A juzgar por el alcance de la discusión sobre el fermentador y sus accesorios, se podría suponer

que consumen casi toda la inversión de capital en una industria de la fermentación. Sin embargo,
no sólo la inversión en equipos de recuperación es elevada, sino que los costos de aislamiento
representan una buena parte (a veces hasta el 60%) del costo del producto final. En una fábrica de
antibióticos, el equipo de recuperación cuesta cuatro veces más que el fermentador. El problema
central de la extracción de productos de la fermentación de la "cerveza" o del caldo es que el
producto requerido suele (aunque no siempre) formar una pequeña proporción de una mezcla
heterogénea compleja de restos celulares, otro producto metabólico y porciones no utilizadas del
medio. A continuación se indican los factores que hay que tener en cuenta para decidir el mejor
método de extracción que se ha de utilizar:

i) el valor del producto final; ii) el grado de pureza necesario para que el producto final sea
aceptable, teniendo en cuenta su potencial de generar ingresos; iii) las propiedades químicas y
físicas del producto; iv) la ubicación del producto en la mezcla, es decir, si está libre en el medio o
si está ligado a las células; v) la ubicación y las propiedades de las impurezas; y, por último; vi) la
eficacia en función de los costos o el atractivo económico de los procedimientos de aislamiento
alternativos disponibles. En el cuadro 10.1 se indican las diversas etapas seguidas en la extracción
de los productos de la fermentación, junto con el nivel aproximado de purificación obtenido en
cada una de ellas. El procedimiento seguido en cada etapa depende, por supuesto, del material
que se extraiga. El producto que se busca puede ser las propias células, como en la fabricación de
levadura, alojado en las células (como en la estreptomicina o en algunas enzimas), o libre en el
medio como en la penicilina.

Física de absorción y/o intercambio iónico

Extracción de solventes

Precipitación

Ultracentrifugación

3. Purificación 50-80

Precipitación fraccionada

Cromatografía (adsorción, partición, intercambio iónico, afinidad)

