SEPARACION DE AMINOACIODOS POR CROMATROGRAFIA

Luisa F. Montes Durango, Estefany P. Pérez Avilez, Aura M. Pérez Álvarez, Joaquín J. Esquivel
Vergara, Jose A. Muñoz Barón

RESUMEN
La cromatografía es una técnica de análisis químico cuyo objetivo es la separación de sustancias

puras en mezclas complejas. En la cromatografía de papel una muestra liquida (fase móvil) fluye

por una línea vertical de papel (fase estacionaria). En esta práctica se utilizó la treonina, valina y

lisina como muestras de referencia, durante el proceso se tomó una tira de papel donde se

marcaron los puntos donde se siembran las muestras, luego en un bicker se agregó solvente de

cromatografía justo por debajo de la línea marcada y se introdujo el papel para posteriormente

sellarse la cámara cromatográfica. Cuando el frente del solvente alcanzo la distancia total de su

recorrido, se retiró el papel cromatográfico y se llevó a la estufa durante cinco minutos para secar

el solvente y así poder revelar con la ninhidrina, volverse a someter a calor por otros cinco

minutos para revelar las manchas respectivas para la identificación de cada aminoácido.

Palabras clave

Ninhidrina, Aminoácidos, papel cromatográfico, solvente, fase móvil, fase estacionaria

1- INTRODUCCIÓN

Los aminoácidos son unidades o monómeros que están formados por un carbono quiral con sus

cuatro valencias completas por un grupo amino, un grupo carboxilo, un hidrogeno y una cadena

carbonada, a partir de las cuales se constituyen cadenas polipectidicas de proteínas, existen

alrededor de 300 aminoácidos hallados, pero, solo 20 de ellos se encuentra con mayor frecuencia

en las proteínas de los cuales algunos pueden ser sintetizados de manera natural por el organismo.

En esta práctica se lleva a cabo la separación de aminoácidos mediante la aplicación de él método

de cromatografía en papel, analizados por medio del cálculo de los respectivos RF. El uso de la

cromatografía de papel para la identificación y separación de aminoácidos es de gran importancia

ya que la separación implica que los aminoácidos cuya cadena lateral (R) tengan un carácter más

apolar, tendrán tendencia con la fase móvil, mientras que los aminoácidos que sean polares serán

retenidos por la fase estacionaria.

En esta práctica se realizó una de las prácticas más sencillas para la identificación de aminoácidos

que fue la combinación de la cromatografía con la reacción de la ninhidrina con el que podemos

identificar los aminoácidos por la tinción de un color. El papel que se utilizó para la

cromatografía fue “WHATMAN n1” que está fabricado con celulosa pura y fibras de celulosa

para intercambio iónico, que permiten separaciones eficientes y rápidas de sustancias orgánicas o

inorgánicas cargadas.

La cromatografía se engloba dentro de las llamadas técnicas de separación y permite el análisis

de mezclas complejas de compuestas muy estrechamente relacionadas químicamente con

referencia de una solución patrón que es una solución de la cual se conocen todos sus

componentes. La separación se lleva acabo según la distinta interacción que presenta cada uno de

los componentes de una muestra respecto a dos fases: una estacionaria y una móvil que fluye

sobre ella. Esta interacción puede ser de varios tipos que a su vez dan lugar a distintas subclases

de cromatografía: de absorción, de reparto, de cambio iónico, de afinidad etc.

En general podríamos decir que nuestro objetivo es determinar la presencia de los aminoácidos

presentes en la muestra y establecer una relación con los estándares utilizados.

 1. MATERIALES Y METODOS

Materiales

- Papel de filtro (Whatman no.1)

- Muestra (solución de aminoácidos)

- Soluciones estándar de aminoácidos (0,1M)

- Solvente: mezclar en volúmenes 100 partes de n-butanol, 30 partes de ácido fórmico y 25

partes de agua.

- Revelador: solución de ninhidrina al 0,1% en acetona

- Cámara cromatográfica

- Tubos capilares

- Estufa a 100° C

- Nebulizador
 Métodos

Se procedió cortando el papel con las dimensiones dadas, luego se trazó con lápiz al largo de una

de las extremidades a 2,5 cm de los bordes, se siguió marcando distintos puntos con distancias

adecuadas a lo largo de la raya en la cual se aplicaron las muestras y los entandares por medio de

los capilares a ± 0,5 cm de diámetro de solución de aminoácidos. Luego se efectuó la formación

de un cilindro con el papel de filtro.

