UNIVERSIDAD POPULAR DEL CESAR

DOCENTE ANDERSON RAMÍREZ AYALA

TEMA: ANALISIS DE RNA Y PROTEÍNAS.

El estudio de las proteínas es de gran importancia en genética, biología molecular,

bioquímica e inmunología entre otras áreas. Para hacer análisis de proteínas, debemos
inicialmente lisar las células para liberar las proteínas que se produzcan en ellas. Las
proteínas se pueden transferir por medio de electroforesis desde varios medios por ejemplo
desde un gel de poliacrilamida a membranas de nitrocelulosa o de nylon. A través de este
procedimiento las proteínas quedan inmovilizadas en la membrana debido a las diferencias
de carga entre la membrana y las proteínas. En este procedimiento de transferencia se
emplean anticuerpos para detectar proteínas específicas que han sido transferidas a la
membrana. Antes de poder ensayar la transferencia los lugares no ocupados de la
membrana se deben saturar con la proteína para evitar que los anticuerpos reaccionen
inespecíficamente con la membrana donde se va a llevar a cabo la unión de la proteína
específica con el anticuerpo. Una vez el contenido de proteínas del gel se ha transferido a
la membrana, se realiza una búsqueda de la proteína a través del empleo de un anticuerpo
primario dirigidos contra la proteína de interés. Posteriormente, se añaden unos anticuerpos
secundarios (o proteínas que se unen a anticuerpos) que reconocen a su vez los anticuerpos
primarios y han sido conjugados con una enzima. La adición del sustrato específico de la
enzima origina un producto coloreado que precipita en el sitio de la membrana donde está
la proteína de interés.
Esta técnica es una herramienta muy útil en numerosas aplicaciones de biología molecular.
Una de las circunstancias en las cuales se hace necesario el western blot es en aquellos
casos en los cuales se ha introducido un gen de un organismo en otro y se desea conocer si
el gen se está expresando de manera correcta, es decir si está produciendo la proteína
correspondiente. También se puede emplear como herramienta en el diagnóstico de
algunos virus como el VIH. Además permite detectar daños en el tamaño de la proteína,
puesto que la proteína de interés debe migrar hasta determinada distancia, entonces una
proteína a la que le falte un fragmento debe correr más de lo normal, por lo tanto quedará
en una posición inferior a la normal, mientras que una proteína que se produzca en un gen
mutado por inserciones o duplicaciones en secuencias codificantes, originará una proteína
que posee mayor tamaño al normal, lo cual provoca que la proteína recorra una distancia
menor a la que debería recorrer y quedará en una posición superior a la posición normal.
Igual que en otras técnicas como la PCR se debe usar un marcador de peso molecular que
corresponde a proteínas de tamaño conocido, para poder determinar si las proteínas
encontradas corresponden con las características de las proteínas esperadas.
 1. Escriba los pasos de un western blot.
2. Cuáles son las características moleculares que permiten
la detección de las proteínas?
3. Cuál es la razón por la cual se observan dos bandas
que han corrido más en el gel?
4. Por qué podemos asegurar que la proteína observada
corresponde o no corresponde con la proteína
esperada?
5. Cuántas muestras se están analizando en la gráfica? Y
cuántas proteínas diferentes se están mostrando en ls
muestras.
6. Teniendo en cuenta que esta técnica analiza proteínas,
cómo se puede identificar en el western blot, una
deleción génica?
7. Consulte una gráfica de electroforesis de proteínas por
SOUTHERN BLOT western blot, y explique los resultados.
8.Qué es un kilodalton?
El ADN extraído de una muestra, puede ser utilizado para diferentes procedimientos
además de la PCR. Una técnica ampliamente utilizada en biología molecular es el
SOUTHERN BLOT, la cual se fundamenta en las cargas eléctricas de los grupos fosfatos,
la complementariedad de bases nitrogenadas y la afinidad de ciertas enzimas de restricción
por secuencias específicas de ADN. El procedimiento básicamente consiste en:
Digestión del ADN con una endonucleasa de restricción: El ADN extraído de la muestra se
trata con una endonucleasa de restricción. La enzima que se usa más frecuentemente para el
análisis legal es Hae III, que corta el ADN en la secuencia 5'-GGCC-3'. El número de
fragmentos generados depende de las veces que se encuentre esta secuencia de
reconocimiento en el ADN que se somete a la enzima. Tras la digestión del ADN, los
fragmentos de ADN resultantes se separan según su tamaño mediante electroforesis en
geles de agarosa. Como resultado, se produce una separación continua de los fragmentos de
ADN de acuerdo con su tamaño. Posteriormente, las moléculas de ADN separadas se
desnaturalizan mientras permanecen en el gel de agarosa, impregnando éste con una
disolución alcalina. Tras la neutralización de ésta, el DNA monocatenario resultante se
transfiere a la superficie de una membrana de nailon, realizando así una copia o "calco" (la
traducción más literal del inglés blot, conservando este sentido, es "secante"). Este proceso
de desnaturalización y transferencia se conoce como método de Southern en recuerdo de
quien lo inventó, Edward Southern. Al igual que la aplicación de un secante a un papel con
la tinta húmeda transfiere una réplica de la imagen del papel a la secante, el "calco" del
ADN en el gel a la membrana de nailon conserva la distribución espacial de los fragmentos
de ADN conseguida en el gel como resultado de la electroforesis. Finalmente se emplea
una sonda de locus único que consiste una molécula pequeña de ADN (en este caso) capaz
de hibridar (es decir, de formar un dúplex ADN con el ADN de un fragmento de restricción
concreto en el ensayo de Southern. La formación de la molécula bicatenaria (dúplex)
depende del emparejamiento de bases complementarias entre las secuencias de la sonda y
del ADN presente en el"calco". Las sondas de locus único, es decir secuencias específicas
se marcan habitualmente con un isótopo radiactivo para facilitar su detección, y se eligen
para que detecten un locus genético polimórfico en un solo cromosoma humano. Después
de la hibridación, se lava el exceso de sonda no unido, de modo que la única radiactividad
que quede en la membrana de nailon sea la asociada al ADN del locus diana.
7. En qué momento del procedimiento se aprovechan las cargas eléctricas del ADN y la
complementariedad de bases?

