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J. Agric. Food Chem. 2007, 55, 643164386431

La dieta enriquecida con cacao mejora la actividad de las

enzimas antioxidantes y modula la composición de los
linfocitos en el timo de las ratas jóvenes
EMMA RAMIRO-PUIG,† MIREIA URP'†-SARDAÅ ,‡ FRANCISCO J. PEÄ REZ-
CANO,† AÅ NGELS FRANCH,† CRISTINA CASTELLOTE,† CRISTINA ANDREÄ S-
LACUEVA,‡ MARIA IZQUIERDO-PULIDO,‡ Y MARGARIDA CASTELL*,†

Departamento de Fisiología y Departamento de Nutrición y Ciencia de los Alimentos, Facultad de

Farmacia, Universidad de Barcelona, Av. Joan XXIII s/n, 08028, Barcelona, España

El cacao es una rica fuente de flavonoides, principalmente (-)-epicatequina, (+)-catequina y

procianidinas. Este artículo informa sobre el efecto de la ingesta continua de cacao en la
capacidad antioxidante del plasma y los tejidos, incluidos los órganos linfoides y el hígado, de las
ratas jóvenes. Las ratas destetadas Wistar recibieron cacao natural (4% o 10% de ingesta de
alimentos) durante tres semanas, correspondientes a su infancia. La absorción de flavonoides se
confirmó mediante la cuantificación de los metabolitos de la epicatequina en la orina. Se examinó
la capacidad antioxidante total (TAC) y la actividad de las enzimas antioxidantes, superóxido
dismutasa (SOD) y catalasa. La ingesta de cacao aumentó la TAC en todos los tejidos,
especialmente en el timo. Además, las actividades de la SOD y la catalasa del timo también
aumentaron en función de la dosis en el cacao. También se analizó si el sistema antioxidante
mejorado en el timo podía influir en su composición celular. Se encontró un aumento en el
porcentaje de timocitos en estado de desarrollo avanzado. En resumen, la dieta de cacao mejora
las defensas antioxidantes del timo e influye en la diferenciación de los timocitos.

PALABRAS CLAVE: Actividad catalasa; actividad SOD; cacao; fenotipo de linfocitos; diferenciación de timocitos

INTRODUCCIÓN
La producción de especies reactivas de oxígeno (ROS),
incluidos los radicales libres, es un proceso fisiológico bien
establecido que está controlado por sistemas antioxidantes
intrínsecos. La defensa antioxidante comprende mecanismos
enzimáticos y no enzimáticos. Las enzimas antioxidantes,
como la superóxido dismutasa (SOD) y la catalasa,
constituyen una defensa de primera línea al catalizar la
conversión de ROS específicos (anión superóxido (O --) y H O
, de estos monómeros llamados procianidinas (6, 7). En este
2 2
respectivamente) en productos menos reactivos o no reactivos.
Los antioxidantes no enzimáticos comprenden una serie de
moléculas, entre ellas la albúmina, el glutatión y el ácido
úrico, entre otras, que actúan neutralizando oxidantes no
específicamente altamente reactivos, como el radical hidroxilo
(HO-), que se produce en exceso cuando las defensas
intracelulares específicas se ven superadas (1). En
determinadas situaciones, el equilibrio oxidante/antioxidante
intrínseco se desplaza hacia la producción de especies
reactivas y, en consecuencia, se potencia el estrés oxidativo.
Un estado de oxidación elevado dentro de una célula puede ser
extremadamente perjudicial, lo que da lugar a la generación de
radicales que conducen a la peroxidación de los lípidos, el
entrecruzamiento del ADN y la formación de enlaces de
trastornos como el cáncer, las enfermedades cardiovasculares
y el envejecimiento (3, 4). Por lo tanto, mejorar las defensas
antioxidantes podría ser una estrategia clave para prevenir o
reducir el riesgo de enfermedad.
Recientemente ha surgido un gran interés en el desarrollo de
alimentos funcionales para mejorar el estado de salud y
bienestar, o reducir los riesgos de enfermedad (5). El cacao es
una fuente rica en antioxidantes, principalmente flavonoides
como (-)-epicatequina, (+)-catequina, y polímeros derivados
2
disulfuro en las proteínas (2). El estrés oxidativo está
claramente involucrado en una amplia gama de
* Autor corresponsal. Dirección postal: Facultad de Farmacia,
Departamento de Fisiología, Av. Joan XXIII s/n, Edificio B, 3bb planta,
08028, Barcelona, España. Teléfono: +34 93 402 45 05. Fax: +34 93 403
59 01. Correo electrónico: margaridacastell@ub.edu.
†
Departamento de Fisiología.
‡
Departamento de Nutrición y Ciencia de la Alimentación.

