VIRUS

miércoles, 26 de agosto de 2020 16:49

1. Estructural Viral
Los virus son partículas submicroscópicas, que no pueden ser vistas en un microscopio óptico (de luz), los virus más grandes miden
alrededor de 300 nanometros. Son parásitos intracelulares estrictos, a pesar de que pueden permanecer en el ambiente, no se pueden
multiplicar ahí, podrán hacerlo dentro de la célula hospedera infectada utilizando parte de la maquinaria metabólica de la cé lula ya que
carecen de ciertos factores.
Es importante estudiarlos porque son importantes patógenos con impacto en la salud humana.
Conocer la estructura de un virus, sirve para hacer diagnóstico (identificar proteínas o secuencias de genoma), permite diseñar vacunas,
permite conocer los mecanismos del virus para su control.
Estructura viral:
1. Ácido nucleico: DNA o RNA
Clasificación de Baltimore: ordena a los virus según su material genético

Grupo I: virus con DNA de doble hebra, con polaridad positiva y negativa (adenovirus)
Grupo II: Virus con polaridad positiva
Grupo III: virus RNA doble hebra
Grupo IV: virus RNA polaridad positiva (VIH, SARS Covid 2)
Grupo V: Virus RNA polaridad negativa (Influenza)
Grupo VI: Virus RNA polaridad positiva, con transcripción reversa
Grupo VII: Virus con DNA doble hebra, con transcripción reversa

2. Proteínas estructurales (protección del genoma y ensamblaje de cubierta estable) y no estructurales (replicación y transport e del
genoma, fraccionamiento de proteínas, interacción con receptores) : entre las proteínas estructurales esta la cápside, cubierta
proteica que está formada por una o más subunidades de proteínas, que están protegiendo al genoma del virus , dependiendo de
cómo se asocie es la forma que tomaran, pudiendo ser virus de simetría icosaédrica, helicoidal o compleja.
• Simetría icosaédrica: posee una cápside altamente estructurada que posee 20 caras triangulares, cuando se encuentra el ácido
nucleico en su interior se conoce como nucleocápside del virus.(VPH, adenovirus, Virus herpes simplex)
• Simetría helicoidal: la cápside rodea al ácido nucleico como un espiral formando la forma helicoidal pudiendo ser rígida (vir us del
mosaico del tabaco) o flexible (influenza). (SARS Covid 19)
• Simetría compleja: no tienen patrón geométrico (Viruela, molusco contagioso, Poxvirus, Bacteriofagos)
3. Algunos poseen envoltura o manto con lípidos e hidratos de carbono: responsable de formas pleomórficas; esféricas y filamentosas.
Los lípidos son capturados de la célula hospedera que infectan (no son capaces de sintetizar lípidos). Aquellos que presentan esta capa
lipídica son denominados, virus envueltos o con manto. Los virus desnudos son más resistentes a condiciones ambientales, teniendo
generalmente mecanismos más largos.

2. Replicación Viral
Tiene 6 etapas distintas:
1.- Adsorción: durante esta existe una interacción entre el virus una célula hospedera, siendo altamente específica. Esta interacción ocurre
entre el ligando viral y el receptor de la célula. Es altamente específica y determinará el grado de hospedero y de tropismo viral. Los
receptores son proteínas o glicoproteínas que tienen importantes funciones biológicas celulares, los virus han "aprendido" a reconocer
receptores específicos de sus células blanco. Puede ser inhibida por anticuerpos antivirales (neutralización) o anticuerpos antirreceptor,
2.- Penetración: la partícula viral entra dentro de la célula hospedera, a través de dos posibles mecanismo según el tipo de virus.
• Viropexia o endocitosis: los virus pueden entrar a través de los mecanismo endocíticos de la célula (mediada por clatrina, mediada por
caveolina, o no mediada por catrina ni caveolina), deben escapar del endosoma por distintos mecanismos (fusión de membranas, lisis
del endosoma, permeabilización del endosoma)
• Fusión: los virus con manto pueden usar este mecanismo, donde la membrana plasmática de la célula se fusiona con la membrana del
virus, liberándose la cápside completa.
Los virus viajaran dentro de la célula, esto puede ser a través de microtúbulos u otros componentes del citoesqueleto de la célula.

