Caracterizacion Molecular de Cepas de Azotobacter PDF

CARACTERIZACIÓN MOLECULAR DE CEPAS NATIVAS COLOMBIANAS DE
Azotobacter spp. MEDIANTE EL ANALISIS DE RESTRICCION DEL DNA

RIBOSOMAL 16S
DIEGO JAVIER JIMÉNEZ AVELLA
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA

FACULTAD DE CIENCIAS BÁSICAS
MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL
Bogotá, D. C. Colombia
AGOSTO DE 2007.
RIBOSOMAL 16S
TRABAJO DE GRADO
PRESENTADO COMO REQUISITO PARCIAL
PARA OBTAR EL TITULO DE
MICROBIOLOGO INDUSTRIAL
DIRECTOR:
JOSE SALVADOR MONTAÑA
CO-DIRECTORA:
MARIA MERCEDES MARTINEZ
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA

FACULTAD DE CIENCIAS BÁSICAS
MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL
Bogotá, D. C. Colombia
AGOSTO DE 2007
NOTA DE ADVERTENCIA
Articulo 23 de la resolución No 13 de julio de 1946

“La universidad no se hace responsable por los conceptos omitidos por sus alumnos
en sus trabajos de tesis. Solo se velara porque no se publique nada contrario al
dogma y a la moral católica y porque las tesis no contengan ataques personales
contra persona alguna, antes bien se vea en ellas el anhelo en buscar la verdad y la
justicia”
RIBOSOMAL 16S
APROBADO
José Salvador Montaña Msc. María Mercedes Martínez Msc.

Director Codirectora
María del Pilar Márquez Msc.

Jurado 1 Andrea Juliana Mantilla
Microbióloga Industrial
Jurado 2
Bogotá. D. C. Colombia
AGOSTO DE 2007.
RIBOSOMAL 16S
APROBADO
Ángela Umaña MPhil. David Gómez Msc.

Decana Académico Director de Carrera
Bogotá. D. C. Colombia
AGOSTO DE 2007
DEDICATORIA
A mis padres por todo su amor, su esfuerzo constante durante mi carrera, su

comprensión, su ayuda y apoyo incondicional y único, y por creer en mí cada
momento en esta gran etapa de mi vida.
AGRADECIMIENTOS
A mis directores José Salvador Montaña y María Mercedes Martínez, por su

apoyo incondicional, por compartir sus invaluables enseñanzas y conocimientos
conmigo y por acompañarme en este valioso paso en mi vida.
A todas las personas del Laboratorio de Microbiología Ambiental y Suelos de la

Pontificia Universidad Javeriana, por su colaboración y por haber permitido el
desarrollo de esta investigación.
A los investigadores de las Unidades de Saneamiento y Biotecnología Ambiental

(USBA) y Biotecnología Vegetal (UBV) por su colaboración y asesoría.
Al Ingeniero agrónomo Andrés Siabato por su colaboración y asesoría en el

muestreo.
A mis hermanos Julis, Caro y Chepe, por su apoyo y cariño en toda mi carrera.
A mi linis por amarme tanto, por su compañía, por su comprensión y por ser un
apoyo incondicional.
A todas las personas de mi familia que me apoyaron y creyeron en mí día a día.
A mis amigos de la Universidad y de Sogamoso por ser personas importantes y

únicas.
TABLA DE CONTENIDO
1. Introducción...................................................................................................... 1
2. Marco teórico.................................................................................................... 3
2.1. Importancia y problemática del nitrógeno en la agricultura............................. 3
2.2. La rizosfera...................................................................................................... 3
2.3. Microorganismos fijadores de nitrógeno atmosférico (diazótrofos)................. 5
2.3.1. Fijación biológica de nitrógeno (FBN).......................................................... 5
2.3.2. Microorganismos diazotróficos simbióticos.................................................. 7
2.3.3. Microorganismos diazotróficos asimbióticos................................................ 9
2.5. Familia Azotobacteraceae............................................................................... 11
2.6. Generalidades del género Azotobacter spp.................................................... 12
2.6.1. Azotobacter chroococcum............................................................................ 16
2.6.2. Azotobacter vinelandii................................................................................. 17
2.7. Técnicas moleculares para la caracterización e identificación de bacterias
diazotrófas.............................................................................................................. 18
2.7.1. Aplicaciones del DNA ribosomal 16S y su utilización en filogenia y
taxonomía............................................................................................................... 19
2.7.2. Análisis de restricción del DNA ribosomal 16S amplificado
(ARDRA)................................................................................................................. 21
2.7.3. Caracterización, identificación y filogenia del género Azotobacter y otras
bacterias diazótrofas mediante el análisis de restricción del RNA ribosomal 16S
(ARDRA)................................................................................................................ 21
3. Formulación del problema y justificación...................................................... 25
4. Objetivos........................................................................................................... 27
4.1. Objetivo general.............................................................................................. 27
4.2. Objetivos específicos....................................................................................... 27
5. Metodología...................................................................................................... 28
5.1. Lugar de muestreo.......................................................................................... 28
5.2. Muestreo del suelo.......................................................................................... 28
5.3. Procesamiento de muestras............................................................................ 29
5.3.1. Medición de pH de las muestras de suelo.................................................... 29
5.3.2. Aislamiento primario..................................................................................... 29
5.4. Aislamiento secundario.................................................................................. 30
5.4.1. Conservación de cepas mediante la técnica de criopreservación en 30
glicerol al 50% (v/v)................................................................................................
5.4.2. Pigmentación de los aislamientos................................................................ 30
5.4.3. Identificación Bioquímica….......................................................................... 31
5.4.4. Cepa control................................................................................................. 31
5.5. Extracción de DNA.......................................................................................... 32
5.6. Amplificación de DNA ribosomal 16S con iniciadores Y1 y Y3....................... 33
5.7. Análisis de restricción del DNA ribosomal 16S amplificado (ARDRA)............ 34
5.7.1. Perfil electroforético para el ARDRA............................................................ 34
5.7.2. Análisis filogenético...................................................................................... 35
5.8. Restricción virtual............................................................................................ 35
6. Resultados........................................................................................................ 36
6.1. Medición de pH de los cultivos muestreados.................................................. 36
6.2. Porcentaje de recuperación de bacterias diazótrofas aerobias asimbióticas.. 36
6.3. Identificación morfológica de bacterias diazótrofas aerobias
asimbióticas............................................................................................................ 37
6.3.1. Morfología de las colonias............................................................................ 37
6.3.2. Morfología de las células.............................................................................. 37
6.3.3. Pigmentación................................................................................................ 38
6.4. Identificación bioquímica................................................................................. 39
6.5. Extracción de DNA.......................................................................................... 41
6.6. Amplificación del DNA ribosomal 16S con los primers Y1 y Y3...................... 42
6.7. Análisis de restricción del DNA ribosomal 16S (ARDRA)............................... 43
6.7.1. Análisis con la enzima AluI........................................................................... 43
6.7.2. Análisis con la enzima HpaII........................................................................ 44
6.7.3. Análisis con la enzima RsaI.......................................................................... 46
6.8. Cladograma generado del análisis con las tres enzimas................................ 48
6.9. Restricción virtual............................................................................................ 48
6.9.1. Análisis virtual con la enzima AluI................................................................ 50
6.9.2. Análisis virtual con la enzima HpaII.............................................................. 52
6.8.3. Análisis virtual con la enzima RsaI............................................................... 53
7. Discusión de resultados.................................................................................. 56
8. Conclusiones.................................................................................................... 67
9. Recomendaciones............................................................................................ 69
10. Referencias..................................................................................................... 70
11. Anexos............................................................................................................. 86
INDICE DE FIGURAS
Figura. 1. Genes implicados en el flujo de electrones hacia el sitio activo de la

nitrogenasa para la reducción del N2..................................................................... 6
Figura. 2. Quistes de Azotobacter spp.................................................................. 12
Figura. 3. Pigmentación de cepas de Azotobacter................................................ 13
Figura. 4. Colonias de Azotobacter spp. en medio libre de nitrógeno y
morfología celular de Azotobacter spp.................................................................. 14
Figura. 5. Esquema de la organización de los genes involucrados en la síntesis
de las tres nitrogenasas utilizadas por A. vinelandii en la fijación de
nitrógeno................................................................................................................. 18
Figura. 6. Lugar de muestreo en el departamento de Boyacá.............................. 28
Figura. 7. Recolección de las muestras de suelo.................................................. 29
Figura 8. Aislamiento primario............................................................................... 30
Figura. 9. Siembra en estria en agar Ashby con benzoato.................................... 31
Figura. 10. Baterías bioquímicas de azucares...................................................... 31
Figura. 11. Morfología de colonia encontrada en los aislamientos de bacterias
fijadoras de nitrógeno aisladas de cultivos de hortalizas....................................... 37
Figura. 12. Morfología celular de los aislamientos................................................ 38
Figura. 13. Pigmentación de los aislamientos en agar Ashby-Benzoato............... 38
Figura. 14. Caracterización bioquímica de los aislamientos.................................. 41
Figura. 15. Amplificación del DNAr 16S............................................................... 42
Figura. 16. Electroforesis en gel de agarosa al 2.0%. Digestión con la enzima
AluI......................................................................................................................... 43
Figura. 17. UPGMA con la enzima AluI para los aislamientos.............................. 44
HpaII....................................................................................................................... 45
Figura. 19. UPGMA con la enzima HpaII para los aislamientos............................ 46
RsaI........................................................................................................................ 46
Figura. 21. UPGMA con la enzima RsaI para los aislamientos............................. 47
Figura. 22. Análisis de agrupamiento UPGMA obtenido con las enzimas AluI,
HpaII y RsaI para los aislamientos......................................................................... 48
Figura. 23. UPGMA con las secuencias alineadas y comparadas utilizadas en
el análisis de restricción virtual............................................................................... 49
Figura. 24. Restricción virtual con la enzima AluI.................................................. 51
Figura. 25. UPGMA del análisis de restricción virtual con la enzima AluI para
las secuencias obtenidas del Genbank.................................................................. 51
Figura. 26. Restricción virtual con la enzima HpaII............................................... 52
Figura. 27. UPGMA del análisis de restricción virtual con la enzima HpaII para
Figura. 28. Restricción virtual con la enzima RsaI................................................. 54
Figura. 29. UPGMA del análisis de restricción virtual con la enzima HpaII para
INDICE DE ECUACIONES
Ecuación 1. Reacción en la fijación de nitrógeno......................................... 7

INDICE DE TABLAS
Tabla 1. Colores de pigmentos solubles en agua producidos por bacterias del

género Azotobacter.............................................................................................. 13
Tabla 2. Movilidad, formación de filamentos y pruebas bioquímicas utilizadas
para la caracterización del género Azotobacter spp............................................ 15
Tabla 3. Secuencia y número de pares de bases de los iniciadores utilizados
para la amplificación del DNAr 16S de bacterias diazótrofas.............................. 33
Tabla 4. Enzimas de restricción utilizadas en los ensayos de ARDRA............... 34
Tabla 5. Valores de pH de suelo de cada cultivo................................................ 36
Tabla 6. Recuento de gránulos con colonias mucilaginosas y porcentaje de
recuperación por cultivo....................................................................................... 36
Tabla 7. Numero de cepas aisladas en agar Ashby- Sacarosa por cada
cultivo................................................................................................................... 37
Tabla 8. Características fenotípicas de los aislamientos de cepas diazotrófas
encontradas en cultivos de hortalizas en el departamento de Boyacá................ 39
Tabla 9. Caracterización bioquímica de los aislamientos, el control positivo
(ATCC 12518) y la cepa CCT.............................................................................. 40
Tabla 10. Identificación preliminar de los aislamientos....................................... 41
Tabla 11. Morfotipos obtenidos con la enzima AluI............................................. 43
Tabla 12. Morfotipos obtenidos con la enzima HpaII........................................... 45
Tabla 13. Morfotipos obtenidos con la enzima RsaI............................................ 47
Tabla 14. Secuencias obtenidas en el Genbank para el análisis de restricción
virtual.................................................................................................................... 49
Tabla 15. Número de bandas y pesos moleculares mayores a 100pb
generados con la enzima AluI en las secuencias obtenidas del Genbank.......... 50
generados con la enzima HpaII en las secuencias obtenidas del Genbank........ 52
generados con la enzima RsaI en las secuencias obtenidas del Genbank......... 54
RESUMEN
Con el fin de aislar y caracterizar bacterias diazotrófas del genero Azotobacter se

realizó un muestreo de suelo en cultivos de hortalizas ubicados en el
departamento de Boyacá, el aislamiento se realizó en medio Ashby-Sacarosa
libre de nitrógeno. El pH de los suelos se encontró cercano a la neutralidad y el
porcentaje de recuperación obtenido fue alrededor de 40%, los aislamientos
fueron clasificados e identificados fenotípica y bioquímicamente, encontrando
bacterias de las especies A. vinelandii, A. chroococcum, A. negricans y A.
paspali. La caracterización molecular se realizó utilizando un análisis de
restricción del DNAr 16s amplificado (ARDRA), para esto se realizó una
extracción de DNA por medio de la utilización de solventes orgánicos (Fenol), el
gen fue amplificado con iniciadores universales utilizados para bacterias
diazótrofas (Y1-Y3) que amplifican 1487pb del gen. Las enzimas utilizadas en el
ARDRA fueron AluI, HpaII y RsaI las cuales presentaron porcentajes de
polimorfismo alrededor de 16%. Los aislamientos se distribuyeron en tres grupos
que presentaron morfotipos similares para las tres enzimas.
Se realizó una comparación de los morfotipos generados en los aislamientos

frente a los generados en una restricción virtual con las mismas enzimas,
utilizando secuencias parciales del gen DNAr 16s de bacterias diazótrofas
obtenidas del Genbank. Los aislamientos presentaron cierta homología con
bandas generadas con la restricción virtual, sin embargo, algunas
identificaciones no fueron precisas ya que el patrón de bandas coincidía con
otras especies de Azotobacter o con otros géneros como en el caso de los
aislamientos C1BR y C5BR. Por otro lado, el aislamiento C5T presentó el mismo
morfotipo con A. chroococcum para las tres enzimas, indicando que su similitud
genética es evidente con esta especie, además corroborando su identificación
preliminar y su pigmentación en medio benzoato. Demostrando que las técnicas
moleculares junto con las convencionales y la bioinformática son herramientas
fundamentales para la caracterización de bacterias diazótrofas importantes en la
agricultura, además de su importancia en estudios de biodiversidad,
bioprospección y biotecnología.
ABSTRACT
With the aim to isolate and characterized nitrogen fixing bacteria from
Azotobacter genera, a soil sample was made in vegetable cultures located at the
department of Boyacá, the isolation was made in the Ashby-Sucrose medium
free of nitrogen. The PH of soils was found near neutrality, and the porcentage of
recovery obtained was around the 40%, the isolations were classified and
identified phenotypical and biochemiclally, finding bacterias of the species A.
vinelandii, A. chroococcum, A. negricans y A. paspali. The molecular
characterization was made using an amplified ribosomal DNA restriction analysis
(ARDRA), for this an extraction of the DNA was made by using organic solvents
(phenol), the gen was amplified with universal primers used for nitrogen fixing
bacterias (Y1-Y3) that amplifies 1487pb of the gen. The enzymes used in the
ARDRA were AluI, HpaII y RsaI which presented polymorphism percentages
around 16%. The isolations were distributed in three groups that presented
similar morphotypes for the three enzymes.
A comparison betweeen the morphotypes generated by isolations and the ones

generated in a virtual restriction with the same enzymes, using partial secuencies
of the gen DNAr 16s from nitrogen fixing bacterias obtained from the Genbank.
The isolations presented certain similarities with bands generated wtih the virtual
restriction; nevertheless some identifications were not precised due that the
pattern of bands matched with other species of Azotobacter or with other genders
kile in the case of isolation C1BR y C5BR. In the other hand, the isolation C5T
presented the same morphotype with A. chroococcum for the three enzymes
indicating that the genetic similarity is evident with this specie, besides
corroborating its preliminar identification and pigmentation on a bezoatum
medium. Showing that the molecular techniques with the conventional ones and
the bioinformatic are fundamental tools for the nitrogen fixing bacterias
characterization important in the agriculture, besides its importance in
biodiversity, bioprospection and biotechnology studies.
1. INTRODUCCIÓN.
Actualmente la gran mayoría de cultivos agrícolas Colombianos dependen de

los fertilizantes químicos sintetizados, los cuales proporcionan nutrientes
asimilables por las plantas, buscando optimizar los procesos de producción. El
uso indiscriminado de fertilizantes químicos, ocasiona contaminación de cuerpos
de agua y suelos, sumado al incremento de los costos de producción y el
impacto negativo en la salud animal y humana. Por esto, el uso de agricultura
orgánica, tecnologías limpias y seguras, han hecho que los biofertilizantes se
conviertan en una gran alternativa para disminuir estos inconvenientes. Los
biofertilizantes son preparaciones de células vivas o latentes que cumplen
funciones específicas en los cultivos, como, la fijación biológica de nitrógeno, la
solubilización del fósforo, la producción de hormonas promotoras de crecimiento,
la producción de antibióticos y la generación de agentes quelantes de hierro.
Las bacterias fijadoras de nitrógeno (diazótrofas) fueron las primeras en

producirse comercialmente con fines de biofertilización pero posteriormente las
bacterias diazótrofas asimbióticas cobraron importancia en la agricultura. De este
grupo, las más utilizadas como biofertilizantes corresponden al género
Azotobacter, compuesto por 7 especies (Azotobacter chroococcum, A. vinelandii,
A. beijerinckii, A. paspali, A. armeniacus, A. nigricans y A. salinestris), siendo A.
chroococcum y A. vinelandii las que se encuentran en gran proporción en la
rizosfera de suelos tropicales que se caracterizan por poseer altos contenidos de
materia orgánica, fosfatos y valores de pH cercanos a la neutralidad. Las
bacterias del género Azotobacter son fijadores de nitrógeno de vida libre,
solubilizadores de fósforo, productores de sustancias promotoras del
crecimiento vegetal (PGPR) y degradadoras de plaguicidas. Por estas razones
se consideran indicadores de salud en cultivos agrícolas.
Los métodos de cultivo más utilizados para aislar bacterias del género
Azotobacter incluyen aislamiento en medio libre de nitrógeno; enriquecimiento en
solución de Winogradsky y posterior siembra en medio libre de nitrógeno; y
siembra de gránulos individuales de suelo en medio libre de nitrógeno. Para su
identificación se emplean pruebas como fermentación de ramnosa, manitol,
inositol, malonato, benzoato y sucrosa; además de test de oxidasa y catalasa,
producción de pigmentos, crecimiento en diferentes valores de pH, crecimiento
en diferentes concentraciones de NaCl y de oxigeno. La identificación también
se realiza mediante observación de la morfología celular, de colonias y la
formación de estructuras de resistencia. Sin embargo, estos métodos generan
ambiguedad en el momento de diferenciar especies dentro del género
Azotobacter u otros géneros diazótrofos como Beijerinckia y Derxia. Por esta
razón su utilización es insuficiente para la identificación y caracterización de
bacterias diazotrófas, además de ser útiles solo para bacterias cultivables.
Debido a esto, se han desarrollado técnicas de huella genética como DGGE,
RFLP, RAPD, ARDRA y secuenciación que permiten una identificación y
caracterización mas precisa.
El DNA ribosomal 16S es utilizado en estudios de filogenia y taxonomía ya que

su estructura y función han permanecido constantes a través del tiempo de modo
que las alteraciones en la secuencia reflejan cambios aleatorios, su transmisión
es principalmente vertical ya que no está sujeto a transferencia génica horizontal
entre microorganismos. La técnica molecular de amplificación del DNA ribosomal
16S es utilizada constantemente en microbiología, ya que por sus características
precisas permite identificar y caracterizar bacterias no cultivables, bacterias
cuyas características bioquímicas no se adaptan a las de ningún género o
especie reconocido; bacterias con elevados requerimientos nutricionales; cuya
caracterización fenotípica no es suficiente o aquellas con crecimiento muy lento.
En este estudio se pretende obtener un acercamiento a la identificación,

caracterización molecular y filogenia de cepas nativas Colombianas del género
Azotobacter mediante el análisis de restricción del DNA ribosomal 16S
amplificado (ARDRA), y con esto lograr una aproximación al conocimiento de la
diversidad genética de bacterias diazotrófas asimbióticas aerobias en cultivos
agrícolas colombianos, a través de la estandarización de un protocolo para la
extracción del DNA total, amplificación y restricción del DNA ribosomal 16S y el
análisis conjunto con la información de secuencias de bacterias diazótrofas
obtenidas del Genebank. En un corto plazo se busca realizar la validación de
esta técnica e incluirla en el portafolio de servicios del laboratorio de
Microbiología Ambiental y Suelos de la Pontificia Universidad Javeriana para el
control de calidad de bioinsumos agrícolas.
2. MARCO TEORICO
2.1 Importancia y problemática del nitrógeno en la Agricultura