Derivatización química

Decoloración

4. Aislamiento del producto final 90-100

Cristalización

Secado

Eliminación de disolventes
10.1 ELIMINACIÓN DE SÓLIDOS (INSOLUBLOS) En general, el paso inicial separa los sólidos de la
fracción líquida, facilitando así los pasos de extracción posteriores, como la sorción, la extracción
de disolventes, que sería un desperdicio o casi imposible si las células no se separaran. Cuando el
producto requerido es sólido o se encuentra alojado en la porción insoluble, la extracción líquida
ayuda a concentrar los sólidos. En unos pocos casos, no se produce ninguna separación, como en
la fermentación de acetona butanol, en la que se utiliza toda la cerveza. En la mayoría de los casos,
sin embargo, los métodos de separación utilizados son la filtración, la centrifugación, la
decantación y el fraccionamiento en espuma. Cuando la fracción requerida se encuentra en las
células, entonces gran parte de las impurezas se eliminan con el filtrado después de que las células
han sido aisladas. 10.1.1 Filtración El filtro rotativo de vacío: Uno de los filtros más utilizados en la
industria es el filtro rotativo de vacío, disponible en varias formas. Esencialmente, el filtro consiste
en un cilindro rotativo hueco dividido en cuatro partes y cubierto con una gasa de metal o de tela.
Se aplica un vacío en el cilindro y, a medida que éste gira, el vacío aspira materiales líquidos de la
fosa poco profunda en la que está sumergido el cilindro rotativo. En el caso de los lodos espesos
difíciles de filtrar (por ejemplo, los caldos de aminoglucósidos), se deja que primero se absorba en
el cilindro una fina capa de medio filtrante (por ejemplo, Kieselguhr). Más tarde, se permite que el
cilindro filtrante con su fina capa de coadyuvante de filtración gire en la artesa en la que ahora se
coloca el caldo. Con el vacío todavía aplicado, el cilindro giratorio se lava con un chorro de agua;
un cuchillo cuyo filo se coloca justo debajo de la capa de ayuda al filtrado raspa los sólidos
recogidos del caldo. Cuando se utiliza para caldo de fácil filtración, como en el caldo de penicilina,
no se utiliza ningún auxiliar de filtración. En su lugar, un arreglo de cuerdas junto con una
liberación del vacío en el segmento del cilindro ayuda a liberar el material recogido del caldo.
Filtros tipo anillo y alambre: Estos filtros consisten en un revestimiento de tierra de diatomeas
sobre una malla de alambre soportada por un marco de varillas de metal. El líquido a filtrar se
introduce a una presión de 75 p.s.i. en lugar de hacerlo al vacío como en el filtro rotativo de vacío.
Se utilizan cuando la carga es ligera como para pulir la cerveza o los zumos de fruta. Se pueden
limpiar con un retrolavado con agua. 10.1.2 Centrifugación La centrifugación no se utiliza
ampliamente para la separación primaria de sólidos del caldo en la cerveza de fermentación
debido al grosor de estos lodos y al hecho de que muchas industrias han funcionado con éxito con
filtros. Sólo en unos pocos casos, una centrífuga es capaz de deshidratar un caldo hasta un punto
cercano al que lo haría un filtro. Sin embargo, en la industria del aislamiento de enzimas, se
prefiere la centrifugación a la filtración, probablemente porque los desechos celulares no
deseados se eliminan con bastante eficacia por este método. Una nueva industria de fermentación
o un cambio en el método de producción de los antiguos procesos puede requerir el uso de
centrifugadoras para la separación primaria. 10.1.3 Coagulación y floculación La coagulación es la
cohesión de coloides dispersos en pequeños bandos; en la floculación, estos bandos se agregan
para formar masas más grandes. La primera es inducida por electrolitos y la segunda por
polielectrolitos de alto peso molecular y compuestos solubles en agua que pueden obtenerse en
forma iónica, aniónica o catiónica. Las bacterias y las proteínas, al ser coloides cargados
negativamente, son fácilmente floculadas por electrolitos o polielectrolitos. A veces se puede
utilizar arcilla o carbón activado. El efecto neto de la floculación es que la eliminación de coloides
facilita la filtración. Incluso puede ser posible simplemente decantar el sobrenadante, una vez que
bandadas suficientemente grandes remueven la porción sólida de la "cerveza". Cuál y cuánto de
los diversos floculantes a utilizar, debe ser resuelto por la experimentación. Como la floculación
depende de las características de la pared celular, los agentes deben cumplir los siguientes
requisitos, especialmente si son las células y no el líquido los productos requeridos. Los floculantes
deben tener las siguientes propiedades. i) Deben reaccionar rápidamente con las células. ii) Deben
ser no tóxicos. iii) No deben alterar los componentes químicos de la célula. iv) Deben tener un
poder cohesivo mínimo a fin de permitir la posterior eliminación efectiva del agua por filtración. v)
Su adición no debe dar lugar a una elevada acidez ni a una elevada alcalinidad. vi) Deben ser
eficaces en pequeñas cantidades y de bajo costo. vii) Deben ser preferentemente lavables para su
reutilización.

10.1.4 Fraccionamiento de la espuma El principio general del fraccionamiento de la espuma es que

en un sistema de espuma líquida, la composición química en el líquido a granel suele ser diferente
de la composición química en la espuma. La espuma se forma esparciendo el líquido a granel que
contiene la sustancia que se va a fraccionar con un gas inerte. El gas se alimenta en la parte
inferior (Fig. 10.1) de una torre y la espuma creada se desborda en la parte superior llevando
consigo los solutos a ser fraccionados. En los líquidos que no forman espuma se pueden añadir
tensioactivos o (sustancias activas de superficie que reducen la tensión superficial, por ejemplo, el
teepol). Este método se ha utilizado para recoger una amplia gama de microorganismos. 10.1.5
Tratamiento del caldo entero En algunas fermentaciones, como la de acetona-butanol, el caldo
entero sin separar se despoja de su contenido en el producto requerido. En la industria de los
antibióticos se logró una situación similar antes de que fuera posible absorber directamente los
antibióticos estreptomicina (utilizando una resina de intercambio catiónico) y novobiocina (sobre
una resina aniónica). Los antibióticos se eluyen de las resinas y luego se cristalizan. Este proceso
ahorra el capital y los gastos recurrentes de la separación inicial de los sólidos del caldo. 10.2
AISLAMIENTO PRIMARIO DEL PRODUCTO Después de la separación del caldo en fracciones
solubles e insolubles, el siguiente proceso depende de la ubicación del producto deseado de la
siguiente manera: las propias células, como en las levaduras, pueden ser el producto deseado; se
secan o refrigeran y el líquido se desecha. Otros tratamientos, como el secado, se tratan más
adelante en el capítulo

