UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO

Facultad de Estudios Superiores Cuautitlán

Laboratorio de Enseñanzas de Desarrollo Farmacéutico (LEDEFAR)
Sección de Tecnología Farmacéutica

Fecha: 23 de febrero de 2018 Número de versión: BFL2601-2

Vigencia: 2018-ll Código: UNAMBIOLF2018

Vencimiento: 2019-l

“Instructivo para la Elaboración de una Curva de

Calibración Espectrofotométrica a partir de una
Solución Madre de Cafeína en Agua”

Autorización

 José Antonio Garduño Rosas ___________________

Firma y fecha

 María Guadalupe Rebollar Barrera ____________________

Firma y fecha

Realización del Protocolo EQUIPO #2

 Bautista Alvarado Julio Cesar

 Quillo Duarte María del Carmen
 Sánchez Valencia Odeth Suhey
 Velasco Reyes Viviana Cristina

Lugar de realización

Av. 1ro de mayo s/n, Santa María las Torres, CP:54740, Cuautitlán Izcalli, México
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“Instructivo para la Elaboración de una Curva de Calibración Espectrofotométrica a partir de una Solución
Madre de Cafeína en Agua”

Fecha: 23/02/18 Vigencia:2018-ll Código: UNAMBIOLF2018 Versión: BFL2601-2

Determinación de la curva de calibración de cafeína a partir de diluciones

1) Etiquetar los tubos de ensaye, secos y limpios, del 1 al 6, denominando al

tubo 1 como el blanco.
a) Preparación de la solución madre de cafeína 30 mcg/ml

2) Pesar 30 mg aproximadamente bien conocido de sustancia de referencia de

cafeína en un vaso de precipitado de 100 ml limpio y seco.
3) Agregar 20 mL de agua, y mezclar con el agitador de vidrio, ir vertiendo
poco a poco agua, y seguir agitando, hasta obtener una mezcla
homogénea.
4) Una vez que la mezcla se haya disuelto totalmente, trasvasar la solución en
un matraz volumétrico de 100 mL, y aforar con agua, tapar y agitar.
5) Tomar 10 ml con una pipeta volumétrica de la solución anterior y transferir a
un matraz volumétrico de 100 mL limpio y seco, llevar a la marca de aforo
tapar y agitar

b) Preparación de sistemas para la curva de calibración.

6) Utilizando matraces volumétricos de 25 mL, así como pipetas volumétricas

de diferente volumen (1 mL, 2 mL, 3 mL, 4 mL y 5 mL), preparar cada uno
de los sistemas siguientes a partir de la solución madre.
 Solución 1: se considerará como el blanco, agregar únicamente agua.
 Solución 2: agregar 1 mL de solución en un matraz volumétrico de 25 ml
con la pipeta del volumen solicitado, aforar con agua después tapar y agitar
 Solución 3: agregar 2 mL de solución en un matraz volumétrico de 25 ml
con la pipeta del volumen solicitado, aforar con agua después tapar y agitar
 Solución 4: agregar 3 mL de solución en otro matraz volumétrico de 25 ml
con la pipeta del volumen solicitado, aforar con agua después tapar y agitar
 Solución 5: agregar 4 mL de solución madre en un matraz volumétrico de
25 ml con la pipeta del volumen solicitado, aforar con agua después tapar y
agitar
 Tubo 6: agregar 5 mL de solución madre en un matraz volumétrico de 25
ml con la pipeta del volumen solicitado, aforar con agua después tapar y
agitar.

 NOTA: Cada solución se prepara por triplicado.

Calibración del instrumento

7) Realizar la calibración del instrumento (espectrofotómetro) utilizando celdas
de cuarzo, colocar únicamente agua en ambas celdas tomar lectura y la
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Madre de Cafeína en Agua”

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que marque la menor absorbancia, esa celda será la utilizada para la

lectura de la curva.
Obtención del espectro de absorción. Determinación de la longitud de onda
óptima
8) Con la solución de 30 mcg/ml, determinar la longitud de onda óptima,
construyendo un gráfico en donde la absorbancia está en función de la
longitud de onda en un intervalo de 200 a 350 nm

9) Tomar lectura de cada una de las soluciones preparados seleccionándolos

de manera aleatoria, enjuagando la celda de lectura con el sistema
siguiente, a la longitud de onda óptima obtenida en la parte anterior y
manteniéndola constante. Realizar este paso para las 15 soluciones.

10) Desechar a la tarja con abundante agua las soluciones de cafeína, lavar y
secar el material utilizado.

Determinación de la curva de calibración de cafeína.

11)Una vez obtenidos las absorbancias por triplicado de cada solución obtener
el promedio en cada caso.
12)Construya una gráfica de absorbancia contra concentración (mcg / ml) de
cafeína utilizando los promedios de absorbancia.
13) Compruebe en qué intervalo hay linealidad para comprobar que la ley de
Beer se cumple. (La absorbancia de una sustancia o especie es
directamente proporcional a la concentración de la misma).
14)Obtenga la ecuación de la recta y el coeficiente de correlación para ver que
tan bien se ajustan sus datos a la línea recta.
15)Realizar una regresión lineal en donde el coeficiente de correlación (R)
tiene que ser muy cercano a 1.

En caso de que se llegue a obtener un punto en la recta en el cual de disperse de

los otros datos y se llegue a obtener una R menor a 0.99 se tiene que rectificar
ese punto, y de ser necesario volver a preparar la solución de que se tiene el dato
erróneo, rectificando que se haya lavado bien el material, y agregado la cantidad
exacta de los reactivos. Se debe volver a leer la absorbancia de dicha solución, y
rectificar el dato de la absorbancia, para observar si hay linealidad.

16)Una vez obteniéndose una R cercana a 1, se puede obtener la ecuación de

la línea recta el cual predice los valores de concentración a partir de los
valores de absorbancia. el R correspondiente al coeficiente de correlación
2

al cuadrado, debe ser al menos de 0.99.

17)Calcular la constante de proporcionalidad, desviación estándar y el
coeficiente de variación (%CV) con los datos obtenidos
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Un valor bajo (menor al 2%) de %CV nos permite afirmar casi con certeza la
precisión del método.

Mientras mayor sea la desviación estándar, mayor será la dispersión de los datos.
18)Interpolar la concentración y la absorbancia a través de la ecuación de la
recta para conocer valores estimados.
19)Calcular el poder predictivo a través de la ecuación:
A
c= Donde
εl
C= concentración estimada

A= absorbancia

εl= pendiente de regresión lineal

20)Calcular el porcentaje de absorbancia y concentración a través de la
formula

%A=(A→ - Aexp / Aexp ) 100 %C =(C→ - Creal / Creal ) 100

Donde Donde

% A = Error de absorbancia % C = Error de concentración

A→ = absorbancia estimada C→ = concentración estimada

Aexp = absorbancia experimental Cexp = concentración real

NOTA: Si todos los parámetros se cumplen , se considera una excelente curva de

calibración.