UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOS

(Universidad del Perú, decana de América)

FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

ESCUELA PROFESIONAL DE GENÉTICA Y BIOTECNOLOGÍA
LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA GENERAL
CINÉTICA DE MUERTE MICROBIA PARTE II
Profesor encargado (a): Susana Gutiérrez

Alumnos: Códigos:

Lima-Perú
Introducción
Las bacterias son un conjunto de seres vivos que se caracterizan por desarrollar
resistencias frente a perturbaciones ambientales. Esto les genera adaptaciones que,
durante millones de años, han ido perfeccionandopara luego ser aprovechadas por las
nuevas generaciones. Estas bacterias, al incorporarse a los ecosistemas, establecen la
base para el correcto desarrollo de la vida. Sin embargo, cuando ocurren perturbaciones
que exceden los niveles umbrales a los que están adaptadas, es el momento en donde
ocurre un desequilibrio en la célula bacteriana, un daño es su estructura; por ejemplo, en
la pared celular, la membrana celular o el ADN, que provocara la muerte. Los agentes
que pueden afectarlas son agrupados, en general, en dos grupos: agentes físicos y
agentes químicos. Los agentes físicos se basan en cambios, a partir de fenómenos que
no involucran una elaboración de estos, como la T°, la radiación (UV) y la osmosis. En
los agentes químicos los fenómenos se basan en componentes de sustancias que afectan
químicamente, como el Ph, metales pesado y sistemas antimicrobianos. Estos últimos se
caracterizan por su efectividad en la reducción del número y demoro de división
bacteriana (Platt, et al, 2004). Por ello, en esta segunda parte de cinética de muerte
microbiana, se mostrarán los resultados obtenidos de las experiencias faltantes que
fueron realizadas en clase. Siendo estas experiencias el efecto de la temperatura, se
evaluaron a 45, 55, 65, 75, 85 y 95°C para determinar el umbral de temperatura; presión
osmótica, a condiciones de solución salina de 5, 10 y 20%; la evaluación de acidez y
basicidad a 3, 5, 7, 9 y 11 Ph, acción de metales pesados, utilizando monedas
desinfectadas y agentes antimicrobianos, utilizando Cefoxitina (FOX), penicilina
(PEN), ampicilina (AM) y ácido nalidícico (NA), como antibióticos. Se utilizaron como
cepas a E.coli, S.aureusy S cerevisiae. El objetivo es comprender cómo actúa cada
agente sobre las bacterias modelo y establecer cuáles son los límites que pueden
soportar en condiciones ambientales.
1.- Efecto de la temperatura

Para poder determinar el efecto del parámetro físico temperatura sobre el crecimiento
bacteriano se tomaron inóculos de una cepa de Escherichiacoli en tubos de ensayo que
fueron expuestos diferentes temperaturas (45°C, 55C°C, 65°C, 75°C, 85°C y 95°C)
durante 10 minutos, posteriormente el tubo de ensayo fue sometido a shock térmico y se
procedió a sembrar 1 ml de este en un placa Petri con agar nutricio mediante el método
de difusión, el proceso se repitió para cada temperatura y se llevó a incubación. A
continuación, se describirán y analizarán los resultados obtenidos en la experiencia.

Resultados

Tras el periodo de incubación protocolar se observó el crecimiento de la cepa en la

placa correspondiente a 45°C evidenciado por el gran número de colonias presentes en
el agar, de manera similar se observó proliferación en la placa de 55°C, aunque el
número de colonias fue significativamente menor que el anterior, en todas las placas
correspondientes a temperaturas mayores no se observó crecimiento de Escherichiacoli.

Figura 1: Crecimiento de Escherichiacoli tras exposición a diferentes temperaturas.