Debido a que el nitrógeno es el elemento más limitante para el crecimiento de
las plantas en suelos tropicales (Franco & Dobereiner, 1994), se ha
incrementado el uso de productos de síntesis, con el ánimo de aumentar la
producción agrícola. Existen reportes de 77 x 106 toneladas de nitrógeno
aplicados mundialmente como fertilizante en diversos cultivos de gran
importancia agronómica, como hortalizas, caña, sorgo, maíz, arroz, flores y
ornamentales entre otros. Lo anterior ha provocado efectos negativos en los
recursos naturales, tales como acumulación de nitratos en las aguas freáticas,
toxicidad en las plantas por la presencia de altos niveles de NO2 en los suelos,
contribuyendo con la muerte de la biota del suelo, ocasionando desequilibrios en
los procesos naturales biogeoquímicos que se traducen en un alto costo
económico, social y ecológico. (Marín et al., 2003).
2.2 La rizósfera
El termino rizósfera se refiere a la zona del suelo influenciada por el desarrollo
de raíces, en donde se activa la proliferación de microorganismos (Hiltner, 1904);
este efecto rizosférico se debe al suministro de exudados radicales que
contienen azúcares, aminoácidos, vitaminas y enzimas, además de señales que
modulan la interacción microbio-planta (Kennedy & Smith, 1995; Bowen &
Rovira, 1999). Las propiedades físicas, químicas y biológicas de la rizósfera son
muy diferentes a las del suelo no rizosférico particularmente, la población
microbiana desciende entre 10 a 100 veces al alejarse pocos milímetros de la
superficie radical (Collados, 2006).
Las poblaciones rizosféricas están compuestas por bacterias, hongos, algas,

nemátodos, protozoos y virus pero la mayor parte de las investigaciones se
centran en hongos y bacterias (Bowen & Rovira, 1999; Gryndler, 2000). Se
estima que existen unas 30.000 especies de bacterias y 1.500.000 especies de
hongos de los cuales solo un 1% y 8% respectivamente han sido identificadas
(Kennedy & Smith, 1995; Barea, 2000). En este contexto hay que referir que la
utilización de técnicas basadas en el análisis de moléculas de DNA ha puesto de
manifiesto que entre el 90% y 99% de los microorganismos del suelo son viables
pero no cultivables (Barea et al., 2005), por lo que dichas técnicas permiten
caracterizar los microorganismos y establecer sus relaciones filogenéticas.
Análisis pioneros de la complejidad microbiana en suelos, realizados por Torsvik

et al., (1990), utilizando técnicas de reasociación de DNA, pusieron en evidencia
la gran diversidad genética bacteriana presente. Así el número de genomas
bacterianos diferentes estimados en una muestra de suelo forestal fue de unos
4.000, en claro contraste con la diversidad genética de las bacterias aisladas en
cultivo a partir de la misma muestra (200 veces menor). En otras muestras de
suelo de la amazonia brasilera la diversidad genómica fue incluso superior
(8.000-10.000 genomas diferentes) (Torsvik et al., 1998).
Los microorganismos en la rizosfera desempeñan funciones de gran importancia

en relación con procesos de edafogénesis; ciclos biogeoquímicos de elementos
como el carbono, el nitrógeno, oxígeno, el azufre, el fósforo, el hierro y otros
metales; fertilidad de las plantas y protección frente a patógenos; degradación de
compuestos xenobióticos y producción de fitohormonas (Nogales, 2005).
Dentro de la microflora de la rizosfera se encuentran especies pertenecientes a

los géneros Agrobacterium, Alcaligenes, Arthrobacter, Enterobacter, Erwinia,
Flavobacteria, Hafnia, Klebsiela, Serratia Xanthomonas, Azotobacter,
Azospirillum, Clostridium, Pseudomonas, Acetobacter, Burkholderia y Bacillus
(Kloepper et al., 1989; Bashan & Levanony, 1990; Tang, 1994; Barea et al.,
2004). Otras bacterias importantes en la microflora del suelo y en la agricultura
son las fosfato solubizadoras, como las aisladas por Useche et al., (2004), en un
estudio de la diversidad en diferentes suelos de la Amazonía, Pseudomonas
spp., P. cepacia, P. gladioli, Xanthomonas spp., X. maltophilia, Enterobacter
agglomerans, Chromobacterium sp., X. maltophilia, y Chromobacterium sp.;
constituyeron nuevos reportes de bacterias solubilizadoras de fósforo en
Colombia.
Observaciones de secciones ultrafinas de suelo mediante microscopía

electrónica, tomografía, análisis geoestadístico y la elaboración de modelos,
especialmente basados en fractales, han demostrado que la distribución de las
bacterias edáficas está altamente estructurada, y que esta estructuración es
importante para la funcionalidad y estructura del suelo. Las bacterias se
organizan en microcolonias compuestas de pocas células que pueden
pertenecer a diferentes morfotipos (Nunan et al., 2003).
2.3 Microorganismos fijadores de nitrógeno atmosférico (diazotrófos)

La fijación biológica de nitrógeno molecular la llevan a cabo diversos géneros de
bacterias de vida libre, algunas de estas se encuentran en la rizósfera en vida
libre, y otros géneros bacterianos forman asociaciones mutualistas con plantas
(Saribay, 2003). Las bacterias fijadoras de nitrógeno presentan una amplia
diversidad taxonómica, con diferentes estilos de vida y de asociación con los
vegetales. Sin embargo, sólo una pequeña proporción de especies es capaz de
hacerlo; 87 especies en dos géneros de arqueobacterias, 38 de bacterias, y 20
géneros de cianobacterias se han identificado como diazótrofas (Hussein, 1999).
En la rizósfera la fijación del nitrógeno se realiza aparentemente sólo por ciertos

tipos de bacterias y por algunos miembros del taxón Archea; estos diazotrófos
incluyen algunas especies de Bacillus spp., Clostridium spp. y Klebsiella spp.,
miembros de la familia Azotobacteraceae (A. vinelandii y A. chroococcum),
Rhizobiaceae y del orden Rhodospirillales (Singleton, 2004). Además de estos,
se han descrito géneros en diferentes hábitats con la capacidad de fijar nitrógeno
atmosférico, entre estos están: Beijerinckia, Chromatium, Rhodopseudomonas,
Rhodospirillum, Rhodomicrobium, Chlorobium, Azospirillum, Desulfovibrio,
Desulfotomaculum y Pseudomonas (Atlas & Bartha 2002).
2.3.1 Fijación biológica de nitrógeno (FBN)

La fijación biológica de nitrógeno esta catalizada por el complejo enzimático
nitrogenasa. El complejo de la enzima tiene dos coproteínas, la proteína I
contiene hierro y molibdeno y la proteína II contiene solamente hierro, aunque se
han encontrado una enzima alterna de Azotobacter vinelandii que contiene
vanadio (Drummond et al., 1995; Eady et al., 1988). La proteína I es un
tetrámero de alrededor de 220.000 Da, formado por dos tipos de subunidades α2
β2, de masa molecular semejante, y producto de los genes nifDK (Telisa et al.,
1999). La proteína II es un dímero de alrededor de 68.000 Da, el gen
responsable de la síntesis de esta proteína es nifH, esta proteína tiene la función
de transportar los electrones del donador fisiológico de electrones (ferrodoxina o
flavodoxina), hacia la proteína I para llevar a cabo la reducción de la molécula de
N2, (Figura 1) (Baca et al., 2000). Se han descrito alrededor de 20 genes
involucrados en la fijación biológica de nitrógeno, cuya secuencia y funciones
han sido ya determinadas. Igualmente se conoce que los genes estructurales de
la nitrogenasa están sumamente conservados, así como un cierto número de
otros genes cuyos productos juegan un papel en la maduración de la enzima, la
síntesis del cofactor, el transporte de molibdeno y la regulación (Elmerich, 1993;
Lee et al., 2000; Desnoues et al., 2003). Las proteínas NifL y NifA son las
encargadas de la regulación y el control de la expresión de los genes nif en la
fijación biológica del nitrógeno, en Azotobacter vinelandii estas dos proteínas
están codificadas por el operon nifLA (Martínez et al., 2005).
Figura 1. Genes implicados en el flujo de electrones hacia el sitio activo de la nitrogenasa para la
reducción del N2. Fuente: Baca et al., (2000).
La reducción de nitrógeno requiere mucha energía, alrededor de 12 a 16

moléculas de ATP por cada molécula de nitrógeno fijada (Ecuación 1)
(Betancurt, 2002; Singleton, 2004; Baca et al., 2000). Para la fijación bacteriana
de nitrógeno molecular se necesita un aporte importante de energía (150
kcal/mol) en forma de ATP y coenzimas reducidas; la energía puede obtenerse a
través de la conversión de la energía lumínica que realizan los organismos
fotoautótrofos, como las cianobacterias, o a través de la respiración de los
heterótrofos como Azotobacter (Atlas & Bartha, 2002). Ya que la fijación de
nitrógeno en bacterias aeróbicas como Azotobacter es un proceso que demanda
gran cantidad de energía, requiere una eficiente fosforilación oxidativa. La
enzima nitrogenasa es altamente sensible al oxígeno y muchos diazotrófos fijan
nitrógeno anaeróbicamente o microaeróbicamente y en algunas cianobacterias
el proceso se realiza en estructuras de resistencia como los heterocistes.
(Singleton, 2004).
Ecuación 1. Reacción en la fijación de nitrógeno. Fuente: Baca et al., (2000)

N2 + 8H+ + 8e- + 16MgATP → 2NH3 + H2 + 16MgADP +16Pi
La nitrogenasa purificada es inactivada rápida e irreversiblemente por el O2, la

proteína (Fe) es mucho más sensible que la proteína (Mo-Fe) con una vida
media en presencia de aire de 45 segundos y 10 minutos respectivamente
(Robson & Postgate, 1980). El efecto de O2 sobre la nitrogenasa restringe la
fijación de N2 en la mayoría de las especies de eubacterias a condiciones
anaeróbicas o de microaerobiosis. Azotobacter y Beijerinckia pueden fijar
nitrógeno a la presión normal de oxígeno, ya que protegen su nitrogenasa de la
inactivación oxidativa por una combinación de compartimentación y de complejos
mecanismos bioquímicos entre los que se encuentran, la protección
conformacional o switching off (Moshiri et al., 1994); la expresión de la citocromo
oxidasa cytbd; la autoprotección, la cual consiste en reducir por medio de la
nitrogenasa reductasa el oxigeno a peróxido de hidrogeno y posiblemente a
agua y por lo tanto, reduciría el oxigeno en la vecindad de la nitrogenasa
(Thorneley & Ashby, 1989). Además de esto, el uso de nitrogenasas alternativas
y la producción de polímeros como alginato y los PHBs (Polihidroxibutiratos) son
alternativas eficientes para proteger el complejo (Atlas & Bartha, 2002; Espin,
2002 <on line>).
2.3.2 Microorganismos diazotróficos simbióticos.

Las bacterias diazotróficas simbióticas son aquellas que son capaces de fijar
nitrógeno atmosférico en simbiosis con las raíces de plantas leguminosas
(guisantes, judías, tréboles, alfalfa, entre otras). Estas raíces poseen pequeños
engrosamientos llamados nódulos que contienen bacteroides o rizobios, en esta
alianza, la planta suministra nutrientes y protección, mientras que el rizobio
proporciona a la planta nitrógeno fijado de la atmósfera (Espín, 2002 <online>).
Se han descrito 40 especies en 9 géneros de bacterias que forman nódulos en
leguminosas, sin embargo, existen bacterias simbióticas que pueden colonizar
otras plantas, Por ejemplo, Rhizobium leguminosarum y cepas fotosintéticas de
Bradyrhizobium se han encontrado en raíces de arroz (Yanni et al., 2001) ;
Rhizobium ettli en raíces de maíz (Gutierrez & Martinez, 2001) y Azorhizobium
caulinodans en las raíces de la oleaginosas (Brassica napus); los nódulos de las
raíces de aliso (Alnus) contienen bacterias del género Frankia, mientras que el
pequeño helecho flotante Azolla contiene Anabaena azollae dentro de cavidades
especializadas. Así mismo, se han detectado cepas pertenecientes a la
cianobacteria Nostoc en las raíces de corraloides de cícadas (Cycas,
Encephalatos, Zamia) de un jardín botánico mediante métodos basados en PCR.
Pisa, (2002), realizó una análisis filogenético amplificando el DNAr 16S con
primers especificos para diazótrofas de cepas simbióticas capaces de nodular
cultivos de frijol (Phaseolus vulgaris) en Brasil, encontrando un 42% de bacterias
del genero Rhizobium, 17% de Ralstonia y 6% de Burkholderia.
Una de las simbiosis más efectivas es la que se establece entre Bradyrhizobium

japonicum-Soya, donde un 70% de la fijación de nitrógeno por la bacteria es
asimilada por la planta. En Brasil se ha empleado con éxito la fertilización
biológica de soya con B. japonicum y 0% de aporte de nitrógeno como fertilizante
químico, ello ha conducido a que este país sea el segundo productor de soya a
nivel mundial (Baldani et al., 1997). En Colombia se han evaluado biofertilizantes
a base de Rhizobium en cultivos de maní, frijol y soya con resultados positivos
en la producción y en la disminución de costos (Torres, 2000 <on line>).
Asi mismo, la utilización de plantas fijadoras de nitrógeno como el trébol y la

alfalfa, pueden incluirse dentro de los esquemas de rotación de las cosechas;
plantas como la Azolla se utiliza como abono orgánico, una práctica común en el
sudeste de Asia, mientras que en los arrozales la fertilidad puede incrementarse
potenciando el crecimiento de cianobacterias autónomas fijadoras de nitrógeno
(Singleton, 2004). Por otro lado, Santillana et al., (2005), comprobaron la
capacidad de Rhizobium para promover el crecimiento de plantas de tomate
(Lycopersicon esculentum Miller), evidenciando la producción de sustancias
promotoras de crecimiento de tipo citoquininas, ácido indol acético y ácido
giberélico.
La simbiosis Rhizobium-Leguminosas es el resultado de una interacción muy

específica entre la bacteria y la planta (Singleton, 2004). La formación del nódulo
es un proceso inducido por un intercambio de señales entre los dos participantes
de la interacción; sustancias con efecto mitógeno (factores de nodulación) son
sintetizadas por los genes de nodulación del microsimbionte (genes nod), en
respuesta a la excreción por la planta de sustancias de tipo flavonoide (Baca et
al., 2000). Se han reportado que existen alrededor de 26 genes nod expresados
en el proceso de nodulación y 26 genes nif expresados en la fijación de
nitrógeno, los cuales codifican para 416 proteínas involucradas en estos dos
sistemas (Freiberg et al., 1997). Sin embargo, Kaneko et al., (2000), identificaron
39 genes cromosomales involucrados en el proceso de nodulación y 46 en la
fijación de nitrógeno.
2.3.3 Microorganismos diazótrofos asimbióticos.

Las bacterias diazótrofas asimbióticas son aquellas que pueden fijar nitrógeno
atmosférico sin la necesidad de formar una simbiosis con plantas, ya que estas
poseen diferentes estrategias para proteger el complejo nitrogenesa. Estas
bacterias se encuentran prácticamente en todos los hábitats: suelo, mar, fuentes
de agua dulce y sedimentos. Entre los principales géneros bacterianos que se
hallan en vida libre o endófitos asociados a la rizosfera se encuentran:
Azotobacter spp., Azotococcus spp., Azospirillum spp., Beijerinckia spp.,
Azotomonas spp., Bacillus spp., Citrobacter spp., Clostridium spp., Chromatium
spp., Chlorobium spp., Desulfovibrio spp., Desulfomonas spp.,
Gluconacetobacter spp., Herbaspirillum spp., Klebsiella spp. (Rodríguez et al.,
2003).
Magalãhes et al., (2001), aislaron y caracterizaron molecularmente 38 cepas

fijadoras de nitrógeno de la rizosfera, hojas y tallos de cultivos de piña y banano
en Rio de Janeiro (Brasil); caracterizaron cepas de Herbaspirillum seropedicae,
Herbaspirillum rubrisubalbicans, Burkholderia brasilensis, y Burkholderia
tropicalis, mostrando la gran diversidad de bacterias fijadoras de nitrógeno
asimbioticas en suelos tropicales. Torres et al., (2000), aislaron 18 cepas del
género Azotobacter de 20 cultivos de arroz en el Tolima (Colombia), las cuales
producían importantes concentraciones de de acido indol acético (AIA),
incluyendo A. vinelandi con 32.22 ppm y A. chroococcum con 30.07 ppm de AIA.
Por otro lado, Aquilanti et al., (a) (2004), aislaron bacterias diazotróficas
asimbióticas de la rizósfera de cultivos de maíz, trigo y hortalizas en Italia, los
géneros encontrados fueron de la familia Azotobactereaceae, al igual que
miembros del géneros Beijerinckia, Azomonas y Agrobacterium. Tejera et al.,
(2005), aislaron cepas de A. chroococcum y Azospirillum spp. de la rizósfera de
cultivos de caña de azúcar en Granada España, utilizando medio libre de
nitrógeno (Burk`s) (Martínez et al., 1985) para su aislamiento, las cepas fueron
identificadas y caracterizadas por medio de métodos convencionales (motilidad,
producción de pigmentos, fermentación de azúcares, producción de PHBs y
morfología de la colonia y celular) y moleculares (Rep- PCR y ARDRA).
Entre las bacterias diazótrofas asimbióticas utilizadas como biofertilizantes una

de las más importantes es Azotobacter spp, la importancia agronómica de esta
radica especialmente en la capacidad de producir antibióticos, sustancias
estimulantes del crecimiento vegetal (SPCV) del tipo auxinas, giberelinas y
citoquininas (Pandey & Kumar, 1990); además de la fijación de nitrógeno,
producción de vitaminas, pigmentos, (Pandey et al., 1998) aminoácidos y otras
moléculas con actividad biológica de interés industrial y comercial como
polisacáridos (Sabra et al., 2001; Cuesta et al., 2006.). CORPOICA produce
biofertilizantes a base de A. chroococcum (Monibac), su forma de presentación
es líquida, su concentración es de 107 UFC/g y ha sido utilizado en cultivos de
algodón, tomate y ají (CORPOICA, 2007 <online>). Bacterias del género
Azotobacter han sido utilizadas como bioinoculantes en cultivos agrícolas
colombianos. El Instituto Colombiano Agropecuario (ICA) mediante la resolución
00375 define bioinoculante como aquel producto elaborado con base en una o
más cepas de microorganismos benéficos que, al aplicarse al suelo o a las
semillas, promueven el crecimiento vegetal o favorece el aprovechamiento de
los nutrientes en asociación con la planta o su rizósfera (ICA, 2004), su uso
favorece a procesos limpios y rápidos de origen microbiano, están elaborados de
diferentes grupos de microorganismos: bacterias, hongos y algas (Garzón et al.,
2001).
El control de calidad y la vigilancia de estos productos en Colombia esta a

cargo del ICA, en general un bioinoculante debe cumplir con adecuada
concentración bacteriana, especificidad para la estimulación del crecimiento
vegetal y para su formulación comercial deben presentar lote y fecha de
vencimiento además de cumplir con las condiciones de almacenamiento
adecuadas (Bashan, 1998). Para bioinoculantes a base de Azotobacter el
inóculo debe presentar una concentración de 1x105 UFC/ml, sin embargo, estas
concentraciones varían de acuerdo al cultivo a manejar. En Colombia existen
diversas empresas encargadas en la producción e importación de estos
bioinoculantes, entre las empresas registradas por el ICA se encuentra
Agrotecnia LTDA, Biocultivos S.A, Eco Organics LTDA, Microagro LTDA, Safer
Agrobiologicos, Fingifert Oriente Colombiano LTDA entre otras (ICA, 2007
<online>)
Neeru et al., (1991), utilizaron A. chroococcum como bioinoculante en la India

para una variedad de cereales, oleaginosas y vegetales obteniendo resultados
favorables en el peso seco de la planta y la producción de grano. Igualmente
Galindo et al., (2006), inocularon bacterias diazotrófas (A. vinelandii) y
solubilizadores de fosfato en plántulas de mangle y plantas de Citrullus vulgaris
en la isla de San Andrés (Colombia) incrementando la altura de las plantas, el
número de hojas y de nodos. Los bioinoculantes en Colombia también se han
utilizado en cultivos de crisantemo (Santana et al., 2002), pompón y clavel
(FUNDASES, 2007 <online>).
García et al., (2005), mediante la inoculación de Azotobacter beijerinckii y

Azospirillum spp. lograron aumentar la absorción de urea y la trasformación de
los exudados radicales en SPCV, incrementando el peso fresco y seco del trigo
inoculado. Estudios realizados en la India indican que los beneficios obtenidos
en la inoculación de semillas con Azotobacter son marginales en suelos con
pobre contenido de materia orgánica, pero muy favorables en suelos con mucha
carga orgánica (Stevenson et al., 2000). Está documentado que bacterias del
género Azotobacter y Azospirillum han utilizadas en sistemas de acuacultura y
en producción de vermicompost para aumentar el contenido de nitrógeno y
fósforo del producto (Garg et al., 2001; Kumar & Singh, 2001).
2.5 Familia Azotobacteraceae.

La familia Azotobacteraceae pertenece a la subclase gamma de las
proteobacterias (Tchan, 1984), esta compuesta por bacterias fijadoras de
nitrógeno de vida libre que comúnmente habitan en suelo, agua y sedimentos.
Estudios de DNA ribosomal 16s (DNAr 16S) han identificado dos géneros en
esta familia, Azotobacter y Azomonas El género Azotobacter se diferencia de
Azomonas por la presencia de quistes pero no se puede diferenciar
morfológicamente de muchas otros géneros de bacterias diazotrófas como
Azospirillum y Beijerinckia; comprende siete especies: A. chroococcum, A.
vinelandii, A. beijerinckii, A. paspali (Doberienener & Day, 1975), A.
armeniacus, A. nigricans (Tchan & New, 1984(a)) y A. salinestris (Page &
Shivprasad, 1991). El género Azomonas comprende tres especies: A.
macrocytogenes, A. agilis, y A. insignis (Tchan & New, 1984(b)).
Los miembros de esta familia Azotobacteraceae tienen la capacidad de sintetizar

antibióticos y generar sustancias promotoras del crecimiento vegetal, (Pandey &
Kumar, 1990) además de fijar nitrógeno no simbióticamente, especies como A.
chroococcum y A. vinelandii son utilizadas como bioinoculantes en suelos
tropicales y alcalinos. Igualmente muchos miembros de la familia
Azotobacteraceae son utilizados para producción de compuestos de interés
comercial como polisacáridos, (Sabra et al., 2001) vitaminas y pigmentos
(Pandey et al., 1998).
2.6 Generalidades del género Azotobacter spp.

