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Cartas en microbiología aplicada / Volumen 32, Número 6

 Acceso Libre

Transcripción inversa in situ para detectar el gen cbbL y visualizar RuBisCO en

bacterias nitri cantes chemoautotrophic

CD Sinigalliano , DN Kuhn , RD Jones , MA Guerrero

Primera publicación: 20 de diciembre de 2001.

https://doi.org/10.1046/j.1472-765X.2001.00927.x
Citado por: 6

 Dr Sinigalliano Southeast Environmental Research Center, Florida International University, University

Park, Miami, FL 33199, EE. UU. (Correo electrónico: sinigall@ u.edu ). Publicación SERC núm. 147.

Resumen
Objetivos: Se utilizaron metodologías in situ dirigidas al gen cbbL para visualizar células de
bacterias nitri cantes. Se utilizaron los protocolos de la PCR procariótica in situ (IS-PCR) y de
la transcripción inversa in situ (ISRT) para determinar la presencia y expresión de genes,
respectivamente.

Métodos y resultados: Se inocularon muestras de agua de mar oligotrópica envejecida con

ensamblajes microbianos que contenían una mezcla de bacterias nitri cantes de
crecimiento activo, bacterias nitri cantes hambrientas y bacterias heterótrofas sin cbbL .
Después de las manipulaciones moleculares, encontramos que mientras todos los
nitri cadores (sanos o hambrientos) con el gen cbbL fueron detectados por IS-PCR, solo los
nitri cadores autótrofos en crecimiento activo con niveles detectables de jación de
carbono y actividad de nitri cación fueron detectados por análisis ISRT.

Conclusiones: estos resultados muestran cómo IS ‐ PCR e ISRT se complementan entre sí, y
su potencial para el análisis de poblaciones heterogéneas en las que se espera una variedad
de células sanas e inmovilizadas.

INTRODUCCIÓN
Muchos estudios ecológicos de organismos macroscópicos se han centrado en la identi cación,
caracterización, enumeración y actividades de individuos especí cos entre una población dada.
Sin embargo, este enfoque ha sido muy difícil al examinar poblaciones microbianas complejas
como las que se encuentran en muestras ambientales. En un intento por visualizar
microorganismos que expresan varias proteínas especí cas de una especie o función, los
investigadores utilizaron previamente técnicas de anticuerpos uorescentes (FA) ( 3) que
permitió la identi cación directa y la enumeración de bacterias individuales en una población,
independiente del cultivo. Sin embargo, las metodologías de AF están limitadas por: (i) el
requisito de aislar los organismos de interés para la producción de anticuerpos especí cos; (ii)
parámetros ambientales que in uyen en la expresión del antígeno; y (iii) resultados falsos
positivos o falsos negativos debido a reactividad cruzada o falta de respuesta. La llegada de
una variedad de técnicas genéticas moleculares para estudios microbiológicos ambientales ha
superado muchos de estos problemas.

Técnicas moleculares in situ independientes de la cultura , tales como hibridación in situ

uorescente (FISH), PCR in situ (IS-PCR), transcripción inversa in situ (ISRT) y transcripción
inversa-PCR in situ (ISRT-PCR), representan un poderoso Nuevo conjunto de herramientas para
la visualización de la presencia y expresión de genes especí cos dentro de células individuales
intactas. No es sorprendente que los estudios integrados que combinan una variedad de
herramientas biogeoquímicas y moleculares de manera complementaria estén aumentando en
la ecología microbiana.

Los métodos basados en FISH y dirigidos a los genes 16S rRNA especí cos fueron los primeros
utilizados para detectar tanto el ADN como el ARN en células intactas de muchos
microorganismos diversos ( 1 ). Sin embargo, el FISH a menudo está limitado por una baja
sensibilidad de detección cuando se dirige a genes funcionales de bajo número de copias o
bajos niveles de expresión de ARNm.

