La determinación de la síntesis de proteína microbiana

en el rumen: comparación entre marcadores microbianos (Revisión)

M.D. Carro
Dpto. de Producción Animal I, Universidad de León, 24071 León
dp1mct@unileon.es

RESUMEN

La cuantificación de la síntesis de proteína microbiana y de la degradación de la proteína del alimento en el

rumen son dos puntos clave en todos los sistemas de valoración nutritiva para los animales rumiantes. La deter-
minación de la síntesis microbiana se realiza mediante la utilización de marcadores microbianos, los cuales se
clasifican en internos (constituyentes de los microorganismos ruminales) y externos (sustancias administradas a
los animales que son incorporadas por los microorganismos). Sin embargo, ninguno de los marcadores utiliza-
dos hasta el momento cumple todos los requisitos exigidos a un «marcador ideal». En esta revisión se analizan
las ventajas y los inconvenientes de los principales marcadores microbianos internos (ácidos nucleicos, bases
púricas, ácido diaminopimélico, D-alanina, ácido aminoetilfosfónico, perfiles de aminoácidos y ATP) y externos
(15N, 35S y 32P), y se discuten los resultados obtenidos en algunos estudios en los que se han utilizado varios
marcadores.

PALABRAS CLAVE: Proteína microbiana

Rumen
Marcadores microbianos
Purinas, 15N

INTRODUCCIÓN

La posesión del retículo-rumen, y de la población microbiana que alberga, permite a

los animales rumiantes transformar las complejas estructuras de la pared celular de los ve-
getales en elementos nutritivos que pueden ser utilizados, una vez absorbidos, para su
mantenimiento y funciones productivas. Sin embargo, el hecho de que los alimentos sean
fermentados en el retículo-rumen antes de la digestión gástrica dificulta el conocimiento
de los nutrientes aportados en la ración que son utilizables por el animal. En lo referente a

Recibido: 5-5-00
Aceptado para su publicación: 16-3-01

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la proteína, los aminoácidos que llegan al duodeno pueden tener tres orígenes diferentes:
la proteína microbiana sintetizada en el rumen, la proteína del alimento que no ha sido de-
gradada y la proteína endógena (descamaciones celulares, jugos digestivos, etc.). La pro-
teína microbiana constituye, generalmente, una proporción considerable del flujo duode-
nal de nitrógeno (N) aminoacídico en los animales rumiantes. Así, se calcula que cuando
los animales reciben raciones convencionales, la proteína microbiana representa entre el
40 y el 90 % de los aminoácidos que llegan al intestino delgado (Schniffen y Robinson,
1987), aunque en ocasiones puede alcanzar el 100 % (AFRC, 1992; Stern et al., 1994).
Debido al papel que juegan los microorganismos ruminales en la digestión de las estructu-
ras de la pared celular de los vegetales y a que la proteína microbiana tiene una gran cali-
dad, las raciones de los rumiantes deben ser formuladas para permitir el crecimiento ópti-
mo de estos microorganismos.
La cuantificación de la síntesis de proteína microbiana y la determinación de la de-
gradación de la proteína de los alimentos en el rumen son dos puntos críticos en todos los
sistemas de valoración nutritiva para los animales rumiantes (Clark et al., 1992), y cobran
especial relevancia en el caso de los animales que presentan altos niveles de producción,
ya que un aporte insuficiente de aminoácidos puede limitar la misma (Nocek y Russel,
1988). Uno de los mayores impedimentos para obtener información fiable sobre estos dos
aspectos es la falta de un método simple y preciso para determinar la síntesis de proteína
microbiana. La cuantificación del crecimiento microbiano en el rumen se puede llevar a
cabo únicamente mediante la utilización de marcadores microbianos (Schönhusen et al.,
1995). Generalmente se utilizan animales provistos de cánulas en el rumen y el duodeno,
y se determina el flujo duodenal de N no amoniacal (NNA). Posteriormente, es necesario
diferenciar el origen del N (microbiano, alimenticio y endógeno), y para ello se determina
la relación marcador/N en la digesta duodenal y en una muestra de microorganismos ais-
lados del rumen o del duodeno de los animales. La relación entre ambos valores (marca-
dor/N en la digesta duodenal / marcador/N en los microorganismos) representa la fracción
nitrogenada de la digesta duodenal que es de origen microbiano. El resto del N que llega
al duodeno corresponde a la fracción proteica del alimento no degradada en el rumen y a
las secreciones y descamaciones endógenas. Este procedimiento in vivo es el más amplia-
mente aceptado, pero presenta tres puntos conflictivos. El primero de ellos es la cuantifi-
cación de la digesta duodenal. Esta cuantificación puede realizarse mediante una colec-
ción total de la digesta en animales provistos de cánulas reentrantes, ya que éstas permiten
recoger la digesta, muestrearla y volverla a introducir en el duodeno. Sin embargo, este
tipo de cánulas no es muy utilizado, debido a que su implantación exige un doble corte en
la pared del duodeno, lo que afecta a la inervación del intestino y a su motilidad (Wenham
y Whyburn, 1980). Por ello es más frecuente el uso de cánulas simples o en T. Estas cá-
nulas únicamente permiten el muestreo de la digesta duodenal en momentos puntuales, y
para cuantificar el total de la digesta es necesario utilizar marcadores de flujo, lo que aña-
de nuevas imprecisiones al proceso. Cada marcador presenta una serie de ventajas e in-
convenientes (Warner, 1981), pero el método más utilizado actualmente es la técnica del
doble marcador propuesta por Faichney (1975), que combina un marcador de la fase sóli-
da y otro de la líquida.
Un segundo punto conflictivo es el aislamiento de una fracción microbiana represen-
tativa de toda la población ruminal. En la mayoría de los estudios en los que se ha deter-
minado la síntesis de proteína microbiana in vivo, la muestra de microorganismos que se
toma como referencia se ha aislado de la fase líquida del rumen, debido a que éste es el
 SÍNTESIS DE PROTEÍNA MICROBIANA Y MARCADORES MICROBIANOS 7

procedimiento más sencillo, aunque en algunos estudios se ha aislado también a partir del
contenido duodenal (Siddons et al., 1982; Kennedy et al., 1984; Schönhusen et al., 1995).
Sin embargo, prácticamente en todos los estudios en los que se han aislado bacterias aso-
ciadas a la fase sólida (BAS) y a la fase líquida (BAL) del rumen se ha observado que
ambas difieren en su composición química (Merry y McAllan, 1983; Legay-Carmier y
Bauchart, 1989), y que ésta a su vez difiere de la de los protozoos (Martin et al., 1994).
En cuanto a los hongos ruminales, en el momento actual no existen datos definitivos so-
bre su composición química y su contribución a la proteína microbiana.
El tercer punto conflictivo es la utilización de un marcador microbiano adecuado. Se-
gún Broderick y Merchen (1992) un marcador microbiano «ideal» debería cumplir los si-
guientes requisitos: (1) ser fácil de determinar y cuantificar, (2) no formar parte de los ali-
mentos que reciben los animales, (3) distribuirse de manera uniforme en todas las espe-
cies microbianas ruminales y (4) ser biológicamente estable. Dehority (1995) añade otros
3 requisitos: (5) no ser absorbido en el tracto digestivo, (6) estar en una proporción cons-
tante en los microorganismos ruminales en todas las fases de su crecimiento y (7) que to-
das sus formas (p.e. libre o formando parte de células intactas de microorganismos rumi-
nales o de alguna de sus partes) presenten el mismo ritmo de tránsito a través del tracto
digestivo. Sin embargo, ninguno de los marcadores que se utilizan hasta el momento cum-
ple todos los requisitos señalados anteriormente (Broderick y Merchen, 1992; Obispo y
Dehority, 1999), por lo que la elección de uno u otro para realizar estudios sobre la sínte-
sis de proteína microbiana en el rumen resulta especialmente complicada. El objetivo de
este trabajo es revisar la información disponible sobre los diferentes marcadores micro-
bianos, haciendo especial hincapié en los más utilizados, y comparar los resultados obte-
nidos en aquellos estudios en los que se ha utilizado más de uno de ellos.
Los marcadores microbianos se clasifican en dos grandes grupos: marcadores inter-
nos y externos. La principal característica de los marcadores internos es que son constitu-
yentes de las células microbianas y por ello no necesitan ser administrados a los animales
experimentales. Por el contrario, los marcadores externos deben ser administrados a los
animales experimentales para que sean incorporados por los microorganismos ruminales
y formen parte de sus estructuras.