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Los virus viajaran dentro de la célula, esto puede ser a través de microtúbulos u otros componentes del citoesqueleto de la célula.
3.- Denudamiento o liberación del genoma viral: se realiza tanto con enzimas celulares como virales, se desarma la cápside liberándose el
genoma en el núcleo o en el citoplasma.
4.-Biosíntesis de macromoléculas virales: durante esta ocurre la síntesis de proteínas, la replicación del genoma, y la obtención de un RNA
mensajero. Su síntesis dependerá de su tipo de genoma:
○ Aquellos que tengan RNA negativo utilizaran una RNA polimerasa dependiente de RNA proveniente del virus, ya que la célula no
contiene este tipo de polimerasas
○ Los RNA de doble hebra traerán su propia polimerasa dependiente de RNA
○ Los que posean RNA de polaridad positiva pueden actuar como RNA mensajero
○ Los Retrovirus (RNA positiva) tienen un mecanismo donde inicialmente transforman el RNA en RNA de doble hebra, a través de una
transcriptasa reversa proveniente del virus, este DNA que se integra en el genoma de la célula hospedera luego es transcrito por una
RNA polimerasa II proveniente de la célula, obteniéndose RNAm.
Una vez que se ha transcrito el RNAm del virus, esto debe ser traducido utilizando la maquinaria metabólica celular (los virus no la poseen),
traducción CAP dependiente (VIH, Influenza), traducción alternativas mediadas por IRES (sitio de entrada interno al ribosoma)

Durante la replicación del genoma se utilizará un mecanismo específico según el tipo de genoma viral:
○ Para DNA de simple hebra positiva se utiliza una DNA polimerasa dependiente de DNA para poder producir un DNA de doble hebra y
se utilizará la hebra negativa de molde para sintetizar más hebras de polaridad positiva de genoma viral
○ Los virus con DNA de doble hebra también se utiliza una DNA polimerasa dependiente de DNA para producir más copias de DNA de
doble hebra
○ Virus de RNA simple hebra polaridad positiva requiere una RNA polimerasa dependiente de RNA para producir una copia intermediaria
con polaridad negativa , que servirá de molde (con la misma enzima) para producir más RNA de polaridad positiva
○ Virus con RNA de simple hebra polaridad negativa se utiliza una RNA polimerasa dependiente de RNA para producir un intermediario
de RNA de polaridad positiva que será utilizado de molde para producir más copias de RNA de polaridad negativa.
*Para la síntesis de proteínas virales se utiliza la misma copia producida y se traduce (una hebra), cuando son DNA doble heb ra se transcribe
a RNA viral de una hebra polaridad positiva que será traducida a una proteína viral
5.- Ensamblaje: Maduración: ocurre la formación de la cápside proteica y su asociación al genoma viral, generalmente en los virus DNA esto
ocurre en el núcleo, mientras que los virus RNA ocurre en el citoplasma. En virus desnudos el ensamblaje permite formar una nucleocápside
completa (virus maduro, con potencial de infectar otras células), los virus con manto la formación de nucleocápside es necesario cuand o
salga de la célula, porque en ese momento adquiere su manto.
6.- Liberación: Pueden salir por yemación (aquellos que tienen envoltura), exocitosis o lisis

Las distintas etapas de replicación viral van a producir el tropismo viral (predilección del virus por un tejido), y estará d eterminado por la
susceptibilidad (capacidad de absorción [unión del ligando con el receptor] ) y la permisividad (que la célula pueda darle al virus todo lo q ue
necesita para desarrollar replicación de su genoma una vez dentro)

3. Patogenia Viral
Se define como los procesos o mecanismo por los cuales los virus producen daño al hospedero, se estudia a nivel celular, individualw y
comunidad. Es vital la existencia del ciclo esencial de existencia de un virus; en una persona que está infectada, el virus se replica y se
excreta por secreciones biológicas a través de las cuales llegara a infectar a un hospedero susceptible, el virus se replicará y se excretará y
podrá infectar a otra persona susceptible, si el ciclo se rompe deja de existir la infección a nivel natural (vacuna anti viruela)
En la patogenia viral influyen factores del ambiente, del hospedero y del virus.