Discusión

La temperatura es uno de los principales factores que afectan el crecimiento y la

supervivencia de las bacterias; en función al rango de temperatura óptima en el que se
desarrollan los microorganismos pueden ser clasificados como psicrófilos (12-15 °C),
mesófilos (30-45°C), termófilos (55-75°C) e hipertermófilos (75°- 95°C). La
incubación a temperaturas menores que las del límite inferior soportado implican
gelificación de las membranas y un transporte de nutrientes tan lento que imposibilita el
crecimiento; por otras parte, la incubación a temperaturas mayores a la del límite
superior genera la desnaturalización de las proteínas, el colapso de la membrana
citoplasmática y la lisis celular. (Sanchez et al., s.f.).

Escherichiacoli es una bacteria mesófila, cuya temperatura óptima es de 37°C, dato

relacionado a su presencia en el intestino humano, siendo posible su desarrollo incluso
entre los 7°C y 46°C, valores correspondientes a periodos de incubación de
aproximadamente 24 a 48 h. (ELIKA, 2013).

Cuando el cultivo se ve expuesto a temperaturas superiores al máximo soportado, se

produce la muerte de una fracción constante en función al tiempo trascurrido ( K t ¿, el
parámetro punto térmico mortal indica la temperatura mínima para la inactivación total
o esterilización en 10 minutos de exposición, siendo 55°C el valor de para
Escherichiacoli(Ñiañez, 1998). Los resultados obtenidos tanto en la primera placa
(45°C) y en la segunda (55°C) corroboran los datos teóricos, puesto que tras la
exposición de la cepa al calor se dio una inactivación parcial del cultivo original
proporcional al valor de la temperatura, luego de la incubación a la temperatura óptima
de Escherichiacoli (37°C) se origina la proliferación bacteriana en base a las
sobrevientes por lo que se observa mayor crecimiento en la primera placa que en la
segunda; las placas correspondientes a temperaturas mayores no proliferaron porque se
superó el punto térmico mortal; es decir, todas las bacterias murieron.

Conclusiones

Tras la exposición de Escherichiacoli a temperaturas mayores a 55°C se da la muerte de

todas las bacterias presenten en el inóculo.

Si bien la temperatura máxima teórica para el crecimiento deEscherichiacoli es de

46°C por ser una bacteria mesófila, tras una exposición de 10 minutos a temperaturas
menores a 55 °C aún existe posibilidad de crecimiento bacteriano de ser incubada a
37°C.
2.- Acción de la presión osmótica

Resultados

Discusión

Conclusiones
3.- Efecto del pH en los microorganismos

Con el fin de estudiar la influencia del pH en el crecimiento de Escherichiacoliy

Saccharomycescerevisiae, se ajustó el pH de los tubos con caldo nutricio estéril y
extracto de malta ajustadas previamente con HCl 1.0 N y NaOH 1.0N a 3, 5, 7, 9 y 11.
Los cultivos fueron inoculados en cada medio respectivamente. El crecimiento se
determinó observando la turbidez en cada tubo.

Resultados

Crecimiento de Escherichiacolien los Crecimiento de Saccharomycestubos

con pH 5, 7 y 9. cerevisiae en los tubos con pH 3, 5, 7,
9 y 11.

Discusión

Los resultados muestran el efecto significativo que tiene el pH sobre el crecimiento de

bacterias neutrófilicas y acidófilicas.

Para la bacteria Escherichiacoli el pH fue determinante en su desarrollo, respondió bien

a pH como 5, 7 y 9, debido a que las bacterias son un grupo de microorganismos
metabólicamente provistos de una capacidad enzimática capaz de permitirles
sobrevivir. Esta bacteria puede crecer en un ph mínimo =4.4 y ph máximo=9 y un ph
optimo= 6-7, por es una bacteria neutrofílica. Uno de los mecanismos que, al menos
en neutrófilicos parece controlar el pH interior es un sistema de antiporte H +/K+: a pH
ácidos, el interior celular puede quedar en principio más alcalino que el exterior. Este
sistema introduce protones en el interior y saca iones potasio. De esta manera
neutralizan el pH interior y siguen teniendo un potencial de membrana para establecer
una fuerza protón motriz que les suministre energía. Si el pH interior cae en torno a 6 o
5.5, la bacteria Escherichiacoli induce una respuesta de tolerancia a ácidos, consistente
en ATPasastranslocadoras de protones (expulsan protones al exterior) y chaperonas
(proteínas celadoras) para corregir las proteínas desnaturalizadas.