Con respecto a esto, el tamaño de la porción de ciertos
productos derivados del cacao proporciona más antioxidantes
fenólicos que las bebidas y frutas como el té y los arándanos,
tradicionalmente considerados altos en antioxidantes (8). En
muchos países, los productos derivados del cacao se
consumen muy comúnmente y en la Unión Europea y los
Estados Unidos la ingesta de cacao se estima en 2,6 y 2,35
g/día de cacao en polvo per cápita, respectivamente (8).
Además de considerar el cacao como una fuente de
antioxidantes en la dieta, también podría considerarse un
producto natural con propiedades terapéuticas.
10.1021/jf070487w CCC: $37.00
$37.00
07/14/2007
∼∼
Los estudios in vitro han demostrado el efecto protector del
cacao y sus flavonoides en diferentes modelos celulares de
estrés oxidativo (9-11). Sin embargo, estos efectos no pueden
extrapolarse directamente a los seres humanos, ya que hay que
tener en cuenta la biodisponibilidad y el metabolismo. Los
flavonoides del cacao son estables durante el tránsito gástrico
(12), se absorben rápidamente y se encuentran en el plasma
después del consumo de la bebida de cacao (13). Los
flavonoides se metabolizan ampliamente y se convierten
principalmente en glucurónidos, sulfatos y formas de O-
metilado durante su transferencia a través del intestino delgado
y luego otra vez
2007 Sociedad Americana de
Química Publicado en la Web
6432 J. Agric. Food Chem., Vol. 55, No. 16, Ramiro-Puig et al.

en el hígado. Los flavonoides no absorbidos llegan al colon Tabla 1. Composición de las dietas experimentales (g/kg)a
donde la microflora intestinal los convierte en ácidos fenólicos c 10%
se absorba y se siga
que son capaces de c o enriq
metabolizando en el n uecid
o
hígado (14). Por lo tanto, m t o con
los flavonoides probados p r caca
en estudios in Vitro no son o o
o
l chow
obviamente los mismos n d
e e
nt
e l
s a