❖ Factores ambientales: influyen en la patogenia la temperatura, humedad, ventilación, radiación UV, pH y la salinidad. Tienen efecto
sobre la infectividad viral, si se altera el manto viral (altas temperaturas, pH, solventes), por ejemplo, se pierde la capa cidad de
infectar porque no está el ligando. Puede afectar la efectividad de transmisión, si la temperatura es baja produce un mayor
acercamiento entre las personas, lo que permite más fácilmente la infección a personas susceptibles. Puede verse afectada por la
presencia de vectores, siendo el ambiente clave en la presencia del vector (geográfico y climáticos)

❖ Factores del hospedero: la genética determina la calidad de respuesta inmune y la capacidad de infectarse. (ejemplo, la deficiencia del
correceptor del virus de la inmunodeficiencia humana). La edad, lactantes y adultos mayores son más susceptibles. El género. Estado
nutricional, fisiológico, estrés, otras enfermedades que afecten la respuesta inmune. Respuesta inmune innata y adquirida. La
respuesta inmune se divide en natural (es con la que se nace, inespecífica, innata, son los efectores preformados (respuesta rápida)) , y
adquirida (adquiriendo dependiendo de la exposición, es específica, preformada pero necesita activación y proliferación (respuesta
más lenta), es especializada y tiene memoria (importante en vacunas)). En la respuesta inmune innata participan barreras epiteliales,
mucosas, complemento, células natural killer, fagocitos; presente desde que nacemos, rápida e inespecífica (se ha visto que puede
tener ciertas respuestas más específica en receptores tipo Toll RL que reconocen patrones asociados a patógenos). Las barrer as
epiteliales (inmunidad innata) consisten en la piel y mucosas, mucus, cilio (remoción de partículas), lizozima (en lágrimas), pH gástrico
(virus con manto no suelen ingresar por esta vía), flujo urinario y secreciones genitales.
La respuesta inmune adaptativa está compuesta por los linfocitos B (respuesta humoral ---->anticuerpos) , linfocitos T que se dividen en LT
citotóxicos y LT Helper. La respuesta inmune adaptativa está dividida en primaria (se desarrolla al exponerse por primera vez a un antígeno)
y secundaria (cuando se vuelve a exponer al antígeno se produce una respuesta mayor)
La respuesta inmune esta interrelacionadas, ambas se desarrollan a nivel local y sistémico, y ambas participan en el control de la infección y en
la resistencia posterior.

❖ Factores del virus:

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1.- Virulencia: capacidad de un virus de producir daño y enfermedad. Influyen en la virulencia; tipo de virus (cepa, variantes), dosis infectiva
(cantidad de partículas virales), tropismo viral (capacidad de un virus de infectar una determinada población de células de un órgano o
tejido y dependerá de la susceptibilidad y la permisividad)

2.- Transmisión: existe una fuente (persona o animal[zoonosis]), va a realizar excreción viral [secreciones biológicas], por distintos
mecanismos de transmisión [se dividen en directos (sin o con contacto físico) e indirectos (vehículo o vector)] el virus llegará a un hospedero
susceptible y en el ingresará a través de la puerta de entrada.
*Vehículos: objetos inertes (Hep. A, rotavirus)
*Vectores: seres vivos, se divide en mecánico (sin replicación del virus) y biológico (se replica en el vector)
*Vertical: de madre a hijo, puede ser transplacentario, parto, lactancia

3.- Puerta de entrada: un tejido puede ser puerta de entrada cuando tiene células donde el virus pueda replicar, puede ser cutánea (si se
rompe), respiratoria, conjuntival (sarampión), digestiva (rotavirus), genitourinaria (its), transplacentaria.

