Secreción de proteína C humana en leche de ratón

Abstract: Para determinar la producción de proteína C humana recombinante (rec-hPC) en la

leche, creamos dos líneas de ratones homocigotos para el transgén de β-caseína / hPC de cabra.
Las hembras y los machos de ambas líneas (# 10 y # 11) mostraron un crecimiento, fertilidad y
lactancia normales. El número de copias del transgén fue aproximadamente cinco veces mayor en
la línea # 10 en comparación con la línea # 11. La expresión de ARNm del transgén solo se detectó
en las glándulas mamarias de ambas líneas. Además, la expresión de ARNm fue cuatro veces
mayor en el día 7 que en el día 1 durante la lactancia. El análisis de transferencia Northern de la
expresión de ARNm en la línea nº 10 de ratones transgénicos (Tg) indicó una fuerte expresión del
transgén en las glándulas mamarias después de siete días de lactancia. La comparación del nivel de
proteína rec-hPC con el de ARNm en las glándulas mamarias mostró un patrón muy similar. Se
detectó fuertemente una banda de 52 kDa correspondiente a la proteína hPC en las glándulas
mamarias de la línea # 10 durante la lactancia. También detectamos dos bandas de cadena pesada
y una banda débil de cadena ligera en la leche de las líneas # 10 y # 11. Se detectó una sola banda
a 52 kDa de células CHO transfectadas con ADNc de hPC. La hPC se localizó principalmente en la
célula epitelial alveolar de las glándulas mamarias.La proteína se expresa fuertemente en el
citoplasma del tejido de la glándula mamaria en cultivo. La proteína hPC producida en la leche
osciló entre 2 y 28 ng / mL. Estos experimentos indicaron que rec-hPC se puede producir a niveles
elevados en las glándulas mamarias de ratones.

Palabras llave: proteína C humana; ratones transgénicos; Glándulas mamárias

1.Introduccion.

La proteína C, también conocida como autoprotrombina IIα y factor de coagulación sanguíneo XIV,
es una proteína zimógena (inactiva), que en su forma activa juega un papel importante en la
regulación de la coagulación sanguínea. inflamación, muerte celular y mantenimiento de la
permeabilidad de los vasos sanguíneos en humanos y otros animales [1]. Su estructura es la de un
polipéptido de dos cadenas que consta de una cadena ligera y una cadena pesada unidas por un
enlace disulfuro. Esta proteína es una proteína plasmática dependiente de la vitamina K que se
sintetiza en el hígado como un precursor de serina proteasa de 461 aminoácidos y sufre varias
modificaciones co y / o postraduccionales, incluida la escisión de endoproteasas en pesadas
ligadas por disulfuro (Mr 41 kDa) y cadenas ligeras (Mr 21 kDa) [2]. La proteína C activada (APC)
realiza estas operaciones principalmente por Proteolíticamente inactivando proteínas Factor Vα y
Factor VIIIα [3]. Dado el papel crucial que desempeña la proteína C como anticoagulante, las
personas con deficiencias de proteína C o resistencia a la APC sufren un riesgo significativamente
mayor de formar coágulos sanguíneos peligrosos (trombosis). Los animales transgénicos que
producen proteínas recombinantes en su leche pueden proporcionar un sistema económico y
seguro para la producción de proteínas con valor medicinal [4, 5]. Se han hecho muchos intentos
para encontrar un sistema de producción alternativo para hPC, y varios grupos han explorado la
posibilidad de expresar hPC en la leche de mamíferos transgénicos [6-11]. Sin embargo, hasta
ahora, los ratones hPC Tg no pudieron lactar normalmente y no pudieron criar camadas [12]. Se
han producido con éxito varias proteínas médicas utilizando el sistema promotor de cabra. Como
una de las proteínas de la leche dominantes, la β-caseína está implicada en la determinación de los
niveles en la leche. Utilizando el promotor de la β-caseína de cabra, se han expresado proteínas
terapéuticas en niveles elevados en la leche de ratones Tg [13]. Es probable que la proteína C
tenga múltiples funciones biomédicas como resultado de la actividad anticoagulante. Además de
tratar la deficiencia de proteína C, se ha demostrado que es útil en el tratamiento de la necrosis
cutánea inducida por cumarina [14], la coagulopatología en la enfermedad meningocócica [15],
inmediata y inhibición transitoria de la trombosis arterial dependiente de plaquetas [16],
tratamiento del accidente cerebrovascular y prevención de la reoclusión en pacientes tratados con
agentes fibrinolíticos [17]. Por estas razones, se están realizando esfuerzos para aislar grandes
cantidades de proteína C. En este estudio, nos centramos en la producción de hPC en la leche de
ratones hPC Tg. Demostramos que la hPC está localizada en las células epiteliales alveolares
dentro de la glándula mamaria del ratón, y que estas glándulas secretan hPC en la leche.