MARCADORES MICROBIANOS INTERNOS

Los principales marcadores internos son: los ácidos nucleicos (ácido ribonucleico
(ARN) y ácido desoxirribonucleico (ADN)), las bases púricas (purinas), el ácido diamino-
pimélico (DAPA), la D-alanina, el ácido aminoetilfosfónico (AEPA), los perfiles de ami-
noácidos y el ATP.

Ácidos nucleicos (ARN y ADN) y purinas

La utilización de estas sustancias como marcadores microbianos se basa en las altas

concentraciones de ADN y, especialmente, de ARN presentes en los organismos unicelu-
lares (Broderick y Merchen, 1982). Su utilización como marcadores microbianos se re-
monta a la década de los sesenta, en la que diversos autores observaron que la síntesis de

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proteína microbiana en el rumen estaba relacionada con el flujo total de polinucleótidos

(Ellis y Pfander, 1965) y con la excreción urinaria de derivados púricos (Topps y Elliot,
1965). Posteriormente se han utilizado como marcadores microbianos el total de ácidos
nucleicos (Zinn y Owens, 1980; Ushida et al., 1985), el ADN (Arambel et al., 1982) y el
ARN (Ling y Buttery, 1978; Merry y McAllan, 1983; Schönhusen et al., 1995), aunque
en los últimos años la utilización de las purinas ha adquirido un mayor protagonismo (Pé-
rez et al., 1996a, 1997b; Calsamiglia et al., 1996; Carro y Miller, 1999a).
El análisis de purinas (Zinn y Owens, 1986) es simple, rápido y más barato que la
mayoría de los otros procedimientos utilizados para estimar la síntesis microbiana en el
rumen. Sin embargo, la utilización de las purinas como marcador microbiano presenta
también algunos inconvenientes. En primer lugar, los ingredientes que forman parte de las
raciones de los animales contienen, en mayor o menor cantidad, purinas. Algunos alimen-
tos presentan contenidos muy inferiores a los existentes en los microorganismos rumina-
les, pero otros (p.e. harina de pescado) presentan valores ligeramente menores a los en-
contrados por algunos autores en estos microorganismos (Titgemeyer et al., 1989; Pérez
et al., 1996b; Carro y Miller, 2001). McAllan y Smith (1973a) observaron que cuando se
introducían ácidos nucleicos libres (ARN y ADN) en el rumen, éstos eran degradados rá-
pidamente a nucleósidos y bases, las cuales eran posteriormente catabolizadas (McAllan y
Smith, 1973b). Sin embargo, la situación puede ser diferente en el caso de los ácidos nu-
cleicos de los alimentos, ya que en este caso se encuentran protegidos por las estructuras
de la pared celular (McAllan, 1982). La degradabilidad de las purinas de origen alimenti-
cio se ha determinado en algunos estudios, pero los resultados obtenidos son contradicto-
rios. Algunos autores (McAllan y Smith, 1973a; Schelling y Byers, 1984) concluyen que
el flujo duodenal de purinas de origen alimenticio es insignificante, a pesar de que otros
estudios, en los que se marcaron los ácidos nucleicos microbianos con 32P (Smith et al.,
1978) o con 15N (Pérez et al., 1997a), señalan que, dependiendo de la ración ingerida por
los animales, hasta un 30 % del flujo duodenal de purinas puede ser de origen alimenticio,
lo que provocaría una sobreestimación de la síntesis de proteína microbiana cuando se uti-
lizan las purinas como marcador. Pérez et al. (1996b) determinaron la degradación apa-
rente y verdadera de las purinas de nueve alimentos (heno de alfalfa, harinas de pescado y
carne, gluten feed, cebada, maíz, tortas de soja y girasol, y paja de cebada) tras su incuba-
ción en bolsas de nylon en el rumen de ovejas. Los valores de degradación verdadera de
las purinas de estos alimentos tras 24 horas de incubación (valor correspondiente a un rit-
mo de paso a través del rumen de 0,042 h–1) oscilaron entre 80 y 99 % (excepto la paja de
cebada que presentó un valor del 50 %). Por otra parte, Calsamiglia et al. (1996) determi-
naron la degradación de las purinas de ocho raciones diferentes en fermentadores conti-
nuos, y señalaron que la degradación microbiana del N púrico de origen alimenticio osci-
ló entre 81 y 110 %.
Un segundo inconveniente de las purinas como marcador microbiano es que la rela-
ción purinas/N no es la misma en las bacterias y protozoos, e incluso varía en las diferen-
tes especies bacterianas. Arambel et al. (1982) analizaron las relaciones ARN/N y
ADN/N en diecisiete especies bacterianas ruminales y observaron que éstas oscilaban en-
tre 8,0 y 102 y entre 0,2 y 39, respectivamente. Cuando las bacterias se agruparon según
las características de su pared celular, observaron que los valores medios de la relación
ARN/N eran de 37 y 62 para las bacterias gram-positivas y gram-negativas, respectiva-
mente, y de 8,8 y 19 para la relación ADN/N. Estas diferencias entre bacterias se han ob-
servado también en la relación purinas/N, tal como puede observarse en la Tabla 1. En la
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mayoría de los trabajos en los que se han comparado distintos extractos microbianos, se
ha observado que las BAS presentan un menor contenido en purinas (o en ARN y ADN)
y una menor relación purinas/N, tanto en estudios in vivo (Merry y McAllan, 1983; Le-
gay-Carmier y Bauchart, 1989; Pérez et al., 1996b, 1997b, 1998a; Martín-Orúe et al.,
1998), como in vitro (Carro y Miller, 2001). Estas diferencias en el contenido en purinas
parecen deberse a las características intrínsecas de las diferentes especies que integran
cada fracción bacteriana y al menor ritmo de crecimiento de las BAS en comparación con
las BAL (Bates et al., 1985; Legay-Carmier et al., 1989).
En la casi totalidad de los estudios en los que se ha determinado la síntesis de proteí-
na microbiana utilizando las purinas como marcador, las BAL se han tomado como mues-
tra de referencia, lo que provoca una subestimación de la síntesis de proteína microbiana,
tal y como se ha observado en los escasos estudios en los que se han comparado los resul-
tados obtenidos con BAL y BAS (Pérez et al., 1998a; Carro y Miller, 2001). En el trabajo
de Carro y Miller (2001) las raciones estaban constituidas por pared celular (fibra neu-
tro-detergente) y la cantidad de proteína microbiana sintetizada fue una media de un 38 %
mayor cuando se utilizaron las BAS como extracto microbiano de referencia que cuando
se utilizaron las BAL. En general, el error cometido en la determinación de la cuantía de
la síntesis microbiana dependerá de la proporción de BAS presente en el rumen. Esta pro-
porción depende del tipo de ración que reciben los animales, pero puede llegar a ser de un
90 % en animales que reciben raciones constituidas únicamente por forrajes (Merry y
McAllan, 1983). Una solución válida para paliar este problema sería obtener extractos
bacterianos representativos de todas las bacterias ruminales, que incluyeran tanto las BAL
como las BAS. A pesar de que existen diversos procedimientos para aislar las BAS, su
eficacia suele ser pequeña debido a que estas bacterias se encuentran firmemente adheri-
das a las partículas de alimento. La mayoría de los métodos comúnmente utilizados para
desligar las BAS de las partículas de alimento permiten liberar entre un 30 y un 60 % de
las mismas (Merry y McAllan, 1983; Legay-Carmier y Bauchart, 1989; Martín-Orúe et
al., 1998), aunque otros autores (Whitehouse et al., 1994; Ranilla et al., 2001) han utiliza-
do procedimientos que permiten desligar aproximadamente un 80 % de las BAS. Sin em-
bargo, algunos de estos tratamientos pueden afectar a la integridad de las bacterias y oca-
sionar pérdidas celulares que modifican relación purinas/N, tal y como han observado
Martín-Orúe et al. (1998) y Carro y Miller (2001). Por otra parte, incluso cuando se han
aplicado tratamientos que permiten un alto porcentaje de desligamiento de las BAS, la re-
cuperación final de éstas en el pellet bacteriano es inferior al 60 % (Ranilla et al., 2001).
Son muy pocos los estudios en los que se ha intentado aislar un extracto bacteriano
«representativo». Carro y Miller (2001) aislaron un extracto bacteriano que incluía bacte-
rias asociadas a la fase sólida y líquida de la digesta obtenida de un fermentador semicon-
tinuo (RUSITEC), y observaron que la relación purinas/N de dicho extracto presentó un
valor intermedio entre los encontrados en las BAL y las BAS (ver Tabla 1). Cecava et al.
(1990) observaron que la relación purinas/N de un extracto microbiano «mixto» aislado
de terneros fue similar a la encontrada en las BAS aisladas de los mismos animales (ver
Tabla 1).
Por otra parte, los protozoos que pasan al abomaso y duodeno contribuyen también al
flujo duodenal de purinas. Estos microorganismos suelen presentar valores para la rela-
ción purinas/N en torno al 50 % de los que presentan las bacterias (ver Tabla 1; Ling y
Buttery, 1978; Firkins et al., 1987; Robinson et al., 1996), por lo que la síntesis de proteí-
na microbiana se subestima de nuevo cuando se utilizan extractos bacterianos como