4.- Diseminación: puede permanecer en el tejido que es puerta de entrada (localizada) (ej, infecciones respiratorias y digestivas), la puerta
de entrada es distinta del órgano blanco (generalizada), se multiplica en la puerta de entrada y luego viaja (vía hematógena, linfática o
neural) al órgano blanco donde se multiplica nuevamente
*Diseminación hematógena: presencia del virus en la sangre (viremia), el virus puede estar libre o asociado a células (sarampión, rubéola,
citomegalovirus)
*Etapas de infección generalizada: el virus ingresa en la puerta de entrada donde se multiplica, de ahí pasa a la sangre (viremia primaria),
llega a órganos profundos (hígado y el bazo) donde se vuelve a replicar, vuelve a la sangre (viremia secundaria) y llega a ór gano blanco
*Diseminación neural (a SNC)(herpes simple, varicela zooster, rabia): el virus replica en la célula epitelial por donde ingresa, pueden viajar
por los axones , y viaja de forma retrograda hacia el cuerpo neuronal ubicado en el SNC
*Diseminación linfática (virus Chikungunya, VIH, sarampión)
*Diseminación vertical: transplacentaria, por contigüidad en el canal genital, o por leche materna
Localizada Diseminada
Excreción Viral Mayor Menor
Periodo de Menor Mayor
Incubación
Respuesta Mayor impacto
Inmune de respuesta de
mucosas

5.- Lesión del órgano blanco (debe ser susceptible y permisivo): la célula puede ir desde sin cambios aparentes a muerte celular, entre
medio hay una serie de cambios (efectos citopáticos, que pueden ser característicos)
*Sincicios : se forma una especie de célula grande (virus respiratorio sincicial)
*Inclusiones: particulares virales agregadas o acumuladas (citomegalovirus, rabia)
*Hemadsorción: las partículas virales unen GR (sarampión)
*Pérdida de control de división celular: multiplicación descontrolada (verrugas de VPH)
*Transformación: VPH cáncer cervicouterino

❖ Modelos de infección viral:

Para que una infección sea exitosa (sea capaz de infectar) se deben cumplir ciertas condiciones:
- Hay una cantidad mínima de virus o viriones capaz de infectar
- Deben haber células susceptibles y que sean permisivas en la puerta de entrada
- Los mecanismos de defensa local están ausentes o son inefectivos

Evolución (tipo/modelo) de infección viral:

- Aguda (el virus ingresa al individuo y es eliminado por completo por la respuesta inmune) (rinovirus, rotavirus, influenza, virus
hepatitis A, rubeóla, sarampión, SARS Covid 19).
- Persistente (el virus no es eliminado por completo y permanece en el hospedero)
○ Latente: permanece el genoma del virus, queda en el núcleo de algunas células durante la latencia no hay replicación oral, en
algunas ocasiones pueden haber reactivaciones que pueden hacer que nuevamente empiece la replicación viral (puede o no
tener síntomas) (Todos los herpesvirus, citomegalovirus, virus varicela zoster, virus Epstein Barr, virus herpes 6,7,8). El virus
evade la respuesta inmune.
○ Crónica: el virus esta siempre replicando, haya o no síntomas, el virus es capaz de eludir la respuesta inmune. (VIH, Virus
Hepatitis B, Virus Hepatitis C)
*Virus hepatitis B: puede desarrollar una evolución aguda (80%), o crónica, en este caso no se producen todos los antígenos
contra la hepatitis B (falta Anti -HBs antígeno de superficie), siendo una respuesta inmune incompleta
○ Lenta: aquella en la cual transcurre mucho tiempo entre las infección del hospedero y el desarrollo de la enfermedad, cuando se
desarrolla esta última pasan pocos meses hasta la muerte del paciente (pancefalitis esclerosante subaguda por virus sarampión)
○ Transformante: el virus infecta a la célula y afecta sus capacidades morfológicas o funcionales, las células pueden multiplicarse de
forma descontrolada (VPH)

Desde el punto de vista clínico, las consecuencias que podemos tener frente a una infección son:
- Infección asintomática
- Enfermedad: se presentan signos y síntomas asociados a la infección

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 - Enfermedad: se presentan signos y síntomas asociados a la infección
○ Un virus característicamente produce un tipo de enfermedad (sarampión, viruela, varicela)
○ Un virus es capaz de producir diferentes enfermedades (ECHO: fiebre, diarrea, exantema, encefalitis)
○ Varios virus distintos pueden producir un mismo síndrome (Hepatitis: VHA,VHB,VHC,VHD,VHnAnB,CMV, etc)

Periodo de incubación: tiempo entre inicio de infección y manifestación de síntomas

Pródromo: etapa con síntomas inespecíficos
Periodo de estado: etapa de síntomas específicos a órganos blancos.