Para Saccharomycescerevisiaecreció en todos los tubos. Probablemente puedo verse

influido por otros factores ambientales, tensión de oxígeno, temperatura, aumentando la
amplitud del rango de pH al que es posible el crecimiento. Sin embargo, las levaduras
que pueden llevar a cabo la fermentación (en condiciones de anaerobiosis) tienen ph
óptimo de 4.5 a 6.5, no resisten los cambios de pH, ni mucho menos valores extremos.
La cantidad de nutrientes disponibles afecta el desarrollo de los microorganismos y la
velocidad de descomposición. Saccharomycescerevisiaepuede crecer en medios con pH
2 hasta de 8.5, pero la mayoría de ellos prefieren un pH ácido, pues los sistemas
consumidores de energía impiden la acidificación del medio intracelular. Necesitan
esas altas concentraciones de H+ para mantener la integridad de sus membranas y
envueltas: a pH neutro esas envueltas se desintegran.

Conclusiones

Los resultados muestran el efecto significativo que tiene el pH sobre el crecimiento de

UFC de bacterias neutrofilas y acidófilas. Este factor no se puede evaluar
independientemente de los demás que intervienen como la temperatura, la humedad y
el tipo de sustrato utilizado como materia prima.

El ph del medio de cultivo no solo determina si una especie microbiana puede o no

desarrollarse sino también modifica la velocidad a la cual se replica. La tolerancia de
las bacterias a los cambios de pH es limitada, los cambios bruscos producen la muerte.
4.- Acción oligodinámica de metales pesados

Se realizaron cultivos de E. coli y S. aureus en placas con agar nutricio y con una
moneda de diez céntimos para comprobar su efecto oligodinámico.

Resultados

En la placa de E. colise obtuvo un halo libre de bacterias de aproximadamente 4 cm de

diámetro, aproximadamente 1,5 cm entre el borde de la moneda y el del halo.

Figura 2: Cultivo de E. coli con la moneda de diez céntimos.

En la placa de S. aureus se obtuvo un halo libre de bacterias de aproximadamente 2.90

cm de diámetro, aproximadamente 0.4 cm entre el borde de la moneda y el del halo. En
esta placa se observa un menor efecto oligodinámico por parte de la moneda.

Figura 3:Cultivo de S. aureus con la moneda de diezcéntimos.

Discusión de resultados

La moneda de diez céntimos utilizada en la práctica está compuesta de latón, una

aleación de Cu y Zn (Olivera & Calcina, 2013). Se pudo comprobar el efecto
oligodinámico de estos metales, es decir su capacidad de ejercer la acción bactericida
(Kraemer, 1905).

Según comparaciones realizadas en diferentes estudios, la plata es el metal con el mejor

efecto oligodinámico, seguido del cobre (Deane, Mills &Hamel, 1970); además, la
concentración mínima requerida para que estos metales realicen la actividad bactericida
es bastante baja (Jain, 1990). Esto explica el motivo por el cual se utilizó la moneda de
diez céntimos (compuesta de cobre y zinc), y que, en caso se haya realizado una
comparación entre el efecto oligodinámico con el resto de monedas, se iba a observar un
área libre de bacterias con un diámetro bastante menor. Asimismo, se pudieron haber
utilizado materialesmás pequeños compuestos de cobre, pero para tener como resultado
un halo de mayor diámetro y con esto mayor facilidad al distinguir si ocurrió o no la
muerte de las bacterias a causa del material, se utilizó la moneda de diez céntimos.