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Tabla 1
Contenido en purinas y relación purinas/nitrógeno (valores entre paréntesis) de muestras de bacterias (BAL:
bacterias asociadas a la fase líquida; BAS: bacterias asociadas a la fase sólida) y protozoos aislados del rumen

Origen de los micro- Bacterias

Referencia Ración BAL BAS Protozoos
organismos mixtas

Firkins et al. (1987) 1 Rumen (vacuno) Forraje: concentrado (70:30) 51,4 (0,80) 57,5 (0,78) – 27,8 (0,44)
Cecava et al. (1990) 3 Rumen (vacuno) Forraje: concentrado (34:66) 153 (1,56) 125 (1,33) 123 (1,30) –
Pérez et al. (1996b) 2 Rumen (ovino) Heno: concentrado (67:33) 59,5 (0,86) 42,2 (0,60) – –
Robinson et al. (1996) 3 Rumen (vacuno) Ensilado: concentrado (56:44) – – 84,6 (0,93) 40,1 (0,62)

Paja: concentrado (82:18) 126 (1,90) 93,4 (1,58) – –

Pérez et al. (1997b) 2 Rumen (ovino)
Paja: concentrado (40:60) 138 (1,95) 99,1 (1,51) – –

Paja 111 (2,12) 93,3 (1,55) – –

Pérez et al. (1998) 2 Rumen (ovino)
Paja: cebada grano (50:50) 112 (1,91) 106 (1,71) – –

Paja: cebada grano (80:20) 93,7 (1,57) 77,9 (1,36) – –

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Martín-Orúe et al. (1998) 2 Rumen (ovino)

Paja: cebada grano (20:80) 147 (1,89) 89,1 (1,28) – –

Carro y Miller (2001) 2 In vitro (RUSITEC) Pared celular de forrajes 64,7 (0,83) 38,6 (0,60) 48,1 (0,72) –
(Fibra neutrodetergente)

1 mg (equivalente a ARN de levaduras)/g materia seca.

2 m mol/g materia seca.
3 mg (equivalente a ARN de levaduras)/g materia orgánica.
 SÍNTESIS DE PROTEÍNA MICROBIANA Y MARCADORES MICROBIANOS 11

muestra de referencia. Sin embargo, la cuantificación de la proteína protozoaria presenta

una gran dificultad, ya que los protozoos suelen sufrir una retención selectiva en el rumen
debido a su adhesión a las partículas de alimento (Broderick y Merchen, 1992), y son es-
casos los estudios en los que se ha determinado su contribución al flujo de N duodenal
(Ling y Buttery, 1978; Robinson et al., 1996).
Otro inconveniente de la utilización de las purinas como marcador microbiano es que
la relación purinas/N en las bacterias cambia tras la administración de alimento a los ani-
males (Craig et al., 1987; Cecava et al., 1990). Craig et al. (1987) observaron que los va-
lores de la relación purinas/N en las bacterias ruminales (BAS y BAL) eran mínimos in-
mediatamente antes de la administración de alimento y aumentaban hasta presentar valo-
res máximos (entre 33 y 44 % superiores a los registrados anteriormente) entre 7 y 9
horas tras la administración de alimento. Sin embargo, este problema puede paliarse reali-
zando muestreos seriados del contenido ruminal, de tal forma que se abarquen todas las
fases del ciclo alimenticio (Cecava et al., 1990).
Como se ha comentado anteriormente, una de las principales ventajas de las purinas
como marcador microbiano es que su análisis por el método de Zinn y Owens (1986) es
simple, rápido y barato. El método consiste en hidrolizar las purinas mediante su trata-
miento con una solución de ácido perclórico, seguido por la precipitación de las mismas
con nitrato de plata y su cuantificación mediante espectrofotometría. Sin embargo, Mak-
kar y Becker (1999) observaron que la recuperación de purinas de extractos bacterianos
ruminales que habían sido añadidos a celulosa, almidón y fibra neutro-detergente era sola-
mente del 50 % cuando se usaba este método, y propusieron la utilización de la técnica
descrita por Balcells et al. (1992) para obtener una recuperación de las purinas cercana al
100 %. Dicha técnica utiliza la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), por lo
que para llevar a cabo los análisis de purinas se necesita disponer de un equipo de HPLC.
Si bien es cierto que no todos los centros de investigación de nuestro país disponen de di-
cho equipo, existen laboratorios que realizan los análisis de purinas mediante esta técnica
a un precio asequible (aproximadamente 2.000 pesetas por análisis).
A pesar de todos los inconvenientes anteriormente descritos, las purinas son recomen-
dadas como uno de los métodos de elección para determinar la síntesis de proteína micro-
biana (Broderick y Merchen, 1992; Brodiscou y Jouany, 1995).
Las purinas que llegan al duodeno pueden ser absorbidas y posteriormente reutiliza-
das por el animal o metabolizadas y excretadas en la orina en forma de alantoína y otros
metabolitos (McAllan, 1982). Debido a ello se ha propuesto que la excreción urinaria de
derivados púricos (DP) puede constituir un parámetro válido para estimar el flujo duode-
nal de proteína microbiana. A pesar de que los primeros estudios que mostraron la exis-
tencia de una estrecha relación entre la excreción urinaria de DP y la concentración de
ácidos nucleicos en el rumen se llevaron a cabo hace más de treinta años (Topps y Elliot,
1965), ha sido en la última década cuando se han realizado numerosos trabajos sobre este
tema. Las purinas de los microorganismos ruminales que llegan al duodeno son absorbi-
das rápidamente a través de la mucosa intestinal, en forma de nucleósidos o como bases
libres, si bien en el ganado vacuno sufren una cierta degradación a ácido úrico en su paso
por la mucosa (Stangassinger et al., 1995). Las purinas absorbidas se transportan hasta el
hígado, donde tiene lugar su utilización y degradación. Tras su metabolismo, las purinas
se excretan en la orina en forma de alantoína, ácido úrico, xantina e hipoxantina, aunque
en el ganado vacuno las cantidades de estos dos últimos compuestos son insignificantes
(Verbic et al., 1990). Otras vías de excreción son la saliva y la leche, pero cuantitativa-