c
o
m
i
d
a
(
A
I
N
-
9
3
G
)
como los que llegan a las casein
células en condiciones de
ViVo. 200
Algunos estudios han
demostrado que el cacao 178
L3
también presenta
maízstarch
propiedades antioxidantes
en el ViVo. La ingesta de 397.486
cacao aumenta la capacidad 381.486
antioxidante y disminuye maltodextrina132
los productos de la sucrose
oxidación de lípidos en el
plasma de los seres 100
humanos (15-17) y las ratas
(13, 18) sanos. Además, el 100
oil
consumo de cacao también
reduce la peroxidación de
70
lípidos en el plasma de
personas con un mayor
soja 59
estrés oxidativo (19, 20). cellulose
La mayoría de esos
estudios se realizaron en 50
animales adultos o en seres
humanos después de recibir 24.5
una sola dosis de cacao. Hasta mezcla de minerales
la fecha, quedan por (TD94046)35
explorar los efectos del
consumo continuo de cacao 35
en ratas jóvenes cuyo mezcla de vitaminas (TD94047)10
sistema inmunológico está
todavía en maduración 10
bitartrato de colina22.5
(21). .
En este artículo, 5
determinamos el estado TBHQ
antioxidante en ratas
jóvenes y saludables a las 0.014
que se les proporcionó una
dieta continua de cacao de 0.014
cacao naturalpowder
22% de proteína
16% de carbohidratos
11% de lípidos
25,5% de celulosa
Dieta enriquecida con cacao en
destete y durante tres
ratas jóvenes
semanas. La absorción
intestinal y el metabolismo
de los flavonoides del
cacao se evaluaron
cuantificando sus
metabolitos en la orina.
Luego, nos centramos en
el análisis de
capacidad antioxidante total
(TAC) en el plasma, los
tejidos linfoides (bazo y
timo) y el hígado. También
se evaluaron las actividades
de la SOD y la catalasa en
los tejidos como sistemas
enzimáticos antioxidantes
representativos. Dada la
importancia del estado
redox en la maduración de
los linfocitos y la elevada
actividad de la enzima
antioxidante detectada en el
timo, se diseñaron nuevos
ensayos para establecer
cambios en su fenotipo
celular.
MATERIALES Y MÉTODOS
Aparato: LC-MS/MS. La
cromatografía líquida de alto
rendimiento (HPLC) se realizó
utilizando un Perkin-Elmer
serie 200 (Norwalk, CT, USA)
equipado con una bomba
cuaternaria, un automuestreador
refrigerado y un detector de
diodos. Para obtener los datos
de MS y MS/MS se utilizó un
espectrómetro de masas triple
cuadrupolar API 3000
(Applied Biosystems, PE
Sciex, Concord, Ontario,
Canadá) equipado con una
fuente Turbo IonSpray que
funcionaba en el modo de
iones negativos.
Reactivos, estándares y
dietas. Los reactivos y
estándares se obtuvieron de las
siguientes fuentes: metanol y
acetonitrilo (grado HPLC) de
Scharlau (Barcelona, España);
ácido fórmico, (-)-
epicatequina, (+)-catequina,
quercetina, creatinina, §-
glucuronidasa y sulfatasa
J. Agric. Food Chem., Vol. 55, No. 16, 20076433
c 3700
cacao y el chocolate. El una dieta enriquecida con un
10% de
contenido fenólico total se cacao fue preparada a partir de la
al
determinó por el método Folin- dieta de control AIN-93G
o
Ciocalteu y se expresó como eliminando
rí
equivalentes de (+)-catequina 72,8 g/kg (16 g/kg de almidón de
a
en mg/g (23). La determinación maíz, 11 g/kg de aceite de soja,
s
y cuantificación de los
t 25,5 g/kg de celulosa y 22 g/kg
compuestos fenólicos de caseína) y añadiendo cacao
o individuales en el cacao en natural.
t
polvo y en la papilla (mg/g) se
al analizaron mediante HPLC
e como se ha descrito (Barcelona, España). Las ratas
s anteriormente (24). fueron alojadas en jaulas de 10
( crías por cada madre lactante
Animales y diseño
k en condiciones controladas de
experimental. Las presas con
c
camadas de ratas Wistar de 15 temperatura y humedad en un
al
días de edad (50% machos, 12:
/k 50% hembras) se obtuvieron de 12 ciclos de luz y oscuridad. En
g Harlan el día 21, las crías fueron
di destetadas y asignadas al azar a
e los siguientes grupos de dieta.
t Grupo de Dieta Enriquecida
a con Cacao 4% (Grupo de
) ∼ Los animales
Cacao 4%).
(tipo H-2), sal de diamonio 2-2- recibieron diariamente 4,8 g de
azino-bis (ácido 3- cacao/kg de rata por vía oral.
etilbenzotiazolina-6-sulfónico) Según la ingesta de comida por
(ABTS), y albúmina de suero día, esta dosis corresponde al
bovino (BSA) de Sigma- 4% (g de cacao/ 100 g de
Aldrich- Fluka (St. Louis, MO); comida). Las ratas tenían libre
Trolox de Calbiochem acceso a la comida y el agua de
(Darmstadt, Alemania); control. 4%-Grupo de dieta de
taxifolina y procianidina B2 de control del cacao. Los animales
Extrasynthese (Genay, recibieron diariamente agua
Francia); e isoquercetina de (vehículo de cacao) por vía oral.
Promochem (Barcelona, A las ratas se les dio libre
España). El agua ultrapura
acceso a la comida de control.
(Milli-Q) se obtuvo del Sistema y el agua.
Millipore (Bedford, MA). El
Grupo de Dieta
medio RPMI 1640 y el suero
Enriquecida con Cacao al
bovino fetal (FBS) fueron
10% (Grupo de Cacao al
comprados a PAA (Pashing,
10%). Se dio a los animales
Austria). El 2-Mercapto-etanol
libre acceso al agua y a la
(ME) fue proporcionado por
comida que contiene 10% (p/p)
Merck (Darmstadt, Alemania).
de cacao (Tabla 1).
El isotiocianato de
Grupo de Dieta de Control
fluoresceína (FITC) conjugado
del 10% de Cacao. A los
con la proteína anti-rata CD3
animales se les dio libre acceso
(1F4) MAb, la ficoeritrina (PE)
al agua y a la comida de
conjugada con la TCRR§ (R73)
control.
y CD4 (OX-35) MAb, y la
Los estudios se realizaron
proteína anti-rata conjugada
de acuerdo con las directrices
con peridinin-clorofila-a
institucionales para el cuidado
(PerCP) CD8R (OX-8) MAb
y uso de animales de
fueron comprados a BD
laboratorio, y los
Biosciences (Heidelberg,
procedimientos experimentales
Alemania). La proteína anti-
fueron aprobados por el
rata CD90 (Thy-1) MAb
Comité Ético de
conjugada con FITC se obtuvo
Experimentación Animal de la
de Caltag (Burligame, CA).
Universidad de Barcelona (ref
Para este estudio se utilizó el
3131).
cacao natural Forastero
Obtención de muestras.
(Nutrexpa, Barcelona, España).