En comparación, los métodos de ampli cación de genes in situ , como IS-PCR, pueden
aumentar el número de moléculas diana y, por lo tanto, superar las limitaciones de sensibilidad
de FISH. Desde su aplicación inicial en 6 , los protocolos de PCR in situ procarióticos se han
aplicado cada vez más en una amplia variedad de hábitats ( 4 ; 13 ; 7 ; 11 ). Una limitación del
enfoque de IS-PCR para la detección de un objetivo de ADN de poblaciones microbianas
naturales es que solo puede reconocer la actividad potencial al detectar la presencia del gen
objetivo.

Métodos como ISRT y RT-PCR, que utilizan ARNm como objetivo, pueden detectar tanto la
presencia como la expresión del gen objetivo. Además, estos métodos pueden determinar la
expresión de genes especí cos dentro de células individuales con un grado de especi cidad
similar y mayor sensibilidad que el FISH. El aumento de la sensibilidad sobre FISH se debe a la
incorporación de muchos nucleótidos marcados con uorescencia en cada copia del ADNc
transcrito. Por lo tanto, ISRT genera una señal lo su cientemente fuerte como para detectar
incluso objetivos de ARN con un número de copia bajo que son difíciles de visualizar solo por
FISH. El ISRT también es potencialmente cuantitativo porque los nucleótidos marcados se
incorporan en proporción directa a la concentración de la plantilla de ARNm. A diferencia de,

Un próximo paso obvio es la aplicación de estas técnicas moleculares en un contexto ecológico

para abordar importantes preguntas abiertas sobre la diversidad microbiana, la estructura de
la comunidad y la actividad en la naturaleza. Sin embargo, pocos estudios hasta la fecha se han
dirigido a genes metabólicos clave. 8 utilizaron hibridaciones in situ para demostrar que las
transcripciones de RuBisCO están presentes tanto en heterocistos como en células vegetativas
de Anabaena spp. De manera similar, 4 utilizaron ISRT para detectar y cuanti car las especies
bacterianas que degradan la lignina en las comunidades de enriquecimiento de lignina y una
Pseudomonas putida F1 de degradación de tolueno en el agua de mar expuesta al tolueno.

En el trabajo reportado aquí, se aplicó una combinación de técnicas moleculares in situ , IS-PCR
e ISRT para detectar cbbL ( 12 ) y así visualizar la actividad de jación de carbono microbiano en
cultivos en crecimiento activo y hambrientos de bacterias quimioutotró cas nitri cantes.

MATERIALES Y MÉTODOS
Muestras bacterianas y tratamientos previos celulares.
Todas las cepas bacterianas utilizadas en este estudio se enumeran en la Tabla 1 . Los
nitri cadores quimioutotró cos y las bacterias quimioheterotró cas utilizadas se cultivaron en
cultivos continuos y discontinuos, respectivamente. Los detalles sobre sus condiciones de
cultivo se han descrito en otra parte (Tabla 1 ). Las células se recolectaron por centrifugación
cuando alcanzaron condiciones de estado estable y se lavaron dos veces con 1 x solución salina
tamponada con fosfato (PBS). Los cultivos muertos de hambre consistían en células lavadas
mantenidas en 1 × PBS a una densidad de 1e 6 células ml –1para 1 mes. Para las mezclas de
células arti ciales, las células se resuspendieron en agua de mar de edad oligotró ca (agua de
mar de Sargasso, almacenada en la oscuridad durante 1 año) y se recuperaron por
centrifugación. Tanto los cultivos axénicos como los cultivos mixtos se jaron, deshidrataron y
permeabilizaron según el método de 6 con ligeras modi caciones. Este trabajo utilizó tiempos
de jación de 3–4 h, lisozima a una concentración nal de 1 mg ml –1 durante 15 min y sin
proteinasa K.

Tabla 1. Organismos utilizados.

Oligonucleótidos
Los cebadores utilizados en este estudio (Chromo forward, Chromo ‑ reverse, D168-forward y
D328 reverse) se diseñaron y probaron previamente para complementar los sitios conservados
en la Forma I del gen rbcL / cbbL ( 9 ). Los conjuntos de cebadores Chromo y D tienen productos
ampli cados con éxito de los nitri cadores utilizados en este estudio. La secuenciación del ADN
y la comparación con los datos de GenBank han veri cado que estos amplicones son cbbL ,
mientras que los cultivos de control negativo (quimioheterotró cos) no mostraron
ampli cación ni hibridación signi cativa por transferencia de puntos con los cebadores
utilizados aquí (datos no mostrados). Estos cebadores oligonucleotídicos fueron sintetizados
por Genosys Biotechnologies, Inc. (The Woodlands, TX, USA) y sus secuencias se muestran en la
Tabla 2 .