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mente representan una pequeña proporción (Chen et al., 1990a). La estrecha relación
existente entre la excreción urinaria de DP y el flujo duodenal de células microbianas se
ha puesto de manifiesto en numerosos trabajos (Sibanda et al., 1982; Balcells et al., 1991;
Chen et al., 1990b; 1991), y ha permitido el desarrollo de ecuaciones que permiten prede-
cir el flujo duodenal de N microbiano a partir de la excreción urinaria de DP en el ganado
vacuno (Verbic et al., 1990) y ovino (Chen et al., 1990b; Balcells et al., 1991), aunque
hasta el momento no se dispone de ninguna ecuación para el ganado caprino.
La utilización de la excreción urinaria de DP para estimar el flujo duodenal de N mi-
crobiano presenta varias ventajas respecto a otros métodos. La ventaja principal es que se
trata de una técnica no invasiva, con lo cual los posibles trastornos en el comportamiento
alimentario de los animales o en su motilidad digestiva (producidos por la implantación
de cánulas) quedan descartados. Por otra parte, esta técnica es relativamente fácil de lle-
var a cabo en la mayoría de las circunstancias, ya que únicamente se necesita realizar la
recogida de la orina de los animales. En algunos estudios (Lebzien et al., 1993; Giesecke
et al., 1994) se ha puesto de manifiesto la relación existente entre la excreción de alantoí-
na en leche y el flujo duodenal de N microbiano, hecho que abre nuevas posibilidades a
esta técnica. La posibilidad de estimar el flujo duodenal de N microbiano a partir de la
concentración de alantoína en la leche [se ha observado que el ácido úrico excretado en la
leche procede en su mayoría del metabolismo de la glándula mamaria (Giesecke et al.,
1994)] es especialmente interesante, ya que en las vacas lecheras interesa lograr un alto
ritmo de síntesis de proteína microbiana debido a la repercusión que tiene la nutrición
proteica no sólo en la producción de leche, sino también en la función reproductora (Fer-
guson y Chalupa, 1989). Si bien los resultados obtenidos son sólo aproximados, esta téc-
nica resulta muy útil en aquellos casos en los que no se puede predecir la síntesis de pro-
teína microbiana porque no se conoce la energía ingerida por los animales (p.e. cuando
los animales reciben forrajes), y no resulta complicado llevarla a cabo, ya que el muestreo
de la leche durante el ordeño es una práctica habitual (Stangassinger et al., 1995).
La excreción urinaria de DP es una técnica prometedora, pero existen ciertos aspectos
que deben ser clarificados para su mejor utilización. Uno de ellos es la cuantificación de
la excreción de DP de origen endógeno. A pesar de que diferentes grupos de trabajo
(Chen et al., 1990b; Balcells et al., 1991) han determinado valores similares para la ex-
creción urinaria endógena de DP en el ganado ovino, no se conoce bien como se ve afec-
tada esta excreción cuando los animales reciben raciones de diferente calidad y/o a dife-
rentes niveles de ingestión. Chen et al. (1992) señalaron que la excreción urinaria de DP
de origen endógeno disminuía a medida que el animal disponía de purinas de origen exó-
geno. Sin embargo, en un estudio más reciente, Pérez et al. (1998b) observaron que la ex-
creción endógena de DP aumentaba al hacerlo la cantidad de concentrado ingerida por los
animales, y aumentar por ello el flujo duodenal de purinas. Aunque la contribución de las
purinas de origen endógeno a la excreción urinaria de DP es proporcionalmente pequeña
(Chen et al., 1992), una cuantificación precisa de su contribución bajo diferentes circuns-
tancias alimenticias permitiría obtener estimaciones más exactas del flujo duodenal de N
microbiano (Stangassinger et al., 1995).
Otro aspecto conflictivo es que en el cálculo del flujo duodenal de N microbiano a
partir de la excreción urinaria de DP se asume que los microorganismos ruminales presen-
tan una relación purinas/N constante, ya que ésta no es determinada en cada experimento.
Sin embargo, esta relación varía con los factores que se han comentado anteriormente, e
incluso se ve afectada por las características de la ración, como son la cantidad de proteí-
 SÍNTESIS DE PROTEÍNA MICROBIANA Y MARCADORES MICROBIANOS 13

na de la misma y su relación forraje:concentrado (Clark et al., 1992). Por otra parte, se ha

observado que existen diferencias en el metabolismo de las purinas entre las diferentes es-
pecies animales, y también entre animales jóvenes y adultos (Stangassinger et al., 1995).
La identificación de estas diferencias permitiría desarrollar modelos que pudieran aplicar-
se a todo tipo de animales, así como extrapolar los datos de una especie a otra.
Por último, hay que tener en cuenta que la excreción urinaria de DP es un parámetro
que refleja posibles cambios en la eficiencia de digestión y absorción de los microorganis-
mos, es decir, es un parámetro que refleja la biodisponibilidad del N microbiano, mientras
que el flujo duodenal de N microbiano determinado directamente mediante el uso de mar-
cadores es independiente de estos procesos (Stangassinger et al., 1995). Asimismo, hay
que considerar que las estimaciones del flujo duodenal de N microbiano obtenidas a partir
de la excreción urinaria de DP no son valores exactos (Broderick y Merchen, 1982; Chen
et al., 1992; Stangassinger et al., 1995), ya que se obtienen aceptando determinados su-
puestos que pueden no ser ciertos en todos los casos (p.e. una relación constante puri-
nas/N en los microorganismos ruminales), pero se acepta su validez a efectos comparati-
vos. Una posible alternativa para el futuro sería analizar la excreción urinaria de DP en to-
dos aquellos experimentos en los que se determine la síntesis de proteína microbiana
mediante la utilización de otros marcadores, de tal forma que se pudieran llegar a clarifi-
car los aspectos mencionados anteriormente. Por otra parte, el análisis de la relación puri-
nas/N en los microorganismos ruminales de animales que reciban raciones de diferente
calidad y administradas a diferentes niveles de ingestión permitiría obtener un rango de
valores, de tal forma que en trabajos posteriores se dispusiera de los valores más apropia-
dos para utilizar en cada caso.