Los microorganismos de este género comprenden bacterias con forma bacilar,
reaccionan a la tinción de Gram como Gram negativos y en cultivos viejos como
Gram variables, las células son ovoides y miden aproximadamente de 2µm a
4µm de diámetro, siendo las de mayor tamaño las de A. chroococcum que llegan
a medir hasta 6µm, puede llegar a formar cadenas de tamaños variables, la
forma de resistencia es el quiste (Figura 2), son aerobios pero algunos pueden
vivir en tensiones bajas de oxígeno y su movilidad se debe a flagelos perítricos
(Tabla 2), además, producen pigmentos solubles en agua en medios específicos
(Tabla 1) (Figura 3) (Saribay, 2003).
Figura 2. Quistes de Azotobacter spp. Fuente: Autor.

En medio libre de nitrógeno con glucosa como única fuente de carbono, las
células jóvenes de diferentes especies presentan una forma bacilar con
extremos redondeados (Figura 4B). Las células de cultivos viejos tienden a ser
elipsoidales y en ciertos casos es común observar gránulos sudanofílicos y
metacromáticos (PHBs) (Tejera et al., 2005; Segura & Espín, 1998). Las colonias
jóvenes de estos microorganismos son generalmente lisas, opacas poco
convexas y viscosas (Figura 4A).
Figura 3. Colonias de diferentes especies de Azotobacter spp. en medio diferencial LG. A)

Azotobacter vinelandii DSM2289. B) Azotobacter armeniacus DSM2284 C) Azotobacter paspali
DSM2283. Fuente: Aquilanti et al., (a) (2004). Pigmentación de diferentes especies en medio
Ashby con benzoato. D) Pigmentación café característica de A. armeniacus, A. chroococcum y A.
nigricans. E) Pigmentación negra-café característica de A. nigricans y A. chroococcum. F)
Pigmentación verde-amarillo característica de A. vinelandii y A. paspali. Fuente: Autor.
Tabla 1. Colores de pigmentos solubles en agua producidos por bacterias del género Azotobacter.
Fuente: Holt, 2000
A. A. A. A. A. A.
Pigmento
vinelandii beijerinckii paspali armeniacus nigricans chroococcum
Amarillo-Verde
+ - + - - -
fluorescente
Verde D - - - - -
Café-Negro - - - - D D
Café-Negro a - - - + + -
Violeta-Rojo
Rojos-Violetas D - + + D -
D: 11% – 89% de las cepas son positivas a producir pigmento.
+: 90% o más de las cepas son positivas a producir pigmento.
- : 90% o más de las cepas son negativas a producir pigmento.
Figura 4. A) Colonias de Azotobacter spp. en medio libre de nitrógeno. B) Morfología de
las células de Azotobacter spp. Fuente: Autor.
Bioquímicamente son catalasa y oxidasa positivo, reducen el nitrato, producen el

sulfuro de hidrógeno e hidrolizan almidón, producen promotores de crecimiento
(giberelinas, auxinas y citoquininas) (Santana et al., 2002), las bacterias de este
género fijan asimbióticamente nitrógeno y son solubizadoras de fosfato, además,
realizan procesos de biodegradación de plaguicidas como el endosulfan (Castillo
et al., 2005). Son quimioorganotróficas, utilizan para su crecimiento azúcares,
alcoholes y sales inorgánicas. Son fijadores de nitrógeno en vida libre, fijan al
menos 10 mg de N2 por gramo de carbohidrato consumido (Holt, 2000).
Requieren molibdeno para fijar nitrógeno que puede ser parcialmente

reemplazado por vanadio. Al igual que los demás fijadores de nitrógeno
Azotobacter sp. es quimioheteròtrofo, utiliza como fuente de carbono y energía
una gran variedad de ácidos orgánicos, azúcares o sus derivados alcohólicos
como el manitol que es el sustrato más empleado para aislarlos y cultivarlos,
dentro las sustancias que utilizan como fuente de carbono y energía se
encuentra la fructosa, glucosa, sucrosa, acetato, fumarato, piruvato, succinato,
acetilmetilcarbinol y α-oxoglutarato (Tabla 2) (Holt, 2000).
Tabla 2. Movilidad, formación de filamentos y pruebas bioquímicas utilizadas para la
caracterización del género Azotobacter spp. Fuente: Holt, 2000
Características y A. A. A. A. A. A.
Test/Especie vinelandii beijerinckii paspali armeniacus nigricans chroococcum
Movilidad + - + + - -
Filamentos en
cultivos jóvenes
-b -b + -b -b -b
Oxidasa + D - D D D
Peroxidasa + + + D + +
Nitrato-Nitrito + + + - + +
Meso-inositol + D - D - -
Fructosa + + + + + +
Glucosa + + + + + +
Sucrosa + + + + + +
Malonato + + - - D D
Benzoato D + - - - +
Caproato + - - - - +
Caprilato + - - + - -
Maltosa + D - + D +
Rafinosa D D - D D +
Glicerol + D - - - D
Sorbitol + D - + D +
Manitol + D - + D +
Ramnosa + - - - - -
- b: Estas especies podrían producir esporádicamente filamentos de diferente longitud
D: 11% - 89% de las cepas son positivas
+: 90% o más de las cepas son positivas
- : 90% o más de las cepas son negativas
Respecto a la fuente de nitrógeno pueden utilizar nitrato, sales de amonio y

aminoácidos, pero ellos pueden además fijar el nitrógeno del ambiente (Garzón
et al., 2001), sin embargo, la adición de nitrato de potasio mejora la producción
de biomasa (Santana et al., 2002). Adicionalmente necesita fuente de magnesio,
potasio, calcio, hierro y fósforo para realizar la fijación de nitrógeno. Su
crecimiento es normal cuando se encuentra a pH de 7.0 - 7.5, requieren una
temperatura óptima de 30ºC, susceptibles a pH ácido, (Balandreau, 1986) altas
concentraciones de NaCl y temperaturas mayores a 35ºC (Saribay, 2003).
2.6.1 Azotobacter chroococcum.
En medios libres de nitrógeno A. chroococcum produce un pigmento café-negro
no difusible, estos se producen en presencia de benzoato. También produce
pigmentos grises-cafés en medios adicionados con 0.2% de gluconato. Sobre
medios libres de nitrógeno esta bacteria forma colonias mucilaginosas pardas las
cuales aparecen a las 48 horas a 30ºC. A. chroococcum presenta colonias
mucosas opacas, inicialmente el color del pigmento es claro y brillante, pero a
medida que la colonia se desarrolla se torna de color café oscuro, la fuente
principal de carbono es el manitol (Santana et al., 2002). A. chroococcum
puede llegar a crecer en un pH alrededor de 5.5 (Saribay, 2003).
A. chroococcum puede utilizar diferentes fuentes de nitrógeno inorgánico como

amonio, nitrato, nitrito o dinitrógeno, este microorganismo realiza la asimilación
de nitrógeno en tres pasos: transporte del nitrato dentro de la célula, reducción
del nitrato a nitrito (Nitrato reductasa) y la reducción de nitrito a amonio (Nitrito
reductasa), sin embargo, estos pasos requieren de dos condiciones
nutricionales, la ausencia de amonio (represor) y la presencia de nitrato o nitrito
(inductores). Se ha reportado la presencia de dos polipéptidos con masas
moleculares de 22kDa (P22) y 35kDa (P35), la expresión de estos genes es
regulada por las fuentes de nitrógeno. La P22 esta asociada a la membrana
citoplasmática y es fosforilada en respuesta al nitrato, este polipéptido es una
proteína sensorial para la asimilación de nitrato en A. chroococcum (Muñoz et
al., 1996).
Además de la fijación de nitrógeno y excreción de amonio al medio, esta especie

tiene la propiedad y la capacidad de biodegradar compuestos tóxicos y
contaminantes; tener efecto antagónico con patógenos (Hongos y Nematodos),
en cultivos agrícolas, solubilizar fosfato tricalcico y producir fitohormonas. Es una
bacteria que metaboliza compuestos fenólicos como, ácidos p-hidroxibenzoico,
vanilinico, p-cumarico, ferulico y 4-hidroxifenilacetico, compuestos que se
encuentran en aguas residuales procedentes de la extracción de aceite de oliva,
estos ácidos tienen un efecto antibacterial, fitotóxico y generan coloración a las
aguas residuales, debido a esto, son compuestos con alta carga contaminante
para el ambiente (Sarybay, 2003; Juárez et al., 2004). Además de esto, tiene la
capacidad de degradar plaguicidas cloroaromáticos contaminantes como el
endosulfán por medio de enzimas deshalogenasas, dioxigenasas e hidroxilasas
(Castillo et al., 2005). Por otro lado, Sudhir et al.,(1983), reportaron que A.
chroococcum tiene la capacidad de inhibir el crecimiento de Rhizoctonia solani
en cultivos de papa a temperaturas de 15°C. Bansal et al., (1999) determinaron
el efecto de bacterias rizosféricas en cultivos de maíz infestados con el
nematodo patógeno Heterodera avenae, reportando que la máxima reducción de
infección la produjo A. chroococcum con un 48% seguido por Pseudomonas con
11% y Azospirillum con 4%.
2.6.2 Azotobacter vinelandii.

Azotobacter vinelandii es una bacteria poliploide, es decir posee varias copias de
su cromosoma, se calcula que pueden tener hasta 80 copias. El número de
copias varía dependiendo del medio y las condiciones de cultivo así como de la
fase de crecimiento. Es de tamaño muy grande de 2 a 5 µm de diámetro es decir
de 5 a10 veces el volumen de E. coli, se ha asociado el tamaño con la poliploidía
(Nagpal et al., 1989).
La capacidad metabólica y genética por las que A. vinelandii ha sido y es objeto

de estudio en biofertilización y biotecnología incluyen la fijación de nitrógeno en
presencia de oxígeno por tres sistemas diferentes de nitrogenasa; presencia de
mecanismos de protección de la nitrogenasa ; alta capacidad respiratoria que en
condiciones diazotróficas o de fijación de nitrógeno es hasta 10 veces más alta
que la de E. coli ; la formación de estructuras de resistencia frente al estrés
ambiental (quistes) y la producción de polímeros de uso industrial como el
alginato y el polihidroxibutirato (Espin, 2002). A. vinelandii fija nitrógeno en
aerobiosis gracias a que posee un sistema bien integrado de protección de su
nitrogenasa que comprende: protección conformacional, protección respiratoria,
autoprotección y otros cambios morfológicos y fisiológicos que le permiten crecer
diazotróficamente en condiciones totalmente aeróbicas (Manchal et al., 2000).
A. vinelandii posee tres tipos de nitrogenasas diferentes para la fijación de

nitrógeno; la nitrogenasa 1 codificada por el gen nifHDK, la nitrogenasa 2 es
dependiente de vanadio y los genes que codifican para las dos proteínas están
designados con el nombre de vnf y se encuentran en los operones vnfHorfFd y
vnfDGK y la nitrogenasa 3 la cual es fabricada en condiciones deficientes de
molibdeno y vanadio esta codificada por el gen anfHDK (Figura 5) (Betancourt,
2002). La comparación de las secuencias entre estos genes indican que el
porcentaje de identidad entre los genes nifH y vnfH es del 88.5%, sugiriendo que
provienen de un gen ancestral. Por otro lado, el porcentaje de similitud entre las
secuencias de los genes nifH y anfH se encuentra alrededor del 70%. Los
genes vnfDK y anfDK muestran una mayor similitud en su secuencia al
compararlos con lo genes nifDK, reportando un porcentaje de similitud de 65.8%
entre los genes vnfK y anfK y una similitud de 65.8% entre los genes vnfD y anfD
(Joerger et al., 1989; Joerger et al., 1990)
Figura 5. Esquema de la organización de los genes involucrados en la síntesis de las tres

nitrogenasas utilizadas por A. vinelandii en la fijación de nitrógeno. Fuente: Betancourt, 2002
2.7 Técnicas moleculares para la caracterización e identificación de

bacterias diazotrófas
Diversos estudios se han realizado en la caracterización, identificación y
taxonomía de la diversidad biológica de bacterias diazotrófas. Las técnicas
moleculares mas utilizadas a nivel mundial son DGGE (Denaturing Gradient Gel
Electrophoresis), RFLP (Restriction Fragment Lenght Polymorphisms), ARDRA
(Amplified Ribosomal DNA Restriction Analysis), RAPD (Random Amplified
Polymorphic DNA) y la secuenciación. Estas técnicas permiten conocer la
diversidad genética de forma precisa en ambientes complejos como la rizosfera
en donde pueden habitar las bacterias fijadoras nitrógeno. Los genes nif y el gen
DNAr 16S han sido reportados para la caracterización de diferentes géneros
diazótrofos, ya que son muy conservados y se encuentran en todos
microorganismos fijadores de nitrógeno. Lovell et al., (2000), realizaron un
DGGE para evaluar la diversidad de bacterias diazótrofas en cultivos de Spartina
alternifora y realizaron una PCR de genes nifH, logrando identificar bacterias
diazótrofas de la subdivisión beta de las proteobacterias. Yeager et al., (2004),
realizaron un T-RFLP del gen nifH utilizando la enzima RsaI para caracterizar la
comunidad diazótrofa en un bosque australiano el cual había sufrido un incendio
forestal, reportando cepas diazótrofas del genero Clostridium y Paenibacillus
R`sch et al., (2002) utilizaron la secuenciación de los genes nifH, nosZ, nirS y
nirK para realizar un estudio de diversidad de bacterias diazótrofas y
desnitrificantes en bosques de suelos ácidos en Alemania. Igualmente Roesch et
al., (2006), realizaron una caracterización de bacterias diazótrofas asociadas a
cultivos de maíz, amplificando el gen nifH del DNA extraído directamente del
suelo con iniciadores nifHFor y nifHRev, y realizaron un análisis RFLP con
enzimas de restricción TaqI y HaeIII, reportando bacterias del género
Herbaspirillum, Azoarcus, Burkholderia y Azospirillum. Además de esto, Soares
et al., (2003), realizaron una comparación entre RFLP, RAPD y secuenciación
parcial del gen DNAr 16S en cepas de Herbaspirillum en Curitiba (Brasil).
Muchos estudios han dado por manifiesto la importancia de las nuevas técnicas
moleculares en la caracterización de bacterias diazótrofas, sin embargo, estos
estudios son una pequeña muestra de la gran cantidad de investigaciones y de
herramientas moleculares para la caracterización e identificación de bacterias
diazótrofas.
2.7.1 Aplicaciones del DNA ribosomal 16S y su utilización en filogenia y

taxonomía
El DNAr 16S es un polirribunucleotido codificado por el gen rrs también
denominado RNA ribosomal 16S, apartir de cuya secuenciación genética se
puede obtener información filogenética y taxonómica. Como cualquier secuencia
de nucleótidos de cadena sencilla, el DNAr 16S se pliega en una estructura
secundaria, caracterizada por la presencia de segmentos de doble cadena,
alternando con regiones de cadena sencilla (Neffs et al.,1990). En eucariotas el
DNAr 18S es la macromolécula equivalente. Dado que los DNAr 16S y 18S
proceden de las subunidades pequeñas de los ribosomas, el acrónimo DNAr
SSU (del inglés, Small Subunit) se utiliza para ambos (Rodicio & Mendoza,
2004). Los DNAr SSU son altamente conservados, presentando regiones
comunes a todos los organismos, pero contienen variaciones que se concentran
en zonas específicas. El análisis de la secuencia de los DNAr 16S de distintos
grupos filogenéticos reveló un hecho adicional de gran importancia práctica: La
presencia de una o más secuencias características que se denominan
oligonucleótidos firma, se trata de secuencias específicas cortas que aparecen
en todos (o en la mayor parte de) los miembros de un determinado grupo
filogenético, y nunca (o sólo raramente) están presentes en otros grupos,
incluidos los más próximos. Por ello, los oligonucleótidos firma pueden utilizarse
para ubicar a cada bacteria dentro de su propio grupo (Rodicio & Mendoza.,
2004; Heyndrickx et al., 1996).
La comparación de las secuencias del DNAr 16S es una herramienta poderosa

para deducir la filogenia, la evolución y la relación entre bacterias,
arqueobacterias y organismos eucariotas. Estas secuencias han sido derivadas
previamente de métodos como catalogación de oligonucleotidos, secuenciación
de clones, secuenciación directa de DNA usando trascriptasa reversa y
secuenciación de material amplificado por reacción de cadena de polimerasa
(PCR) (Weisburg et al., 1991). Aunque existen cronómetros moleculares
alternativos al DNAr 16S, hasta el momento ninguno ha conseguido desplazarlo.
Este marcador molecular presenta una serie de ventajas: 1) está presente en

todos los organismos y tiene la misma función en todos ellos; 2) debido a
restricciones estructurales, diferentes regiones de la molécula presentan distinto
grado de variabilidad en secuencia, lo que permite realizar comparaciones con
diferente nivel de resolución; 3) su transmisión es principalmente vertical ya que
se considera que no está sujeto a transferencia génica horizontal entre
microorganismos; 4) la longitud de su secuencia tiene un tamaño adecuado
como para proporcionar suficiente información, con un coste asumible, y 5) el
análisis de la secuencia permite realizar reconstrucciones filogenéticas de los
microorganismos. (Rodicio & Mendoza, 2004; Nogales, 2005).
La identificación basada en la secuenciación del gen que codifica el DNAr 16S

en los laboratorios microbiológicos se centra en cepas cuya identificación por
métodos fenotípicos resulta imposible, es el caso de bacterias no cultivables,
hecho que en ocasiones ha conducido al descubrimiento de nuevos
microorganismos; bacterias cuyas características bioquímicas no se adaptan a
las de ningún género o especie reconocido, esta situación puede presentarse
cuando se trata de nuevas especies; cepas de especies comunes que exhiben
un perfil bioquímico ambiguo; bacterias para las cuales la caracterización
fenotípica sea sustancialmente deficiente; bacterias fastidiosas, a consecuencia
de sus requerimientos nutricionales complejos y bacterias de crecimiento lento,
que retrasa considerablemente la identificación convencional. (Rodicio &
Mendoza, 2004)
2.7.2 Análisis de restricción del DNA ribosomal 16S amplificado (ARDRA)