4. Antivirales
Los antivirales tienen la función de bloquear los eventos replicativos del virus, inhibiendo su: entrada, liberación, replicación de sus
macromoléculas, ensamble, maduración o liberación. La clave para definir lo bueno que es un antiviral es su selectividad (capacidad que
tiene un antiviral de discriminar entre procesos virales y celulares), el desarrollo de antivirales nuevo y el uso de los ya existentes se asocia a
toxicidad, rápida excreción, rápido metabolismo, pobre absorción.

Existen varios modelos de antivirales según el ciclo replicativo o la fase replicativa del virus:
- Inhibidores de la adsorción: anticuerpos naturales y artificiales, receptores solubles, antirreceptores
- Inhibidores de la penetración y denudamiento: amantadina (influenza)
- Inhibidores de macromoléculas:
○ Proteínas (interferón)
○ Ácidos nucleicos: ADN (ACV, GCV, AZT); ARN (Ribavirina)
- Maduración o ensamblaje: antiproteasas
- Liberación de las partículas virales: antineuramidasa

❖ Aciclovir: se utiliza como inhibidor análogo de nucleósido contra la infección contra el virus herpes simplex. En una célula infectada por
el virus, que posee un genoma de DNA de doble hebra que se replica en el núcleo, el aciclovir es fosforilado por la timidina kinasa del
herpes, transformándolo en aciclovir monofosfato, es fosforilado 2 veces más por kinasas provenientes de la célula se forma aciclovir
trifosfato, entra al núcleo por un poro, compite y se une a la DNA polimerasa del herpes y se agrega a la cadena que se está elongando
de DNA compitiendo con la guanina, al no haber un 3' con OH no se puede seguir alargando la cadena de nucleótidos, siendo un
terminador de la síntesis de la cadena de DNA (también inhibe a la polimerasa viral) .
Actúa de 2 maneras: compite con el GTP, siendo un terminador de la cadena de síntesis de DNA e inhibe a la polimerasa viral
Es selectivo porque debe ser monofosforilada por la TK viral para activarse y la polimerasa viral es más sensible al aciclovir

❖ Zidovudina (AZT), se utiliza en la infección por VIH, es un análogo de nucleósido, es fosforilada 3 veces por kinasas de origen celular,
luego de ser trifosforilada inhibe la replicación del genoma viral, es un virus de RNA de simple hebra polaridad positiva que debe ser
retrotranscrito hacia un DNA de doble hebra por una enzima viral, transcriptasa reversa, AZT-TP compite con un nucleótido haciendo
que se termine la elongación del DNA e inhibiendo a transcriptasa del virus . Tiene una afinidad 100 veces mayor por la transcriptasa
reversa que por la DNA polimerasa.

❖ Antineuroaminidas; se utiliza contra la influenza A y B, el virus una vez que ya ha hecho todo su ciclo replicativo dentro de la célula,
sale de esta pero queda adherido a la superficie de la célula, por la interacción que existe entre el ácido siálico de origen celular (en la
membrana plasmática) con la hemoglutinina (glicoproteina que está en la membrana del virus), esta conexión debe ser cortada por
una proteasa que se encuentra en la superficie del virus, neuroaminidasa, liberándose así el virus para poder propagarse. El antiviral
bloquea a la neuroaminidasa bloqueando su acción, los virus quedan adheridos a la membrana de la célula donde son reconocidos por
el sistema inmune y posteriormente eliminados.

