Instructivo.

Determinación de la curva de calibración de cafeína a partir de diluciones

1) Todo el Material de Vidrio a utilizar debe estar previamente lavado y secado.

2)Etiquetar los tubos de ensaye, del 1 al 6, denominando al tubo 1 como el blanco.
 a) Preparación de la solución madre
3) Pesar 30 mg de cafeína pura el cual se proporcionará por el asesor. Se debe
pesar en una balanza analítica previamente calibrada.
4) Una vez pesado la cantidad de 30 mg de cafeína, se debe transferir en un vaso
de precipitado de 100 mL, agregar agua, y mezclar con el agitador de vidrio, ir
vertiendo poco a poco agua, y seguir agitando, hasta obtener una mezcla
homogénea.
5) Una vez que la mezcla se haya disuelto totalmente, trasvasar la solución en un
matraz volumétrico de 100 mL, y aforar.
 b) Preparación de sistemas para la curva de calibración.
6) Utilizando matraces volumétricos de 10 mL, así como pipetas volumétricas de
diferente volumen (1 mL, 2 mL, 3 mL, 4 mL y 5 mL), preparar cada uno de los
sistemas siguientes a partir de la solución madre.
-El sistema 1 se considerará como el blanco, en un matraz volumétrico de 10 ml,
agregar 10 mL de agua.
-En el sistema 2, se agregará 1 mL de solución madre en un matraz volumétrico
con la pipeta del volumen solicitado y después aforar a 10 mL con agua.
-Sistema 3: agregar 2 mL de solución madre en un matraz volumétrico y realizar el
aforo a 10 mL, con agua.
-Sistema 4: agregar 3 mL de solución madre en otro matraz volumétrico y aforar a
10 mL de agua
-Sistema 5: agregar 4 mL de solución madre en un matraz volumétrico y aforar a
10 mL de agua
-Sistema 6: agregar 5 mL de solución madre en un matraz volumétrico y aforar a
10 mL de agua.
7) Una vez preparados los sistemas, se deben trasvasar cada uno a un tubo de
ensaye que previamente ya se habían etiquetado.
Calibración del instrumento

8) Realizar la calibración del instrumento (espectrofotómetro) de acuerdo con el

instructivo anexo.

c) Obtención del espectro de absorción. Determinación de la longitud de

onda óptima

9) Con el sistema 6, que es el más concentrado, determinar la longitud de onda

óptima, construyendo un gráfico en donde la absorbancia está en función de la
longitud de onda en un intervalo de 400 a 600 nm con incrementos de 20 nm.
Nota: para cada cambio de sistema es necesario calibrar el equipo con el blanco
llevándolo a cero de absorbancia.
10) Tomar lectura de cada uno de los sistemas preparados, iniciando con el
sistema más diluido al más concentrado, enjuagando la celda de lectura con el
sistema siguiente (más concentrado). a la longitud de onda óptima obtenida en la
parte anterior y manteniéndola constante.

11)Desechar a la tarja con abundante agua sus muestras de cafeína, y lavar muy
bien el material utilizado.

d) Determinación de la curva de calibración de cafeína.

12) Construya una gráfica de absorbancia contra concentración molar de cafeína.

13) Compruebe en qué intervalo hay linealidad para comprobar que la ley de Beer
se cumple. (La absorbancia de una sustancia o especie es directamente
proporcional a la concentración de la misma).
14) Obtenga la ecuación de la recta y el coeficiente de correlación para ver que
tan bien se ajustan sus datos a la línea recta.
15) Realizar una regresión lineal en donde R tiene que ser muy cercano a 1.
-En caso de que se llegue a obtener un punto en la recta en el cual de disperse de
los otros datos y se llegue a obtener una R menor a 0.99 se tiene que rectificar
ese punto, y de ser necesario volver a preparar el tubo el cual se tiene el dato
erróneo, rectificando que se haya lavado bien el material, y agregado la cantidad
exacta de los reactivos. Se debe volver a leer la absorbancia de dicho tubo, y
rectificar el dato de la absorbancia, para observar si hay linealidad, de no ser el
caso, el dato se considera como erróneo y no se considera.
16)Una vez obteniéndose una R cercana a 1, se puede obtener la ecuación de la
línea recta el cual predice los valores de concentración a partir de los valores de
absorbancia. el R correspondiente al coeficiente de variación al cuadrado, debe
2

ser al menos de 0.99.