Una alternativa para buscar la información filogenética y taxonómica que
encierra el DNAr 16S es el análisis del patrón electroforético obtenido después
de la digestión del gen con enzimas de restricción. La relación matemática entre
el número de los sitios compartidos por la enzima de restricción o de los
fragmentos compartidos del DNA es lo que entra en discusión para identificar la
divergencia genética. Los modelos matemáticos para hallar la similaridad de los
patrones de corte se basan en el uso de matrices binarias utilizando coeficientes
de similitud como el de Dice, Jaccard, Nei & Li, entre otros. Estos coeficientes
permiten agrupar a los morfotipos en clústers que identifican la distancia
genética mediante el uso de métodos de análisis de agrupamiento tales como el
Neigboring-Joing y UPGMA. En los últimos años, la amplificación del DNAr 16S
y el análisis de restricción se ha realizado en diferentes géneros como:
Clostridium, Streptocooccus, Mycobacteria, Moraxella, Leptospira Rhizobia,
Brevibacterium, Acinetobacter, entre otros (Heyndrickx et al., 1996).
2.7.3 Caracterización, identificación y filogenia del género Azotobacter y

otras bacterias diazótrofas mediante ARDRA
El análisis de restricción de DNAr 16S ha sido reportado por muchos autores
para realizar caracterización filogenética de baterías diazótrofas, sin embargo, un
punto critico de este análisis es la correcta identificación de las enzimas para una
caracterización adecuada. Debido a que las endonucleasas reconocen solo
ciertas secuencias de nucleótidos, el uso de estas debe generar una
diferenciación clara, es decir, deben reconocer sitios de corte en el gen DNAr
16S de diazótrofas y generar morfotipos diferentes para obtener porcentajes de
polimorfismo altos, con el fin de diferenciar las secuencias amplificadas. Las
herramientas de bioinformáticas han sido fundamentales para los análisis de
restricción ya que permiten simular los cortes de una enzima en determinada
secuencia, y de esta forma distinguir las enzimas que pueden proporcionar una
mayor información. Existen diferentes programas en internet para realizar
restricciones virtuales, entre los que se encuentran el FastPCR, CLC Gen
Worbech 2.2.4 y el Webcutter 2.0, además, existen diferentes enzimas de
restricción reportadas para la caracterización de diazótrofas. Aquilanti et al., (a)
(2004), compararon diferentes métodos de aislamiento preliminar y tomaron
muestras de suelo en el centro de Italia para realizar un análisis ARDRA,
utilizando los iniciadores universales 27f y1495r, que amplificaban el DNAr 16S
completo (1500 bp) para posteriormente realizar una digestión con las enzimas
de restricción RsaI y HhaI, identificando miembros de la familia
Azotobactereaceae, además especies del género Azomonas, Beijerinckia,
Azospirillum y Agrobacterium, reportando que la enzima Rsa I genera un patrón
de 5 bandas en la electroforesis para las especies del género Azotobacter.
De la misma forma, Magalãhes et al., (2001), realizaron una caracterización de

diazótrofas mediante ARDRA en aislamientos de muestras de suelo obtenidas
en cultivos de piña y banano utilizando los iniciadores universales Y1 y Y3 que
amplifican aproximadamente 1500 pb, utilizando enzimas de restricción AluI,
HaeII, HinfI y RsaI identificando bacterias diazotróficas: Herbaspirillum
seropedicae, Herbaspirillum rubrisubalbicans, Burkholderia brasilensis, y
Burkholderia tropicalis. Tejera et al., (2005), amplificaron el DNAr 16S utilizando
los iniciadores universales 41f y 1488r para especies de Azotobacter y utilizaron
las enzimas TaqI, NdeII y MspI para el análisis de restricción, reportando la
presencia de A. chroococcum y Azospirillum brasilense en cultivos de caña de
azúcar.
Perin et al., (2006), realizaron una caracterización de bacterias diazótrofas del

género Burkholderia aisladas de cultivos de maíz y caña de azúcar en México y
Brasil amplificando el DNAr 16S con los iniciadores universales para el dominio
bacteria fD1 y rD1 utilizando las enzimas AluI, DdeI, HaeIII, HhaI, HinfI, MspI, y
RsaI. Junior et al., (2004), realizaron una identificación de cepas de Azospirillum
asociados a Brachiaria spp. utilizando los iniciadores Y1 y Y3 para amplificar el
gen DNAr 16S y utilizaron las enzimas HaeIII, AluI, RsaI y CfoI, los patrones de
restricción fueron comparados utilizando el coeficiente de Jaccard (Rohlf, 2000) y
los aislados fueron agrupados por el método de medias distancias y
representados gráficamente por un dendrograma con el software NTSYS 2.0.
Aquilanti et al., (b) (2004), realizaron un análisis de restricción del DNAr 16S para
la caracterización de la familia Azotobactereaceae, utilizando iniciadores
universales 27f y 1495r amplificando 1500 bp y posteriormente utilizando unos
iniciadores internos Y1 y Y2 amplificando 300 bp en el extremo 5', para después
realizar la secuenciación del gen, utilizaron las enzimas RsaI, HhaI, HpaII,
FnuDII y AluI e identificaron las diferentes especies del genero Azotobacter,
seleccionaron las enzimas con ayuda de una restricción virtual del gen DNAr 16S
de secuencias de Azotobacter sp. y Azomonas sp. tomadas del Genbank,
utilizaron el programa Genetool software (Version 2.0) (Wishart et al., 2000), los
datos los organizaron en una matriz binaria de presencia (0) ausencia (1) de
bandas en los patrones de corte. Los diferentes patrones de corte de cada cepa
caracterizada con cada enzima fueron diferenciando y definiendo los haplotipos
y la combinación de los haplotipos obtenidos con las 5 enzimas fueron
agrupados generando los filotipos (Tiedje et al., 1999).
Asi mismo, Aquilanti et al., (b) (2004), hallaron la diversidad de los haplotipos, la
cual fue estimada usando el coeficiente de Shannon–Weaver: H= - £pi lnpi,
donde pi es la frecuencia de cada haplotipo (Shannon & Weaver, 1949). La
distancia genética entre los filotipos fue calculada utilizando el coeficiente de Nei
y Li (Nei & Li, 1979), y el resultado de la distancia en la matriz fue usado para el
análisis UPGMA y el análisis Neighbor-joining mid-point. La secuencia del gen
16S en todos los aislamientos estudiados fue comparada empleando el
programa Basic BLAST y los alineamientos usando el programa CLUSTALW
(Higgins et al., 1992) disponible en http://www.ebi.ac.uk/clustalw/. Los autores
reportaron el porcentaje de polimorfismo de cada enzima (RsaI 16%, HhaII 24%,
AluI 23%, HpaII 22%, FnuDII 15%) y concluyeron que la enzima RsaI posee un
bajo porcentaje diversidad 1.79, comparado con las enzimas HpaII y AluI
El análisis de restricción del DNA ribosomal 16S se ha utilizado para filogenia de

bacterias fototróficas de Rhizobium (Young et al., 1991), identificación de
especies de Micobacterias (Kurabachew et al., 2003), identificación de especies
de Actinomyces en aislados de muestras clínicas (Hall et al., 2001), identificación
para delinear las especies del bacterioplancton marino (Hagstrom et al., 2002) y
la identificación de diferentes bacterias importantes en biotecnología. Esto
demuestra que las técnicas moleculares como el ARDRA son muy útiles en la
identificación y caracterización de diferentes grupos de microorganismos y que
genera una identificación precisa de bacterias diazótrofas en suelos. Así mismo,
se constituye en una herramienta importante en estudios de filogenia,
taxonomía y ecología microbiana.
3. FORMULACION DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACION
Los procedimientos convencionales para la caracterización e identificación de

microorganismos diazótrofos empleando características fenotípicas, (forma
bacteriana, presencia de flagelos y test de Gram) bioquímicas (asimilación de
azucares, crecimiento en medios libres de nitrógeno, pruebas de oxidasa y
catalasa) y fisiológicas (crecimiento a diferentes temperaturas, condiciones
atmosféricas, concentración de sal y valores de pH) son métodos que permiten
identificar solamente algunos géneros de bacterias cultivables presentes en un
agroecosistema, además, son métodos que manifiestan un mayor grado de
ambigüedad entre especies y por esto la identificación y caracterización se hace
mas difícil.
Los microorganismos diazótrofos, descritos desde el siglo pasado, han sido

objeto no solo de estudio en microbiología de suelos, sino también en el
desarrollo de productos biológicos comerciales, especialmente en Cuba, México
y Estados Unidos. En este momento en Colombia, donde se han aislado
numerosas cepas asociadas a cultivos de importancia agrícola (arroz, caña,
maíz, hortalizas, algodón, banano, flores, etc.,), se cuenta con productos
comerciales registrados que contienen bacterias fijadoras de nitrógeno de vida
libre o simbiótica, con miras a ser utilizados para reducir o complementar la
fertilización química nitrogenada. Sin embargo, el control de calidad de estos
productos y la caracterización de los aislamientos se dificultan por la similitud
macro y microscópica de los mismos, haciendo que los análisis moleculares
sean la única herramienta realmente precisa.
El análisis del DNA ribosomal 16S suministra información importante sobre la

identidad de bacterias diazótrofas del género Azotobacter, y permite establer las
relaciones filogenéticas entre individuos del mismo agroecosistema. El análisis
de restricción del DNA ribosomal 16S amplificado a partir de muestras de suelo
de un agroecosistema proporciona un panorama claro de la diversidad presente
y lo convierte en una herramienta útil para la caracterización de microorganismos
no cultivables, de crecimiento lento o de aquellos con necesidades nutricionales
complejas.
La ejecución de esta propuesta pretende caracterizar cepas nativas colombianas
de la familia Azotobacteraceae, de la cual muchas especies se utilizan en la
industria agrícola como biofertilizantes. Además se procura establecer
protocolos de extracción y amplificación de ADN con el fin de validar esta
metodología para el control de calidad de bioproductos que contengan bacterias
diazótrofas e incluirla en el portafolio de servicios del Laboratorio de
Microbiología Ambiental y Suelos de la Pontificia Universidad Javeriana.
4. OBJETIVOS
4.1 Objetivo general.
9 Caracterizar molecularmente cepas nativas Colombianas de Azotobacter

spp. aisladas de cultivos de hortalizas mediante el Análisis de Restricción
del DNA Ribosomal 16S Amplificado (ARDRA)
4.2 Objetivos específicos.
9 Aislar cepas nativas colombianas de Azotobacter spp. en suelos de

cultivos de hortalizas ubicados en el departamento de Boyacá
9 Identificar fenotípica y bioquímicamente cepas de Azotobacter spp.

aisladas de suelos de cultivos de hortalizas ubicados en el departamento
de Boyacá.
9 Estandarizar un protocolo para extraer DNA total y amplificar el DNA

ribosomal 16S de cepas nativas de Azotobacter spp.
9 Analizar y comparar los patrones de corte generados por las enzimas de

restricción (AluI, HpaII y RsaI) sobre el DNA ribosomal 16S amplificado a
partir de cada uno de aislamientos.
9 Realizar un análisis filogenético de las diferentes cepas nativas aisladas.

5. METODOLOGIA
5.1 Lugar de muestreo
El muestreo de suelo se realizó en los municipios de Sogamoso y Tibasosa en el
departamento de Boyacá. Se muestrearon 6 cultivos de hortalizas (brócoli,
calabacín, coliflor, espinaca, tomate y zanahoria).
Se obtuvieron muestras de suelos de cultivos de calabacín (Cucurbita pepo),

espinaca (Spinacia oleracea) y tomate (Lycopersicon esculentum Mill) en la
granja agroindustrial de Cementos Paz del Rio en el municipio de Sogamoso
ubicado a 170 Km de la ciudad de Bogotá, la cual cuenta con una ubicación
geográfica de 5°43’41’’de latitud norte y 72°55’13’’ longitud oeste, con una
temperatura promedio de 17°C y una altura de 2500 msnm. Las muestras de
suelos de los cultivos de brócoli (Brassica oleracea itálica); coliflor (B. oleracea
botrytis) y zanahoria (Daucus carota var. Sativus) fueron colectadas en una finca
particular productora de hortalizas del municipio de Tibasosa, ubicado
geográficamente a 5°44’00’’ latitud norte y 73°00’04’’ longitud oeste, cuenta con
una temperatura promedio de 15°C y una altura de 2748 msnm. (Figura 6)
Figura 6. Lugar de muestreo en el departamento de Boyacá.
5.2 Muestreo del suelo

De cada cultivo de hortalizas se tomaron cinco muestras de 500g (Figura 7A) a
una profundidad de 10 a 15 cm (Martyniuk & Martyniuk 2003; Tejera et al.,
2005), el muestreo se realizó en forma de zig-zag a lo largo del cultivo (Torres et
al., 2000). Las muestra se empacaron en bolsas de papel que se colocaron
dentro de bolsas de plástico herméticas y posteriormente fueron trasportadas en
neveras de icopor a temperatura ambiente al laboratorio de Microbiología
Ambiental y Suelos de la Pontificia Universidad Javeriana (Figura 7B).
Figura 7. Recolección de las muestras de suelo. A) Muestras de 500 gramos; B) Trasporte de las
muestras en bolsas herméticas y neveras de icopor. Fuente: Autor.
5.3 Procesamiento de muestras

Una vez en el laboratorio, las muestras de suelo fueron tamizadas en un tamiz
estándar de 4.75 mm (Aquilanti et al., 2004 (a)), con el fin de obtener gránulos
uniformes, para realizar el aislamiento primario.
5.3.1 Medición de pH de las muestras de suelo

La medición del pH se realizó siguiendo el protocolo descrito por Van Lierop,
1981; se colocó en un frasco de vidrio limpio suelo tamizado y agua destilada en
proporción 1:1 p/v. Posteriormente, la suspensión se dejó precipitar durante 5
min y se tomó el valor de pH del sobrenadante con un potenciómetro OAKTON®.
Los valores de pH fueron promediados a partir de cuatro mediciones en cada
cultivo.
5.3.2 Aislamiento primario

A partir de cada muestra de suelo obtenida en los diferentes cultivos, se realizó
el aislamiento primario por triplicado, empleando la técnica de gránulos de suelo;
que consiste en colocar 20 gránulos en cajas de Agar Ashby-Sacarosa a una
distancia aproximada de 1 cm (Figura 8A) (Anexo 1) (Aquilanti et al., 2004 (a);
Pochon, 1975). Las cajas se incubaron a 28°C por 7 días hasta observar
alrededor de los gránulos colonias translucidas y mucilaginosas (Figura 8B). Se
realizó el recuento de gránulos con colonias, con el fin de obtener el porcentaje
de recuperación de bacterias diazótrofas aerobias asimbióticas para cada cultivo
(% de recuperación = No. de gránulos con colonias mucilaginosas/total de
gránulos sembrados X 100) y se realizó coloración de Gram.
Figura 8. Aislamiento primario. A) Siembra de gránulos en agar Ashby-Manitol; B) gránulos

mucilaginosos después de la incubación. Fuente: Autor.
5.4 Aislamiento secundario

El aislamiento secundario se realizó mediante siembra por agotamiento en cajas
con Agar Ashby-Sacarosa a partir de las colonias obtenidas en el aislamiento
primario. Las cajas fueron incubadas por 7 días a 28°C, posteriormente se
observó el crecimiento en el medio selectivo Ashby-Sacarosa, la morfología de la
colonia y de las células por medio de la coloración de Gram. (Tejera et al., 2005).
Las cepas aisladas que presentaron crecimiento en el segundo aislamiento se
codificaron de acuerdo al cultivo de donde fueron aisladas.
5.4.1 Conservación de los aislamientos mediante la técnica de

criopreservación en glicerol al 50% (v/v)
A partir de las cepas aisladas y evaluadas se realizaron cultivos en erlenmeyer
de 100ml con 50ml de caldo nutritivo (Anexo 2), el cual se incubó a 28°C por 24
horas con agitación de 150 rpm. El cultivo fue depositado en 10 viales eppendorf
de 1.5ml con 50% v/v de glicerol puro y estéril. Los tubos eppendorf se
almacenaron en bolsas ziploc a - 80°C (Aquilanti et al., 2004 (a) Poutou et al.,
1994).
5.4.2 Pigmentación de los aislamientos

Con el fin de observar la producción de pigmentos en medio solido, de cada
aislamiento se realizó una siembra en agar diferencial Ashby con 5g/l de
Benzoato (Anexo 1) (Torres et al., 2000) remplazando la fuente de carbono
(Sacarosa) en cajas de petri pequeñas para observar la pigmentación en las
colonias. La siembra se realizó tomando una colonia de cada aislamiento y
realizando una estría en toda la caja, se incubo a 28°C por 7 días y se observó
pigmentación (Figura 9). (Martyniuk & Martyniuk 2002)
Figura 9. Siembra en estria en agar Ashby con benzoato. Fuente: Autor.
5.4.3 Identificación Bioquímica

A cada aislamiento se le realizó una caracterización con base en el
comportamiento bioquímico frente a la fermentación de glucosa, maltosa, manitol
y ramnosa (Anexo 3) también se realizó una prueba de asimilación y crecimiento
en benzoato como fuente de carbono, test de catalasa, oxidasa y desnitrificación
en caldo nitrato (Holt, 2000; Tejera et al., 2005). La batería de azúcares fue
sembrada con una colonia de cada cepa, se llevó a incubar a 28°C por 24
horas. Posteriormente se verificó la acidificación del medio como indicativo de la
fermentación de azúcares y benzoato (Figura 10). Finalmente se realizó la
prueba de Nessler para determinar la desnitrificación, y las pruebas de catalasa
y oxidasa a partir de las colonias. (Anexo 4). Todas las pruebas bioquímicas se
realizaron por triplicado.
Figura 10. Baterías bioquímicas de azucares sin sembrar. A) Baterías bioquímicas servidas en
placas de 24 pozos; B) Baterías bioquímicas servidas en tubos de 13X100. Fuente: Autor.
5.4.4 Cepa control

Para la identificación bioquímica y la caracterización molecular se utilizó una
cepa A. vinelandii ATCC No. 12518 como control positivo, además se realizó la
caracterización a una cepa de Azotobacter aislada por Toro, (2006) en un cultivo
de papa (Solanum tuberosum L.) en el municipio de Tierra Negra (Boyacá).
5.5 Extracción de DNA
Inicialmente la extracción de DNA se realizó siguiendo el protocolo descrito por
Aquilanti et al., (a) (2004) Para esto, se tomaron tres colonias y se suspendieron
en 500µl de agua destilada estéril. Se llevaron a centrifugar a 5000 rpm por 5
min, el “pellet” obtenido se resuspendió en 100µl de agua estéril más 100µl de
Tris-HCL 10mM a pH 8.2. Finalmente se adicionó 0.65µl de proteinasa K
(20mg/ml), se llevó a incubar a 55°C por 2 horas, posteriormente se centrifugó a
5000 rpm por 5 min y se tomó 2µl del sobrenadante para la reacción de
amplificación (PCR).
Considerando que la extracción a partir de colonias no fue exitosa se procedió a

realizar la extracción de DNA a partir de medio de cultivo liquido, siguiendo el
protocolo propuesto por Maloy (1989) (http://www.research.umbc.edu), que
utiliza solventes orgánicos como Fenol Cloroformo alcohol Isoamílico (FCI) y
Cloroformo alcohol Isoamílico (CI) para la remoción de proteína. Este protocolo
ha sido utilizado con éxito por investigadores del Instituto Amazónico de
Investigaciones Científicas (SINCHI) para la extracción de DNA de bacterias
diazótrofas. El procedimiento consistió en realizar una suspensión a partir de una
colonia de Azotobacter en 5ml de caldo nutritivo en tubo falcón de 15ml la cual
se llevó a incubar de forma inclinada 48 horas a temperatura ambiente a 150
rpm. Posteriormente el cultivo se colocó en 2 tubos eppendorf de 1.5ml (c/u con
1.5ml del cultivo); se centrifugaron a 13000 rpm por 2 min y se desechó el
sobrenadante.
Las células se resuspendieron en 50µl de TE 1X (Anexo 5) y se reunieron las

fracciones en un solo tubo eppendorf de 1.5ml; se agregó 1ml TE de 1X y se
lavó suavemente, agitando los tubos; se centrifugó a 13000 rpm/2 min y se
descartó el sobrenadante; se resuspendieron las células en 350µl de TE 1X y se
adicionó 5µl lisozima (50mg/ml) y 2µl RNAsa A (10mg/ml), se llevó a incubar 10
min a 37ºC; posteriormente se adicionó 3µl proteinasa K (20mg/ml) y 30 µl SDS
10% y se volvió a incubar a 15 min a 65ºC hasta observar una suspensión
translúcida que indicará la lisis bacteriana. Una vez lisadas las células, se
adicionó 350µl de la mezcla fenol cloroformo alcohol isoamílico (FCI) 25:24:1
(Anexo 6) y se mezcló por inversión 5 veces; se centrifugó el tubo 13000 rpm por
7 min; posteriormente, el sobrenadante se recuperó en un tubo eppendorf de
1.5ml, teniendo cuidado de no tomar la interface ni la fase orgánica (fenol); se
adicionó 350µl de una mezcla de cloroformo alcohol isoamílico (CI) 24:1 y se
mezcló por inversión 5 veces para volver a centrifugar a 13000 rpm por 7 min;
El sobrenadante obtenido fue transferido a un tubo de vidrio de 13X100 que

contenía 1ml de etanol absoluto (98%); se mezcló suavemente hasta observar el
DNA suspendido; posteriormente, con ayuda de una pipeta pasteur estéril se
tomó el DNA y se colocó en un tubo eppendorf que contenía 500µl de etanol al
70%, posteriormente se centrifugó a 10000 rpm por 5 min. El pellet de DNA
obtenido se dejó secar durante 20 minutos a temperatura ambiente y finalmente
fue resuspendido en 50µl de agua destilada estéril para ser utilizado en la
reacción de amplificación (PCR).
5.6. Amplificación de DNA ribosomal 16S con iniciadores Y1 y Y3

Para lograr la amplificación del gen DNAr 16S se utilizaron los iniciadores
universales Y1 y Y3 que amplifican una región del DNAr 16S de la posición 20 a
la 1507 (1487 pb) de bacterias diazótrofas. (Magalãhes et al., 2001) (Tabla 3). La
amplificación se llevó a cabo en un volumen de 100µl que contiene: Buffer 1X;
2mM de MgCl2; 50µM de dNTPs; 0.2µM de iniciador Y1 y 0.2µM de iniciador Y3;
4U de Taq DNA polimerasa recombinante marca Biolase®; en un ensayo
preliminar de amplificación con cuatro volúmenes de DNA (1, 2, 3 y 4µl) se
determinó que el volumen del molde adecuado para una amplificación exitosa
era de 3µl (50ng aproximadamente) (Junior et al., 2004).
La reacción de amplificación (PCR) se llevó a cabó en un termociclador (My

cycler de Biorad® con un paso inicial de denaturación de 93ºC por 2 min; 35
ciclos con un programa de temperatura que consiste en: denaturación a 93ºC por
45 seg; anillamiento a 62ºC por 45 seg y elongación a 72ºC por 2 min; y un
paso final de extensión de 72ºC por 5 min (Junior et al., 2004).
Tabla 3. Secuencia y número de pares de bases de los iniciadores utilizados para la amplificación
del DNAr 16S de bacterias diazótrofas.
INICIADORES SECUENCIA PARES DE BASES (pb)

Y1 Forward 5'-TGGCTCAGAACGAACGCTGGCGGC-3' 24
Y3 Reverse 5'-TACCTTGTTACGACTTCACCCCAGTC-3' 26
Para observar los productos de la amplificación del DNAr 16S se corrió una
electroforesis en gel de agarosa al 1.0 % (p/v) en TBE 1X (Anexo 7), con
0.5µg/ml de bromuro de etidio. La electroforesis se llevó a cabo en una cámara
Thermo EC 330 Midcell® Primo a 3.2 V/cm por 1 hora. Se colocaron en cada
pozo 15µl del producto de amplificación con 3µl de buffer de carga 6X; se utilizó
el marcador de peso molecular de 100pb (Promega®). La visualización de las
bandas se realizó en un transiluminador de luz U.V y los geles fueron
fotografiados en el equipo Gel Documentation de Biorad®
5.7 Análisis de restricción del DNA ribosomal 16S amplificado (ARDRA)