❖ Inhibidores de proteasa: actúan en la maduración del virus, muchos virus durante su síntesis de proteínas producen una gran
poliproteína la cual debe ser cortada por proteasas para obtener cada subunidad funcional y que sean catalíticamente activas, los
inhibidores de proteasas imitan la zona de corte de la proteasa, uniéndose a la proteasa (lo reconoce y está en exceso) reconociéndolo
e inhibiendo su acción en el sustrato natural (Simeprevenir hepatitis C, Boceprevir, Telaprevir, Asunaprevir, Simeprevir, Paritaprevir,
Vaniprevir, Grazoprevir)

Existen solo 9 virus que tienen antivirales aprobados, la tasa de mutación de algunos virus es un gran problema, los virus RNA tienen alta
tasa de mutación porque la RNA polimerasa dependiente de RNA no poseen actividad correctora

5. Métodos de detección de virus y su aplicación en el diagnóstico

Importancia del diagnóstico virológico a nivel individual: es muy importante en aquellas situaciones en el curso puede ser letal, aquellas
infecciones donde existe tratamiento intervenciones o estrategias de gestión (tratamiento profiláctico o antivirales) y en aq uellas de curso
crónico.
A nivel de salud pública:
1.- Mantener los bancos de sangre libre de virus
2.- En la supervisión y seguimiento de programas de vacunación
3.- En la identificación de brotes
4.- Reconocer la presencia de virus no habituales
5.- Identificar la circulación de nuevos agentes

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5.- Identificar la circulación de nuevos agentes

El diagnostico virológico se puede evaluar desde dos aspectos:

- Diagnostico viral clínico (el médico a través de los síntomas y signos se orienta al virus de origen)
- Diagnostico viral laboratorio (cuando se requiere confirmar la sospecha viral)

Muestra adecuada, requiere:

- Aspectos del paciente-situación epidemiológica
- Conocimiento de la estructura y patogenia viral
- Que queremos saber del agente infeccioso (virus o respuesta inmune) (técnica diagnóstica)

Muestra, virus, lesión

Síndrome clínico Tipo de muestra

Infecciones respiratorias Células de nasofaringe (aspirado, tórula)
Infecciones gastro Deposiciones, biopsia intestinal
intestinales
Infecciones sistémicas Sangre (suero, plasma o células)
Hepatitis Sangre, deposiciones
Exantemas Células basales de lesiones o hisopado nasofaríngeo.
Biopsia
Sangre
Deposiciones
Tubo: medio de transporte universal el aspirado nasofaríngeo requiere de un aparato de succión y un catéter estéril de succió n

Traslado adecuado de la muestra: siempre en frío, a 4°C en hielo húmedo o en sistemas refrigerantes, debe ser en un medio de transporte adecuado que
cumpla con todas las normas, no conviene congelar y descongelar pues disminuye la viabilidad del virus (puede producir daño en el manto o en el
genoma del virus), y depende de la técnica de diagnóstico a usar.

El diagnóstico en laboratorio puede tener 2 enfoques:

- Detección directa o indirecta del virus (o sus componentes):
○ Buscando el agente viral completo: mediante microscopia electrónica o aislamiento viral
▪ Microscopía electrónica: no se utiliza en clínica, pero es muy importante para visualizar directamente el agente viral, pero requiere de
gran cantidad de partículas (limitada sensibilidad)
▪ Aislamiento viral: se buscan partículas virales con capacidad replicativa, se toma la muestra, se transporta en frío (no congelar y
descongelar porque se pierde la viabilidad o capacidad infectiva), se inocula en células que están disponibles en el laboratorio y se
espera si hay mecanismos citopáticos o alteraciones en estas células que me permitan discriminar que hubo replicación viral. Mucho
mecanismos citopáticos son compartidos por varios virus por lo que se requiere la confirmación de la presencia de este virus utilizando
otras técnicas.
Ventajas: nos permite discriminar si hay virus viables o con capacidad infectiva en la muestra, además genera más virus para
análisis posteriores
Desventajas: el efecto citopático (ECP) puede demorar, puede haber coinfecciones y no hay modelo celular para todos los virus,
además de requerirse mucho espacio en el laboratorio

○ Buscando los componentes virales: antígenos (inmunoanálisis) o genoma (métodos moleculares)

