EXPRESION DE PROTEINAS

RECOMBINANTES
 ESQUEMA DE CLONADO

DNA a Vector
clonar
Digestión con
enzimas de
mRNA de la restricción
proteína de
interés
Ligación E. coli competentes

Transformación

Selección

Screening

Plantas transgenicas Terapia génica

Bacterias modificadas
Proteínas recombinantes
 SINTESIS DE cDNA SINTESIS 1ERA CADENA

5´cap
AAAAAA(A)nA 3´
mRNA

dATP
dTTP Transcriptasa reversa
dGTP
dCTP
DNA polimerasa

cDNA
 PCR
Primers: Forward incluye AUG

Reverse incluye STOP

F

Clonado en vector de expresión

PROMOTOR
 PCR
Primers: Forward incluye AUG

Reverse incluye STOP

PstI F

R KpnI

Clonado en vector de expresión

 Sistemas de expresión

E. coli
Rápido , barato, fácil (cuando funciona)
• Fácil clonado
• Cultivo barato
• Rápido crecimiento

• Deficiente en modificaciones post-traduccionales eucariotas

glicosilación, fosforilatcon, etc.
• Deficiente en ciertos tRNAs comunes a genes eucariotas
• Ciertas proteínas se pliegan mal y forman cuerpos de inclusión
Levaduras
Pichia pastoris o Saccharomyces cerevisiae

• Clonado en E. coli, luego se transforma el DNA en la

levaduras
• Rapido crecimiento, no tan alta producción.
• Modificaciones post-traduccionales
Sistemas de expresión eucariotas
Baculovirus / Células de insectos
• Clonado en E. coli, transfección células de insecto,
• Modificaciones post-traduccionales muy semejantea a mamiferos
– Señales de secreción, glicosilacón and fosforilación
• Expresa bien proteínas secretadas de membrana, e intracelulares

Sistemas de células de mamiferos

Autenticas modificaciones post-traduccionales

Erythropoeitin (Epogen; Amgen, Thousand Oaks, CA, USA)

CHO cells (Chinese hamster ovary)

HEK-293 (Human Embryonic Kidney 293 cells), BHK (baby

hamster kidney cells)
Companias : Genentech (S. San Francisco, CA, USA), Roche
(Basel, Switzerland), Novartis (Basel, Switzerland) and Bayer
(Berkeley, CA, USA), proteinas recombinantes de uso
medicinal )
Ejemplos de sobrexpresión de proteínas para purificación
PROMOTORES en general INDUCIBLES
Bacterias: Lactosa o análogos IPTG
Levaduras: Galactosa
Cromatografía de afinidad
 Expresión y purificación de proteínas
recombinantes
MCS

TAG

Promotor
 Proteínas de fusión

Gene 1 gene of interest

MET ... LEU ARG THR-stop MET VAL ILE ... stop
ATG ... GTG CGA ACC TAA ATG GTG ATC ... TAG

Gene 1 gene of interest

MET ... LEU ARG THR MET VAL ILE ... stop
ATG ... GTG CGA ACC ATG GTG ATC ... TAG
Corte proteasa
Proteínas Humanas recombinantes
Erythropoietin (EPO)
Insulina
Granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF)
alpha-L-iduronidase (rhIDU; laronidase)
acetylgalactosamine-4-sulfatase (rhASB; galsulfase)
Dornase alfa ( DNAsa)
Tissue plasminogen activator (TPA)
Glucocerebrosidase Ceredase by Genzyme
Interferon (IF) Interferon-beta-1a
Insulin-like growth factor 1 (IGF-1)

Viral recombinantes
Proteína de envoltura de hepatitis B virus

Molecular biology enzymes

Factor X
Taq Pol
AMMV (Transcriptasa reversa)
Enzimas de restricción
MUTAGENESIS
La mutagénesis in vitro es usada para producir cambios en la
información genética. Análisis de los subsecuentes cambios , en
la expresión y actividad del producto ayuda a elucidar el efecto
funcional de la mutación.

Tipos

• Mutagenesis al azar

• Mutagenesis sitio dirigida

 • Taq DNAP I sin proofreading ( 0,1x 10-4 a 2x10-4)
• Manganeso aumenta velocidad de error
Al azar
• [dNTPs] no equimolar
• Se transforma el producto mutado en E. coli y Levadura
• Screening por fenotipo
Clonado

Screening

Secuenciacion
 Dirigida

Figure 1A. PCR for Base Substitutions. Primers containing the base changes of interest as a non-complementary break in the primer
sequence (indicated by the blue bubble in primer A) are used in a PCR reaction. As the primers are extended, the resulting amplification
product incorporates the mutation, replacing the original sequence (shown as a blue bar in the PCR product).
Dirigida
Evolución dirigida

Estabilidad estructural
Termoestabilidad
Mayor reactividad
Selectividad enantiomero
Solubilidad
Expresión

Forma de optimizar enzimas , para adaptar proteínas a las demandas industriales y

para avanzar en ele entendimiento de las relaciones estructura –función en las
biocatalisis
Métodos para mutagenizar
 Objetivo:
Evolución de citocromo P450, enzima con mas actividad
Catálisis de oxidación de sustratos orgánicos. Mejoramiento de actividad peroxigenasa
(oxidación usando peroxido). Hidroxilacion de alcanos, alquenos, alcoholes, ácidos
grasos, amidas, hidrocarburos poliaromaticos y heterociclos

Screen for P450cam aromatic hydroxylation activity using horseradish peroxidase (HRP) [9··]. (a) Naphthalene is taken up by the E. coli cell where it is
hydroxylated by P450cam. The resulting naphthol is oxidatively coupled by intracellularly coexpressed HRP and converted into fluorescent polymers,
which remain associated with the cell. (b) Representative results of screening the first P450cam random mutant library using fluorescence digital
imaging (inset shows image of a section of an agar plate). Naphthalene hydroxylation activities, as measured by the total fluorescence generated
during a fixed incubation period, are plotted in descending order. The range of total fluorescence of clones expressing wild-type P450cam is indicated
with gray bar. Confirmed higher activity mutants are labeled.
Otro ejemplo

Uso de selección genetica en E.coli, para aislar variantes termofilicas de

Indolglicerol fosfato sintetasa , que permitiera a las células crecer mas rápido a 37 °C