Los productos de PCR fueron digeridos con las enzimas de restricción: AluI,
(Magalãhes et al., 2001; Aquilanti et al., 2004 (b)) HpaII (Aquilanti et al., 2004 (b))
y RsaI (Magalãhes et al., 2001; Aquilanti et al., 2004 (a) (b)).
La digestiones se llevaron a cabo por separado con cada enzima en un volumen

final de 40µl que contenian: 2.5U de cada una de las enzimas AluI, HpaII y RsaI
(Promega®); Buffer 1X; 0.1mg/µl de albumina de suero bovina (BSA); 25µl de
producto de amplificación. Todas las digestiones fueron incubadas en baño de
agua a 37°C por 3 horas de acuerdo con las recomendaciones del fabricante.
Las enzimas utilizadas y su correspondiente sitio de corte se encuentran en la
tabla 4.
Tabla 4. Enzimas de restricción utilizadas en los ensayos de ARDRA.
ENZIMA SITIO DE RESTRICCION

AluI (5'- AG / CT - 3') (3'- TC / GA -5')
HpaII (5'- C / CG G- 3') (3'- G GC / C-5')
RsaI (5'- GT / AC- 3') (3'-CA / TG-5')
5.7.1 Perfil electroforético para el ARDRA

Para observar y separar los productos de restricción del DNAr 16S se corrió una
electroforesis en gel de agarosa al 2.5% (p/v) en TBE 1X (0.09M de Tris-base,
0.09M de borato de sodio y 2.4 mM de EDTA, pH 8.3), con 0.5µg/ml de bromuro
de etidio. La electroforesis se llevó a cabo en una cámara de electroforesis
Thermo EC 330 Midcell® Primo a 3.2 V/cm durante 3 horas; Se colocaron en
cada pozo 25µl del producto de amplificación con 5µl de buffer de carga 6X; se
utilizó el marcador de peso molecular de 100pb (Promega®). Las bandas se
visualizaron en un transiluminador de luz U.V y los geles fueron fotografiados en
el equipo Gel Documentation de Biorad®
5.7.2 Análisis filogenético

Las imágenes digitalizadas de los geles producto del ARDRA fueron analizadas
con el software Quantity One de Biorad®. Se establecieron los patrones de
bandas en cada cepa aislada mediante una matriz básica de presencia y
ausencia (1 y 0); los pesos moleculares de cada banda se determinaron
mediante un análisis de regresión lineal, teniendo como referencia los pesos
moleculares del marcador de 100 pb (Promega®). Posteriormente, se construyó
la matriz de similaridad genética utilizando el índice de Dice a partir del cual se
realizó el análisis de agrupamiento UPGMA y el correspondiente cladograma
para cada enzima. Adicionalmente utilizando el programa NTSYS versión 2.0 se
realizó un análisis de agrupamiento UPGMA con las tres enzimas empleando el
coeficiente de Dice.
5.8 Restricción virtual

Con el fin de verificar el nivel de polimorfismo generado por las enzimas(AluI,
HpaII y RsaI) se realizó una restricción virtual utilizando el programa CLC Gene
Workbench 2.2.4®, Para eso se obtuvieron del Genebank, secuencias parciales
del DNAr 16S amplificadas de bacterias diazótrofas de las especies Azotobacter
vinelandii (AY336565); A. chroococcum (AY353708); A. paspali (AJ308318); A.
salinestris (AB175656); A. armeniacus (AB175655); A. beijerinckii (EF100152);
A. nigricans (AB175651); Azospirillum spp. (AF112477); Azomonas
macrocytogenes (AB175654); Beijerinckia derxi (AJ563934); Burkholderia tropica
(AF164045); Derxia gummosa (AB089482); Herbaspirillum seropedicae
(AY191275); Rhizobium leguminosarum (AY509900) y Escherichia coli
(AB305017).
Estas secuencias fueron alineadas empleando el programa CLC Gene

Workbench 2.3.4. Finalmente, con los patrones electroforéticos obtenidos se
realizó el correspondiente agrupamiento (UPGMA) como se describe en 5.7.2 y
se generó el cladograma que permitió establecer una comparación de los
morfotipos obtenidos con cada enzima en los diferentes aislamientos.
6. RESULTADOS
6.1 Medición de pH de los cultivos muestreados

El valor de pH registrado en los suelos muestreados se encuentra cercano a la
neutralidad. Para el caso del cultivo de zanahoria se obtuvo un valor de 6.25,
mientras que para el cultivo de tomate se registró un valor de 7.44. Estos valores
se encuentran en el rango óptimo reportado para el crecimiento de bacterias del
género Azotobacter (Tabla 6).
Tabla 5. Valores de pH de suelo de cada cultivo. Fuente: Autor.
Cultivo pH (Promedio) *
Brócoli 7.06
Calabacín 6.82
Coliflor 7.12
Espinaca 6.79
Tomate 7.44
Zanahoria 6.25
* Promedio de cuatro mediciones
6.2 Porcentaje de recuperación de bacterias diazótrofas aerobias

asimbióticas
Los porcentajes de recuperación se realizaron para cada cultivo, obteniendo un
mayor porcentaje en los cultivos de espinaca, tomate y brócoli, sin embargo, en
el cultivo de zanahoria se obtuvo el porcentaje de recuperación mas bajo
(31.33%). En la tabla 7 se muestran los promedios de gránulos con colonias
mucilaginosas y el porcentaje de recuperación en cada cultivo.
Tabla 6. Recuento de gránulos con colonias mucilaginosas y porcentaje de recuperación por

cultivo. Fuente: Autor.
Promedio* gránulos con colonias Porcentaje de

Cultivo
mucilaginosas recuperación
Brócoli 7.26 36.33
Calabacín 7.00 35.00
Coliflor 6.73 33.66
Espinaca 9.00 45.00
Tomate 7.53 37.66
Zanahoria 6.26 31.33
*Promedio de gránulos con colonia mucilaginosas en las 5 muestras de cada cultivo realizado por
triplicado
6.3 Identificación morfológica de bacterias diazótrofas aerobias
asimbióticas
En el aislamiento secundario en medio Ashby-Sacarosa se logró obtener un total
de 24 aislamientos de bacterias aerobias fijadoras de nitrógeno asimbióticas
(Tabla 7).
Tabla 7. Numero de cepas aisladas en agar Ashby- Sacarosa por cada cultivo
Cultivo Número de cepas aisladas
Brócoli 5
Calabacín 4
Coliflor 3
Espinaca 5
Tomate 5
Zanahoria 2
6.3.1 Morfología de las colonias

En el total de aislamientos se evidenciaron dos morfologías diferentes de
colonias (Figura 11). Las colonias en la mayoría de aislamientos fueron de color
crema, medianas, irregulares y brillantes muy similares a la reportadas para el
género Azotobacter, sin embargo, se presentaron aislamientos con colonias
pequeñas traslucidas y brillantes como en el caso de algunos aislamientos del
cultivo de brócoli. En la tabla 8 se muestran los resultados de la morfología de
las colonias de todos los aislamientos.
Figura 11. Morfología de colonia encontrada en los aislamientos de bacterias fijadoras de

nitrógeno aisladas de cultivos de hortalizas. A) Cepa C5E, colonias color crema, medianas,
irregulares y brillantes; B) Cepa C3BR, colonias pequeñas traslucidas y brillantes. Fuente: Autor
6.3.2 Morfología de las células

Se logró identificar tres morfologías celulares, se evidenció formación de quistes
en algunas cepas, al igual que bacilos Gram negativos, grandes y cortos, estas
dos morfologías son similares a las reportadas para el género Azotobacter. Sin
embargo, en algunas cepas se presentaron bacilos Gram negativos, cortos y
pequeños (Figura 12). En la tabla 8 se muestran los resultados obtenidos para la
morfología celular de todos los aislamientos
Figura 12. Morfología celular de los aislamientos. A) C5CA, quistes; B) CCT, bacilos Gram
negativos ovalados y grandes; C) C1BR, bacilos Gram negativos pequeños. Fuente autor
6.3.3 Pigmentación
La mayoría de las cepas aisladas no presentaron pigmentación, sin embargo,
algunos aislamientos pigmentaron de un color café claro, otros presentaron una
pigmentación café-negra y uno solo presento pigmentación verde (Figura 13 y
Tabla 8) esta característica de algunas bacterias de género Azotobacter ha sido
reportadas por Martyniuk & Martyniuk, 2003; Torres, 2000. Las pigmentaciones
de color café o negro son características de las especies de A. armenicus A.
nigricans y A. chroorococcum, mientras que la pigmentación amarillo verdosa es
característica de las especies de A. vinelandii y A. paspali (Holt, 2000), sin
embargo, estas se presentan dependiendo del medio diferencial donde se
encuentren o la presencia de un determinado sustrato, tal como lo han reportado
Aquilanti et al., (a) (2004); Holt, (2000).
Figura 13. Pigmentación de los aislamientos en agar Ashby-Benzoato. A) C1T, pigmentación café.
B) C5T; pigmentación negra-café; C) C5CA; pigmentación amarillo-verde. Fuente: Autor
Tabla 8. Características fenotípicas de los aislamientos de cepas diazotrófas encontradas en
cultivos de hortalizas en el departamento de Boyacá. Fuente: Autor
Morfología de Morfología
Cepa Muestra Lugar Pigmentación
la colonia celular
ATCC
- - A Y Sin pigmentación
12518
CCT Papa Tierra negra A Y Sin pigmentación
C1BR Brócoli Tibasosa A X Sin pigmentación
C2BR Brócoli Tibasosa B X Sin pigmentación
C3BR Brócoli Tibasosa B Y Sin pigmentación
C4BR Brócoli Tibasosa B X Sin pigmentación
C5BR Brócoli Tibasosa A Y Sin pigmentación

Calabacín
C1CA Sogamoso A Y Sin pigmentación
Calabacín
C3CA Sogamoso A X Café-Amarillo
Calabacín
C4CA Sogamoso A X Café claro
Calabacín
C5CA Sogamoso A Z Amarillo-verde
C1CO Coliflor Tibasosa A Y Negra
C4CO Coliflor Tibasosa A Y Sin pigmentación
C5CO Coliflor Tibasosa B Y Sin pigmentación
C1E Espinaca Sogamoso B Y Sin pigmentación
C2E Espinaca Sogamoso A Y Sin pigmentación
C3E Espinaca Sogamoso A Y Café
C4E Espinaca Sogamoso A X Café
C5E Espinaca Sogamoso A Y Café-negro
C1T Tomate Sogamoso A Y Café claro
C2T Tomate Sogamoso A X Sin pigmentación
C3T Tomate Sogamoso B Y Café-Negro
C4T Tomate Sogamoso A Y Café
C5T Tomate Sogamoso A Y Café-Negra
C1Z Zanahoria Tibasosa A Z Sin pigmentación
C2Z Zanahoria Tibasosa B X Sin pigmentación

A: Colonias color crema, medianas, irregulares y brillantes.
B: Colonias pequeñas traslucidas y brillantes.
X: Bacilos Gram negativos pequeños.
Y: Bacilos Gram negativos grandes.
Z: Quistes (Estructuras de resistencia).
6.4 Identificación Bioquímica

La identificación bioquímica se realizó utilizando las técnicas convencionales
para la identificación del género Azotobacter, las pruebas empleadas se basan
en la utilización de cuatro azúcares como fuente de carbono, prueba de oxidasa,
prueba de catalasa y desnitrificación de nitratos (Figura 14). En la tabla 9 se
muestran los resultados de la caracterización bioquímica de todas las cepas
aisladas.
Tabla 9. Caracterización bioquímica de los aislamientos, el control positivo (ATCC 12518) y la

cepa CCT. Fuente: Autor.
Cepa/Test GLU MAL MAN RAM BNZ OXI CAT NITRATO
ATCC 12518 + + + + D + + NITRITO

CCT + + + + + + + NITRITO
C1BR - - - - D + + NITRITO
C2BR - + + D - - + AMONIO
C3BR + D + - - + + NITRITO
C4BR - - - - - - + AMONIO
C5BR D + + + - + + NITRITO
C1CA + + D + + + + AMONIO
C3CA - - D - D + + AMONIO
C4CA D - - - - + + AMONIO
C5CA + + + + + + + NITRITO
C1CO D + + - D D + NITRITO
C4CO D - - - D + + NITRITO
C5CO + - - D - + + AMONIO
C1E D - - - - + + AMONIO
C2E + + + + + + + NITRITO
C3E + + + + + + + NITRITO
C4E - - - - D + + AMONIO
C5E + D + - D D + AMONIO
C1T + - - - - + + AMONIO
C2T - D - - - - + NITRITO
C3T - - - - - + + AMONIO
C4T + + + + + + + NITRITO
C5T D + + - D D + AMONIO
C1Z + - - - - - + NITRITO
C2Z - - - - - + - NITRITO
+: Prueba positiva.
- : Prueba negativa.
D: Bioquímica dudosa.
Figura 14. Caracterización bioquímica de los aislamientos. A) Acidificación del medio en la
asimilación de azúcares; prueba positiva. B) Prueba de oxidasa positiva; C) Prueba de catalasa
positiva; D) Prueba de desnitrificación positiva. Fuente: Autor.
De todas las cepas aisladas 10 fueron positivas para glucosa y 6 mostraron un

resultado dudoso para este azúcar, estas cepas fueron identificadas como
bacterias del género Azotobacter. Adicionalmente, la identidad de la cepa control
de A. vinelandii ATCC 12518 fue confirmada mediante las mismas pruebas.
Debido a que los resultados bioquímicos pueden ser ambiguos para diferentes
especies de Azotobacter y pueden ocasionar problemas en la identificación y
hacerla poco exacta, se tuvieron en cuenta las observaciones macro y
microscópicas (morfología de colonia y celular) así como la pigmentación
producida en medio Ashby-Benzoato para la identificación preliminar (Tabla 10).
Tabla 10. Identificación preliminar de los aislamientos. Fuente: Autor

Cepas Aisladas Identificación Preliminar
CCT; C5BR; C1CA; C5CA; C2E; C3E; C4T Azotobacter vinelandii
C1CO; C5E; C5T Azotobacter chroococcum/ A. nigricans
C3BR; C4CA; C4CO; C5CO; C1E; C1T; Azotobacter nigricans
C1Z Azotobacter paspali
En la identificación preliminar se evidenció que las cepas C1CO, C5E y C5T

presentaron resultados ambiguos para las especies de A. chroococcum y A.
nigricans, además de presentar pigmentación café-negra en el medio diferencial
Ashby-Benzoato.
6.5 Extracción de DNA

Para la extracción de DNA se utilizaron los protocolos descritos por Aquilanti et
al., (b) (2004) y Maloy, (1989). En el primer caso la extracción se realizó a partir
de colonias crecidas en medio Ashby-Sacarosa. Sin embargo este protocolo no
resultó ser exitoso pues a pesar de obtener una cantidad adecuada de DNA, al
realizar la amplificación con los iniciadores universales (Y1–Y3) para el gen
DNAr 16S no se obtuvo ninguna banda de amplificación. Debido a esto se
decidió utilizar el protocolo propuesto por Maloy, (1989)., que utiliza solventes
orgánicos para una eficiente remoción de proteínas y polisacáridos, permitiendo
obtener un DNA con mayor pureza y alto peso molecular, lo que garantiza el
éxito de la reacción de amplificación. Una vez obtenido el DNA de alto peso
molecular (Figura 15 carril 1) se procedió ha realizar la amplificación con los
primers Y1 y Y3 y se obtuvo el fragmento de 1487 pb acorde con lo reportado
por Magalhães et al, (2001); Junior et al., (2004). Utilizando el protocolo de
extracción propuesto por Maloy, (1989) se logró obtener ADN de 14 aislamientos
así como del control positivo (cepa de A vinelandii ATCC 12518) y la cepa CCT.
Los aislamientos que presentaron extracción de DNA exitosa fueron: C1BR,
C3BR, C5BR, C1CA, C5CA, C5CO, C1E, C2E, C3E, C5E, C1T, C4T, C5T, C1Z,
estos fueron caracterizados molecularmente por medio del análisis de
restricción. El único aislamiento que no se identificó preliminarmente como
bacteria del género Azotobacter fue C1BR.
6.6 Amplificación del DNA ribosomal 16S con los primers Y1 y Y3

Se realizó un ensayo preliminar con dos aislamientos para conocer la cantidad
adecuada de molde para la amplificación del DNAr 16S, los resultados
evidenciaron que con todos los volúmenes utilizados (1, 2, 3 y 4µl) se obtuvo una
banda de amplificación clara de aproximadamente 1490 pb (Figura 15), sin
embargo, considerando que la cantidad de DNA en todos los casos no es la
misma se decidió utilizar un volumen de 3µl en todas las reacciones. La
amplificación del DNAr 16S se realizó para los 14 aislamientos de los cuales se
obtuvo DNA, para la cepa control ATCC 12518 y para la cepa CCT.
Figura 15. Amplificación del DNAr 16S de dos cepas aisladas, variando el volumen de molde. 1 y
2) DNA de alto peso molecular de los aislamientos C3E y C5T. 3 y 7) 1µl de DNA de los
aislamientos C3E y C5T. 4 y 8) 2µl de DNA de los aislamientos C3E y C5T. 5 y 9) 3µl de DNA de
los aislamientos C3E y C5T. 6 y 10) 4µl de DNA de los aislamientos C3E y C5T. 11) Agua
destilada estéril 12) MPM (100pb). Fuente: Autor.
6.7 Análisis de restricción del DNA ribosomal 16S (ARDRA)
Para el análisis de restricción con la enzimas AluI, HpaII y RsaI se utilizó el gen
DNAr 16s amplificado con los primers Y1 y Y3, la visualización de las bandas se
realizó mediante una electroforesis en gel de agarosa al 2.0% a 3.2V/cm por 3
horas. (Figura 16, 18 y 20).
6.7.1 Análisis con la enzima AluI

Esta enzima generó 8 patrones de restricción o morfotipos diferentes, en donde
el morfotipo VIII fue el que generó mayor cantidad de bandas con un total de 12
y los morfotipos I y VI generaron el menor número de bandas con 3 bandas
cada uno (Tabla 11).
Figura 16. Electroforesis en gel de agarosa al 2.0%, digestión con la enzima AluI. 1) ATCC 12518.
2) CCT. 3) C1BR. 4) C3BR. 5) C5BR. 6) C1CA. 7) C5CA. 8) C5CO. 9) Agua destilada estéril. 10)
MPM (100pb). 11) C1E. 12) C2E. 13) C3E. 14) C5E. 15) C1T. 16) C4T. 17) C5T. 18) C1Z. Fuente:
Autor.
Tabla 11. Morfotipos obtenidos con la enzima AluI. Fuente: Autor.
Morfotipo Cepas # Bandas Pares de bases

I ATCC 12518; CCT; C5CA; C3E 3 558-370-203
II C1BR 4 845-591-217-172
III C3BR; C5CO; C1E; C1T 6 845-591-449-370-217-172
IV C5BR 2 845-591
V C1CA; C2E; C4T 4 591-558-370-203
VI C5E 3 591-370-203
370-300-250-203-172-147-133-116-
VII C5T 9 108
845-591-449-370-300-250-203-172-
VIII C1Z 12 147-133-116-108
La restricción con esta enzima generó un total de 78 bandas para todas las
cepas evaluadas de las cuales 13 bandas fueron polimórficas obteniendo un
porcentaje de polimorfismo de 16.6%. A partir de los diferentes morfotipos de
restricción se construyó una matriz de presencia y ausencia (1 y 0) y se realizó el
agrupamiento respectivo con el método UPGMA utilizando el coeficiente de
similitud de DICE (Anexo 8), este agrupamiento generó un cladograma en el cual
se evidencia que todas las cepas evaluadas forman tres grupos (I, II y III). Se
observó de manera general que el coeficiente de similitud para las cepas del
grupo III (C3E, CCT, C5CA, ATCC 12518, C4T, C2E Y C1CA) fue
aproximadamente de 0.80, y presentan un coeficiente de similitud muy bajo
aproximadamente 0.30 con respecto a las cepas C1Z y C5T que hacen parte del
grupo II. (Figura 17).
Figura 17. UPGMA con la enzima AluI para los aislamientos. Fuente Autor.
6.7.2. Análisis con la enzima HpaII

La restricción con la enzima HpaII generó 12 morfotipos de los cuales el que
generó el mayor número de bandas fue el morfotipo IV con 9 bandas, por otro
lado, los morfotipos I, VI, IX, X y XI presentaron 6 bandas. El mayor número de
cepas se encontró formando parte del morfotipo I que incluye las cepas ATCC
12518, CCT, C2E y C3E (Tabla 12).
Figura 18. Electroforesis en gel de agarosa al 2.0%. Digestión con la enzima HpaII. 1) ATCC
12518. 2) CCT. 3) C1BR. 4) C3BR. 5) C5BR. 6) C1CA. 7) C5CA. 8) C5CO. 9) Control Negativo.
10) MPM (100 pb Promega). 11) C1E. 12) C2E. 13) C3E. 14) C5E. 15) C1T 16) C4T. 17) C5T. 18)
C1Z. Fuente: Autor.
Tabla 12. Morfotipos obtenidos con la enzima HpaII. Fuente: Autor.
Morfotipo Cepas # Bandas Pares de bases