El fundamento de este efecto es el daño que causan los iones metálicos sobre
macromoléculas de la célula. Las proteínas tienen una gran afinidad con los iones
metálicos, por lo que estos se unen a sus grupos reactivos causando su denaturalización.
De esta manera, interfieren en los procesos que involucren estas proteínas, inhibiendo
rutas metabólicas y así el desarrollo de la bacteria (Russel & Hugo, 1994). Por su parte,
el cobre puede causar daño oxidativo a la bacteria al catalizar especies reactivas de
oxígeno; tiene la capacidad de interactuar con tioles, impidiendo que estos actúen como
debe ser en las rutas metabólicas, generando alteraciones en estas; y fácilmente se une a
los sitios de unión de metaloproteínas y ciertas enzimas metabólicas al alterar sus
grupos de hierro y azufre (Tarrant et al., 2019). Una enzima sobre la cual ejerce acción
el sobre es la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, la cual cataliza el paso de
gliceraldehido-3-fosfato a 1,3-bisfosfoglicerato durante el proceso de glucólisis (Tarrant
et al., 2019). Además, el cobre cargado positivamente podría distorsionar la pared
bacteriana uniéndose a las proteínas con carga negativa presentes en esta, permitiendo el
ingreso de otros metales, como plata, que puede llegar a causar daños en el DNA, RNA
y demás proteínas(Shrestha et al., 2009).
El efecto oligodinámico afecta tanto a las Gram positivas como a las Gram negativas
(Shrestha et al., 2009), aunque existen especies bacterianas más sensibles a este efecto y
otras que cuentan con cierta resistencia ante los metales, ya sea por una característica
intrínseca o adquirida (como en el caso de mutaciones o traspase de plásmidos) (Russel
& Hugo, 1994). Efectivamente, en las placas se observa que la moneda tuvo efecto tanto
en la E. coli (Gram negativa) como en la S. aureus (Gram positiva). No obstante, se
evidencia que la E. coli es más vulnerable a los metales, pues el halo generado es de
mayor diámetro. Cabe destacar que S. aureus se ha adaptado para poder crecer en
presencia de exceso de cobre, ya que, pese a que se ven bloqueadas las vías normales de
metabolismo de carbono, la bacteria altera su proteoma y utiliza vías alternativas que no
requieran de las enzimas o proteínas afectadas por el cobre(Tarrant et al., 2019).

Conclusiones

 Los metales pesados alteran el desarrollo bacteriano al interactuar con ciertas

proteínas e inhibir algunas vías metabólicas, a lo que se conoce como efecto
oligodinámico.
 La E. colies bastante susceptible al efecto oligodinámico, mientras que S. aureusha
desarrollado resistencia ante los iones metálicos.
 El cobre, componente de las monedas de diez céntimos, es el segundo metal de
mayor efecto oligodinámico.

5.- Acción de antimicrobianos- método de discos de antibióticos

S. aureus fue el primer microorganismo en poner en manifiesto la resistencia a

antibióticos y de desarrollar diversos mecanismos, tanto intrínsecos como adquiridos
para conseguir resistencia a la mayoría de los antimicrobianos existentes.

Para este procedimiento se colocó discos de distintos antibióticos (Ampicilina,

Penicilina, Ácido Nilidixico y Cefoxitina) en placas de Mueller Hinton que contenían
St. Aureus y E.coli respectivamente.
Resultados

Cultivo de S. aureus con discos de antibióticos.

Cultivo de E.coli con discos de antibióticos.

Diámetros de zonas de inhibición

St. aureus E.coli
AM 18 mm 28 mm
PEN - -
NA 27 mm 9 mm
FOX 31,5 mm 16 mm
Discusión

El motivo por el cual se utilizó cepas de S. aureus y E.coli fue que estas tienen un
patrón de sensibilidad ya conocido frente a los antimicrobianos (son de uso universal).
Esta sensibilidad debe ser reproducida en cada laboratorio asegurando con ello que el
procedimiento empleado está operando en óptimas condiciones.

Los discos, para antibiograma son producidos por casas comerciales bajo un riguroso
protocolo de control internacional. Cada disco contiene una concentración
predeterminada que permite una correlación más o menos precisa con la concentración
mínima inhibitoria que dicho antibiótico alcanza "in vivo" según los resultados de cepas
control resistencia o susceptibilidad. Solo deben utilizarse discos con nombre genérico.

Tan pronto el disco impregnado de antibiótico se pone en contacto con la superficie

húmeda del agar, el filtro absorbe agua y el antibiótico difunde al agar. El antibiótico
difunde radialmente a través del espesor del agar a partir del disco formándose un
gradiente de concentración.