▪ Los antígenos viral los podemos detectar por inmunoanálisis (inmunofluorescencia directa e indirecta, ELISA, test rápido como
aglutinación, inmunocromatografía, antigenemia-Shell vial). El inmunoanálisis es la reacción en la cual existe una interacción entre un
antígeno y un anticuerpo, y se puede visualizar este complejo, pudiéndose evaluar si hay antígeno o anticuerpo. Existe un método
directo en el cual tenemos el antígeno y le agregamos un anticuerpo marcado, y el método indirecto donde se tiene el antígeno, un
anticuerpo antiviral (siendo específico para el antígeno) y se agrega un segundo anticuerpo, que es antianticuerpo que tiene un
indicador, así se puede discriminar la presencia de estos complejos. El indicador que se utilice indica el nombre de la técnica;
radioisótopo (radioinmunoanálisis), flurocromo (inmunofluorescencia, en este caso se hace incidir luz para ver la marcación, se utiliza
para discriminar virus respiratorios [VRS, parainfluenza,FluA y B, adenovirus:IFI][Metapneumovirus:IFD]), enzimático (técnica de ELISA),
□ Sistema de captura (ELISA): se utiliza un pocillo que esta recubierto con un anticuerpo de captura, estos anticuerpos son
específicos para el antígeno que se busca, sobre el pocillo se coloca la muestra y si está presente el antígeno interaccionará con
el anticuerpo, después se agrega un anticuerpo específico para el antígeno, que esta conjugado con una enzima, para determinar
si esta positivo se agrega un sustrato, si está presente la enzima habrá un cambio de color en el sustrato [ELISA DIRECTO]
□ [ELISA INDIRECTO] se tiene el pocillo con el anticuerpo de captura se agrega la muestra, se agrega un anticuerpo primario
específico, y se agrega un segundo anticuerpo que tiene la enzima conjugada, se agrega un sustrato, si hay cambio de color la
enzima está presente).
□ Existen otras técnicas como ELFA que utiliza un sustrato fluorogénico para hacer la detección final.
□ Test rápidos, demoran de 10 a 15 minutos en tener los resultados, entre ellos podemos encontrar inmunocromatografía.
Tenemos un dispositivo donde se coloca la muestra, y esta muestra va a migrar por el interior del dispositivo y si está presente el
antígeno será capturado por un anticuerpo específico que tienen una marca, esto se va a mover y se va a encontrar con un
anticuerpo de captura que va a retener el complejo antígeno anticuerpo, como el anticuerpo está marcado producirá una señal,
hay otro anticuerpo que es de control para revisar que funcione el dispositivo.
Existen muchos test diagnósticos rápidos que se pueden utilizar, el de VIH permite detectar antígenos y anticuerpos

▪ Genoma (técnicas moleculares): hay dos enfoques; uno es amplificar la molécula blanco (más utilizado, puede ser amplificador de DNA
[PCR] {Transcripción inversa PCR para genomas RNA} o de RNA [Transcripción in vitro TMA]) y el otro amplificar la señal (se tiene la
molécula blanco se colocan muchas señales y amplificamos la señal para poder visualizar).
Para los modelos moleculares se requiere una muestra adecuada, realizar la extracción de ácidos nucleico.