Después de 2 semanas de
Se utilizó como dieta de control
tratamiento dietético, las ratas
la fórmula AIN-93G (22), que
fueron mantenidas en jaulas
proporciona los nutrientes
metabólicas durante 24 h para
necesarios para el óptimo
recoger la producción de orina.
crecimiento de las ratas. La
La orina se centrifugó (2000g,
dieta de 10% de cacao se
15 min, temperatura ambiente
elaboró a partir de AIN-93G
(RT)), se acidificó añadiendo
modificado que contiene 100 g
HCl (0,2 M en la orina), y se
de cacao por kg. La
congeló a -80 C para un
composición de la dieta se
posterior análisis de
detalla en el Cuadro 1.
metabolitos de flavonoides.
Contenido fenólico del Después de 3 semanas de
6434 J. Agric. Food Chem., Vol. 55, No. 16,
cacao o de una dieta de
control, se anestesió a ratas de
6 semanas de edad para
obtener sangre por punción
cardíaca y se extirpó el timo,
el bazo y el hígado. Los
órganos se enjuagaron con
una solución salina
tamponada con fosfato (PBS)
(pH 7,4) e inmediatamente se
congelaron en nitrógeno
líquido y luego se
almacenaron a -80 C
hasta su análisis. Las muestras
de sangre se mantuvieron en
hielo y se centrifugaron
(3000g, 10 min, 4 C) para
obtener plasma que se
almacenó a -80 C hasta
los ensayos de capacidad
antioxidante.
Procedimiento de
extracción de orina. La orina
fue descongelada a 4 C y
procesada como se describió
anteriormente (25) con
Cromatografía
líquida/espectrometría de
masas en tándem (HPLC-
MS/MS)
× Análisis. El método
cromatográfico y comida que contiene 10%
espectrométrico se realizó
como se ha descrito
anteriormente (24).
Brevemente, se utilizó una
columna Luna C18 (50
2.0
mm i.d., 5 µm) (Phenomenex,
Torrance, CA) con una elución
de gradiente con 0.1% de ácido
fórmico en agua como fase
móvil A y 0.1% de ácido
fórmico en acetonitrilo como
fase móvil B a 800 µL/min.
Los parámetros de MS y
MS/MS fueron los descritos
anteriormente (24). Cada
muestra se midió por HPLC-
MS/MS en el modo de
vigilancia de reacción múltiple
(MRM) con las siguientes
transiciones: (-)-epicat- echin
(289/245), epicatequina
glucoronida (465/289), epicat-
sulfat-
echin (369/289), O-metil epicatequina (303/288), O-metil epicatequina
glucurónido (479/289),
epicatequina O-metilo sulfatada
(383/289), glucurónido de
epicatequina sulfatada
(545/289), glucurónido de
epicatequina O-metilo
sulfatada (559/289),
procianidina B2 (577/289) y
taxifolina (303/285). Los picos
se identificaron con un
producto de exploración iónica
en un tiempo de ciclo de 1 s.
Para confirmar las formas
conjugadas se realizó una
algunas modificaciones en el
soporte de extracción en fase
sólida (SPE). Brevemente, se
cargó 1 mL de orina en un
cartucho HLB de Waters
Oasis (60 mg) (Waters,
Mildford, MA) que había sido
preacondicionado con 1 mL de
metanol y equilibrado con 2
mL de ácido fórmico de 1,5
mol/L en agua. El cartucho se
lavó con 2 mL de ácido
fórmico de 1,5 mol/L y con 2
mL de agua/metanol (95:5;
v:v). La elución se logró con 2
mL de metanol con 0,1% de
ácido fórmico. El eluato se
evaporó hasta la sequedad y se
reconstituyó con la fase móvil
hasta 100 µL. El porcentaje de
recuperación de la orina de
control con púas fue > 71%
((5,3%). La creatinina en la
orina se midió mediante un
ensayo colorimétrico con
ácido pícrico (26).
Tabla 2. Contenido fenólico
total (FolinCiocalteu) y
polifenoles (HPLC) en el
cacao en polvo y en la
de cacao (mg/g)a
Cac
aop
ow
der
10
%
de
la
co
mid
a Luego, ABTS-+ se diluyó con
de
cac
ao
polifenol total21.851.08 .90
54
()-catecina0.740.05
.1
0 .004
procianidina
B21.68.110.23.01
()-
epicatechin2.20.100.3401
isoquercetina
0.05.0010.02.00
quercetin0.03.000.0100
hidrólisis enzimática como se
ha descrito anteriormente (27)
con algunas modificaciones. Se
acidificó una muestra de orina
de 1 mL a pH 5 con 50 µL de
ácido acético de 0,58 mol/L y
se incubó a 37 C durante 45
min en presencia de un extracto
de Helix pomatia que contenía
1100 U de §-glucuronidasa y
42 U de sulfatasa (Sigma).
Después de la acidificación a
pH 2 con 40 µL de HCl de 6
mol/L, la orina se cargó en un
cartucho preacondicionado y se
trató como se ha descrito
anteriormente. La
concentración de metabolitos de
(-)-epicatequina se expresó en
equivalentes de epicatequina
(25, 28).
Homogeneizados de
tejidos. Las muestras de tejido
se homogeneizaron en 5 mL de
tampón frío (50 mM de fosfato
potásico, pH 7,0, que contiene
1 mM de EDTA) por gramo de
tejido, utilizando un politrón
(Cinematica, Suiza). Luego, las
muestras se centrifugaron
(10000g, 15 min a 4 C) y los
sobrenadantes se almacenaron a
-80 C hasta su uso (< 1
mes). Ensayo ABTS. La
capacidad antioxidante total
(TAC) de las muestras de
plasma y tejidos se determinó
mediante el método ABTS
descrito por Re et al.
(29) con modificaciones. Este
ensayo se basa en la capacidad
de la muestra, por medio de sus
antioxidantes no enzimáticos,
de reducir el ABTS-+ (color
azul-verde), lo que resulta en
una decoloración.
La STAB se disolvió en
agua a 7 mM, e nmol de formaldehído/min/mg
inmediatamente se añadió
K2S2O8 (concentración final
de 2,45 mM) para convertir la
STAB en un catión radical
ABTS-+. Esta solución se
mantuvo en agitación
continua y en la oscuridad
durante 12-16 h antes de usarla
para permitir la generación de
ABTS-+ (color azul-verde).
agua destilada en una
proporción de 1:50. El ensayo
se realizó en placas de 96
pozos. Se utilizó como
estándar el Trolox, un
derivado hidrosoluble de la
vitamina E. Se añadió ABTS-
+ diluido (100 µl) a 100 µl de
cada muestra o estándar
diluido en solución salina
tamponada con fosfato (PBS)
de pH 7,4. La absorbancia a
420 nm se monitorizó cada 60
s durante 360 s. El porcentaje
de inhibición de la
absorbancia se calculó y se
graficó en función del tiempo
y la concentración. Los valores
de las muestras se interpolaron
en una curva estándar trolox
(29). Los resultados se
expresaron como mM trolox
para las muestras de plasma y
µmol/g para los
homogeneizados de tejido.