Tabla 2. Descripciones de los cebadores oligonucleotídicos utilizados en este estudio

Procedimiento directo de PCR in situ procariótico (IS ‐ PCR) en

diapositivas
Las bacterias nitri cantes quimioutotró cas que contienen el gen cbbL se detectaron mediante
IS-PCR procariótica utilizando los cebadores Chromo y D especí cos de rbcL / cbbL de acuerdo
con el procedimiento de 6 , con las siguientes excepciones: (i) se preparó la mezcla dNTP
marcada con uorescencia como se describe en 4 ; (ii) las diapositivas utilizadas en este trabajo
fueron Superfrost ®Diapositivas de 3 cámaras más (MJ Research, Inc. Watertown, MA, EUA)
cubiertas con el no. 2 cubiertas (24 × 60 mm, MJ Research) y selladas con reactivo Self-Seal (MJ
Research); (iii) la ampli cación en portaobjetos se realizó en un termociclador PTC-200
equipado con una unidad alfa (MJ Research). Las condiciones de ciclado para la
desnaturalización inicial fueron 95 ° C durante 3 min, 50 ° C durante 30 sy 72 ° C durante 60 s.
A esto le siguieron 35 ciclos de 95 ° C durante 30 s, 50 ° C durante 30 sy 72 ° C durante 60 s, y
nalizó por extensión a 72 ° C durante 10 min.

Procedimiento de transcripción inversa in situ (ISRT) en diapositivas

Para detectar células que contienen transcritos de ARNm para cbbL , las células se recolectaron,
se jaron, se colocaron en portaobjetos de vidrio y se permeabilizaron como se describió
anteriormente para la IS-PCR procariota ( 6 ) con las siguientes modi caciones: todos los
portaobjetos y los vidrios de cobertura utilizados se trataron previamente con RNaseZAP TM
(Ambion, Austin, TX, EE. UU.), Mientras que las soluciones y el agua destilada utilizadas se
trataron con pirocarbonato de dietilo (DEPC, concentración nal de 0,1%) antes del autoclave.
Luego se hicieron copias de ADNc uorescentes de las transcripciones de cbbL mediante la
siguiente modi cación del procedimiento ISRT de 4. Para la etapa de hibridación del cebador
ISRT, las manchas celulares permeabilizadas y deshidratadas se cubrieron con 25 µl de una
solución de hibridación que consiste en formamida desionizada al 25%, 1 × SSC, 5 solución de
Denhardt, 1 mg ml –1 solución de ADN de testículos de arenque sonicados, 1 % SDS, 0 · 4 U μl –1
inhibidor de RNasa (Boehringer-Mannheim) y 2 μmol l –1 de la cbbLcebador inverso. Las
diapositivas se cubrieron con ningún. 2 vasos de cobertura y luego se colocaron por separado
en una placa de Petri de plástico cubierta que contenía un pañuelo humedecido con agua
tratada con DEPC. Para mantener las condiciones de humedad, las placas de Petri se
mantuvieron dentro de bolsas de plástico selladas que contenían una toalla de papel húmeda.
Las bolsas y el contenido se incubaron posteriormente durante 2 horas a 45ºC. Después de la
hibridación de 2 h, los portaobjetos se lavaron dos veces durante 5 min a 45 ° C en recipientes
Coplin con 0 x 5 × SSC. Las manchas celulares en los portaobjetos se deshidrataron en una
serie de etanol y se dejaron secar. Para la etapa de extensión del cebador ISRT, se agregaron 25
μl de la mezcla de reacción ISRT a cada mancha celular. La solución de reacción ISRT consistió
en lo siguiente (100 μl –1 ): 63 μl de agua estéril tratada con DEPC, 1 μl de 50 mmol l –
1ditiotreitol, 2 μl de inhibidor de la ARNasa (40 U μl –1 ), 4 μl de la transcriptasa inversa del virus

de la mieloblastosis aviar (25 U μl –1 , Promega), 20 μl de 5 × AMV-RT bu er (Promega) y 10 μl de