I ATCC 12518; CCT; C2E; C3E 6 511-272-172-144-123-113
II C1BR; C5BR 4 951-636-411-220
III C3BR 8 951-638-411-334-256-239-220-113
IV C1CA 9 951-511-461-411-272-172-144-123-113
V C5CA 7 951-511-272-172-144-123-113
VI C5CO 6 951-411-334-256-239-123
VII C1E 7 951-638-461-411-334-456-239
VIII C5E 4 411-334-256-239
IX C1T 6 951-638-411-220-144-123
X C4T 6 461-272-172-144-123-113
XI C5T 6 677-411-367-272-220-123
XII C1Z 5 677-411-334-256-239
Por otro lado, la restricción con esta enzima generó un total de 92 bandas para
las 16 cepas analizadas, de todas las bandas 16 fueron polimórficas, pero
ninguna de ellas fue única, esta enzima tiene un porcentaje de polimorfismo de
17.3%. Los resultados del agrupamiento utilizando el coeficiente de Dice (Anexo
9) muestran que las cepas analizadas con esta enzima generan dos grupos
diferentes (Figura 19). Las cepas C1CA, C4T, C5CA, C3E, C2E, CCT y ATCC
12518 se agrupan con un coeficiente de similitud de aproximadamente de 0.60
(grupo I), encontrándose el mayor coeficiente de similitud (0.95) entre la cepa
ATCC 12518 y el aislamiento CCT. De otra parte en el grupo (II), los
aislamientos C1T y C5T se agrupan con un coeficiente de similitud de 0.20 con
respecto al resto de aislamientos de este grupo.
Figura 19. UPGMA con la enzima HpaII para los aislamientos. Fuente: Autor.
6.7.3. Análisis con la enzima RsaI
La enzima RsaI generó el menor número de morfotipos (solo 7) observándose el

menor número de bandas en el morfotipo IV (3 bandas). El morfotipo que incluyó
mayor cantidad de aislamientos corresponde al morfotipo I, con el que se obtuvo
un patrón de 5 bandas (Tabla 13)
Figura 20. Electroforesis en gel de agarosa al 2.0%. Digestión con la enzima RsaI. 1) ATCC
12518. 2) CCT. 3) C1BR. 4) C3BR. 5) C5BR. 6) C1CA. 7) C5CA. 8) C5CO. 9) Control Negativo.
10) MPM (100 pb Promega®), 11) C1E. 12) C2E. 13) C3E. 14) C5E. 15) C1T. 16) C4T. 17) C5T.
18) C1Z. Fuente: Autor.
Tabla 13. Morfotipos hallados con la enzima RsaI. Fuente: Autor
Morfotipo Cepas # Bandas Pares de Bases

ATCC 12518; CCT;
I 5 968-507-457-405-108
C1CA; C5CA; C2E; C4T.
II C1BR, C5BR 4 479-405-350-139
III C3BR; C5CO; C1E 6 479-426-405-350-139-108
IV C3E; C5T 3 892-507-108
V C5E 6 640*-426-405-374-350-139
VI C1T 7 479-426-405-374-350-139-108
VII C1Z 7 892-507-426-405-350-139-108
*Banda única.
Esta enzima generó un total de 82 bandas entre los 7 morfotipos de las cuales
13 bandas fueron polimórficas y una de ellas fue única y se encuentra en el
morfotipo V generando un porcentaje de polimorfismo de 15.8% y un porcentaje
de bandas únicas de 1.2%. En forma general el agrupamiento utilizando el
coeficiente de Dice (Anexo 10) y el método UPGMA generó 2 grupos (I y II) en
donde las cepas que conforman el grupo (I) tienen un coeficiente de similitud
aproximadamente de 0.65, mientras que en el otro grupo (II) las cepas ATCC
12518, CCT, C1CA, C4T y C5CA presentaron un coeficiente de similitud de
aproximadamente 0.85 (Figura 21).
Figura 21. UPGMA con la enzima RsaI para los aislamientos. Fuente: Autor.
6.8 Cladograma generado del análisis con las tres enzimas
Para reunir los datos obtenidos de los tres análisis se realizó agrupamiento
UPGMA con el coeficiente de Dice utilizando del programa NTSYS 2.0. Los
resultados obtenidos muestran que todos los aislamientos junto con la cepa
ATCC 12518 forman tres grupos (I, II y III). El grupo I se formó con un
coeficiente de similitud de aproximadamente 0.75. En este grupo la cepa ATCC
12518 y el aislamiento CCT presentaron el mayor coeficiente de similitud (1.0) y
un coeficiente de similitud de 0.97 con respecto al aislamiento C5CA. El grupo II
presentó un coeficiente de similitud de aproximadamente 0.69 e incluye todos los
aislamientos de brócoli. Por otro lado, en el grupo III los aislamientos C5T y C1Z
se forma con un coeficiente de similitud de aproximadamente 0.65, además
mostraron los morfotipos más disímiles (Figura 22).
Figura 22. Análisis de agrupamiento UPGMA obtenido con las enzimas AluI, HpaII y RsaI para los
aislamientos. Fuente: Autor.
6.9 Restricción virtual.

Para la restricción virtual se utilizaron secuencias parciales del gen DNAr 16s de
bacterias diazótrofas y de Escherichia coli como control negativo, obtenidas del
Genbank (Tabla 14). Los alineamientos, la comparación de las secuencias y el
agrupamiento (UPGMA) se realizaron en el software CLC Gen Workbench 2.2.4,
De manera general las secuencias se agruparon en cuatro grupos, en donde en
el clúster II se encuentran la mayoría de las especies del género Azotobacter
excepto A. chroococcum que se encuentra en el grupo I. Por otro lado, en el
grupo III solamente se encuentra la bacteria no fijadora de nitrógeno (E. coli), y
en el ultimo grupo se encuentra H. seropedicae, D. gummosa y B. tropica.
(Figura 22).
Tabla 14. Secuencias del DNAr 16S obtenidas en el Genbank para el análisis de restricción virtual.
Microorganismo Accession Secuencia (pb) Iniciadores Publicación

A. vinelandii AY336565 1398 27f- 1495r Aquilanti et al., 2004 (a ; b)
A. chroococcum AY353708 1383 27f-1495r Aquilanti et al., 2004 (a ; b)
A. paspali AJ308318 1384 - Hilario et al., 2004
A. salinestris AB175656 1477 - No publicado
A. armeniacus AB175655 1481 - No publicado
A. beijerinckii EF100152 1372 - No publicado
A. nigricans AB175651 1475 - No publicado
Azospirillum spp. AF112477 1457 - Oh et al., 1999
A. macrocytogenes AB175654 1442 - No publicado
B. derxi AJ563934 1429 28f-1481r Dedysh et al.,
B. tropica AF164045 1429 Y1-Y3 Magalhães et al, 2001
D. gummosa AB089482 1449 8f-1527r Xie & Yokota et al., 2004
H. seropedicae AY191275 1429 Y1-Y3 Magalhães et al, 2001
R. leguminosarum AY509900 1475 - No publicado
E. coli AB305017 1464 - No publicado
Figura 23. UPGMA con las secuencias alineadas y comparadas utilizadas en el análisis de
restricción virtual. Fuente: Autor.
El alineamiento y la comparación de las secuencias mostraron que el mayor

porcentaje de similitud se presentó entre las secuencias de A. salinestris y A.
armenicus con un 98.58%. Por otro lado, la similitud de las secuencias en las
especies del género Azotobacter se encuentra en un rango de 71.92% a
98.58%, siendo A. chroococcum la mas disímil de este grupo. Además, se
evidenció que las secuencias de Azospirillum spp. y A. macrocytogenes fueron
las mas similares con respecto a las del género Azotobacter. Finalmente se
observó que la similitud de las secuencias de E. coli, H. seropedicae, B. tropica y
D. gummosa, con respecto a las del género Azotobacter esta en un rango de
74.68% a 83.34%. (Anexo 11).
6.9.1 Análisis virtual con la enzima AluI

La restricción virtual realizada con esta enzima mostró que cada secuencia
pertenece a un morfotipo distinto, se evidenció que las secuencias del género
Azotobacter generan 3 bandas mayores a 100pb, excepto la secuencia de A.
chroococcum que produce 6 bandas. Por otro lado las secuencias de B. derxi, B.
tropica y R. leguminosarum generaron 5 bandas (Tabla 15). Esta enzima generó
un total de 64 bandas de las cuales 30 fueron polimórficas obteniendo un
porcentaje de polimorfismo de 48.3% (Figura 24).
Tabla 15. Número de bandas y pesos moleculares mayores a 100pb generados con la enzima AluI
en las secuencias obtenidas del Genbank. Fuente Autor.
Microorganismo Número de bandas Pesos moleculares (pb)

A. chroococcum 6 239-208-184-159-144-126
A. vinelandii 4 600-208*-207*-175-162
A. nigricans 4 602-241-208*-207*-162
A. paspali 4 601-370-207-117
A. armeniacus 4 601-370-225-207
A. salinestris 4 601-221-208*-207*-162
A. beijerinckii 4 601-209*-207*-162-108
A. macrocytogenes 4 572-208*-207*-192-162
Azospirillum spp. 3 600-209*-207*-162*-162*
B. derxi 5 430-382-231-200-144
D. gummosa 4 571-396-209-152
B. tropica 5 571-396-209-200-147
H. seropedicae 4 427-209-205*-202*-144
R. leguminosarum 5 402-208-207*-207*-184-144
E. coli 4 377-361-221-207
*Pesos moleculares que generan la misma banda en la electroforesis virtual
Figura 24. Restricción virtual con la enzima AluI. 1) MPM 100pb 2) A. chroococcum. 3) A.
vinelandii. 4) A. nigricans. 5) A. paspali. 6) A. armeniacus. 7) A. salinestris. 8) A. beijerinckii. 9)
Azomonas macrocytogenes. 10) Azospirillum spp. 11) Beijerinckia derxi. 12) Derxia gummosa. 13)
Burkholderia tropica. 14) Herbaspirillum seropedicae. 15) Rhizobium leguminosarum. 16)
Escherichia coli. Fuente: Autor.
Los patrones de corte obtenidos con esta enzima fueron agrupados a por medio
del análisis UPGMA (Figura 24) y se determinó su similaridad por medio del
coeficiente de Dice (Anexo 12). Los resultados de este análisis mostraron 6
grupos ubicándose la mayoría de las especies de Azotobacter en el grupo IV, sin
embargo A. chroococcum, A. paspali y A. armeniacus se encuentran formando
parte de otros grupos. (Figura 24). Se logró observar que la similitud entre los
patrones de corte generados por las secuencias de A. negricans, A. vinelandii, A.
salinestri, Azospirillum spp. y A. beijerinckii fue de aproximadamente 0.85, por
otro lado, A. armenicus y A. paspali generaron una similitud aproximada de 0.78
entre ellos y una similitud de 0.60 frente al grupo anteriormente mencionado.
Figura. 25. UPGMA del análisis de restricción virtual con la enzima AluI para las secuencias
obtenidas del Genbank. Fuente: Autor.
6.8.2 Análisis virtual con la enzima HpaII
Con esta enzima cada secuencia formó un morfotipo diferente excepto las
secuencias de A. vinelandii y A. negricans, que mostraron un patrón de bandas
idéntico en la electroforesis virtual, sin embargo, dos de sus bandas se
diferencian por tan solo una base. Las secuencias de A. chroococcum y A.
salinestris generaron 5 y 4 bandas respectivamente, mientras que las demás
secuencias del género Azotobacter formaron 4 bandas, siendo las secuencias de
B. derxi y E. coli las que generaron el mayor número de bandas (Tabla 16). Esta
enzima generó un total de 73 bandas y un porcentaje de polimorfismo de 42.4%.
(Figura 25).
Tabla 16. Número de bandas y pesos moleculares mayores a 100pb generados con la enzima
HpaII en las secuencias obtenidas del Genbank. Fuente: Autor.

A. chroococcum 3 654-271-220
A. vinelandii 4 545-406-128-108
A. nigricans 4 546-406-128-109
A. paspali 4 546-373-129*-128*-108
A. armeniacus 4 656-406-128-118
A. salinestris 5 406*-405*-139-128-118-108
A. beijerinckii 4 547-364-128*-125*-108
A. macrocytogenes 5 546-404-128-112-108
Azospirillum spp. 5 548-449-128-124-108
B. derxi 6 417-287-220-153-142-114
D. gummosa 5 487-423-128-116-108
B. tropica 4 541-277-128-108*-107*
H. seropedicae 5 456-423-128-116-108
R. leguminosarum 5 494-402-220-157-121
E. coli 6 476-278-160-135-108-106*-104*
Figura 26. Restricción virtual con la enzima HpaII. 1) MPM 100pb 2) A. chroococcum. 3) A.
Los patrones de corte fueron agrupados utilizando el análisis UPGMA (Figura
26), el cual fue determinado mediante una matriz de similitud utilizando el
coeficiente de Dice (Anexo 13). Este agrupamiento mostró de forma general que
las secuencias forman 5 grupos, las secuencias de A. vinelandi y A.
macrocytogenes tiene una similitud mayor a 0.85 en el grupo V, las secuencias
de A. salinestris y A. armeniacus forman un solo grupo (III), mientras que la
secuencia de A. chroococcum forma parte del grupo I.
Figura. 27. UPGMA del análisis de restricción virtual con la enzima HpaII para las secuencias
6.8.3 Análisis virtual con la enzima RsaI

Con esta enzima se obtuvieron 14 morfotipos diferentes y un total de 62 bandas
que generaron un porcentaje de polimorfismo de 50% (Figura 27). Se encontró
que A. armeniacus y A. salinestris, corresponden a un mismo morfotipo con un
total de 5 bandas. En el caso de A. chroococcum se obtuvo un patrón de dos
bandas, siendo el morfotipo que menor número de bandas presentó (Tabla 17).
(Figura 28) (Anexo 14).
Tabla 17. Número de bandas y pesos moleculares mayores a 100pb generados con la enzima
RsaI en las secuencias obtenidas del Genbank. Fuente: Autor.

A. chroococcum 2 789-505
A. vinelandii 4 585-356-233-146
A. nigricans 4 652-356-234-146
A. paspali 5 527-356-234-146-121
A. armeniacus 5 635-356-234-146-110
A. salinestris 5 631-356-235-146-110
A. beijerinckii 5 518-357-234-146-117
A. macrocytogenes 5 591-356-234-146-104
Azospirillum spp. 4 838-357-146-116
B. derxi 4 422*-414*-262-142-106
D. gummosa 4 470-404-352-146
B. tropica 4 439-404-390-108
H. seropedicae 4 439-404-348-150
R. leguminosarum 3 825-501-149
E. coli 3 502-457-407
Figura 28. Restricción virtual con la enzima RsaI. 1) MPM 100pb 2) A. chroococcum. 3) A.
Los morfotipos obtenidos de la restricción virtual formaron 4 grupos. En el grupo

IV se encuentran la mayoría de las especies de Azotobacter excepto A.
chroococcum, que se encuentra formando parte del grupo III, junto a R.
legominosarum y E. coli. La mayoría de especies del género Azotobacter se
agrupan con un coeficiente de similitud de aproximadamente 0.70 (grupo IV) en
este grupo se incluyen las especies A. salinestris y A. armeniacus que presentan
el coeficiente máximo de similitud de 1.00.
Figura. 29. UPGMA del análisis de restricción virtual con la enzima HpaII para las secuencias
7. DISCUSIÓN DE RESULTADOS
Los cultivos de hortalizas son de gran importancia agrícola en nuestro país, ya

que son fuente de materias primas para el comercio y la alimentación. Los
suelos de estos cultivos poseen bacterias diazótrofas del género Azotobacter
que cumplen diferentes roles benéficos como, la fijación del nitrógeno molecular,
la producción de fitohormonas (Pandey & Kumar, 1990), la depuración de
compuestos tóxicos (Juárez et al., 2004) y mantienen el equilibrio ambiental y
ecológico en el agroecosistema. Estas bacterias son utilizadas como
biofertilizantes para disminuir el uso de compuestos nitrogenados sintéticos, con
el fin darle un valor agregado ecológico al producto, además generar mayor
rentabilidad desde el punto de vista económico (Torres, 2000 <on line>).
Para el aislamiento y caracterización molecular de bacterias diazótrofas del

género Azotobacter fueron muestreados suelos de diferentes cultivos de
hortalizas ubicados en dos municipios en el departamento de Boyacá (Figura 6).
Estos suelos fueron tomados en cuenta para el muestreo ya que pertenecen a
cultivos de hortalizas fertilizados con gran cantidad de materia orgánica y
fosfatos, lo que beneficia la proliferación de bacterias diazótrofas tal como lo
reporta Jensen, (1965); Gordon, (1981); Tsain et al., (1979), además de no
utilizar, en su esquema de rotación, fertilizantes nitrogenados en exceso que
puedan inhibir las bacterias diazótrofas, se evidencio un color oscuro en el suelo
lo que hace suponer gran cantidad de materia orgánica presente (Figura 8),
además se obtuvo información del manejo de fertilizantes en estos cultivos,
suministrada por el Ingeniero agrónomo a cargo de estas plantaciones.
El muestreo se realizó en forma de zig-zag a lo largo del cultivo a una

profundidad de 10 a 15cm, con el fin de obtener un buen porcentaje de
recuperación bacteriano (Torres et al., 2000; Aquilanti et al., 2004 (a)), aunque
los 5 muestreos realizados por cultivo no fueron cuantificados estadísticamente
fueron suficientes para el aislamiento. Por otro lado, los cultivos evaluados no
eran de gran extensión y las 5 muestras fueron representativas para la
recuperación de bacterias diazótrofas asimbióticas aerobias.
Se observó que los suelos de todos los cultivos poseen un pH cercano a la
neutralidad (Tabla 5), lo que favorece el aislamiento de bacterias del género
Azotobacter, siendo el suelo del cultivo de zanahoria el que presentó un menor
valor pH (6.25) lo que posiblemente afectó la recuperación y el crecimiento de
bacterias de este género. Aunque se han reportado especies que pueden crecer
desde pH alrededor de 5.5 como A. chroococcum y A. vinelandii (Sarybay,
2003), sin embargo, el rango optimo para el crecimiento cuando realizan la
fijación de nitrógeno se encuentra entre 7.0 y 7.5 (Balandreau, 1986).
El aislamiento y recuperación se realizó en medio Ashby-Sacarosa, este es un

medio diferencial libre de nitrógeno que permite el aislamiento de bacterias
fijadoras de nitrógeno. Debido a que todas las especies de Azotobacter son
capaces de utilizar la sacarosa como fuente de carbono (Holt, 2000), el medio
fue preparado con 5g/L de sacarosa. Sin embargo se ha reportado que para el
aislamiento de A. chroococcum se puede utilizar medio con manitol o benzoato,
(Torres et al., 2000), además posee microelementos importantes para la fijación
de nitrógeno como el FeSO4 y algunos utilizan Molibdeno como en el caso del
medio Jensen`s (Kumar & Narula, 1999).
Los porcentajes de recuperación se presentaron en un rango de 31.3 a 45.0%