Actividades de las enzimas
antioxidantes. Las actividades
de la superóxido dismutasa y la
catalasa en muestras de tejido
se determinaron mediante
métodos colorimétricos
Ramiro-Puig et al.
utilizando equipos comerciales
(Calbiochem, Darmstadt,
Alemania). El ensayo de la
actividad de la superóxido
dismutasa se basa en la
detección de radicales
superóxidos generados por la
adición de xantina oxidasa. Se
utilizó una sal de tetra-zolio
como cromógeno, y los valores
de absorbencia se interpolaron
en una curva estándar de SOD.
Los resultados se expresaron
como proteína U/mg. Una
unidad de SOD se define como
la cantidad de enzima necesaria
para exhibir el 50% de
dismutación del radical
superóxido.
La actividad de la catalasa se
estableció por la capacidad de la
muestra de reaccionar con el
metanol en presencia de H2O2.
El formaldehído producido se
midió espectrofotométricamente
utilizando púrpura (4-amino-3-
hy- drazino-5-mercapto-1,2,4-
triazol) como cromógeno. Los
valores de absorbencia se
interpolaron en una curva
estándar de formaldehído, y los
resultados se expresaron como
de proteína.
El contenido de proteína fue
cuantificado por el ensayo
Bradford (30) con albúmina de
suero bovino como estándar.
Aislamiento de timocitos.
La suspensión de células de
timocitos se obtuvo pasando el
timo a través de una malla de
acero (Cellector). La suspensión
celular se incubó en hielo para
eliminar los restos de tejido por
sedimentación durante 10 min.
A continuación, las células
fueron centrifugadas (500g, 5
min, 4 C) y resuspendidas con
un medio RPMI que contenía
un 10% de FBS y 0,05 mM ME
Dieta enriquecida con cacao en
a
ratas jóvenes
Los resultados se
expresaron como la media
de la SD (n ) 3).
(medios completos). El
recuento y la viabilidad de las
células se determinaron
mediante un análisis
microscópico de luz
fluorescente.
Fenotipo por tinción de
inmunofluorescencia y nongavage). La SEM de los
análisis de citometría de
flujo. Los timocitos fueron
teñidos con MAb anti-ratas
conjugado con FITC, PE, o
PerCP: anti-TCRR§ (R73),
anti-CD4 (OX-35), anti-CD8R
(OX-8), anti-CD3 (1F4), y
anti-CD90 (Thy-1). 105 células
fueron etiquetadas con
concentraciones saturadas de
FITC-, PE-, y PerCP-MAb en
PBS pH 7.2 conteniendo 1%
de FBS y 0.09% de NaN3 (30
min, 4 C, en la oscuridad). Se
incluyó para cada muestra una
tinción de control negativo
utilizando un MAb de isotipo
coincidente. Después de lavar
con PBS pH 7.2, las células se
fijaron con 0.5% p-
formaldehído y se
almacenaron a 4 C en la
oscuridad. Los análisis se
realizaron utilizando un
citómetro de la Coulter Epics
XL2 Corporation (Miami,
FL), y los datos fueron
evaluados por el software del
citómetro (Summit V3.1,
Cytomation, Inc). Los
resultados se expresaron
como porcentaje de células
positivas en la población de
linfocitos previamente
seleccionada de acuerdo con
sus características de
dispersión hacia adelante
(FSC) y hacia los lados (SSC).
Análisis estadístico. Los
resultados de las figuras y
tablas se expresaron como
media ( SEM, excepto la
tabla 2 que se expresó como
media ( SD. Los datos de las
concentraciones de
epicatequina y metabolitos
fueron sesgados (pruebas de
Kolmogorov y Levene). La
prueba de Wilcoxon para
muestras relacionadas se
realizó para comparar los
cambios entre ambas ingestas
de cacao. Se realizó un
ANOVA convencional de una
sola vía, considerando los
grupos de dieta como variables
independientes. Cuando la
ingesta de cacao tuvo un
efecto significativo en la
variable dependiente, se
aplicó la prueba de
Bonferroni. Se aceptaron
diferencias significativas
J. Agric. Food Chem., Vol. 55, No. 16, 20076433
cuando P < 0,05. Tras espectros iónicos del
comparar los grupos producto.
experimentales, no se La epicatequina aglicona
observaron diferencias
estadísticas entre los dos
se identificó en muestras de
orina de ratas alimentadas
grupos de control. Por lo tanto,
a fin de simplificar la con cacao (pico 1) (Figura
interpretación de los 1). Se identificaron tres
resultados, se agruparon en los epicatequinas glucu-
gráficos los datos de los dos ronidas y tres epicatequinas
grupos de control (gavage y O-metil glucuronidas en la
orina de ratas (Figura 1).
grupos de control en los
Los picos 2, 3 y 4
gráficos indica la baja
dispersión de estos grupos. representan los metabolitos
glucoronidos con MRM de
Las diferencias significativas
marcadas en los gráficos se 465/289 que fueron
deben a la comparación entre
el grupo de tratamiento y su ×
correspondiente grupo de
control. Todos los datos se
analizaron utilizando el
Sistema de Análisis
Estadístico SPSS, V. 11.5
(SPSS).
RESULTADOS
Contenido de
polifenoles en el cacao y
el chocolate. El contenido
fenólico total e individual
en el cacao en polvo y el
10% en el cacao chow se
muestra en el cuadro 2.
Tanto el cacao en polvo
como el 10% de las
chocolatinas de cacao
contenían cantidades
sustanciales de polifenoles,
mientras que los niveles
fenólicos de la dieta de
control (AIN-93G) estaban
por debajo del límite de
detección. Por lo tanto, en
nuestro estudio los
polifenoles fueron
proporcionados por el
cacao.
Metabolitos de
epicatequina en la orina
de rata de 24 horas. La
cuantificación de los
metabolitos de
epicatequina se establece
como un biomarcador de la
absorción de flavonoides
(31). La identificación de
metabolitos en muestras
biológicas se basó en 3
parámetros: la
comparación del tiempo de
retención del estándar
disponible, la transición de
metabolitos MRM y la
transición de epicatequina
[con una DP más alta en
condiciones de disociación
inducida por colisión
(CID)/MS/MS], y los
 mientras que no se detectaron metabolitos en la orina de las
ratas de control. La tabla 3 muestra la cantidad de epicatequina
y sus metabolitos en la orina después de dietas con 4% o 10%
de cacao. Los metabolitos del cacao encontrados en la orina
fueron proporcionales a la ingesta de cacao, pero no se
encontraron diferencias significativas entre ambos