2.resultados.

2.1. Producción de ratones transgénicos hPC

En total, se transfirieron 469 embriones unicelulares a 24 ratones receptores. Nacieron 61 crías de

22 receptores que habían recibido embriones microinyectados con la construcción pBC1-hPC. El
Screening del ADN genómico de las biopsias de la cola mediante PCR indicó que cuatro camadas
contenían el transgén, para un frecuencia de integración del 6,6%.Se identificaron cuatro ratones
transgénicos mediante cebadores específicos de transgén para ADN genómico, que se esperaba
que produjera productos de 470 pb (Figura 1).

Figura 1. Detección del transgén de proteína C humana (hPC) en ratones fundadores mediante análisis de
PCR. Se identificaron cuatro ratones transgénicos mediante cebadores específicos de transgén. Los
productos de PCR se colocan a la derecha. Los tamaños de los marcadores de ADN están a la izquierda (en
nucleótidos). Carril 1: control negativo con ADN; Carril 2-11: muestras extraídas de colas. Los números 10,
11, 15 y 38 se detectaron mediante PCR como tamaño esperado. M: Marcador.

Se produjeron las líneas transgénicas para cuatro fundadores positivos (nº 10, nº 11, nº 15 y nº
38). El screen se confirmó mediante PCR y análisis de transferencia Southern (Figura 2A, B). El
análisis de transferencia Southern del ADN de la cola de la línea 10 y 11 se muestra en la Figura 2C.
El gen hPC se insertó en los cromosomas en la línea # 10 y la línea # 11. El número de copias del
transgén fue aproximadamente cinco veces mayor en la línea # 10 en comparación con la línea #
11 (Figura 2C). Se produjeron ratones Tg homocigotos hasta la generación F5. Por lo tanto,
confirmamos que estas dos líneas (# 10 y # 11) se transmitieron a la línea germinal.}
Figura 2. Transmisión a la línea germinal de ratones transgénicos. El ADN se aisló de las biopsias de la cola.
Las muestras de ADN se digirieron con KpnI, se procesaron en gel de agarosa al 0,7%, se transfirieron a
membranas de nitrocelulosa y se hibridaron con ADNc de hPC. (A) El segundo al quinto Se amplificaron
generaciones de ratones transgénicos mediante PCR a partir de las líneas nº 10 y nº 11. Carriles 1: control
negativo sin ADN; Carriles 2: Control negativo con ADN; Carril 3: Control positivo con vector de ADNc de hPC;
Carriles 4–7: línea # 10; Carriles 8-11: línea # 11; (B) Resultados de la transferencia Southern de muestras de
ADN de heterocigotos. Número 4–7: # 10 líneas; Número 8-11: # 11 líneas; (C) Los resultados de la
transferencia Southern en la quinta generación de ratones Tg homocigotos se analizaron a partir de las
líneas nº 10 y nº 11. La electroforesis resulta del corte de la enzima KpnI (izquierda). Número 2-3: línea # 10;
Número 4-5: línea # 11. V: vector construido; Ne .: Control negativo. M: Marcador.