(Tabla 6), sin embargo, el cultivo de menor porcentaje fue el de zanahoria, lo
cual se pudo presentar debido al pH bajo del suelo, así mismo, en este cultivo
solamente se logró obtener dos aislamientos (C1Z y C2Z), para los demás
cultivos el porcentaje de recuperación se presentó en un rango de 35 a 45%,
aunque fueron porcentajes relativamente bajos se lograron aislar 22 cepas
fijadoras de nitrógeno aerobias asimbióticas, en donde el mayor número de
cepas aisladas se presentó en los cultivos de tomate, espinaca y brócoli (5
aislamientos). Las colonias mucilaginosas obtenidas en los gránulos en el
aislamiento primario presentaron quistes formados, esto se debe a que las
bacterias de el género Azotobacter cuando provienen del suelo se encuentran en
un estado de resistencia a las condiciones ambientales (desecación) (Vela,
1974).
Los 24 aislamientos presentaron dos morfologías de colonias (Figura 11), una de

ellas se caracterizó por presentar colonias color crema, medianas, irregulares y
brillantes, morfología reportada para bacterias del género Azotobacter (Aquilanti
et al., (a) 2004), sin embargo, algunas presentaron colonias pequeñas
traslucidas y brillantes, las cuales pueden ser muy similares a las anteriormente
nombradas y presentarse en otros géneros fijadores de nitrógeno asimbióticos
como Beijerinckia (Holt, 2000) lo que dificulta la identificación. Los aislamientos
que presentaron este tipo de colonia fueron C2BR, C3BR, C4BR, C5CO, C1E,
C3T y C2Z; los demás aislamientos presentaron colonias similares a las
reportadas por el género Azotobacter (Tabla 8).
La identificación mediante la morfología celular generó tres diferentes formas

celulares. En los aislamientos C1Z y C5CA se observaron quistes (Figura 12),
estos pueden formarse después de la fase de crecimiento exponencial, cuando
las condiciones son adversas por falta de nutrientes o nutrientes complejos como
el β-Hidroxibutirato o bien cuando se degradan los PHBs (Hitchins & Sadoff,
1973), también por la acción de iones calcio en el medio (Hitchins & Sadoff,
1970); por otro lado, estas estructuras de resistencia no son formadas
exclusivamente por especies del género Azotobacter, sino que también son
características de especies del género Beijerinckia, aunque existen diferencias
en el número de quistes agrupados, ya que Azotobacter forma pares y
Beijerinckia no los agrupa, para el caso de estos dos aislamientos los quistes se
agruparon en pares.
Los aislamientos C1BR, C3BR, C4BR, C3CA, C4CA, C4E, C2T Y C2Z
presentaron bacilos Gram negativos pequeños, muy similares a los formados por
Azospirillum spp., Beijerinckia spp., Herbaspirillum spp. y Derxia spp., el resto de
los aislamientos presentaron bacilos Gram negativos grandes como los
reportados por Azotobacter spp. (Holt, 2000) (Tabla 8), sin embargo, los
aislamientos que presentaron esta morfología posiblemente pudieron germinar y
pasar a su forma vegetativa, proceso que ocurre cuando las bacterias crecen
con medios libres de nitrógeno y una fuente de azúcar fácil de metabolizar como
el manitol o la sacarosa (Hitchins & Sadoff, 1970). En general, esta identificación
y caracterización morfológica es muy relevante a la hora de identificar un género
bacteriano fijador de nitrógeno y al mismo tiempo ofrece una serie de ventajas
para distinguir fenotipos diferentes al manifestado por bacterias del género
Azotobacter, tal es el caso de los aislamientos C2BR, C4BR y C2Z, los cuales no
presentaron ninguna homología con las características morfológicas de
Azotobacter, pero presentaron una clara fijación de nitrógeno asimbiótica, lo cual
sugiere que pueden ser fijadoras de nitrógeno mas no ser del género
Azotobacter.
Con respecto a la caracterización fisiológica o a la producción de pigmentos, se

evidenciaron tres pigmentaciones diferentes, café claro, café-negro y amarillo
verdoso. Según se ha reportado, el género Azotobacter tiene la capacidad de
producir pigmentos solubles (Pandey et al., 1998; Holt, 2000 Saribay, 2003), lo
que puede ser útil a la hora de caracterizar diferentes especies, sin embargo, de
acuerdo con la composición del medio, otras especies como Bejerinckia derxi
tiene la capacidad de presentar pigmentaciones solubles de color verde (Holt,
2000). En este caso se observó la pigmentación en un medio Ashby con 5g/L de
benzoato, utilizado para diferenciar especies de A. chroococcum y A. negricans,
las cuales forman pigmentos oscuros (negros o cafés) (Torres et al., 2000;
Martyniuk & Martyniuk 2002).
Los resultados muestran que los aislamientos C1CO, C5E, C1T, C3T, C5T,
presentaron características fenotípicas y de pigmentación similares a las
presentadas por A. chroococcum y A. nigricans, (Tabla 8), este tipo de
pigmentación se debe a que el benzoato es tomado como fuente de carbono y
metabolizado por medio de la vía β-cetoadipato, que genera succinato que es
introducido a la cadena respiratoria mediante el sistema dependiente de flavina,
el cual esta relacionado con la pigmentación del medio. (Castillo, 2005).
Por otro lado, se observó que los aislamientos C3CA y C4E evidenciaron una
pigmentación café-amarilla, con bacilos Gram negativos pequeños, diferentes a
los de Azotobacter y una identificación bioquímica preliminar negativa para este
género; esto indica que pueden ser fijadoras de nitrógeno que pigmentan pero
que no son del género Azotobacter o que su identificación bioquímica no fue lo
suficientemente clara. Por el contrario los aislamientos C4CA y C3E también
pigmentaron café pero a diferencia del resto, el primer aislamiento presentó
bacilos Gram negativos pequeños y el segundo fue identificado bioquímicamente
como A. vinelandii. Esto demuestra la gran dificultad de caracterizar estos
microorganismos por métodos convencionales (Aquilanti et al., (a) 2004).
La identificación bioquímica preliminar se llevó a cabo con base en la utilización
de cuatro azúcares y benzoato como fuente de carbono, pruebas de oxidasa y
catalasa y desnitrificación de nitrato, estas bioquímicas se utilizaron ya que
permiten diferenciar el género Azotobacter, de otras bacteria fijadoras de
nitrógeno asimbióticas (Tejera et al., 2005) y así mismo ayuda a diferenciar cada
especie, un ejemplo claro de esto es que A. vinelandii es la única especie del
género capaz de asimilar la ramnosa y utilizarla como fuente de carbono (Holt,
2000), además todas las especies de este género tiene la capacidad de producir
oxidasas para la protección de su nitrogenasa (Thorneley & Ashby, 1989). Los
resultados de la identificación bioquímica preliminar muestran que de los 24
aislamientos 16 presentaron un resultado positivo o dudoso para la fermentación
de glucosa, sin embargo fueron considerados bacterias del género Azotobacter
(Tabla 9), los resultados dudosos se presentaron debido a que en las tres
replicas una de ellas generó un resultado diferente, esto pudo ocurrir por la
alcalinización del medio después de de la utilización y fermentación del azúcar, o
bien por factores externos de contaminación.
La identificación preliminar evaluando los aislamientos mediante la morfología

celular y de colonia, la pigmentación y las bioquímicas generó 4 grupos (Tabla
10), el primero conformado por los aislamientos C5BR, C1CA, C5CA, C2E, C3E,
C4T los cuales fueron identificados como bacterias de la especie A. vinelandii, el
segundo grupo presentó ambigüedad entre las especies de A. chroococcum y A.
nigricans, esto ocurrió ya que muchos de sus resultados de las pruebas
bioquímicas fueron dudosos pero coinciden con el perfil para estas especies En
el tercer grupo se presentaron los aislamientos C3BR, C4CA, C4CO, C5CO,
C1E, C1T los cuales se identificaron como A. negricans y en el ultimo grupo una
sola cepa del cultivo de zanahoria (C1Z) fue identificada como A. paspali. La
cepa control (ATCC12518) presentó un resultado que confirmó su ubicación
taxonómica como A. vinelandii, este resultado coincide con el obtenido para la
cepa CCT; en ambos casos se presentaron colonias con la morfología típica
reportada para el género Azotobacter (Aquilanti et al., 2004 (a)) con la diferencia
de no presentarse pigmentación en el medio Ashby-Benzoato, ya que esta
especie no es capaz de catabolizar el benzoato (Holt, 2000).
De otra parte, trabajo realizado por Mantilla, 2007 aportó información tendiente a
establecer la identidad de la cepa ATCC 12518 con base en la gran producción
de ácido indol acético (AIA) característica de las bacterias de este género.
Una vez caracterizados los aislamientos fenotípica y bioquímicamente se

procedió a realizar la caracterización molecular. En esta etapa se utilizaron dos
protocolos de extracción de DNA, el primero propuesto por Aquilanti et al., 2004
(b), el cual no fue exitoso, ya que al realizar la amplificación con los iniciadores
Y1 y Y3 no se obtuvo la banda esperada de 1487pb (Magalãhes et al., 2001), los
interferentes de esta extracción pudieron ser de tipo metodológico o externo, ya
que se ha reportado que la impureza o baja calidad del DNA puede inhibir el
proceso de amplificación (PCR) (White, 1993). Fue por esto que se utilizó el
protocolo de extracción reportado por Maloy, 1989, el cual utiliza solventes
orgánicos para la remoción de proteínas y polisacáridos, agentes que pueden
inhibir la reacción de PCR. Con los aislamientos C1BR, C3BR, C5BR, C1CA,
C5CA, C5CO, C1E, C2E, C3E, C5E, C1T, C4T, C5T, C1Z que presentaron una
extracción de DNA exitosa, se realizó la amplificación del DNAr 16S y posterior
análisis de restricción. La cepa CCT (aislada en otro trabajo y catalogada como
Azotobacter) y el control ATCC12518 también fueron evaluadas mediante este
análisis molecular.
Los iniciadores universales Y1 y Y3, han sido utilizados en la amplificación del

DNAr 16S de bacterias diazótrofas (Magalãhes et al., 2001; Junior et al., 2004),
sin embargo, no son específicos para bacterias del género Azotobacter, pero ya
que en este estudio se realizó una identificación preliminar no fue necesario
utilizar iniciadores únicos para el género. La caracterización de bacterias
diazótrofas se puede realizar a partir de diversos genes presentes en estos
microorganismos que codifiquen para determinadas funciones, como los nif para
la nitrogenasa (Roesch et al., 2006), pero debido a las características del gen
DNAr 16S y a su trasmisión únicamente vertical, se ha convertido en el
cronometro molecular por excelencia. Este gen codifica para el RNAr 16S que
hace parte del la subunidad pequeña del ribosoma (SSU) (Weisburg et al., 1991;
Rodicio & Mendoza, 2004; Nogales, 2005).
El ARDRA se realizó con tres enzimas de restricción (AluI, RsaI, HpaII), los
morfotipos generados con estas enzimas en los aislamientos fueron comparados
con los morfotipos generados por las mismas enzimas en secuencias parciales
del DNAr 16S de diferentes géneros fijadores de nitrógeno obtenidas del
Genbank. De manera general, estas enzimas presentaron porcentajes de
polimorfismos altos en el análisis de restricción de los aislamientos, ya que para
la enzima AluI el porcentaje fue de 16.6%, para la HpaII fue de 17.3% y para
RsaI fue de 15.8%, estos son muy similares a los reportados por Aquilanti et al.,
(a y b) (2004), por el grado de polimorfismo que son utilizadas en caracterización
de bacterias diazótrofas (Magalãhes et al., 2001), ya que permiten una clara
diferenciación inter e intraespecífica de bacterias diazótrofas. Se evidenció una
relación directamente proporcional entre el porcentaje de polimorfismo y los
morfotipos generados, ya que en la enzima RsaI donde se presentó el menor
porcentaje de polimorfismo también se obtuvieron menos morfotipos, este
resultado es consistente con lo reportado por Aquilanti et al., (b) (2004).
El porcentaje de polimorfismo obtenido en este trabajo fue menor comparado

con el generado por la restricción virtual para las tres enzimas. Esto se debió,
posiblemente, a que para el análisis virtual, se utilizaron secuencias de
diferentes microorganismos (diazotrófos asimbióticos, simbióticos, endófitos y
una bacteria no fijadora de nitrógeno), lo que aumentó el grado de polimorfismo
y el número de morfotipos, sin embargo, se pudo evidenciar que estas enzimas
permiten obtener una clara diferenciación inter e intraespecífica.
Los resultados del análisis UPGMA conjunto para las tres enzimas formo tres
grupos (Figura 22). Se evidenció que las cepas C3E, CCT, ATCC 12518, C5CA,
C4T, C2E muestran un agrupamiento único en para las tres enzimas, grupo (I).
Por otro lado, las cepas C5BR, C1BR, C1E, C3BR, C1T, C5CO se agrupan
igualmente con las tres enzimas en otro grupo (II). Caso especial fueron las
cepas C5E, C5T y C1Z, que se agruparon en el grupo (III), esto indica que las
cepas C5E, C5T y C1Z no generaron un morfotipo similar a ninguno de los
demás aislamientos, algo evidente, ya que las cepas C5T y C1Z siempre
presentaron morfotipos irregulares para cada enzima y la cepa C5E presentó
una banda única con la enzima RsaI; estas bandas únicas son muy especiales,
ya que pueden ser útiles en el diseño de iniciadores específicos para la
amplificación mediante la reacción de la polimerasa (PCR).
Se observó que las cepas del grupo (II) incluyen aislamientos encontrados
solamente en los cultivos ubicados en el municipio de Sogamoso, mientras que
para el grupo (II) y (III) las cepas pertenecen a los cultivos muestreados en los
dos municipios. Esto indica que posiblemente los aislamientos generan grupos
filogenéticos diferentes de acuerdo a las características del suelo o al tipo cultivo.
Por otro lado, no se observó una relación entre los diferentes grupos con
respecto al pH del suelo, sin embargo en el grupo II, la mayoría de la cepas
fueron aisladas de suelos con valores de pH en un rango entre 7.06 a 7.44.
Al comparar los morfotipos generados del análisis ARDRA en este trabajo y los
generados a partir de la restricción virtual de las secuencias obtenidas del
Genebank, se observó en algunos casos una gran consistencia entre el número
de bandas y sus correspondientes pesos moleculares, sin embargo en otros
casos esta consistencia se presenta solo para una o dos de las enzimas. Esto
puede deberse a que los iniciadores utilizados (Y1-Y3) no son los mismos que
los utilizados para la amplificación de las secuencias reportadas en el Genebank
(Tabla 14) y por esto los pesos moleculares de las bandas generadas con las
enzimas pueden diferir en unos cuantos pares de bases especialmente en los
fragmentos de las regiones flanqueantes del gen, se consideraron bandas
similares en la comparación cuando diferían entre 15 a 25pb. Por otro lado, en
algunos aislamientos se observó la presencia de bandas de mayor peso
molecular después de la digestión con algunas enzimas, hecho que no se
presenta en las digestiones virtuales lo que indica que algunas copias del gen no
fueron digeridas completamente.
Con respecto al grupo (I) se logró observar que con las tres enzimas todas las
cepas mostraron similitud en las bandas generadas con respecto a los patrones
de corte de las especies del género Azotobacter utilizadas en la restricción
virtual. Sin embargo los patrones de corte no fueron suficientemente claros y se
decidió hacer un análisis minucioso de las bandas generadas en cada morfotipo
para evidenciar homología. Un ejemplo de esta similitud se generó con la cepa
C1CA, la cual presentó para la enzima AluI una similitud de dos bandas con
respecto a la secuencia de A. vinelandii y 4 bandas similares con la enzima HpaII
para el mismo microorganismo, sin embargo, con la enzima RsaI no se logró
ubicar esta cepa en ningún grupo. Con respecto a la cepa utilizada como control
(ATCC 12518) generó una similitud de 2 bandas con la enzima AluI y HpaII, pero
al igual que la anterior el morfotipo generado con la enzima RsaI no permitió
compararla con ninguna secuencia virtual. Debido a éstos resultados aunque
los morfotipos generados no sean completamente exactos el patrón de bandas
permite diferenciar de manera parcial cada aislamiento y considerarlo muy
similar a bacterias del género Azotobacter.
Con respecto al grupo (II) se logró observar que estas cepas poseen varias
bandas similares con las tres enzimas para bacterias del género Azotobacter, sin
embargo se encontró una relación muy cercana entre estas y las restricciones
virtuales de B. derxi, A. macrocytogenes y Azospirillum spp., un ejemplo claro de
esta situación se presento con la cepa C1BR, la cual presentó una similitud de
tres bandas con la enzima AluI frente a Azospirillum spp. y de tres bandas frente
a A. macrocytogenes pero con las enzimas HpaII y RsaI se presentaron dos
bandas similares a B. derxi, además con la enzima RsaI mostró similaridad de
cuatro bandas frente a D. gummosa. Posiblemente esta cepa es diferente a las
del género Azotobacter ya que su identificación preliminar fue negativa para
especies de este género, además su morfología corresponde a bacilos Gram
negativos pequeños similares a los de Azospirillum spp. y B. derxi. (Holt, 2000),
además siempre se ubicó junto con C5BR en un clúster alejado de los demás
aislamientos (Figuras 17, 19 y 21).
Por otro lado, en este mismo grupo, se evidenció que la cepa C5CO tiene una
similitud con A. negricans, ya que comparte algunas bandas en sus diferentes
morfotipos para las tres enzimas, aunque también comparte algunas bandas con
A. vinelandii. Sin embargo la caracterización bioquímica y fenotípica mostró un
perfil que se ajusta a la especie A. negricans por lo que se puede concluir que
las características bioquímicas, fenotípicas y moleculares permiten ubicarla
taxonómicamente como A. negricans.
Con respecto al grupo (III) se observó de manera especial que la cepa C5T
generó morfotipos idénticos en las tres enzimas con respecto A. chroococcum,
con diferencias en unas pocas bases, pero con el mismo perfil de corte. Lo que
significa que este aislamiento tiene una gran similaridad de secuencia con la
utilizada en la restricción virtual para A. chroococcum, se puede concluir que
genéticamente este aislamiento puede ser considerado como A. chroococcum,
además su identificación bioquímica lo respalda (Tabla 10), así como la
pigmentación producida en medio con benzoato (Figura 13 B).
Por otro lado, se logró verificar que el aislamiento C5T aunque presentó unos
morfotipos atípicos en todas las enzimas pertenece al género Azotobacter, sin
embargo, la secuencia de esta especie es diferente a las demás de este género,
esto se observó también en la restricción virtual y en la comparación de los
alineamientos de las secuencias obtenidas en el Genbank (Figura 22) ya que
formo siempre morfotipos y grupos diferentes a las demás especies de
Azotobacter, tal como lo reporta Aquilanti et al., (b) (2004). Las cepas C5E y C1Z
las cuales son muy similares a la cepa C5T, mostraron en la comparación con
las restricciones virtuales que comparten varias bandas en las tres enzimas con
el género A. chroococcum, sin embargo, la cepa C5E es la mas similar, aunque
no compartió los mismos sitios de corte con cada enzima, pero observando su
pigmentación (Tabla 9) posiblemente se trate de la misma especie. De otra parte
la cepa C1Z mostró similitud con otras especies de Azotobacter, por lo que su
identificación como A. paspali de acuerdo con las pruebas bioquímicas
preliminares, no pudo ser confirmada.
En conclusión, de los 16 aislamientos 14 presentaron similitud genética con

respecto a especies del género Azotobacter. De estos, el aislamiento C5T
presentó un morfotipo para las tres enzimas idéntico al presentado por la
secuencia de A. chroococcum, mientras que los aislamientos C1BR y C5BR
presentaron similitud con otros géneros fijadores de nitrógeno como B, derxi, A.
macrocytogenes, Azospirillum spp. y D. gummosa. Aunque el análisis molecular
es confiable, lo recomendable en estos casos es trabajar con cepas certificadas
para tener una comparación clara frente a los aislamientos.
Para finalizar es preciso anotar que las caracterizaciones moleculares mediante

ARDRA (Magalãhes et al., 2001; Tejera et al., 2005) DGGE (Lovell et al., 2000),
RFLPs (Yeager et al., 2004) y otras técnicas permiten tener una mayor certeza
en la identificación de géneros diazotrófos, sin embargo las técnicas
convencionales son de gran ayuda en estas identificaciones. El ARDRA es una
de las herramientas mas utilizadas en la caracterización molecular de
organismos, ya que permite obtener relaciones filogenéticas entre individuos,
además de conocer un poco mas de su estructura genética (Heyndrickx et al.,
1996). Las enzimas utilizadas en este tipo de análisis deben generar un alto
grado de polimorfismo, que permitan observar diferencias significativas inter o
intraespecíficas. Para esto las ayudas bioinformaticas son fundamentales ya
permiten clasificar enzimas que generen polimorfismo para grupos específicos y
así evitar altos costos en análisis inútiles además de ser indispensables en
estudios de biodiversidad, bioprospección y biotecnología.
8. CONCLUSIONES
El suelo muestreado en cultivos de hortalizas en dos municipios del

departamento de Boyacá presentó valores de pH adecuados y determinantes
para la recuperación de bacterias diazótrofas del género Azotobacter.
La caracterización fenotípica y bioquímica permitió identificar 17 aislamientos

presuntivos como especies del género Azotobacter, sin embargo, se presentaron
resultados ambiguos y dudosos.
Utilizando el protocolo de Maloy, (1989), se logró extraer DNA bacteriano con

una pureza y calidad adecuadas para amplificar el gen DNAr 16S de bacterias
diazótrofas, utilizando los iniciadores universales Y1-Y3.
El análisis de restricción del DNA ribosomal amplificado (ARDRA) con las

enzimas AluI, HpaII, y RsaI género porcentajes de polimorfismo de
aproximadamente 16%, obteniéndose el mayor valor con la enzima HpaII. Esto
permitió agrupar los aislamientos de bacterias del género Azotobacter en tres
grupos de similaridad, El grupo I el cual se formó con un coeficiente de similitud
de aproximadamente 0.8 incluye los aislamientos mas similares genéticamente a
las especies del género Azotobacter.
El aislamiento CCT proveniente de un cultivo de papa presentó el máximo valor

de similitud (1.0) con respecto a la cepa de Azotobacter vinelandii ATCC 12518,
lo que sugiere que puede tratarse de esta especie. En el caso del aislamiento
C1CA se presentó un coeficiente de similitud de 0.95 con respecto a las
anteriormente mencionadas, indicando que también puede tratarse de A.
vinelandii. Estos resultados fueron consistentes con los obtenidos para la
restricción virtual y las pruebas bioquímicas preliminares.
El análisis de restricción virtual con secuencias obtenidas del Genbank permitió

establecer comparaciones útiles para aclarar la ubicación taxonómica e
identificación de algunos aislamientos de bacterias diazótrofas provenientes de
cultivos de hortalizas. Esto demuestra la importancia de las herramientas
bioinformaticas como apoyo en estudios de diversidad.
Mediante la combinación de métodos convencionales y moleculares se logró
caracterizar de manera precisa como A. chroococcum un aislamiento
proveniente de un cultivo de tomate del municipio de Sogamoso y con una alta
similaridad como A. vinelandii los aislamientos C5CA y CCT, provenientes de
cultivos de calabacín y papa respectivamente.
9. RECOMENDACIONES
Utilizar diferentes medios y sustratos para verificar la pigmentación de otras

especies del género Azotobacter y verificar el comportamiento bioquímico frente
a una mayor cantidad de sustratos.
Realizar pruebas fisicoquímicas del suelo muestreado, con el fin de obtener

mayor información del agroecosistema y de esta forma conocer la función de las
bacterias aisladas en estos cultivos.
Realizar pruebas de AIA para identificar la producción de esta fitohormona y

pruebas de reducción de acetileno.
Con el fin de amplificar DNAr 16s de bacterias del género Azotobacter se debe
trabajar en el diseño de primers específicos y de esta forma tener mayor
exactitud en la caracterización.
Utilizar un mayor número de enzimas de restricción, con el fin de obtener más

información de las secuencias del gen DNAr 16s de bacterias del género
Azotobacter.
Se sugiere utilizar en estos casos cepas certificadas para obtener una

comparación realmente clara de los aislamientos en las restricciones virtuales,
además con el fin de identificarlos plenamente se debe secuenciar el gen
completa o parcialmente (Y1-Y2).
Realizar caracterización con genes nif y comparar los resultados con las
realizadas en base al DNAr 16S
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11. ANEXOS
ANEXO 1. MEDIO AGAR ASHBY

