiciones
controladas, que servirán para hacer cultivos de células madre, vacunas ADN (
también llamadas de ADN desnudo) en donde este ADN codifica a una proteína viral
antigénica de interés, que inducirá la respuesta inmunitaria, o síntesis de nuevos
antibióticos, u otras aplicaciones en la parte de ingeniería molecular, donde
podemos encontrar plantas transformadas a lo que se llamaría a organismos
genéticamente modificadas o transgénicas, por otra lado tenemos las
investigaciones biosanitarias que serviría para la identificación de genes implicados
en enfermedades genética, lo que permitiría la detección y tratamiento del patógeno.
Algunos beneficios, han ayudado a la medicina en diversas ramas, com son las
aplicaciones de la prevención de enfermedades hereditarias, la terapia génica, la
producción de sustancias terapéuticas y la elaboración de vacunas, a partir del
cultivo de microorganismos, de donde obtendrán importantes sustancias como la
penicilina (extraída de un hongo), la insulina (extraída de bacterias); también se han
obtenido a través de plantas y animales transgénicos el factor VIII, que interviene en
la coagulación de la sangre y la producción de hormonas humanas, con el fin de
tratar muchas enfermedades carenciales, como el enanismo por déficit de hormona
del crecimiento, por último uno de los beneficios que mas a impactado en la
medicina son las vacunas, que se obtienen cultivando virus en células vivas, en
laboratorio, los cuales se matan o se debilitan para preparar vacunas contra la
hepatitis B, contra el sida, paludismo y otro tipo de patógenos.

CONCLUSIONES

Con este trabajo podremos concluir que las enzimas de restricción son conjunto
primordial a la hora de ejecución de diversos ensayos útiles en investigación clínica,
desde la determinación fiel de polimorfismos de fragmentos de restricción, Entre las
enzimas que modifican los ácidos nucleicos se encuentran las nucleasas, es decir,
aquellas capaces de cortar los enlaces fosfodiéster que unen los nucleótidos de una
cadena de ácidos nucleicos. El descubrimiento de los diferentes tipos de enzimas ha
facilitado con gran éxito en la investigación las tareas del estudio de los genomas
así como su expresión, su regulación y su posterior correlación con el desarrollo de
diversas enfermedades.

ya abarcando una conclusión más general del tema, concluimos que estas enzimas
de restricción presentan una actividad endonucleasa, que son de origen bacteriano
y cortan los enlaces fosfodiéster del ADN en una secuencia específica denominada
secuencia diana, pudiendo reconocer la secuencia palindrómicas. El uso de estas
enzimas como herramienta biotecnológica surgió de la necesidad de cortar las
largas cadenas de ADN genómico para manipularse y analizarse en fragmentos
más pequeños, pero también pueden confirmar mutaciones detectadas con otras
técnicas.

BIBLIOGRAFÍA

https://www.quimica.es/enciclopedia/Enzima_de_restricci%C3%B3n.html#Tipo
s_de_Enzimas_de_Restricci.C3.B3n

INTRODUCCIÓN A LOS ENZIMAS DE RESTRICCIÓN

Redalyc.Técnicas de Biología Molecular en el desarrollo de la investigación.

Revisión de la literatura

http://blogdelaboratorio.com/las-enzimas-de-restriccion/

Laboratorio 12: Enzimas de Restricción y Electroforesis de DNA

https://es.slideshare.net/ef_salcedo/clase-03-tecnologia-del-adn-recombinante
?next_slideshow=1

https://revistadigital.inesem.es/biosanitario/adn-recombinante/

https://catedrabiologiamolecularusal.files.wordpress.com/2015/02/seminario-1
7-biologia-molecular-3.pdf

https://pdfs.semanticscholar.org/b12b/4ff1a4524091815ae9ed5f97f0d8efdd6fee.
pdf