2.2. Evaluación de la expresión de ARNm por RT-PCR, qRT-PCR y Northern Blot

Utilizando los cebadores específicos para hPC, se realizó RT-PCR y qRT-PCR para detectar la
expresión de ARNm en tejidos de ratones. Utilizando los cebadores específicos para hPC, se realizó
RT-PCR y qRT-PCR para detectar la expresión de ARNm en tejidos de ratones. Había una pequeña
cantidad de expresión de hPC en el bazo de la línea # 10, lo que puede deberse a la PCR. Sin
embargo, no detectamos ninguna expresión de hPC en el corazón, hígado y riñón. El análisis qRT-
PCR también se realizó para hPC en las glándulas mamarias los días 1, 7 y 15 durante la lactancia.
En la línea n. ° 10, el nivel de expresión de hPC fue cuatro veces mayor en el día 7 en comparación
con el día 1. Sin embargo, esta proteína rara vez se expresa en la línea # 11, como lo muestra los
resultados de qRT-PCR (Figura 3B). Por tanto, el gen de hPC insertado en la línea # 11 puede ser
inestable, en mosaico y no producir rec-hPC. El análisis de transferencia Northern del ARN de la
glándula mamaria para los ratones Tg de la línea nº 10 y los ratones de control se realizaron con
hPC marcada con Dig. Se detectó una banda muy fuerte, de aproximadamente 1 kb de tamaño,
siete días después del parto (Figura 3C).
Figura 3. Expresión de ARNm por RT-PCR, qRT-PCR y Northern blot. (A) Resultados de RT-PCR de glándulas
mamarias y otros tejidos; (B) qRT-PCR resulta de las glándulas mamarias los días 1, 7 y 15 durante la
lactancia; (C) Transferencia de Northern con sonda con cDNA de hPC en la línea # 10. M: marcador; Él:
corazón; Li: hígado; Ki: riñón; Sp: bazo; Ne: control negativo.

2.3. Análisis de Western Blot en las glándulas mamarias y la leche.

Como se muestra en la Figura 4A, se detectó fuertemente una banda de 52 kDa correspondiente a
la proteína hPC en las glándulas mamarias de los ratones Tg de la línea # 10 los días 1, 7 y 15
durante la lactancia. Se detectó una señal débil en los ratones Tg de la línea nº 11 el día 15, pero
no se detectó ninguna señal los días 1 y 7. La expresión de hPC fue notablemente alta los días 7 y
15 durante la lactancia. En comparación, el patrón de expresión de ARNm fue muy similar al
patrón de expresión de proteínas en las glándulas mamarias. Además, la proteína rec-hPC también
se evaluó en la leche de las líneas # 10 y # 11 mediante transferencia Western blot.

Detectamos dos bandas de cadena pesada y una banda débil de cadena ligera en estas dos líneas
de ratones Tg. También se detectó una única banda de 52 kDa en la célula CHO transfectada por
ADNc de hPC (Figura 4C).
Figura 4. Análisis de transferencia Western de hPC de las glándulas mamarias y la leche durante la lactancia.
(A) Detección de proteínas de las glándulas mamarias durante la lactancia; (B) El análisis de la cantidad de
hPC expresada en las glándulas mamarias; (C) Detección de proteína hPC evaluada en la leche de las líneas #
10 y # 11 mediante Western blot. SC: formas de hPC de cadena sencilla;HC: forma hPC de cadena pesada;
LC: formas de hPC de cadena ligera; CHO: hPC expresada en las células CHO transfectadas con cDNA de hPC.