COMPOSICION g/l
Sacarosa/Manitol o Benzoato 5
KH2PO4 1
MgSO4.7H2O 0.2
FeSO4. 7H2O 0.005
NaCl 0.2
CaCl2. 2H2O 0.2
Agar 15
pH 7.0 (+/- 0.2). Fuente: Martínez, 2003
ANEXO 2. CALDO NUTRITIVO Scharlau chemie®

COMPOSICION g/l
Extracto de carne 3.0
Extracto de peptona 5.0
ANEXO 3. PREPARACION DE AZUCARES Merck®

COMPOSICION g/l
Base rojo de fenol (caldo) 15
Azúcar (Maltosa; Manitol; Glucosa; Ramnosa)* 1
*Para la preparación con el benzoato se agrega igualmente un gramo por litro de
medio.
ANEXO 4. PRUEBA DE OXIDASA Y CATALASA. Fuente: Escobar, 2002.
Prueba de oxidasa: Coloque sobre una tira de papel filtro, puesta sobre una
lamina, varias gotas del reactivo recién preparado de tetrametil-p-fenilendiamina
al 1% en agua destilada estéril. Con un palillo tome una colonia del
microorganismo y frótela sobre el papel humedecido. La prueba de oxidasa
indica la presencia de enzimas oxidativas, denominadas citocromos, que son
porfirinas, que contiene hierro y se encuentran en la cadena respiratoria, pues
participan en el trasporte de electrones. Una prueba positiva de oxidasa se
determina por el cambio de color de azul a púrpura después de diez segundos
de poner al microorganismo con el reactivo
Prueba de catalasa: Esta se leva a cabo con el fin de comprobar la presencia

de la enzima catalasa. Con un asa de siembra se recogió el centro de una
colonia pura de 18 a 24 h de incubación en TSA y se extendió sobre un
portaobjetos, luego con un gotero se agrego una gota de HO2 al 3%. La
formación de burbujas indica la liberación de O2 característico de un resultado
positivo.
ANEXO 5. PREPARACION DE TE 1X
COMPOSICIÓN CANTIDAD/ 100ml
Tris 10mM 1ml
EDTA 1mM 0.08ml
Agua destilada 39.52ml
ANEXO 6. PREPARACION DE FCI (25:24:1) y FC (24:1)*

Fenol 50ml
Cloroformo 48ml
Alcohol Isoamílico 2ml
*Para la preparación del FC no se utiliza el fenol
ANEXO 7 PREPARACION DE TBE 5X*

Tris 10.8 g
Acido bórico 5.5g
EDTA 4ml
*Para la preparación del TBE 1X se diluye con agua destilada.
Fuente: Sambrook. 1989.
ANEXO 8. INDICE DE DICE PARA LA ENZIMA AluI
ATCC CCT C1BR C3BR C5BR C1CA C5CA C5CO C1E C2E C3E C5E C1T C4T C5T C1Z
ATCC 100.0 93.9 0.0 26.5 0.0 86.6 97.3 13.7 19.5 85.7 83.4 50.0 11.3 90.7 35.2 32.6
CCT 93.9 100.0 0.0 24.6 0.0 90.5 92.5 14.2 20.2 89.0 83.1 52.3 11.8 88.0 36.1 34.2
C1BR 0.0 0.0 100.0 72.4 49.7 15.9 0.0 76.9 60.7 15.5 0.0 29.8 85.2 14.7 16.5 36.0
C3BR 26.5 24.6 72.4 100.0 42.2 36.0 27.0 86.8 83.4 36.3 29.6 42.7 82.2 36.4 27.3 52.9
C5BR 0.0 0.0 49.7 42.2 100.0 19.8 0.0 38.7 53.7 19.3 0.0 32.3 39.3 18.2 0.0 21.2
C1CA 86.6 90.5 15.9 36.0 19.8 100.0 85.2 26.2 31.3 98.1 76.9 65.1 25.2 95.6 34.2 40.8
C5CA 97.3 92.5 0.0 27.0 0.0 85.2 100.0 14.0 19.9 84.2 86.0 51.5 11.6 90.0 35.8 31.2
C5CO 13.7 14.2 76.9 86.8 38.7 26.2 14.0 100.0 83.8 26.0 15.5 46.2 87.3 25.1 23.7 52.9
C1E 19.5 20.2 60.7 83.4 53.7 31.3 19.9 83.8 100.0 31.1 21.9 46.5 72.0 30.2 21.3 49.8
C2E 85.7 89.0 15.5 36.3 19.3 98.1 84.2 26.0 31.1 100.0 78.9 65.4 25.0 94.8 34.5 40.8
C3E 83.4 83.1 0.0 29.6 0.0 76.9 86.0 15.5 21.9 78.9 100.0 52.5 13.0 78.2 31.2 26.8
C5E 50.0 52.3 29.8 42.7 32.3 65.1 51.5 46.2 46.5 65.4 52.5 100.0 37.5 63.1 30.5 41.7
C1T 11.3 11.8 85.2 82.2 39.3 25.2 11.6 87.3 72.0 25.0 13.0 37.5 100.0 24.0 22.8 43.8
C4T 90.7 88.0 14.7 36.4 18.2 95.6 90.0 25.1 30.2 94.8 78.2 63.1 24.0 100.0 34.0 38.9
C5T 35.2 36.1 16.5 27.3 0.0 34.2 35.8 23.7 21.3 34.5 31.2 30.5 22.8 34.0 100.0 76.5
C1Z 32.6 34.2 36.0 52.9 21.2 40.8 31.2 52.9 49.8 40.8 26.8 41.7 43.8 38.9 76.5 100.0
ANEXO 9. INDICE DE DICE PARA LA ENZIMA HpaII

ATCC 100.0 94.0 0.0 17.4 0.0 62.7 70.8 8.4 0.0 84.0 81.3 0.0 19.1 64.3 24.4 0.0
CCT 94.0 100.0 0.0 17.3 0.0 59.5 70.5 13.8 0.0 83.2 83.2 0.0 24.5 64.8 26.8 0.0
C1BR 0.0 0.0 100.0 51.8 81.7 24.4 17.7 40.3 66.7 0.0 0.0 15.3 43.4 0.0 20.0 17.1
C3BR 17.4 17.3 51.8 100.0 50.1 25.3 14.5 48.9 63.6 15.4 9.9 45.2 39.4 11.1 15.2 54.8
C5BR 0.0 0.0 81.7 50.1 100.0 16.4 16.4 37.8 55.4 0.0 0.0 13.9 53.0 0.0 25.1 9.3
C1CA 62.7 59.5 24.4 25.3 16.4 100.0 60.1 18.6 24.2 56.8 65.6 9.8 35.8 58.3 24.5 13.6
C5CA 70.8 70.5 17.7 14.5 16.4 60.1 100.0 18.8 14.0 77.2 62.9 0.0 25.6 61.4 24.4 0.0
C5CO 8.4 13.8 40.3 48.9 37.8 18.6 18.8 100.0 61.4 5.7 17.3 31.4 26.8 10.2 19.2 39.0
C1E 0.0 0.0 66.7 63.6 55.4 24.2 14.0 61.4 100.0 0.0 0.0 49.0 29.8 4.0 9.6 46.1
C2E 84.0 83.2 0.0 15.4 0.0 56.8 77.2 5.7 0.0 100.0 72.0 0.0 17.2 67.6 24.6 0.0
C3E 81.3 83.2 0.0 9.9 0.0 65.6 62.9 17.3 0.0 72.0 100.0 0.0 17.1 60.5 28.4 0.0
C5E 0.0 0.0 15.3 45.2 13.9 9.8 0.0 31.4 49.0 0.0 0.0 100.0 10.5 0.0 10.8 60.7
C1T 19.1 24.5 43.4 39.4 53.0 35.8 25.6 26.8 29.8 17.2 17.1 10.5 100.0 19.5 48.4 15.1
C4T 64.3 64.8 0.0 11.1 0.0 58.3 61.4 10.2 4.0 67.6 60.5 0.0 19.5 100.0 27.8 0.0
C5T 24.4 26.8 20.0 15.2 25.1 24.5 24.4 19.2 9.6 24.6 28.4 10.8 48.4 27.8 100.0 32.3
C1Z 0.0 0.0 17.1 54.8 9.3 13.6 0.0 39.0 46.1 0.0 0.0 60.7 15.1 0.0 32.3 100.0
ANEXO 10. INDICE DE DICE PARA LA ENZIMA RsaI
ATCC 100.0 84.1 18.6 38.5 18.7 82.0 83.0 42.5 29.7 71.3 48.8 17.7 35.4 86.9 43.3 45.0
CCT 84.1 100.0 22.6 34.0 18.8 87.4 91.8 37.3 28.8 63.1 54.0 15.8 35.2 87.9 41.6 40.5
C1BR 18.6 22.6 100.0 71.8 92.8 25.6 24.4 69.1 77.6 14.2 0.0 61.2 77.7 25.5 0.0 45.8
C3BR 38.5 34.0 71.8 100.0 76.3 30.4 32.4 92.8 92.6 22.4 23.7 66.0 89.1 33.6 17.7 65.6
C5BR 18.7 18.8 92.8 76.3 100.0 21.4 20.3 71.5 83.1 14.3 0.0 63.1 79.3 21.2 0.0 45.8
C1CA 82.0 87.4 25.6 30.4 21.4 100.0 94.2 34.0 32.1 66.5 43.5 17.9 32.0 93.2 46.2 44.8
C5CA 83.0 91.8 24.4 32.4 20.3 94.2 100.0 36.0 30.8 64.1 44.6 17.1 33.8 94.3 45.6 43.4
C5CO 42.5 37.3 69.1 92.8 71.5 34.0 36.0 100.0 86.8 23.1 24.5 62.7 85.9 37.3 18.3 65.4
C1E 29.7 28.8 77.6 92.6 83.1 32.1 30.8 86.8 100.0 22.3 14.7 67.4 87.8 31.9 15.7 64.9
C2E 71.3 63.1 14.2 22.4 14.3 66.5 64.1 23.1 22.3 100.0 31.0 13.5 21.0 68.8 34.0 35.2
C3E 48.8 54.0 0.0 23.7 0.0 43.5 44.6 24.5 14.7 31.0 100.0 0.0 21.4 41.0 87.6 55.6
C5E 17.7 15.8 61.2 66.0 63.1 17.9 17.1 62.7 67.4 13.5 0.0 100.0 59.1 17.8 0.0 57.9
C1T 35.4 35.2 77.7 89.1 79.3 32.0 33.8 85.9 87.8 21.0 21.4 59.1 100.0 34.9 16.6 58.3
C4T 86.9 87.9 25.5 33.6 21.2 93.2 94.3 37.3 31.9 68.8 41.0 17.8 34.9 100.0 41.9 44.3
C5T 43.3 41.6 0.0 17.7 0.0 46.2 45.6 18.3 15.7 34.0 87.6 0.0 16.6 41.9 100.0 61.8
C1Z 45.0 40.5 45.8 65.6 45.8 44.8 43.4 65.4 64.9 35.2 55.6 57.9 58.3 44.3 61.8 100.0
ANEXO 11. PORCENTAJE DE SIMILITUD DE LAS SECUENCIAS

OBTENIDAS DEL GENBANK
ANEXO 12. COEFICIENTE DE DICE PARA EL ARDRA VIRTUAL UTILIZANDO
LA ENZIMA AluI
A. chroococcum A. vinelandii A. nigricans A. paspali A. armeniacus A. salinestris A. beijerinckii A. macrocytogenes Azospiril lum spp. B. derxi D. gummosa B. tropica H. seropedicae R. leguminosarum E. coli
A. chroococcum 100.0 22.6 36.4 20.0 20.0 22.6 23.4 22.6 24.3 18.1 19.9 17.9 36.4 25.4 20.0
A. vinelandii 22.6 100.0 78.4 47.1 47.1 78.5 75.5 57.2 84.0 0.0 29.1 25.1 25.3 0.0 29.1
A. nigricans 36.4 78.4 100.0 47.3 47.2 78.5 75.4 57.1 83.9 0.0 29.1 25.1 25.3 0.0 29.1
A. paspali 20.0 47.1 47.3 100.0 75.0 47.2 46.3 29.4 48.6 0.0 24.9 21.9 22.0 0.0 24.9
A. armeniacus 20.0 47.1 47.2 75.0 100.0 47.1 46.2 29.4 48.5 0.0 24.8 21.9 22.0 0.0 24.9
A. salinestris 22.6 78.5 78.5 47.2 47.1 100.0 75.5 57.2 84.1 0.0 29.1 25.1 25.3 0.0 29.2
A. beijerinckii 23.4 75.5 75.4 46.3 46.2 75.5 100.0 56.6 85.0 0.0 30.4 26.1 26.3 0.0 30.5
A. macrocytogenes 22.6 57.2 57.1 29.4 29.4 57.2 56.6 100.0 64.0 0.0 46.9 40.7 25.3 0.0 29.2
Azospiril lum spp. 24.3 84.0 83.9 48.6 48.5 84.1 85.0 64.0 100.0 0.0 31.9 27.2 27.4 0.0 32.0
B. derxi 18.1 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 100.0 0.0 19.9 20.2 14.6 0.0
D. gummosa 19.9 29.1 29.1 24.9 24.8 29.1 30.4 46.9 31.9 0.0 100.0 44.0 22.0 0.0 24.8
B. tropica 17.9 25.1 25.1 21.9 21.9 25.1 26.1 40.7 27.2 19.9 44.0 100.0 19.8 0.0 21.9
H. seropedicae 36.4 25.3 25.3 22.0 22.0 25.3 26.3 25.3 27.4 20.2 22.0 19.8 100.0 14.6 22.0
R. leguminosarum 25.4 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 14.6 0.0 0.0 14.6 100.0 30.2
E. coli 20.0 29.1 29.1 24.9 24.9 29.2 30.5 29.2 32.0 0.0 24.8 21.9 22.0 30.2 100.0

LA ENZIMA HpaII
A. chroococcum 100.0 0.0 0.0 0.0 28.5 0.0 0.0 0.0 0.0 22.2 0.0 0.0 0.0 24.8 0.0
A. vinelandii 0.0 100.0 75.1 65.0 50.1 60.0 59.3 88.8 64.9 0.0 44.4 64.2 44.4 21.9 16.5
A. nigricans 0.0 75.1 100.0 47.4 50.2 43.5 36.7 66.9 42.8 0.0 22.5 35.2 22.5 21.9 0.0
A. paspali 0.0 65.0 47.4 100.0 29.5 39.0 48.0 56.9 54.7 0.0 41.3 63.9 41.2 0.0 13.3
A. armeniacus 28.5 50.1 50.2 29.5 100.0 60.2 14.1 44.6 20.8 0.0 22.4 17.7 22.4 21.8 0.0
A. salinestris 0.0 60.0 43.5 39.0 60.2 100.0 29.9 53.0 29.4 0.0 29.6 38.7 29.6 23.0 12.8
A. beijerinckii 0.0 59.3 36.7 48.0 14.1 29.9 100.0 53.4 70.2 0.0 32.9 57.8 32.9 0.0 15.3
B. derxi 22.2 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 100.0 0.0 0.0 0.0 18.0 0.0
D. gummosa 0.0 44.4 22.5 41.3 22.4 29.6 32.9 40.1 38.5 0.0 100.0 40.9 80.0 19.9 15.1
B. tropica 0.0 64.2 35.2 63.9 17.7 38.7 57.8 56.3 55.7 0.0 40.9 100.0 40.8 0.0 31.9
H. seropedicae 0.0 44.4 22.5 41.2 22.4 29.6 32.9 40.1 38.5 0.0 80.0 40.8 100.0 0.0 15.1
R. leguminosarum 24.8 21.9 21.9 0.0 21.8 23.0 0.0 19.8 0.0 18.0 19.9 0.0 0.0 100.0 0.0
E. coli 0.0 16.5 0.0 13.3 0.0 12.8 15.3 15.1 15.0 0.0 15.1 31.9 15.1 0.0 100.0
LA ENZIMA RsaI
A. chroococcum 100.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 39.8 40.0
A. vinelandii 0.0 100.0 74.9 66.6 66.5 66.6 66.5 88.7 49.8 0.0 24.8 0.0 0.0 0.0 0.0
A. nigricans 0.0 74.9 100.0 66.8 66.7 66.7 66.6 66.9 49.7 0.0 24.8 0.0 0.0 0.0 0.0
A. paspali 0.0 66.6 66.8 100.0 60.0 60.1 60.0 60.2 44.2 0.0 22.1 0.0 0.0 0.0 0.0
A. armeniacus 0.0 66.5 66.7 60.0 100.0 99.9 59.9 60.1 44.1 0.0 22.0 0.0 0.0 0.0 0.0
A. salinestris 0.0 66.6 66.7 60.1 99.9 100.0 59.9 60.2 44.2 0.0 22.1 0.0 0.0 0.0 0.0
A. beijerinckii 0.0 66.5 66.6 60.0 59.9 59.9 100.0 60.0 44.3 0.0 22.0 0.0 0.0 0.0 0.0
B. derxi 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 100.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0
D. gummosa 0.0 24.8 24.8 22.1 22.0 22.1 22.0 22.1 24.8 0.0 100.0 25.0 25.2 0.0 28.7
B. tropica 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 25.0 100.0 50.0 0.0 28.4
H. seropedicae 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 25.2 50.0 100.0 0.0 28.6
R. leguminosarum 39.8 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 100.0 33.2
E. coli 40.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 28.7 28.4 28.6 33.2 100.0

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CARACTERIZACIÓN MOLECULAR DE CEPAS NATIVAS COLOMBIANAS DE

Azotobacter spp. MEDIANTE EL ANALISIS DE RESTRICCION DEL DNA

DIEGO JAVIER JIMÉNEZ AVELLA

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA

DIEGO JAVIER JIMÉNEZ AVELLA

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA

Articulo 23 de la resolución No 13 de julio de 1946

DIEGO JAVIER JIMÉNEZ AVELLA

José Salvador Montaña Msc. María Mercedes Martínez Msc.

María del Pilar Márquez Msc.

DIEGO JAVIER JIMÉNEZ AVELLA

Ángela Umaña MPhil. David Gómez Msc.

A mis padres por todo su amor, su esfuerzo constante durante mi carrera, su

A mis directores José Salvador Montaña y María Mercedes Martínez, por su

A todas las personas del Laboratorio de Microbiología Ambiental y Suelos de la

A los investigadores de las Unidades de Saneamiento y Biotecnología Ambiental

Al Ingeniero agrónomo Andrés Siabato por su colaboración y asesoría en el

A todas las personas de mi familia que me apoyaron y creyeron en mí día a día.

A mis amigos de la Universidad y de Sogamoso por ser personas importantes y

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2.3 Microorganismos fijadores de nitrógeno atmosférico (diazotrófos)

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2.3.1 Fijación biológica de nitrógeno (FBN)

La reducción de nitrógeno requiere mucha energía, alrededor de 12 a 16

Ecuación 1. Reacción en la fijación de nitrógeno. Fuente: Baca et al., (2000)

La nitrogenasa purificada es inactivada rápida e irreversiblemente por el O2, la

2.3.2 Microorganismos diazotróficos simbióticos.

Una de las simbiosis más efectivas es la que se establece entre Bradyrhizobium

Asi mismo, la utilización de plantas fijadoras de nitrógeno como el trébol y la

La simbiosis Rhizobium-Leguminosas es el resultado de una interacción muy

2.3.3 Microorganismos diazótrofos asimbióticos.

Magalãhes et al., (2001), aislaron y caracterizaron molecularmente 38 cepas

Entre las bacterias diazótrofas asimbióticas utilizadas como biofertilizantes una

El control de calidad y la vigilancia de estos productos en Colombia esta a

Neeru et al., (1991), utilizaron A. chroococcum como bioinoculante en la India

García et al., (2005), mediante la inoculación de Azotobacter beijerinckii y

2.5 Familia Azotobacteraceae.

Los miembros de esta familia Azotobacteraceae tienen la capacidad de sintetizar

2.6 Generalidades del género Azotobacter spp.

Figura 2. Quistes de Azotobacter spp. Fuente: Autor.

Figura 3. Colonias de diferentes especies de Azotobacter spp. en medio diferencial LG. A)

Bioquímicamente son catalasa y oxidasa positivo, reducen el nitrato, producen el

Requieren molibdeno para fijar nitrógeno que puede ser parcialmente

Respecto a la fuente de nitrógeno pueden utilizar nitrato, sales de amonio y

A. chroococcum puede utilizar diferentes fuentes de nitrógeno inorgánico como

Además de la fijación de nitrógeno y excreción de amonio al medio, esta especie

2.6.2 Azotobacter vinelandii.

La capacidad metabólica y genética por las que A. vinelandii ha sido y es objeto