El producto requerido puede estar ligado al micelio o a las células bacterianas, como en el caso de
las enzimas o los antibióticos ligados. Las células tienen que ser interrumpidas de cualquiera de las
diversas maneras disponibles: calor, interrupción mecánica, etc. Los desechos celulares se
eliminan ahora por centrifugación, filtración o cualquiera de los otros métodos de eliminación de
sólidos descritos anteriormente. Si el material está disponible extracelularmente o si se ha
obtenido por lixiviación con o sin disrupción celular, se trata por uno de los siguientes métodos:
extracción líquida, extracción por disociación, sorción o precipitación. 10.2.1 Disrupción celular
Deben liberarse moléculas biológicas dentro de la célula. Esto se logra mediante la disrupción
celular (lisis). La disrupción celular es un proceso sensible debido a la resistencia de la pared
celular a la alta presión osmótica en su interior. Además, las dificultades surgen de una disrupción
celular no controlada que resulta de una liberación sin obstáculos de todos los productos
intracelulares (proteínas, ácidos nucleicos, desechos celulares), así como de los requisitos para la
disrupción celular sin la desnaturalización del producto deseado. 10.2.1.1 Métodos mecánicos
Cuando el material objetivo es intracelular, los microorganismos son perturbados principalmente
por la disrupción mecánica de las células. El equipo para la disrupción celular incluye: i)
Homogeneizadores. Éstos bombean lodos a través de orificios o válvulas restringidos a una presión
muy alta (hasta 1500 bar) seguida de una expansión instantánea a través de una boquilla de salida
especial. La caída repentina de la presión en el momento de la descarga provoca una explosión de
la célula. El método se aplica principalmente para la liberación de moléculas intracelulares. ii)
Molinos de bolas. En un molino de bolas, las células se agitan en suspensión con pequeñas
partículas abrasivas. Las células se rompen debido a las fuerzas de cizallamiento, la molienda entre
las bolas y las colisiones con las bolas. Las cuentas interrumpen las células para liberar las
biomoléculas. iii) Alteración ultrasónica. Este método de lisis celular se logra con un sonido de alta
frecuencia que se produce electrónicamente y se transporta a través de una punta metálica a una
suspensión celular apropiadamente concentrada. Es costoso y se utiliza principalmente en
laboratorios. 10.2.1.2 Métodos no mecánicos La permeabilización de las células puede provocar su
disrupción por diversas vías: i) Permeabilización química: Se han empleado muchos métodos
químicos para extraer los componentes intracelulares de los microorganismos permeabilizando (es
decir, haciéndolos permeables) las barreras de la pared exterior. Puede lograrse con disolventes
orgánicos que actúan mediante la creación de canales a través de la membrana celular: tolueno,
éter, alcohol feniletílico DMSO, benceno, metanol o cloroformo. La permeabilización química
también puede lograrse con antibióticos, tioninas, surfactantes (Triton, Brij, Duponal), agentes
caótropos y quelatos. Un producto químico muy importante es el EDTA (agente quelante) que se
utiliza ampliamente para la permeabilización de microorganismos Gram negativos. Su eficacia es el
resultado de su capacidad para unir los cationes divalentes de Ca++, Mg++. Estos cationes
estabilizan la estructura de las membranas externas uniendo los lipopolisacáridos entre sí. A través
de la eliminación de estos cationes, el EDTA, aumenta las áreas de permeabilidad de las paredes
exteriores. ii) Permeabilización mecánica: Un método de permeabilización mecánica es el choque
osmótico. Si bien las células expuestas a una presión osmótica extracelular que varía lentamente
suelen ser capaces de adaptarse a esos cambios, las células expuestas a cambios rápidos de
osmolaridad externa pueden sufrir lesiones mecánicas. Este procedimiento se lleva a cabo
normalmente permitiendo primero a las células equilibrar la presión osmótica interna y externa en
un medio con alto contenido de sacarosa y luego diluyendo rápidamente la sacarosa. Se supone
que la sobrepresión inmediata resultante del citosol daña la membrana celular. Se cree que las
enzimas liberadas por este método son periplásmicas o por lo menos están localizadas cerca de la
superficie de la célula. iii) Permeabilización enzimática: Las enzimas también pueden emplearse
para permeabilizar las células, pero este método suele limitarse a liberar enzimas periplásmicas o
de superficie. En estos procedimientos se suele utilizar el EDTA para desestabilizar la membrana
exterior de las células Gram negativas, haciendo que la capa de peptidoclycan sea accesible a la
enzima utilizada. Las enzimas utilizadas para la permeabilización enzimática son: beta (1,6) y beta
(1,3) glicanasas, proteasas y mananasas. 10.2.2 Extracción líquida También conocida como
extracción con disolvente o extracción líquido-líquido, este procedimiento se utiliza ampliamente
en la industria para transferir un soluto de un disolvente a otro en el que es más soluble. También
puede utilizarse para separar los sólidos solubles de la mezcla con material insoluble mediante un
tratamiento con un disolvente. La ley en la que se basa la extracción líquido-líquido establece que
cuando un soluto orgánico se expone a un sistema líquido inmiscible de dos fases, la relación de la
concentración del soluto en las dos fases es constante para una temperatura determinada. Esta
relación, K, es el coeficiente de reparto o distribución, dado como: K = C1 /C2 donde C1 y C2 son
las concentraciones en la fase 1 y la fase 2, respectivamente. Sin embargo, la ecuación es efectiva
para soluciones diluidas, pero no para soluciones muy concentradas. La selectividad de una
solución disolvente se indica por la relación de los coeficientes de distribución de los componentes
en cuestión. Los disolventes que se utilicen realmente dependerán de una serie de factores, entre
los que se incluyen las propiedades de distribución del soluto en ellos, la volatilidad, la facilidad de
recuperación y el coste. En este método, el caldo que se va a extraer se agita con un disolvente
hidrofóbico (es decir, uno que no se mezcle con el agua), se deja que se asiente y se elimina el
disolvente que debería contener más del material que se va a extraer. Esto puede hacerse a
pequeña escala de laboratorio en embudos de separación o en un tanque agitado en la industria.
La separación puede hacerse en un tanque agitado de una de varias maneras (Fig. 10.2): 1) por
lotes en un solo tanque y el disolvente con su soluto drenado, o 2) de forma continua con un
tanque de mezcla y asentamiento. Se logran extracciones más eficientes con la adición continua de
disolvente en (3) una disposición de corriente cruzada en la que los sucesivos extractos de
disolvente se diluirán progresivamente más o en (4) un modo de contracorriente en el que se logra
una extracción eficiente con menos uso de disolvente