Ácido diaminopimélico (DAPA)

El DAPA es un aminoácido que forma parte de la pared celular de numerosas bacte-

rias ruminales, pero que no se encuentra en los protozoos (Ling y Buttery, 1978). Su posi-
ble utilización como marcador microbiano se planteó en los años cincuenta y desde enton-
ces se ha utilizado en multitud de estudios, a pesar de que presenta numerosos inconve-
nientes. El hecho de que el DAPA se encuentre únicamente en la pared celular de las
bacterias hace que la relación DAPA/N en las mismas varíe con aquellas condiciones que
alteran el tamaño celular. Las condiciones que favorecen el crecimiento de las bacterias
de mayor tamaño provocan una disminución de la relación DAPA/N, ya que la relación
pared celular/protoplasma será proporcionalmente menor cuanto mayor sea el tamaño de
las bacterias (Broderick y Merchen, 1992). Por el contrario, las bacterias de menor tama-
ño presentan una proporción DAPA/N comparativamente mayor. Además, en algunas
bacterias como los cocos gram-positivos no existe DAPA en su pared celular (Merry y
McAllan, 1983). Debido a estas diferencias entre bacterias no resulta extraño que en va-
rios estudios (Merry y McAllan, 1983; Olubobokun y Craig, 1990) se haya observado que
el contenido en DAPA y la relación DAPA/N es significativamente menor en las BAS
que en las BAL (ver Tabla 2).
Por otra parte, en algunos estudios (Ling y Buttery, 1978; Olubobokum y Craig,
1990) se ha observado que la cantidad de DAPA en los microorganismos ruminales va-
ría en función del tiempo transcurrido desde la ingestión de alimento. Dufva et al. (1982)
señalaron que la relación DAPA/N era menor en las BAL aisladas de animales que

Invest. Agr.: Prod. Sanid. Anim. Vol. 16 (1), 2001

 14
Tabla 2
Contenido en ácido diaminopimélico (DAPA) y relaciones (valores entre paréntesis) DAPA/N y ácido
aminoetilfosfónico-N (AEPA-N)/N de muestras de bacterias (BAL: bacterias asociadas a la fase líquida; BAS:
bacterias asociadas a la fase sólida) y protozoos aislados del rumen

Origen de los
Marcador microbiano y refe- Bacterias
microorganis- Ración BAL BAS Protozoos
rencia mixtas
mos

Ácido diamimopimélico

Merry y McAllan (1983) 1 Rumen (vacuno) Cebada: paja cebada: urea

(45:48:3) 3,81 (0,047) 2,20 (0,031) – –
Rhanema y Theurer (1986) 1 Rumen (vacuno) Sorgo grano: melazas: forraje
(84:6:10) – – 3,28 (0,049) 1,02 (0,017)
Legay-Carmier y Bauchart (1989) 1 Rumen (vacuno) Heno: concentrado (50:50) 2,23 (0,034) 1,39 (0,024) – –
Olubobokum y Craig (1990) 1 Rumen (vacuno) Heno: concentrado (94:6) 1,90 (0,021) 1,58 (0,022) – –
Martin et al. (1994) 2 Rumen (vacuno) Heno: cebada (65:35) 2,52 (0,028) 1,10 (0,013) – –
M.D. CARRO

Robinson et al. (1996) 2 Rumen (vacuno) Ensilado: concentrado (56:44) 7,05 (0,078) – – 2,03 (0,031)

Ácido diaminoetilfosfónico

Ling y Buttery (1978) Rumen (ovino) Cebada grano: paja: melazas: torta
de soja (58:16:10:16) – – –(0,64) –(2,26)
Cebada grano: paja: melazas: urea
(72:16:10:2) – – –(0,22) –(1,72)

1 mg de DAPA/g materia seca.

2 mg de DAPA/g materia orgánica.
 SÍNTESIS DE PROTEÍNA MICROBIANA Y MARCADORES MICROBIANOS 15

recibían raciones forrajeras que en las aisladas de animales que recibían raciones con altas
proporciones de concentrado, si bien Robinson et al. (1996) no observaron efectos signifi-
cativos de la ración en la relación DAPA/N de bacterias y protozoos aislados de novillos
que recibían raciones compuestas por ensilado y concentrado.
Otro problema grave es la ausencia de DAPA en los protozoos ruminales (Ling y
Buttery, 1978). A pesar de ello, las preparaciones de protozoos aislados del rumen presen-
tan ciertas cantidades de DAPA, bien por su contaminación con bacterias durante el aisla-
miento o, principalmente, debido a la presencia de restos de bacterias no digeridas en el
interior de los mismos (Coleman y Sandford, 1979). Sin embargo, la relación DAPA/N en
los protozoos es muy inferior (entre 3 y 8 veces menor) a la de las bacterias (ver Tabla 2;
Czerkawski, 1974; Rahnema y Theurer, 1986; Robinson et al., 1986), por lo que no consi-
derar este hecho produce una subestimación de la producción de N microbiano. Estos he-
chos hacen que el DAPA no cumpla la premisa de encontrarse distribuido de forma uni-
forme en todos los microorganismos ruminales.
La lisis microbiana que tiene lugar en el rumen y abomaso provoca una pérdida del
contenido celular, de tal forma que muchos restos de paredes celulares de bacterias pa-
san al duodeno (Gómez et al., 1991). Dado que el DAPA solamente se encuentra en la
pared celular de las bacterias, este hecho hace que la digesta duodenal presente una rela-
ción DAPA/N anormalmente alta, y por ello se sobreestima la producción de N micro-
biano. A lo largo de varios experimentos realizados con ovejas, Masson et al. (1991)
observaron que del total de DAPA presente en la digesta duodenal sólo un 69 % forma-
ba parte de células bacterianas intactas cuando las muestras se obtenían una hora antes
de la ingestión de alimento, y esta cifra se reducía al 29 % si las muestras se obtenían
varias horas después de la ingestión. Estos datos indican que, a menudo, más de la mi-
tad del DAPA que llega al duodeno puede encontrarse en forma libre o en restos de pa-
redes celulares, de tal forma que en algunos estudios se han obtenido proporciones de N
microbiano en la digesta duodenal superiores al 100 % (Nikolic y Jovanovic, 1973). En
otros estudios se ha observado que el uso del DAPA provocó una sobreestimación de la
producción de N microbiano en comparación con otros marcadores, como el 35S (Sid-
dons et al., 1982; Whitelaw et al., 1984), el 15N (Siddons et al., 1982; Schönhusen et al.,
1995), el perfil de aminoácidos (Siddons et al., 1982; Schönhusen et al., 1995) y las pu-
rinas (Illg y Stern, 1994). Por el contrario, Ling y Buttery (1978) y Walker y Nader
(1975) obtuvieron menores valores de síntesis de proteína microbiana con DAPA que
con 35S. Parte de estas diferencias pueden deberse al método analítico usado para deter-
minar las concentraciones de DAPA. Este análisis (Czerkawski, 1974) utiliza técnicas
de cromatografía de intercambio iónico y de colorimetría, y aunque es el método utiliza-
do en la mayoría de los laboratorios, muchos de ellos han introducido modificaciones en
el mismo. En cualquier caso, el análisis del DAPA implica numerosos pasos y es una
técnica larga y laboriosa.
Algunos autores (Czerkawski, 1974; Rahnema y Theurer, 1986) han encontrado
DAPA en algunos alimentos de uso habitual en las raciones de los animales rumiantes.
Rahnema y Theurer (1986) señalaron que los valores de la relación DAPA/N en diferen-
tes alimentos oscilaban entre 18 y 40 % de los encontrados en las bacterias ruminales. Sin
embargo, otros estudios (Czerkawski, 1974) han determinado valores de DAPA mucho
menores (inferiores a la mitad) en alimentos de características similares, y se han atribui-
do los altos valores encontrados por Rahnema y Theurer (1986) a imprecisiones del méto-
do analítico utilizado por estos autores (Broderick y Merchen, 1992).