10 × mezcla de dNTP etiquetada que contiene 200 μmol l – 1 dATP, dCTP y dGTP, 190 μmol l – 1
dTTP (Promega) y 10 μmol l –1CY3-dUTP (Boehringer Mannheim). Las diapositivas fueron
cubiertas con ningún. 2 cubiertas y se incubaron en las mismas condiciones húmedas que se
describieron anteriormente para la hibridación con cebador inverso. La incubación se llevó a
cabo durante 3 horas a 45 ° C, al nal de las cuales los portaobjetos se lavaron dos veces en
recipientes de Coplin con 0 x 5 × SSC a 45 ° C durante 5 minutos cada uno. Luego se
deshidrataron los portaobjetos, se sometieron a una contratinción con yoduro de YOPRO-1
(sondas moleculares) y se tomaron imágenes como se describe a continuación.

Medición de la actividad de la enzima RuBisCO mediante la

incorporación de 14 CO 3 HNa
Las suspensiones celulares (aproximadamente 1e 6 células ml- 1 ) se suplementaron con 100
μl de 14 CO 3 HNa (actividad especí ca 2 · 5 μCi ml -1 , NEN Life Sciences), se mezclaron y se
incubaron durante 3 h en un agitador rotatorio en el oscuro. Después de la incubación, los
contenidos de las botellas se ltraron a través de ltros de membrana GA ‐ 8 Supor de 0 · 2 μm
(Gelman Sciences, Ann Arbor, MI, EE. UU.). Los ltros se colocaron en viales de centelleo de 20
ml a los que se agregaron 5 ml de líquido de centelleo Ultima Gold (Packard, Meriden, CT, EE.
UU.). La incorporación de la etiqueta se determinó con un contador de centelleo líquido
Beckman modelo LS 3801 (Beckman Instruments Inc., Fullerton, CA, EE. UU.) Y se estableció
sobre la base de controles a los que no se agregaron células.

Medición de la actividad nitri cante por NH 4 + tasas de oxidación.

La producción de Nitrito se utilizó como un índice de oxidación de amonio y fue seguido por la
medición de NO 2 - concentración usando el método espectrofotométrico de 2 .

Microscopía y procesamiento de imágenes.

Los portaobjetos fueron examinados por microscopía de epi uorescencia; las imágenes se
adquirieron con una cámara CCD de color frío, Hamamatsu Modelo 5810 (Hamamatsu, Japón),
y las imágenes adquiridas se procesaron y analizaron con ImagePro Plus (Media Cybernetics,
Silver Springs, MD, EE. UU.) versión 3 · 0. Todas las muestras se tiñeron con dos colorantes
uorescentes, CY3 (excitación 552 nm, emisión 568 nm) y YOPRO-1 (excitación 491 nm, emisión
506 nm). Debido a la tinción dual, se observaron dos veces los mismos campos microscópicos:
primero, bajo un ltro verde estándar (546–580 nm) para visualizar las células diana que
incorporan nucleótidos marcados con CY3; y luego bajo un ltro azul estándar (450–490 nm)
para visualizar todas las células presentes en la muestra, utilizando YOPRO-1 como
contratinción.

La intensidad promedio de píxeles por área (es decir, la intensidad de la señal uorescente) de
las células individuales se calculó con las operaciones de conteo / medida de ImagePro Plus.
Las lecturas de intensidad de uorescencia promedio se obtuvieron de al menos 50-75 células
en cinco imágenes electrónicas diferentes y se calibraron usando perlas uorescentes InSpeck
(Molecular Probes, Eugene, OR, EE. UU.) Que se asignaron arbitrariamente como 100% de
intensidad de uorescencia. Los resultados son el promedio de dos experimentos duplicados.
Los datos se analizaron para detectar diferencias signi cativas entre los distintos tratamientos
mediante la prueba t de Student (no pareada) utilizando SigmaStat para Windows (versión 1 · 0,
Jandel Corporation, San Rafael, CA, EE. UU.).