Figura 1. Cromatograma representativo de monitoreo de reacción

múltiple de la orina de una rata. Picos: (1) ()-epicatequina, (2, 3, 4)
epicatequina glucoronada,
(5, 6, 7) epicatequina O-metil glucoronida.

Figura 2. Espectros de iones producto de los picos 5, 6 y 7.

Confirman los tres glucurónidos de epicatequina O-metilo en
diferentes posiciones.

confirmado con la transición de la epicatequina (289/245). Los

picos 5, 6 y 7 con MRM de 479/289 corresponden a la
epicatequina O-metil glucoronida identificada con el producto
de exploración iónica de la molécula desprotonativa (m/z 479).
El espectro iónico del producto de los tres picos mostró la
molécula desprotonated (m/z 479) y los iones m/z 303
correspondientes a la epicatequina de metilo, m/z
137 correspondiente al clásico fragmento de anillo A
relacionado con la epicatequina, y m/z 175 y m/z 113
correspondiente al ácido glucurónido (Figura 2). Estos
resultados confirmatorios coinciden con los de Schroeder y
otros (28), que mostraron los espectros de los estándares
auténticos de varios isómeros de metil-epicatequina
glucuronidos.
La baja concentración de otros metabolitos de la
epicatequina no permitió confirmar su presencia por medio de
la exploración iónica del producto o por las transiciones MRM
(32).
Metabolitos de epicatequina y epicatequina en la orina de
rata. Después de 2 semanas de suplementación dietética con
cacao (gavage o chow), se encontraron metabolitos de
epicatequina y epicatequina en la orina de todas las ratas,
Tabla 3. MediaSEM) de ()-Epicatequina, Epicatequina
Glucuronida y Epicatequina O-metil Glucuronida (µmol/g
Creatinina) de la orina de rata excretada después de la
administración de 4% de cacao en gavage o chow que contiene
10% (p/p) de cacao (n ) 612)
significativamente: El 4% de la dieta de cacao mejoró la TAC
del timo y del bazo en un 73 y un 55%, respectivamente (P <
0,05). Inesperadamente, la dieta de cacao del 10% no afectó al
timo y al bazo

Grup Grupo
o de
de 10%
4% de
de caca
cac o
ao
()-epicatechin 1.92  4.00 
0.93 1.85
epicatequina glucoronida 14.26  25.57 
1.60 18.14
Glucurónurón de epicatequina 0.53  0.99 
o-metilo 0.07 0.62
metabolitos totales de 16.66  30.55 
epicatequina 2.20 18.53

Figura 3. Capacidad antioxidante total (TAC) de plasma (A), timo,

bazo e hígado (B) en ratas jóvenes después de tres semanas de
consumo de cacao. Cada barra representa la media de SEM
(n ) 915). *P < 0.05 en grupos de 4%- o 10%- de cacao vs. sus
respectivos grupos de control. φP < 0.05 en grupos de 4%- o 10%
de cacao.

Tabla 4. Porcentajes de timocitos que expresan niveles bajos y altos

de TCRR§, y los coreceptores CD4 y/o CD8 en su superficie en
ratas jóvenes después de tres semanas de 10% de ingesta de
cacao

grupo de Grupo
control del
(%) 10%
de
cacao
(%)
TCRR§alto 13.24  13.88 
2.81 1.31
TCRR§low 61.94  49.16 
2.92 3.18 *
TCRR total§+ 75.18  63.05 
2.80 4.14 *
CD8CD4 (DP) 88.61  82.19 
0.22 1.20 *
CD8CD4 (DN) 1.90  3.41 
0.09 0.19 *
timocitos inmaduros 90.52  85.59 
totales (CD8CD4, 0.22 1.07 *
CD8CD4)
CD8CD4 (SP) 3.42  4.67 
0.59 0.76
CD8CD4 (SP) 6.07  9.75 
0.71 0.95 *
timocitos maduros 9.18  14.41 
totales (CD8CD4, 0.45 1.01*
CD8CD4)
a
Los valores representan el SEM medio (n ) 4). *P < 0,05 en el
grupo de 10%decacao vs grupo de control.

grupos (P > 0.05). La excreción dependiente de la dosis y la

alta variabilidad entre las diferentes ratas fueron descritas por
Baba y otros (33).
Efecto de la dieta del cacao en la capacidad
antioxidante total del plasma y los tejidos (TAC). La TAC
se midió en el plasma, el timo, el bazo y el hígado mediante
el ensayo ABTS (Figura 3). La TAC en plasma de ambos
grupos de cacao no difirió significativamente de la de las ratas
de control (Figura 3A). Sin embargo, el TAC tisular mejoró
∼
Figura 4. Actividades de la superóxido dismutasa (SOD) (A) y la catalasa (B) del timo, bazo e hígado en ratas jóvenes después de tres
semanas de consumo de cacao. Cada barra representa la media de SEM (n ) 915). *P < 0.05 en grupos de 4% o 10% de cacao vs. sus
respectivos grupos de control. φP < 0.05 en grupos de 4% o 10%decacao.
catalasa se midieron en el timo, el bazo y el hígado después de 3
semanas de tratamiento.

Figura 5. Histogramas que muestran la distribución de los timocitos

según la expresión de superficie del TCRR§ de una rata de control
representativa y una rata alimentada con cacao al 10% (A).
Histogramas biparamétricos que muestran la distribución de los
timocitos según la expresión de superficie de los coreceptores CD4 y
CD8 de una rata de control representativa y una rata alimentada
con 10% de cacao (B).