Invest. Agr.: Prod. Sanid. Anim. Vol. 16 (1), 2001

16 M.D. CARRO

Debido a los inconvenientes comentados, principalmente al hecho de que gran parte

del DAPA presente en la digesta duodenal no está asociado con células bacterianas intac-
tas, actualmente no se recomienda su uso como marcador microbiano (Masson et al.,
1991; Broderick y Merchen, 1992; Illg y Stern, 1994), a pesar de que ha sido muy em-
pleado en las últimas décadas.

D-alanina y ácido aminoetilfosfónico (AEPA)

La D-alanina es un aminoácido que forma parte de la pared celular de numerosas bac-

terias ruminales, pero que no se encuentra en los protozoos (Ling y Buttery, 1978) ni en
los alimentos utilizados en las raciones de los rumiantes (Garrett et al., 1986). Sin embar-
go, la D-alanina ha sido utilizada en muy pocos estudios, y en alguno de ellos se han obte-
nido proporciones de N microbiano en la digesta duodenal superiores al 100 % (Quigley y
Schwat, 1988), lo que teóricamente resulta imposible. Por estas razones la D-alanina no
suele utilizarse como marcador microbiano.
Horiguchi y Kandtsu (1959) aislaron un aminoácido, el ácido aminoetilfosfónico
(AEPA), que formaba parte de los protozoos ciliados del rumen, pero que no estaba pre-
sente en la mayoría de los alimentos usados comúnmente en las raciones de los animales,
por lo que se propuso su utilización como marcador protozoario. Sin embargo, en estudios
más recientes (Ling y Buttery, 1978; Horigani y Horiguchi, 1990) se ha observado la pre-
sencia de AEPA en las bacterias ruminales (ver Tabla 2) y en algunos alimentos. Horigani
y Horiguchi (1990) señalan que las bacterias ruminales pueden incorporar AEPA y las
plantas pueden tomarlo de los microorganismos existentes en el suelo. Debido a estos he-
chos se desaconseja el uso de AEPA como marcador de la síntesis microbiana de origen
protozoario (Horigani y Horiguchi, 1990).

Perfiles de aminoácidos

Este método, propuesto por Evans et al. (1975), se basa en estimar la cantidad de N
microbiano, N de origen alimenticio y N de origen endógeno a partir de las diferencias
existentes en el contenido en los distintos aminoácidos de estas tres fracciones. Esta técni-
ca acepta varias premisas que no son totalmente ciertas. En primer lugar, se asume que la
proteína endógena presenta una composición aminoacídica constante, y por ello se suele
tomar como patrón el pepsinógeno bovino, sin considerar la composición de otras proteí-
nas que pueden formar parte de la misma (Siddons et al., 1982). Por otra parte, se admite
que la proteína de origen alimenticio no degradada en el rumen tiene la misma composi-
ción en aminoácidos que la proteína del alimento, sin considerar que la composición ami-
noacídica de la fracción proteica rápidamente degradable es diferente de la de aquellas
fracciones que se degradan más lentamente (Nikolic y Jovanovic, 1972; Siddons et al.,
1982). En cuanto a los microorganismos ruminales, se suele aislar una muestra de los
mismos o se asume una composición constante (Stern y Hoover, 1979). A pesar de que en
algunos trabajos se ha señalado que los microorganismos ruminales presentan una compo-
sición aminoacídica constante, Clark et al. (1992) revisaron los principales estudios en los
que se determinó la composición aminoacídica de extractos bacterianos (441 muestras co-
rrespondientes a animales que ingirieron 61 raciones diferentes) y observaron una amplia
 SÍNTESIS DE PROTEÍNA MICROBIANA Y MARCADORES MICROBIANOS 17

variabilidad en el contenido en todos los aminoácidos, con coeficientes de variación que

oscilaron entre 4,8 y 25,6 % (valores para el ácido aspártico y la metionina, respectiva-
mente). Además, la composición aminoacídica de los microorganismos ruminales cambia
tras la administración de alimento (Clark et al., 1992), por lo que el aislamiento de una
fracción microbiana representativa resulta especialmente difícil.
Evans et al. (1975) compararon los resultados de este método con los obtenidos con
DAPA y observaron que los valores eran similares, pero inferiores a los obtenidos utili-
zando ARN como marcador. De forma similar, Siddons et al. (1982) y Schönhusen et al.
(1995) obtuvieron valores de síntesis de proteína microbiana mucho menores con los per-
files de aminoácidos que con otros marcadores (DAPA, ARN, 15N y 35S). Debido a que las
premisas en las que se basa esta técnica no son válidas y a los resultados erráticos obteni-
dos en varios estudios, este método no suele utilizarse para cuantificar la síntesis de pro-
teína microbiana.

ATP

Forsberg y Lam (1977) utilizaron el ATP como marcador microbiano para cuantificar
las proporciones de BAL y BAS en el rumen, y para ello aceptaron las siguientes premi-
sas: a) que el ATP está presente en todas las células vivas, pero no forma parte de las cé-
lulas muertas; b) que la concentración de ATP es similar en todos los microorganismos
ruminales y c) que la extracción y posterior análisis de la concentración de ATP en las cé-
lulas son relativamente simples y baratos (Stern y Hoover, 1979). Sin embargo, estos mis-
mos autores observaron que existían diferencias en la concentración de ATP entre los di-
ferentes microorganismos ruminales, y que, dependiendo del método utilizado, había una
gran variabilidad en la eficiencia de la extracción de ATP de las células. Posteriormente,
Wallace y West (1982) también observaron diferencias en el contenido en ATP entre bac-
terias y protozoos. Estos autores señalan que la concentración de ATP refleja el nivel de
actividad de los microorganismos ruminales más que la cantidad total de los mismos, por
lo que no debe ser usado como marcador microbiano.

MARCADORES MICROBIANOS EXTERNOS

Los marcadores microbianos externos deben administrarse a los animales para que
sean incorporados por los microorganismos ruminales y formen parte de sus estructuras.
El procedimiento más empleado consiste en realizar una infusión continua del marcador
en el rumen de los animales durante el período experimental hasta que se alcanzan condi-
ciones de equilibrio («steady state»). Los principales marcadores externos son 15N, 35S y
32P, aunque en algunos estudios se ha determinado la incorporación de compuestos marca-

dos con 3H y 14C (Chikunya y Miller, 1997; Lambert et al., 1998).

Invest. Agr.: Prod. Sanid. Anim. Vol. 16 (1), 2001

18 M.D. CARRO

15 N

El 15N se administra a los animales experimentales en forma de sales amónicas

(15NH4Cl, (15NH4)2SO4) o de urea. Estas sustancias se disuelven fácilmente en agua, y tras
un período de infusión de 3-4 días se consigue un enriquecimiento constante de los mi-
croorganismos ruminales (Firkins et al., 1987; Beckers et al., 1995). El 15N es uno de los
marcadores externos más utilizados, tanto en estudios in vivo (Carro et al., 1992a; Leb-
zien et al., 1993; Pérez et al., 1996a, 1996b) como in vitro (Carro et al., 1992b; Blümmel
et al., 1997; Carro y Miller, 1999b). Este hecho es debido a algunas de las ventajas que
presenta: 1) es un isótopo no radioactivo, por lo que puede ser utilizado en cualquier oca-
sión sin riesgos de contaminación medioambiental; 2) los alimentos de los animales no
suelen presentar enriquecimientos en 15N superiores a la abundancia natural (0,3663), y la
infusión de 15N únicamente enriquece a los microorganismos; 3) el 15N infundido se incor-
pora a todos los microorganismos, ya que las bacterias incorporan el 15NH3 y los proto-
zoos lo incorporan indirectamente cuando engullen y digieren a las bacterias, aunque el
grado de enriquecimiento de las diferentes fracciones de microorganismos suele ser dife-
rente.
Otra ventaja del 15N es que marca directamente el N microbiano, es decir, el material
cuya cuantía se desea determinar. Sin embargo, lo que realmente se determina con este
método es la incorporación de 15NH3 por los microorganismos, y no se tiene en cuenta la
incorporación directa de aminoácidos y péptidos. Este hecho cobra una especial importan-
cia si se tiene en cuenta que las diferentes especies bacterianas ruminales difieren en la
utilización de amoniaco y N aminoacídico para su síntesis proteica (Russell et al., 1992).
En varios estudios (Komisarczuk et al., 1987; Carro y Miller, 1999b; Ranilla et al., 2000)
se ha observado que las BAS incorporan una menor proporción de amoníaco que las
BAL, por lo que resulta lógico que presenten habitualmente un menor enriquecimiento en
15N (ver Tabla 3). Este hecho se ha observado tanto en condiciones in vivo (Martin et al.,