Se continuó introduciendo el cilindro en la cámara cromatográfica, con las debidas precauciones

para evitar que el solvente tuviera contacto con las manchas que se formaron con los puntos de

muestra. Se selló la cámara y se tuvo un tiempo de espera de ± 1 hora, ya transcurrido el tiempo

de espera se retiró el papel y se determinó la altura recorrida por las muestras y el solvente. Se

sometió a calor en la estufa y luego se hizo la revelación con la ninhidrina, se sometió a calor por

segunda vez para ser reveladas las manchas que señalarían la presencia de aminoácidos.
 2. RESULTADOS

Luego de la revelación con la ninhidrina se obtuvieron los siguientes resultados:

Distancia recorrida por cada sustancia

d1 = 1,45 cm → Treonina

d2 = 2,5 cm → Valina

d3 = 1,5 cm → Lisina

d41 = 1,4 cm → Muestra

d42 = 2,4 cm → Muestra

Distancia recorrida por el solvente

ds = 5,3cm
 3. DISCUSIÓN

Se procede a calcular los Rf de cada patrón y de la muestra para así determinar de manera clara y

segura cuales son los aminoácidos presentes en nuestra muestra.

d muestra
Rf =
d solvente

d 1 1,45 cm
Rf1 = = = 0,27
d s 5 ,, 3 cm

d 2 2,5 cm
Rf2 = = = 0,47
d s 5,3 cm

d 3 1,5 cm
Rf3 = = = 0,28
ds 5 cm

d 41 1,4 cm
Rf41 = = = 0,26
ds 5,3 cm

d 42 2,4 cm
Rf42 = = = 0,45
ds 5,3 cm

En el laboratorio se realizó una cromatografía en papel con los aminoácidos Valina, Treonina y

lisina estos fueron puestos a una distancia de más o menos 1.5cm entre ellas evitando que se

mezclaran y junto a ellas una mezcla de aminoácidos a la cual se le pretendía hallar los

componentes. El papel con las siembras se colocó en un vaso de precipitado al cual luego se le

agregó el soluto a una distancia considerable de las muestras para que estás no fuesen arrastradas

por el líquido el cual pasados unos minutos ascendió por capilaridad como técnica ascendente

arrastrando los distintos aminoácidos siendo los más afines al soluto arrastrados a una mayor

altura de donde se encontraba la siembra, una vez el soluto ascendió lo suficiente se sacó el papel

del vaso de precipitado y se llevó a una estufa donde se secó para posteriormente adicionarle el
revelador de Ninhidrina 0.2% el cual al reaccionar con el grupo Alfa-amino de los aminoácidos

forma complejos coloreados  que varían entre violeta y azul pero que, solo fueron visibles luego

de secar el papel en la estufa lo que nos permitió ver dónde exactamente se encontraban los

aminoácidos contenidos en la mezcla determinando así de cuáles se trataba utilizando la

referencia de los aminoácidos conocidos comparando las manchas reveladas.

Aminoácido Rf exp Rf teórico

Treonina 0,28 0,35

Valina 0,47 0,60

Lisina 0,27 0,14

 4. CONCLUSIONES

Se puede evidenciar que la cromatografía de papel es uno de los métodos más sencillos y

eficaces al momento de realizar la identificación de aminoácidos presentes en una muestra

siguiendo respectivos patrones lo cual nos permitió de manera clara lograr evidenciar que la

mezcla o muestra que trabajamos en el laboratorio se encontraba compuesta por 2 patrones

respectivos de aminoácidos como lo son la Treonina y la Valina dado que según los cálculos del

Rf son los que más coinciden con los patrones.

d 1 1,5 cm d 41 1,5 cm
Rf1 = = =0,30= Rf41= = = 0,30
d s 5 cm ds 5 cm

d 2 2,7 cm d 42 2,7 cm
Rf2 = = =0,54=Rf42= = = 0,54
d s 5 cm ds 5 cm

Denotando así la eficacia de este método al momento de la identificación de las sustancias que

componen una muestra.

 5. REFERENCIAS

Rodrigues-Sotres, Rogelio. La estructura de las proteínas.

Lehninger, 2000. Principios de bioquímica Omega, Barcelona.

Raymond Chang, 2007. Bioquímica.

Méndez, 2001 .Experimentos básicos de bioquímica. 1era ed. México, D.F.: prado.

Pratt, 2012. Bioquímica. 1era ed. México D.F.: Manual Moderno.