TAC, pero fue capaz de aumentar el TAC del hígado ∼ en un

26% (P < 0,05) (Figura 3B).
Efecto de la dieta del cacao en las enzimas antioxidantes
del timo, el bazo y el hígado. Las actividades de la SOD y la
Las dietas de cacao no modificaron las actividades de la SOD
y la catalasa en el bazo y el hígado, pero es interesante que
esta dieta, en función de la dosis, aumentó ambas actividades
enzimáticas en el timo, logrando un aumento de 1,64 veces en
la SOD y 2,4 veces en las actividades de la catalasa con
respecto a los grupos de control (P < 0,05) (Figura 4).
Efecto de la dieta del cacao en el fenotipo de los
timocitos. El fenotipo de los timocitos fue analizado en un
10% de ratas alimentadas con cacao y su correspondiente
grupo de control. En ambos grupos, el 99% de los timocitos
expresaron CD90 y CD3 en su superficie. La diferenciación de
los timocitos se caracteriza por la expresión de marcadores
bien definidos en la superficie de las células, incluyendo CD4
y CD8, así como el receptor de células T (TCRR§). Así pues,
las células únicas positivas (SP) (CD8+CD4- y CD8-CD4+)
con altos niveles de expresión de superficie de TCRR§
(TCRR§alto) corresponden a los timocitos más maduros
presentes en el timo. El 10% de la dieta de cacao disminuyó
significativamente la proporción de células T con baja
en ratas jóvenes. El cacao utilizado en este estudio contenía un
2,2% (con
w) de los polifenoles totales, siendo la (-)-epicatequina el
principal compuesto monomérico
∼ (10% de los polifenoles
totales). Las ratas destetadas fueron alimentadas con dietas
enriquecidas con cacao durante tres semanas, lo que
corresponde a su infancia (la pubertad se estima en 7-9 semanas
en ambos sexos) (35). Se probaron dos dosis de cacao: el 4%
de la ingesta de alimentos administrados por sonda oral y el
10% incluido en la comida. En ambos protocolos de
administración, los flavonoides del cacao fueron absorbidos y
metabolizados por las ratas, como lo demuestra la cantidad
total de metabolitos flavonoides excretados en la orina, que
está bien correlacionada con la absorción de flavonoides (31).
Aunque la biodisponibilidad puede verse afectada por el tipo de
2 22
administración oral (gavage vs chow), nuestros resultados
mostraron una absorción de epi-catecina dependiente de la
dosis, independientemente de si el cacao se administró por
gavage oral o se incluyó en la dieta.
Dado que los flavonoides del cacao fueron absorbidos, se
esperaba que la capacidad antioxidante aumentara. Sin
embargo, no se encontraron 2diferencias 22
en el TAC
plasmático entre nuestros grupos, y esto podría atribuirse a
la corta vida media plasmática de los flavonoides. A este
respecto, se detectó en ratas un aumento transitorio del TAC
plasmático 10-45 min después de la cosecha, en correlación
con el pico plamático de∼la epicatequina (13, 18). En
nuestro estudio, la sangre del 4% de las ratas ∼ alimentadas
con cacao se obtuvo 20 h después del degüello y el 10% de
las ratas alimentadas con cacao se privaron de la comida
enriquecida con cacao 2 h antes de la recogida de sangre.
Por lo tanto, la brecha entre la ingesta de cacao y la
recolección de sangre podría explicar la falta de cambios en
el TAC de plasma entre los grupos.
Aunque el TAC del plasma no se modificó por la ingesta de
cacao, el TAC de los tejidos se incrementó significativamente.
Se observó una jerarquía en la reducción de la actividad: timo >
bazo > hígado. Esto podía atribuirse a la acumulación de
flavonoides en determinados tejidos diana, lo que permitía
mantener el aumento de su capacidad antioxidante. A este
respecto, se ha descrito que, tras un consumo a largo plazo, la
quercetina, un flavonoide también presente en el cacao, se
acumulaba principalmente en el pulmón > testículos > riñón >
timo de forma dependiente de la dosis (34). Se determinó
que los efectos sobre el timo y el bazo TAC no dependían
significativamente de la dosis. Así, la dieta de cacao al 4%
expresión de TCRR§ (P < 0,05 frente al grupo de control); sin
embargo, la proporción de linfocitos maduros (TCRR§alto) no
se vio afectada significativamente (Tabla 4 y Figura 5A).
Además, cuando se estudió el coreceptor, se encontró un
mayor porcentaje de timocitos en estado de desarrollo
avanzado, específicamente células SP CD4+ (P < 0,05 frente
al grupo de control), y una menor proporción de células T DP en
desarrollo (CD8+CD4+) en el grupo de 10% de cacao (P < 0,05
frente al grupo de control) (Tabla 4 y Figura 5B). Sin
embargo, el 10% de cacao aumentó la proporción de células
dobles negativas (DN o CD8- CD4-), que también pueden
actuar como precursores de células no T (P < 0,05) (Tabla 4).
DISCUSIÓN
Estudios anteriores in Vitro mostraron los efectos
inhibitorios de los flavonoides del cacao en la producción de
ROS de las células inmunes activadas (10, 34). Este artículo
reporta por primera vez el efecto de la ingesta continua de
cacao en la capacidad antioxidante del tejido linfoide
produjo un fuerte aumento de la TAC del timo y del bazo,
mientras que la dieta de cacao al 10% sólo aumentó la TAC en
el hígado. Una posible razón de este hecho podría ser la
activación de las vías oxidativas en el timo y el bazo como
mecanismo de compensación celular desencadenada por los
altos niveles de antioxidantes acumulados en esos tejidos (4).
Por el contrario, en el hígado la tasa metabólica de los
flavonoides disminuiría su capacidad antioxidante y, por lo
tanto, no se produciría un efecto compensatorio oxidativo. Sin
embargo, deben realizarse más estudios para aclarar esta
hipótesis.
Además del TAC, también se analizó la actividad de las
enzimas antioxidantes endógenas. La célula carece de un
sistema específico para eliminar el radical hidroxilo (HO-),
considerado la especie de oxígeno más reactiva responsable del
daño celular. Por lo tanto, la eliminación de O -- y H O por las
enzimas SOD y catalasa, respectivamente, es crucial para
prevenir la generación de HO-. En el presente estudio, el timo
SOD y las actividades de la catalasa fueron aumentadas por la
ingesta de cacao, mientras que el bazo y el hígado no se vieron
afectados. Los antioxidantes del cacao, especialmente los
flavonoides, parecen ser responsables del aumento de la
actividad de las enzimas. A este respecto, los polifenoles
pueden aumentar las actividades de la SOD y la catalasa
neutralizando sus sustratos (O -- y H O , respectivamente) y
aumentando la expresión de estas enzimas (37). Tanto la
actividad de la SOD como la de la catalasa aumentaron sólo en
el timo, lo que posiblemente se deba a una mayor acumulación
de flavonoides que en otros tejidos, como se ha descrito
anteriormente (36). La mayor cantidad de epicatequina libre,
proporcional a la dosis de cacao ingerida, podría