In chromatography, the components of a mixture of solutes migrate at different rates on a solid

because of varying solubility levels of the solutes in a particular solvent. The mixture of solutes is
introduced (usually as a solution) at one end of the solid phase, and the solvent (i.e. the solution
which separates the mixture) flows through this initial point of the mixture application.
Fermentation products are separated by any of the following chromatographic methods with the
reasons for separation of the solids given in each one of them: (i) Adsorption chromatography:
(e.g. paper chromatography) variations in the weak (Van der Waal) forces binding solutes to the
solid phase; (ii) Partition chromatography: A mobile solvent is passed through a column containing
an immobilized liquid phase; the solvent and immobilized liquid phases are immiscible. Separation
occurs by the different distribution or partition coefficients of the solutes between the mobile and
immobilized liquid phases. 180 Modern Industrial Microbiology and Biotechnology (iii) Ion
exchange chromatography: The difference in the strength of the chemical bonding between the
various solutes and the resin constitutes the basis for this method. (iv) Gel filtration: This depends
on the ability of molecules of different sizes and shapes to permeate the matrix of a gel swollen in
the desired solvent. The gel can be considered as containing two types of solvent: one within the
gel particle and one outside it. Large particles which cannot penetrate the gel appear in the
column effluent after a volume equivalent to the solvent outside the gel has emerged from the
column. Small molecules which permeate the matrix appear in the effluent after a volume
equivalent to the total liquid volume within the matrix has emerged.