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 Para los modelos moleculares se requiere una muestra adecuada, realizar la extracción de ácidos nucleico.
□ Transcripción inversa (RT): genomas RNA, se obtiene el RNA de la muestra mediante la transcriptasa inversa se copia en cDNA y
se puede usar en PCR
□ PCR: se produce una amplificación exponencial de una secuencia específica de DNA de una longitud determinada, el producto
amplificado se puede detectar fácilmente. PCR convencional es cualitativo que se visualiza en una electroforesis, y un PCR en
tiempo real que puede ser cualitativo o cuantitativo.
Posee 3 procesos:
1.- Denaturación: aumentar la t° 94 o 95°, en este proceso los puentes de hidrogeno se separan y se pueden obtener las hebras
separadas
2.- Apareamiento: etapa donde los partidores, cebadores o primers (secuencias de oligonucleótidos que permiten limitar el
segmento amplificado a la zona de interés y dan especificidad) hibridan específicamente por complementariedad de bases con la
muestra de ADN. (T° entre 45-65°)
3.- Elongación (extensión): en esta etapa participa la ADN polimerasa que va ir incorporando los nucleótidos por
complementariedad de bases (72°)
Estos 3 procesos se repiten durante un número determinado de veces (ciclos) y ocurren a distintas temperaturas. Al repetirse
estos procesos se amplifica el sector que se busca. Para visualizarlo, en caso del PCR convencional se hace electroforesis en geles
de agarosa obteniéndose una banda única que debe estar a la misma altura del control positivo, en el PCR en tiempo real se
obtienen curvas de amplificaciones (fluorescencia), dentro de la reacción se agregan agentes intercalantes o sondas
fluorescentes, también es un ensayo cualitativo (+ o -), cuantitativo (podemos conocer cuantas copias de genomas hay)*
*Para ello se necesita una curva estándar con un número de copias conocidas.
El PCR tiempo real cuantitativo se utiliza para determinar si el virus está en replicación activa, y para monitorizar el tratamiento
antiviral, tomando una muestra inicial y luego de un tiempo para ver si este ha sido efectivo (HCV,CMV,EBV,HBV,VIH)
Ventajas: rapidez, sensibilidad, especificidad, detectar a partir de diversos tipos de muestra y necesidad de poca cantidad
de muestra.
- Detección de la respuesta inmune: mediante la búsqueda de anticuerpos (técnicas serológicas): en la respuesta humoral hay un tiempo donde el
individuo produce anticuerpos, primero IGm y luego IGg, los últimos permanecen en el tiempo y pueden estar disponibles cuando hay nuevamente
infección o sigue infectado (persistente). Con estos métodos se busca demostrar que el suero del paciente existen anticuerpos específicos
antivirales. Se pueden determinar infecciones recientes:
○ Seroconversión: se obtienen 2 muestras evaluando la seroconversión
○ IgM específica
O conocer la condición de inmunidad a un virus en particular: IgG
Hay métodos clásicos: neutralización, inhibición de la hemaglutinación, fijación del complemento. Y métodos actuales: ensayos enzimáticos,
Wester Blot, Aglutinación con látex, Inmunocromatográfia
○ ELISA para anticuerpos: en los pocillos hay antígeno viral de captura adherido, se va a colocar la muestre del paciente (suero), buscando un
anticuerpo específico, luego se agrega un anticuerpo conjugado acoplado la enzima y luego se agrega el sustrato, habiendo cambio de color
si es positiva
○ Western Blot: se tiene una membrana de nitrocelulosa en el cual ya están las distintas proteínas de un virus, se agrega el suero del paciente y
van a interactuar con estas proteínas, si se obtiene una banda es positiva
○ POCT (Point of Care Testing): son más rápidos, ensayos automatizados que pueden detectar uno o varios virus, es un equipo donde se agrega
la muestra y desarrolla una amplificación isotermica para detectar influenza A o B (ALERE), demora 15 minutos.
○ Cobast-Liat se puede detectar influenza A y B, puede hacer PCR múltiple, resultados en 20 minutos
○ Xpert Flu: es automatizado y realiza un PCR en tiempo real, determina influenza A y B, y H1N1, demora 75 minutos.
○ Filmarrays: ensayo múltiple con PCR múltiple y permite detectar múltiples virus. Demora 60 min
○ Multiplex XMAP: hay esferas fluorescentes que van a estar unidas a distintas ondas para detectar un patógeno
○ FilmArray: panel respiratorio - panel gastrointestinal.

El tiempo de evolución del cuadro clínico es importante para saber cuál es la muestra adecuada o cuál técnica se ocupará para confirmar el agente
etiológico
Variabilidad viral: muchos virus presentan variaciones genómicas, y circular como diferentes genotipos, esto es importante cu ando hay resistencia a
antivirales, políticas de salud pública (epidemiología molecular), genotipos asociados a gravedad de las infecciones.
Técnicas:
- PCR asociado con cortes de enzima de restricción (RFLP): se obtienen bandas específicas para cada genotipo
- Hibridación con sondas: las sondas son secuencias nucleotídicas complementarias al segmento que se busca encontrar, en una me mbrana de
nitrocelulosa hay sondas adheridas, se coloca el material amplificado y habrá hibridación si está presente determinado genot ipo, y con un tipo de
marca específica.
- Secuenciación: permite hacer comparación y análisis filogenéticos de genomas completos

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