Se aprovechan en la electroforesis, ya que el ADN, al tener en general cargas negativas por

los grupos fosfatos se va a guiar hacia las positivas que brinda la placa en gel y así medir su
peso.

Y la complementariedad de bases se aprovecha en la formación de la cadena bicatenaria

(duplex).

8. Qué sucedería si al investigador o laboratorista olvida desnaturalizar el ADN en este

procedimiento y luego lo pone a reaccionar con la sonda?

Lo más probable suceda es que al no ser desnaturalizado el ADN, las cadenas que pasarían
a ser monocatenarias no codificaran (se unirán) a las secuencias o enzimas, por lo tanto no
habría una copia sino una dilución inconclusa de reactivos y ADN.

9. Cuáles son los pasos de un Southern blot?

1. Extracción del ADN

2. Digestión del ADN con una endonucleasa de restricción
3. Electroforesis en gel de agarosa
4. Preparación de un ensayo de Southern ("Southern blot")
5. Hibridación con sonda radioactiva
6. Detección de los RFLPs mediante autorradiografía
7. Reensayar el resultado del Southern con sondas adicionales

10. Cuál es el origen del nombre de la técnica y cuál es la traducción literal del nombre
del procedimiento?

El origen de la técnica se debe al nombre del inventor que es Edwin Southern y esta se
traduce a mancha sureña.
11. Analice la gráfica anterior, y deduzca una conclusión del resultado.
NORTHERN BLOT
El northern blot es una técnica análoga al Southern blot, sigue los mismos pasos, sin
embargo esta analiza secuencias de ARN más no de ADN, lo cual implica que no se
requieren enzimas de restricción debido a que los RNA son de menor tamaño al ADN.
Adicionalmente las sondas que se emplean serán de RNA. El northern blot, tiene una gran
aplicación para conocer la actividad de los genes: podemos identificar si un gen está
presente y se está transcribiendo, lo cual es muy importante en genética clínica, ya que
podemos predecir la proximidad de una patología originada por la expresión de ciertos
genes. En oncología podemos conocer si los genes involucrados en la aparición o
progresión del cáncer están activos o inactivos. La intensidad de la señal, normalmente se
relaciona con los niveles de expresión de los genes, de tal forma que a mayor intensidad,
habrá mayor cantidad de RNA por lo tanto estará más activo.