2.4. Localización de la proteína hPC en la glándula mamaria

Para determinar los tipos de células que son responsables de la expresión de la proteína hPC en la glándula
mamaria, realizamos un análisis inmunohistoquímico los días 1, 7 y 15 durante la lactancia en ratones Tg de
las líneas # 10 y # 11. Como se muestra en la Figura 5A, los ratones Tg que expresan la proteína hPC se
localizaron principalmente en las células epiteliales alveolares de la glándula mamaria. También
determinamos la localización de hPC en células cultivadas de los tejidos de la glándula mamaria el día 7
durante la lactancia. Los datos mostrados en la Figura 5B indican que esta proteína se expresa fuertemente
en el citoplasma de células cultivadas que se originaron a partir de glándulas mamarias de ratones Tg.
Figura 5. Localización de la proteína hPC expresada en las glándulas mamarias durante la lactancia por
inmunohistoquímica y en las células de glándula mamaria de ratones Tg cultivadas por inmunofluorescencia.
(A) Inmunohistoquímica. Análisis inmunohistoquímicos representativos utilizando antisuero hPC (1: 1000) y
anticuerpos secundarios de cerdo anti-conejo (1: 1000). Se utilizó suero preinmune (1: 1000) como antisuero
primario como control negativo. Las secciones de la glándula mamaria se muestran los días 1, 7 y 15 durante
la lactancia. Barra negra = 100 μm. Las flechas indican células epiteliales alveolares de la glándula mamaria;
(B) Inmunofluorescencia en glándulas mamarias cultivadas de ratones Tg (línea # 10) el día 7 durante la
lactancia. La contra tinción se realizó con DAPI (azul). La expresión de hPC fue detectada por Alexa 488
(verde). La imagen combinada muestra los colores azul y verde.

2.5. Ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA)

Para analizar la cantidad de proteína rec-hPC en la leche de ratones Tg, realizamos un ELISA los
días 1, 7 y 15 durante la lactancia. Como se muestra en la Figura 6, rec-hPC en los ratones Tg de la
línea # 10 varió de 2 a 28 ng / mL Estaba por debajo de 4 ng / mL el día 1 y luego aumentó
considerablemente el día 7, y varió de 17 a 28 ng / mL el día 15. Por el contrario, el análisis de la
leche de la línea n. ° 11 el día 15 indicó que todas las muestras eran menos de 5 ng / mL.

Figura 6. La cantidad de rec-hPC en la leche de ratones Tg por ELISA. (A) rec-hPC en las líneas nº 10
analizadas por ELISA los días 1, 7 y 15 durante la lactancia; (B) análisis de hPC en la línea n. ° 11. Cada punto
y barra vertical representa la media y el error estándar de los valores medios (SE), respectivamente, para las
tres muestras diferentes.

3.Discucion

En el presente estudio, producimos con éxito hPC en las glándulas mamarias y la leche de ratones Tg. Esto se
confirmó mediante RT-PCR, transferencia Northern e inmunohistoquímica durante la lactancia. En este
estudio, se utilizó el sistema promotor de β-caseína de cabra para expresar el gen hPC. Establecimos cuatro
ratones transgénicos positivos, indicados # 10, # 11, # 15 y # 38. Sin embargo, solo las líneas # 10 y # 11 de
ratones Tg pudieron reproducirse (Figura 6A, B). Las hembras de ambas líneas (líneas # 10 y # 11) tuvieron
un crecimiento y fertilidad normales. Sin embargo, las líneas # 15 y # 38 no pudieron reproducirse. Esta
puede ser la razón del mosaicismo del gen insertado. Estudios previos han observado algo similar con
ratones Tg que expresan el gen hPC que no pueden lactar normalmente o criar camadas [12]. Estos defectos
no se encontraron en los ratones Tg de quinta a octava generación producidos en este estudio (ahora se
muestran los datos). Nuestra frecuencia de integración en los ratones fundadores fue del 6,6%, y eso fue
con una sola inyección. En total, se obtuvieron 26 cachorros de ocho receptores para una frecuencia de
integración del 27% [11]. Sin embargo, se observó una frecuencia de integración similar a la observada en
este estudio en ratones Tg que expresaban eritropoyetina humana dimérica [18].

El análisis de la expresión de ARNm indica que la expresión fue específica de las glándulas mamarias y fue la
más alta el día 7 durante la lactancia. Los resultados son muy similares a los de estudios previos que
informaron un pico en la expresión de ARNm de hPC en la mitad de la lactancia [8], y en el día 10 de
lactancia [6] para ratones Tg hPC. En el cerdo, el mRNA de hPC también se expresó en gran medida durante
la lactancia temprana y los días 35 y 55 [11]. Además, la expresión de ARNm de la hormona del crecimiento
humana bajo el promotor del gen de la β-caseína bovina solo estaba presente en las glándulas mamarias de
bovinos lactantes [19]. Además, Ebert et al. [20] sugieren que las glándulas mamarias contienen niveles muy
expresados de activador del plasminógeno tisular hasta la terminación de la tercera lactancia de 30 a 89 en
las cabras. Por tanto, coincidimos en que el uso del promotor de β-caseína puede ser útil para la producción
de material en la leche.