1994; Beckers et al., 1995; Pérez et al., 1996b), como in vitro (Komisarczuk et al., 1987;
Carro y Miller, 1999b; Ranilla et al., 2000). Por ello, cuando se utilizan las BAL como
extracto microbiano de referencia se subestima la síntesis de proteína microbiana. Carro y
Miller (1998) observaron que la síntesis microbiana en fermentadores semicontinuos
(RUSITEC), al que se administraban cuatro raciones diferentes, era una media de un
22 % menor cuando se usaban las BAL como extracto de referencia que cuando se usaban
las BAS. Tal y como se ha comentado para otros marcadores microbianos, este problema
podría solucionarse mediante el aislamiento de una fracción microbiana «representativa».
La precisión y exactitud del análisis de 15N por espectrometría de masas son excelen-
tes (se pueden detectar enriquecimientos del 0,001 % por encima del enriquecimiento na-
tural), pero la preparación de las muestras para el análisis es laboriosa, ya que a menudo
es necesario un procesado previo de las mismas. Este procesado suele consistir en un aná-
lisis kjeldahl, seguido de una destilación y evaporación del destilado. En caso de ser nece-
sario este procesado, el manejo de las muestras debe ser muy cuidadoso para evitar la
contaminación de las mismas durante la destilación (Firkins et al., 1992). Por otra parte,
los espectrómetros de masas son equipos muy caros y presentan un manejo complicado,
por lo que no están al alcance de la mayoría de los laboratorios, y esto representa uno de
los principales puntos limitantes de esta técnica. Sin embargo, en nuestro país existen cen-
tros que realizan análisis de 15N a un precio aproximado de 2.500 pesetas por muestra.
Una posible alternativa es el análisis de 15N mediante espectrometría de emisión, técnica
 Tabla 3
15 35
Valores de la relación N/N (%) y S/N en muestras de bacterias (BAL: bacterias asociadas a la fase líquida; BAS:
bacterias asociadas a la fase sólida) y protozoos aislados del rumen
Origen de los mi-
Marcador microbiano y Bacterias
cro- Ración BAL BAS Protozoos
referencia mixtas
organismos
15N

Firkins et al. (1987) Rumen (vacuno) Forraje: concentrado (70:30) 0,748 0,749 – 0,631

Invest. Agr.: Prod. Sanid. Anim. Vol. 16 (1), 2001

Komisarczuk et al. (1987) 1 In vitro Paja: pulpa de remolacha: manioca (50:29:21) 0,932 0,611 – –
(RUSITEC)
Heno 0,525 0,479 – 0,456
Martin et al. (1994) 1 Rumen (vacuno)
Heno: cebada grano (65:35) 0,536 0,476 – 0,464
Pérez et al. (1996b) 1 Rumen (ovino) Heno: concentrado (67:33) 0,563 0,521 – –
Pérez et al. (1997b) Rumen (ovino) Paja cebada: concentrado (40:60) 0,480 0,478 – –
Paja: cebada grano (80:20) 0,649 0,629 – –
Martín-Orúe et al. (1998) 1 Rumen (ovino)
Paja: cebada grano (20:80) 0,611 0,538 – –
Chikunya y Miller (1999) 1 Rumen (ovino) Paja: pulpa de remolacha (70:30) 0,423 0,420 – –
Carro y Miller (1999b) 1 In vitro Pared celular de forrajes 0,668 0,572 0,600 –
(RUSITEC) (Fibra neutro-detergente)
Ranilla et al. (2000) 1 In vitro Pared celular de forrajes 0,751 0,626 0,702 –
(botellas de cultivo) (Fibra neutro-detergente)
SÍNTESIS DE PROTEÍNA MICROBIANA Y MARCADORES MICROBIANOS

35S

Merry y McAllan (1983) Rumen (vacuno) Cebada: paja cebada: urea (45:48:3) 2,11 2,04 – –
Chikunya y Miller (1999) Rumen (ovino) Paja: pulpa de remolacha (70:30) 3,16 3,63 – –
1 Las diferencias entre las BAL y las BAS en la relación 15N/N son estadísticamente significativas (P < 0,05).
19
20 M.D. CARRO

que presenta una menor precisión, pero que requiere un equipo menos costoso y más fácil
de manejar (Proksch, 1972). Otro inconveniente del 15N es el alto precio del isótopo, el
cual varía en función del enriquecimiento de la fuente. Por ejemplo, 1 g de 15NH4 Cl (Sig-
ma-Alldrich Química, S.A.) con un enriquecimiento del 98 y del 10 % cuesta aproxima-
damente 40.000 y 1.800 pesetas, respectivamente. La cantidad mínima necesaria para
marcar los microorganismos ruminales suele ser de 80 mg de 15N por cada 100 g de N en
la ración, por lo que el uso del 15N en estudios in vivo se ve limitado en muchos casos por
razones económicas. Sin embargo, estas razones no limitan su uso en estudios in vitro, en
los que la cantidad necesaria es mucho menor (1 g de 15NH4 Cl con un enriquecimiento
del 98 % permite realizar varios experimentos in vitro, dependiendo del número de trata-
mientos y de réplicas). En cualquier caso, el 15N es uno de los métodos más seguros y fia-
bles, y es recomendado como uno de los métodos de elección para determinar la síntesis
de proteína microbiana (Broderick y Merchen, 1992).
Los resultados obtenidos en los diferentes estudios en los que se han comparado el 15N
y las purinas son contradictorios. Pérez et al. (1996a) observaron que los valores de síntesis
microbiana en ovejas que recibían heno de alfalfa suplementado con diferentes cantidades
de cebada (0, 220, 400 y 550 g/día) eran entre un 14 y un 22 % menores cuando se utiliza-
ban las purinas como marcador que cuando se utilizaba 15N. De acuerdo con estos resulta-
dos, Calsamiglia et al. (1996) observaron que las purinas subestimaban la síntesis microbia-
na entre un 1 y un 18 %, en comparación con el 15N, en fermentadores continuos que reci-
bían una ración basal suplementada con diferentes concentrados proteicos. Por el contrario,
Carro y Miller (1999a) obtuvieron valores entre un 15 y un 17 % mayores con purinas que
con 15N al determinar la síntesis microbiana en un fermentador semicontinuo al que se le
administraba una ración basal con un contenido mínimo de purinas (pared celular suple-
mentada con cuatro fuentes nitrogenadas diferentes). De forma similar, Tejido et al. (2001)
observaron que las purinas sobreestimaban la síntesis microbiana entre un 19 y un 47 %
comparadas con el 15N cuando ambos marcadores se utilizaron para cuantificar el creci-
miento microbiano in vitro sobre sustratos que no contenían purinas (almidón y celulosa).
Carro y Miller (1999a) y Tejido et al. (2001) atribuyeron los mayores valores obtenidos con
las purinas a una pérdida de purinas en el proceso de aislamiento de los extractos bacteria-
nos, tal y como ya ha sido comentado anteriormente. Otros autores (Cecava et al., 1991)
han observado también una sobreestimación de la sínteis microbiana con las bases púricas
en estudios in vivo, y la han atribuido al efecto de las purinas del alimento que no son de-
gradadas en el rumen. A pesar de las diferencias obtenidas en los valores absolutos de sínte-
sis microbiana en los diferentes estudios, en los trabajos de Pérez et al. (1996a) y Carro y
Miller (1999a) se observó una correlación significativa entre los valores obtenidos para
cada ración con los dos marcadores, si bien esta relación no fue significativa en los trabajos
de Calsamiglia et al. (1996) y Tejido et al. (2001).