12. Qué es sonda en el campo de la biología molecular, y cuáles son sus características?

Una sonda es una secuencia de ADN o ARN de cadena simple que se utiliza para

encontrar su secuencia complementaria en el genoma de una muestra.
Mas específicamente como herramienta para detectar la presencia de secuencias
complementarias al ADN o ARN diana u objetivo.

Tiene como características que Para visualizar las moléculas diana se utilizan sonda
marcadas radiactivamente o mediante marcaje inmunológico.

13. Cuál es la complementariedad de bases entre las sondas empleadas en el northern blot?
 de tipo northern cuando la diana a detectar sea mayoritariamente de ARN.
con un mínimo de 25 bases complementarias para nuestra secuencia diana

14. Cómo podemos asegurar que el ARN que estamos analizando, tiene el tamaño
molecular esperado?
La intensidad de la señal, normalmente se relaciona con los niveles de expresión de los
genes, de tal forma que, a mayor intensidad, habrá mayor cantidad de RNA por lo tanto
estará más activo.

15. Por qué podemos asegurar que el RNA atrapado con la sonda de RNA corresponde al
gen de interés y no a otro tipo de RNA?
Por Los patrones de expresión obtenidos. Desde que el RNA se separó por su tamaño, las
sondas contra el mismo pueden darnos una idea de su tamaño, sugerir ayuste alternativo, o
motivos repetidos en la secuencia.

16. Mencione un ejemplo en el que esta técnica se emplee a nivel de bacteriología.

17. Cuáles son los pasos de un northern blot.
1. Separación del RNA. ...
2. Transferencia e inmovilización del RNA. ...
3. Pre-hibridación e hibridación de la sonda. ...
4. Detección del RNA

18. Analice las siguientes gráficas y proponga una conclusión

18. Consulte una gráfica de Nortehern blot aplicada al campo de la microbiología y

explique los resultados .

HIBRIDACIÓN IN SITU FLUORESCENTE (FISH).

La hibridación in situ fluorescente es una técnica en la que se fusionan aspectos

moleculares y citogenéticos. Moleculares porque se emplean sondas que van dirigidas
contra secuencias específicas de ADN y además están marcadas con un fluorocromo, por lo
tanto la unión emite una coloración fluorescente. Dado que los genes se diferencian por
las secuencias de ADN, cada gen es identificado con una sonda diferente. El procedimiento
es relativamente sencillo y a nivel humano es muy utilizado, y básicamente consiste en
cultivar células que frecuentemente son linfocitos, se le adiciona una sustancia inductora de
la mitosis como la Fitohemaglutinina, luego se detiene la mitosis con una sustancia como la
colchicina. Las células se lisan con una solución hipotónica, para liberar el material
genético. Una vez en la lámina, el ADN se desnaturaliza y se pone a reaccionar con la
sonda, la cual está marcada. Así por ejemplo, podemos pensar que usamos una sonda
marcada con un fluorocromo verde para identificar una trisomía 21, y una segunda sonda
marcada con un fluorocromo rojo para identificar el cromosoma X. Si en el microscopio
observamos dos señales verdes y dos señales rojas, pensamos que se trata de una niña
normal sin síndrome de Down.

17. Qué se debe observar en un paciente masculino con Down? O en un paciente de sexo
femenino con Down.
18. Cuál es la complementariedad de bases que se debe presentar en este procedimiento?
19. Menciones otras tres patologías que se puedan diagnosticar por medio de esta técnica.
20. Elabore un listado de los reactivos que se emplean en esta técnica y mencione la
función de cada uno de ellos.