El punto final de inhibición completa del crecimiento se estima a simple vista, excepto
para las sulfonamidas y para algunas especies de Proteus.

Para la ampicilina se infiere que S. aureus tuvo un comportamiento más resistente que
E.coli debido al mayor diámetro del halo de inhibición. S. aureus posee el gen de
resistencia a ampicilina pbp5R.

La elevada resistencia de las cepas de S. aureus a ampicilina en en distintas partes del

mundo pone de manifiesto que ya no es conveniente utilizar estos antibióticos en
infecciones ocasionadas por S. aureus.

Respecto a la penicilina, no se apreció halo de inhibición alrededor de este disco en

ninguno de los cultivos empleados. Esto se debe a que las cepas utilizadas tienen la
capacidad de generar betalactamasas capaces de hidrolizar el enlace amida del anillo
betalactámico de las penicilinas, cefalosporinas y otros antimicrobianos betalactámicos,
dando lugar a compuestos sin actividad antibacteriana.

En condiciones normales, el gen blaZ esta inhibido por el represor BlaI, pero la
presencia de penicilina y sus análogos favorecen la producción de una proteína
antirrepresora, BlaR1, la cual al autofragmentarse degrada secuencialmente el represor
BlaI, permitiendo la expresión del gen blaZ, el cual codifica la betalactamasa que
hidroliza e inactiva la penicilina G, las carboxipenicilinas, y las ureidopenicilinas
aunque no hidroliza las cefalosporinas, y es posible inhibir su acción por inhibidores de
las betalactamasas como el ácido clavulánico o el tazobactam.

En relación al ácido nalidíxico, tanto S. aureus como E.coli se mostraron sensibles a los
efectos de dicho antibiótico debido a que no poseen genes que posibiliten la formación
de enzimas que degraden a dicho antibiótico.

Finalmente, respecto a la respuesta frente a Cefoxitina, E.coli posee mayor resistencia

que S.aureus. Esta resistencia es mediada principalmente a través de la hidrólisis por
beta-lactamasa, la alteración de las proteínas de unión a penicilina (PBP), y la
disminución de la permeabilidad a través de la pared celular.

Conclusiones

La resistencia a los antibióticos se considera uno de los problemas primordiales de salud

pública en el mundo, ya que constituye un desafío tanto en el plano de la epidemiología
como del tratamiento farmacológico de las enfermedades infecciosas.

La lucha contra los microorganismos resistentes es continua, pues la gran capacidad de

adaptación de los Gram positivos de importancia clínica continuará planteando retos
importantes para la medicina mundial a corto y largo plazo.
6.- Cuestionario

1.- ¿Qué componentes bacterianos confieren resistencias térmicas?

Los componentes ideales que pueden conferir resistencia térmica son las esporas. Estas
se forman cuando los niveles de estrés ambiental, entre ellos la temperatura, crean
condiciones adversas a la bacteria. Entre las más resistentes están las que desarrollan
endosporas, específicamente en Gram –positivas, ya presentan un bajo contenido de G y
C. Además, las estructuras de las endosporas influyen mucho. La capa externa es la que
soporta mayor resistencia térmica, debajo de esta se encuentra una capa de
peptidoglucano, una distribución correcta de esta promueve la deshidratación,
promoviendo aún más la resistencia a T° altas; luego está la membrana y el núcleo de la
espora, encontrándose en un estado de deshidratación.

2.- ¿Qué aplicaciones prácticas se basan en la acción de la presión osmótica?

A continuación, se citan 2 aplicaciones principales en la alimentación y potabilización

del agua:

Industria de alimentos

Determinar en la industria de alimentos las concentraciones salinas y azucaradas juegan

un papel importante, debido a que estas son la materia prima en bebidas y alimentos.
Uno de los procesos que permiten separar el exceso de estas sustancias de manera
rápida y eficaz y que deriva del ósmosis, es la llamada ósmosis inversa. Esta consiste en
ejercer una mayor presión a la presión osmótica.