RESULTADOS Y DISCUSIÓN
En el presente estudio, se usó una combinación de métodos moleculares in situ para visualizar
tanto la jación potencial de CO 2 (IS-PCR) como la actividad real de jación de CO 2 (ISRT), según
lo re ejado por la expresión del gen cbbL en bacterias quimioutotró cas nitri cantes. Además,
la expresión de cbbL detectada por ISRT se correlacionó con la jación de carbono y las
actividades de nitri cación de las mismas células (Tabla 3 ) según se midió mediante ensayos
de actividad enzimática.

Tabla 3. Comparación de metodologías in situ con actividades de jación de carbono y

nitri cación.

Detección del gen cbbL (IS-PCR) y su expresión (ISRT) en un oxidante

de amonio
Las técnicas in situ reportadas aquí utilizaron el tinte uorescente CY3 para marcar aquellas
células que contenían o expresaban el gen cbbL . La Figura 1 (f) muestra una uorescencia roja
positiva por ISRT para la presencia de ARNm de cbbL solo en células de Nitrosococcus oceani en
crecimiento activo . El mismo procedimiento ISRT no puede detectar células muertas de N.
oceani ( Fig. 1 h) que contienen el gen cbbL pero no lo expresan. Las células muertas de hambre
parecían más pequeñas y signi cativamente más débiles que las células de crecimiento activo.
IS ‐ PCR, por otro lado, demostró ser útil para visualizar el potencial de jación de carbono en
ambos en crecimiento activo ( Fig. 1B) y nitri cadores quimioautotró cos reducidos de hambre
( Fig. 1 d). Esto se debe a que IS-PCR solo proporciona información sobre la presencia del gen
cbbL , no sobre su transcripción. Claramente, IS-PCR e ISRT se complementan bien entre sí
como técnicas, ya que IS-PCR sigue siendo la forma más sensible de detectar la presencia de un
gen objetivo, incluso si no se está transcribiendo actualmente (es decir, células muertas de
hambre o inactivas), mientras que ISRT puede indicar el nivel actual de actividad de expresión
por ese gen objetivo.

Figura 1

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Detección del gen cbbL (IS-PCR) y su expresión (ISRT) en un oxidante de amonio. Los
paneles (a) - (d) muestran las reacciones de IS ‐ PCR y los paneles (e) - (h) muestran
las reacciones de ISRT. Los paneles (a), (b), (e) y (f) ilustran la respuesta de las células
sanas, mientras que los paneles (c), (d), (g) y (h) ilustran la respuesta de las células
hambrientas. Los paneles (a), (c), (e) y (g) son las contratinciones YOPRO-1 de los
paneles (b), (d), (f) y (h), respectivamente. Los paneles (b) y (d) muestran una
uorescencia roja positiva para la presencia del gen cbbL en células de Nitrosococcus
oceani (18W30) en crecimiento activo (b) y hambrientas (d ) después de una reacción
de IS-PCR. El panel (b) incluye una esfera uorescente estándar roja ( ). Una
uorescencia roja positiva para la presencia de cbbL.El ARNm solo se detecta en las
células de N. oceani en crecimiento activo (f), mientras que las mismas células
sometidas a condiciones de inanición no mostraron niveles detectables de
uorescencia después de una reacción ISRT (h). La única uorescencia roja
detectada en el panel (h) corresponde a un artefacto diferente de la morfología de
 cocos de N. oceanus . Los tiempos de integración variaron según el conjunto de
ltros utilizado y fueron 1 · 4 s para el ltro azul y 4 · 5 s para el ltro verde.