reflejan la principal concentración objetivo de epicatequina
libre en el timo (tejido lipofílico) de manera dependiente de la
dosis debido a su coeficiente de partición (38, 39).
Además, el bazo y el hígado contienen mayores
proporciones de fagocitos que producen ROS que el timo
(macrófagos en la pulpa roja del bazo y células de Kupffer en
el hígado). Por lo tanto, la alta actividad de SOD y CAT en el
timo podría deberse en parte a un menor consumo de tales
enzimas en este tejido.
La influencia del cacao en la actividad antioxidante del
timo nos llevó a creer que el cacao también podría afectar a la
composición de los linfocitos, como ya se ha visto en el bazo
y en el tejido linfático asociado al intestino (GALT) (40). Este
estudio muestra que el 10% de la dieta de cacao parece acelerar
el progreso de los timocitos inmaduros (células DN y DP con
expresión TCRR§baja) hacia etapas de células T más maduras
(células SP con TCRR§alta). Por lo tanto, la dieta del 10% de
cacao puede influir en la microarquitectura y la señalización
celular, induciendo cambios en el desarrollo de las células T.
Se ha descrito que un entorno reductor mantenido de la célula
estimula un ligero cambio hacia un entorno ligeramente
oxidante que promueve la diferenciación y la maduración
celular (4). Por lo tanto, un ambiente antioxidante continuo en
el timo puede promover un estado oxidante leve que favorece
la maduración de la linfa. Por otra parte, las células DN, un
subconjunto cuya proporción también aumentó con la dieta
del cacao, tienen un potencial de multilinaje, incluyendo
células B, células T, células mieloides, células asesinas
naturales y células dendríticas (41). En este sentido, una
elevada ingesta de cacao puede promover la diferenciación de
otros subconjuntos de células inmunitarias. Durante la
infancia, el sistema inmunológico todavía está en desarrollo
y, por consiguiente, el cuerpo es más susceptible a las
infecciones; por lo tanto, mejorar la diferenciación de los
linfocitos puede ser beneficioso para prevenir o reducir el
riesgo de enfermedades.
En resumen, el cacao fue absorbido y metabolizado
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(12) Rios, L. Y.; Bennett, R. N.; Lazarus, S. A.; Remesy, C.;
Scalbert, A.; Williamson, G. Las procianidinas del cacao son
eficazmente por ratas jóvenes después de una ingesta continua,
pero no afectó a la actividad antioxidante del plasma. Sin
embargo, nuestros resultados muestran el aumento de la
capacidad antioxidante en tejidos como el timo, el bazo y el
hígado. En el timo, la dieta de cacao más rica produjo un
fuerte aumento de la actividad de las enzimas antioxidantes y
también puede mejorar la maduración del timo.
SEGURIDAD
Las muestras de orina de rata se consideraron
potencialmente infecciosas. Se respetaron las directrices para
el trabajo con disolventes y ácidos orgánicos. Se aplicaron las
precauciones universales para la manipulación de productos
químicos y fluidos.
RECONOCIMIENTO
Este estudio fue apoyado por Nutrexpa, S.A., y por
subvenciones del Ministerio de Educación y Ciencia (MEC)
(CDTI P-02-0277, PROFIT (FIT-060000-2002-99, CB
06/02/0079, AGL2005-002823, y AGL2004-08378-C02-
01/02) y de
la Generalitat de Catalunya (SGR 2005-0083). E.R.-P. recibe
una beca de la Generalitat de Catalunya (2003FI 00578), y
M.U.-S. tiene una FPI del MEC.
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Recibido para su examen el 19 de febrero de 2007. Manuscrito revisado
recibido el 1 de junio de 2007. Aceptado el 6 de junio de 2007.
JF070487W