Tratamiento del agua

Cuando los sólidos disueltos generan una presión a través de la malla permitiendo que
estos se quedan en un lado de la membrana para poder realizar la ósmosis inversa, se
realiza una limpieza óptima. Cabe señalar que el exceso de este método puede acumular
en la parte divisoria de la membrana una acumulación de desechos, dando como
resultado una saturación. Por lo que se recomienda hacer un asea rutinario.
3.- ¿Son los antibióticos eficaces contra las infecciones virales?

No, porque los antibióticos tienen un patrón activo que les permite; en base a
componentes derivados del estudio de las bacterias, ya sea la composición de la pared,
membrana o características de su ADN y proteínas. Estos pertenecen a una serie de
compuestos denominados metabolitos secundarios, estás no permiten el crecimiento ni
el metabolismo que ocurren en un proceso normal, pero se caracterizan por realizar
funciones especializadas. No obstante, en la revista NatureMicrobiology se publicó un
estudio en donde se daba a conocer el accionar de antibióticos sobre virus. Este
proyecto fue realizado por la Universidad de Yale, bajo el mando de la profesora del
Departamento de Inmunología AkikoIwasaki. Esta investigación fue realizada en ratas
de laboratorio, a estas se la inoculó con bacterias y virus; posteriormente se les inyecto
el antibiótico, desencadenando una inhibición viral. Esto da a conocer que las
investigaciones actuales no son suficientes para lograr comprender la interrelación de
estos microorganismos.

4.- ¿Existe alguna relación entre el diámetro del halo y la composición química del
antibiótico?

El diámetro del halo va a depender de qué tan resistente sea la bacteria. Un antibiótico,
al ser un metabolito secundario que puede ser de origen natural o no, va a tener una
composición basada en las características estructurales (por ejemplo, de la pared celular)
de la bacteria. Si se utilizará un antibiótico, por ejemplo, el ácido nilidixico, este
actuaría sobre bacterias que no presentan cierta resistencia cuando atraviese la pared y
la membrana, ya que su nivel de acción es en el ADN bacteriano, en el ADN
polimerasa. Por lo tanto, si puede existir alguna relación entre el halo y la composición
química del antibiótico.

5.- Menciones los niveles de acción de los antibióticos empleados en práctica.

Los mecanismos de acción son los lugares o zonas en donde actúa el antibiótico; es
decir, estructura de la bacteria que será afectada. A continuación, se indican los sitios
activos de cada antibiótico utilizados en clase.

Penicilina (PEN): El accionar es a nivel de la pared celular. Esto es debido a un anillo

de la beta-lactama (familia a la que pertenece) que provoca la inhibición de la enzima
DD-transpeptidasa, esta permite que el péptidoglucano se reticule. Ocasiona mayor
daño en las Gram positivas, porque estas presentan una mayor cantidad de
peptidoglucano en su pared celular.

Ampicilina (AM): Al igual que la penicilina, esta también actúa a nivel de la pared
celular. Pero esta actúa en la etapa de síntesis de la pared celular. Esto se debe a la
asociación de ciertas proteínas específicas, como las Penicillin- BindngProteins o PBPs.
Estos antibióticos pertenecen al grupo de los beta-lactámicos.

Cefoxitina (FOX):

Ácido nilidixico: Afecta a nivel de ácidos nucleicos, específicamente, el ADN. Este, al

pertenecer a las quinolonas, interfiere en la duplicación del ADN, inhibiendo el accionar
de la ADN-polimierasa. Sin embargo, algunas bacterias suelen presentar resistencia
muy rápido.

* Información obtenida en Vedamecum.es. Está reconocido oficialmente por las

autoridades sanitarias correspondientes como Soporte Válido para incluir publicidad de
medicamentos o especialidades farmacéuticas de prescripción dirigida a los
profesionales sanitarios (S.V.nº09/10-W-CM), concedida el 3 de diciembre de
2010.Madrid, España.
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No olvidar poner en orden alfabético (borrar esto cuando ya hayan puesto todos v:
)