La detección de cbbL mRNA por ISRT en agua de mar natural

modi cado con organismos conocidos
La técnica ISRT utilizada aquí también podría distinguir claramente entre las bacterias
nitri cantes quimioutotró cas que contienen ARNm de cbbL y los heterótrofos que no lo hacen.
Para este trabajo, las bacterias elegidas fueron morfológicamente distintas, de modo que
cuando se examinaron mezclas de células quimioutotró cas y heterótrofas por contraste no
especí co con el tinte uorescente YOPRO-1, la identidad de cada célula podría determinarse
solo por morfología. En la Fig. 2 , el enfoque ISRT dirigido a cbbL se utilizó en un conjunto de
agua de mar natural envejecido inoculado con un nitri cador conocido, Nitrobacter (25W30N) y
un control negativo, el chemoheterotroph Pseudomonas stutzeri. La uorescencia roja positiva
se observó a partir de la incorporación directa de CY3-nucleótidos solo para el tipo morfológico
correspondiente al quimioautótrofo ( Fig. 2b) y, por lo tanto, la expresión de cbbL solo se
observó para ese organismo que se sabe que está activamente jando carbono.
Auto uorescencia roja, así como cbbL.También podría esperarse de algunos de los miembros
nativos de estas comunidades naturales de agua de mar (es decir, toplancton), pero esto se
evitó intencionalmente en este caso mediante el uso de agua de mar envejecida, donde la
auto uorescencia de fondo natural se reduce signi cativamente. Es cierto que el rango de
emisión del colorante CY3, y de la mayoría de los tintes uorescentes utilizados actualmente,
tiende a coincidir con las frecuencias de auto uorescencia de las comunidades microbianas
nativas que se encuentran en muchos tipos de aguas naturales. Sin embargo, el propósito de
este estudio no fue desarrollar un protocolo universal para muestras naturales, sino mostrar el
uso potencial de in situ.Metodologías en muestras ambientales. La aplicación más amplia de
estas técnicas a muestras naturales depende actualmente del desarrollo de tintes innovadores
que evitan las frecuencias naturales de auto uorescencia.

Figura 2

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 Detección por ISRT de la expresión de cbbL en agua de mar natural modi cada con
organismos conocidos. Los paneles (a) y (b) contienen un conjunto de agua de mar
natural envejecido complementado con Nitrobacter spp. ( ), Pseudomonas stutzeri (
) y esferas uorescentes rojas estándar ( ). En el panel (b), solo las células
elipsoidales correspondientes al quimioautótrofo mostraron niveles detectables de
transcritos de cbbL . El panel (a) es la contratinción YOPRO-1 del mismo campo que
se muestra en el panel (b) donde aparecen células positivas ( Nitrobacter spp.) Y
negativas ( Ps. Stutzeri ) junto con un organismo marino no identi cado ( )

El enfoque ISRT utilizado aquí tiene varias ventajas sobre otras técnicas para el monitoreo in
situ de la expresión génica, como la RT-PCR o la extensión de la sonda de ARN ( 6).). ISRT no es
un procedimiento tan complejo, no requiere el uso de termocicladores u otros equipos
costosos (excepto el microscopio y el sistema de imágenes), y no necesita los pasos extensos
de lavado. A diferencia de la mayoría de los protocolos de RT-PCR, ISRT también tiene el
potencial de ser cuantitativo, ya que la cantidad de cDNA marcado generado es una
representación aritmética de la cantidad de dRNA de dRNA. Además, la especi cidad de los
ISRT puede mejorarse combinando una reacción de transcripción inversa no marcada con FISH
utilizando una sonda marcada especí ca para el cDNA generado. Este enfoque combinado de
ISRT / FISH indirecto se ha utilizado con éxito para detectar los mismos objetivos de cbbL
utilizados aquí (datos no mostrados). La sensibilidad, la velocidad y la relativa simplicidad de
estos procedimientos ISRT son muy prometedores en las aplicaciones de monitoreo ambiental.
Por ejemplo, las muestras podrían procesarse fácilmente en estaciones de campo o a bordo de
barcos para su posterior visualización en el laboratorio. Por estas razones, laLas técnicas
moleculares in situ descritas aquí deberían ser una adición útil a las otras técnicas
biogeoquímicas que conforman la 'caja de herramientas' disponible para los ecólogos
microbianos.

Expresiones de gratitud
Este trabajo fue apoyado por el Departamento de Energía (subvención DE-FG02‐
97ER62451.A000). El soporte adicional para DNK fue proporcionado por NIGMS / NIH grant
08205.

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