35 S

De forma similar a la descrita para el 15N, el 35S se infunde en el rumen en forma de

sales (principalmente Na2 35SO4) y es incorporado a la proteína de los microorganismos a
través de la síntesis de novo de aminoácidos azufrados (cistina y metionina), aunque tam-
bién puede incorporarse a otros compuestos azufrados como la coenzima A (Broderick y
Merchen, 1992). Los protozoos son marcados indirectamente cuando engullen y digieren
 SÍNTESIS DE PROTEÍNA MICROBIANA Y MARCADORES MICROBIANOS 21

a las bacterias ruminales. El método requiere el aislamiento de una fracción microbiana

representativa y la determinación de la relación 35S/N en la misma y en la digesta duode-
nal. En los primeros estudios realizados era necesario determinar la actividad específica
del 35S en la cistina, la metionina o en el total de aminoácidos azufrados (Beever et al.,
1974), lo que complicaba la parte analítica de la determinación de la síntesis microbiana.
Sin embargo, Mathers y Miller (1980) propusieron una modificación del método que re-
duce el número de análisis y aumenta su precisión (Siddons et al., 1982), y que ha sido
usada en numerosos estudios (Kennedy et al., 1984; Chikunya y Miller, 1998, 1999).
Una limitación del 35S como marcador microbiano es el error introducido debido a
que una cantidad considerable de S microbiano puede proceder de la incorporación direc-
ta de péptidos y/o aminoácidos azufrados a la proteína microbiana. Por otra parte, el 35S es
un isótopo radiactivo, aunque su radiación b es débil y su vida media es relativamente
corta (noventa días). Sin embargo, la utilización de este isótopo exige disponer de instala-
ciones y laboratorios aptos para trabajar con material radiactivo, así como de personal
cualificado para ello.
Kennedy et al. (1984) realizaron un experimento para comparar el 15N y el 35S como
marcadores microbianos y observaron que el 15N produjo valores un 24 % menores que el
35S. Por el contrario, Siddons et al. (1982) señalaron que la síntesis de proteína microbia-

na en ovejas alimentadas con ensilado o con heno de hierba fue hasta un 25 % menor con
el 35S que con el 15N. De forma similar, Chikunya y Miller (1999) observaron que el 35S
produjo valores un 12 % inferiores a los obtenidos con el 15N cuando ambos se utilizaron
para determinar la síntesis de proteína microbiana en ovejas alimentadas con una ración
compuesta por paja y pulpa de remolacha (70:30). Dado que las diferencias obtenidas en
los distintos estudios comparativos no son consistentes, se piensa que las condiciones ali-
menticias pueden afectar de forma diferente a las estimaciones de la síntesis de proteína
microbiana realizadas con estos dos marcadores (Siddons et al., 1982).

32 P

Bucholtz y Bergen (1973) observaron que la captación de fósforo y su incorporación

a los fosfolípidos microbianos presentaban una estrecha correlación con la síntesis de pro-
teína microbiana en el rumen, por lo que propusieron el uso de 32P como marcador. Poste-
riormente, Smith et al. (1978) propusieron una técnica basada en la incorporación de 32P a
los ácidos nucleicos microbianos. Estos autores observaron que los valores obtenidos con
32P eran aproximadamente un 85 % de los estimados utilizando ARN como marcador, y

atribuyeron esta diferencia a que el ARN sobreestimaba la síntesis microbiana debido a la

presencia de pequeñas cantidades de ARN de origen alimenticio. A pesar de estos resulta-
dos, la alta energía de este isótopo hace que su manejo sea peligroso y por ello se ha utili-
zado mayoritariamente en estudios in vitro (Van Nevel y Demeyer, 1977; Merry et al.,
1990). Por otra parte, su vida media es corta (catorce días) y esto hace que se disponga de
un tiempo limitado para analizar las muestras de digesta y extractos microbianos.

Invest. Agr.: Prod. Sanid. Anim. Vol. 16 (1), 2001

22 M.D. CARRO

CONCLUSIONES

En el momento actual los dos marcadores microbianos más utilizados son las purinas
y el 15N, y ambos han sido propuestos como marcadores de elección por varios autores
(Broderick y Merchen, 1982; Broudiscou y Jouany, 1995). A pesar de que son pocos los
estudios en los que se han comparado estos dos marcadores, en algunos de ellos se ha ob-
servado una correlación significativa entre los resultados obtenidos por los dos métodos.
Las purinas presentan la ventaja de ser constituyentes de los microorganismos, hecho que
evita la necesidad de realizar infusiones en el rumen para administrar el marcador, pero
un inconveniente es que también forman parte de los alimentos que reciben los animales.
El 15N presenta principalmente problemas económicos, dado el alto precio del isótopo y
de la analítica que conlleva la técnica. Un problema grave que presentan ambos marcado-
res es el aislamiento de una fracción bacteriana representativa, ya que las relaciones puri-
nas/N y 15N/N difieren en las diferentes poblaciones microbianas (BAS, BAL y proto-
zoos).
En la medida de lo posible sería recomendable la utilización conjunta de purinas y
15N como marcadores en los estudios en los que se determine la síntesis de proteína mi-

crobiana. Además, sería deseable recoger la orina producida por los animales y analizar
su concentración en DP, lo que probablemente permitiría validar de forma definitiva la
excreción urinaria de DP como indicador del flujo duodenal de N microbiano.

AGRADECIMIENTOS

Este trabajo forma parte de los Proyectos LE 29/98 y LE 38/01 financiados por la Junta de Castilla y León.
Deseo manifestar mi agradecimiento al Dr. Balcells por las interesantes conversaciones que hemos mantenido
sobre la utilización de las bases púricas y el 15N como marcadores microbianos.

SUMMARY
Determination of microbial protein synthesis in the rumen: a comparison of
microbial markers (Review)

Measurement of microbial protein synthesis and protein degradation in the rumen is critical in all the pro-
tein evaluation systems for ruminants. Microbial protein synthesis is determined by means of microbial markers,
which are classified as internal (inherently present in rumen microorganisms) and external (compounds added to
the rumen to label the microorganisms) markers. However, no marker has proven to be completely satisfactory.
This review examines the advantages and disadvantages of the internal (nucleic acids, purine bases,
diaminopimelic acid, D-alanine, aminoethyl-phosphonic acid, amino acid profiles and ATP) and external (15N,
35S and 32P) microbial markers and presents the results obtained from studies in which several microbial markers

were compared.

KEY WORDS: Microbial protein

Rumen
Microbial markers
Purines
15
N
 SÍNTESIS DE PROTEÍNA MICROBIANA Y MARCADORES MICROBIANOS 23

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