La expresión de la proteína hPC se detectó fuertemente en las glándulas mamarias de los ratones Tg nº 10.
Su expresión fue la más alta el día 7 durante la lactancia. Para la proteína rec-hPC expresada en la leche, se
observó tanto la cadena pesada como la cadena ligera a aproximadamente 41 y 21 kDa, respectivamente.
Además de estas dos bandas, había una sola banda a 52 kDa. Estas observaciones fueron consistentes con
informes anteriores para la expresión de rhPC [6,8,9,11,12]. La masa molecular de las supuestas formas de
cadena pesada de rec-hPC (35-38 kDa), cadena ligera (18-20 kDa) y cadena simple de rec-hPC
(aproximadamente 55-58 kDa) fue aproximadamente 2-3 kDa menor que el de hPC [11]. Esto puede deberse
a diferencias en el contenido y la estructura de carbohidratos. La rec-hPC contenía una población
significativamente mayor de material monocatenario que la hPC expresada de forma natural, lo que puede
indicar una limitación de la velocidad en la eliminación postraduccional del dipéptido Lys-Arg en las
posiciones 156 a 157 [21]. La proteína rhPC se localizó intensamente en las células epiteliales alveolares de
la glándula mamaria. También determinamos mediante inmunofluorescencia que la expresión de rec-hPC se
localizó en el citoplasma de células cultivadas de glándulas mamarias en el día 7 de lactancia. Esta
observación concuerda con datos previos que muestran la presencia de proteína rec-hPC en el epitelio
secretor y en la luz alveolar y ductal [8, 12]. Por lo tanto, sugerimos que rec-hPC se dirige correctamente y
experimenta una secreción normal por las células epiteliales mamarias. Nuestros resultados demuestran
que la expresión del gen hPC no tiene obviamente ningún efecto tóxico obvio en el glándulas mamarias de
ratones Tg.

Con respecto a los ratones Tg de la línea # 10, la cantidad de rec-hPC secretada en la leche el día 15 de
lactancia, según lo determinado por ELISA, fue de 15-28 ng / mL y el día 7 (8-22 ng / mL) . Sin embargo, la
cantidad de rhPC en la línea # 11 estaba por debajo de 5 ng / mL. La cantidad de hPC en las hembras Fo,
determinada por ELISA, fue de 1 a 75 μg / ml, que fue más baja que en generaciones posteriores (0,31 a 1,53
mg / ml). Esto puede deberse al mosaicismo de los fundadores [6]. La hPC genómica en ratones se
incrementó aproximadamente 200 veces de 0,5 a 3 μg / ml en los ratones con la construcción de cDNA [11]
a 0,1-0,7 mg / ml en los ratones con la construcción genómica [22]. En los cerdos, la hPC derivada del ADNc y
del genoma se secretó en cantidades similares (100–1800 μg / mL), y el nivel de expresión osciló entre 100–
400 μg / mL en el linaje consanguíneo para el transgén del ADNc [20]. Se generaron cerdos Tg que
produjeron rec-hPC en su leche hasta a 1 g / L [11]. Los niveles de rec-hPC en la leche oscilaron entre 40 y
1200 μg / ml [9]. Estas diferencias de expresión en las líneas de Tg pueden ocurrir debido a diferencias en el
promotor utilizado, la construcción del gen, el mosaicismo del gen insertado y el tipo de gen. En ratones, la
expresión de hPC indujo un fenotipo de lactancia anormal [4, 12] y se informó un fenotipo leve [23]. En el
presente estudio, no encontramos ningún cambio de fenotipo hasta la octava generación.