CARATULA

"DEGRADACIÓN DE SUSTRATOS VEGETALES UTILIZANDO ACTINOMICETOS

AISLADOS DEL ESTIÉRCOL"

1. MARCO TEORICO

La biodegradación es el proceso natural por el cual los microorganismos degradan o

alteran moléculas orgánicas transformándolas en moléculas más pequeñas y no tóxicas.
Sin embargo, este proceso es muy lento y puede acelerarse introduciendo determinadas
bacterias o plantas en los ambientes contaminados. Esta intervención se denomina
“biorremediación” o “biocorrección” y se define como el empleo de organismos vivos para
eliminar o neutralizar contaminantes del suelo o del agua. En los procesos de
biorremediación generalmente se emplean mezclas de microorganismos, aunque algunos
se basan en la introducción de cepas definidas de bacterias u hongos. Actualmente se
están desarrollando microorganismos, algas (especialmente cianobacterias o algas
azules) y plantas genéticamente modificadas para ser empleadas en biorremediación.  

Básicamente, los procesos de biorremediación pueden ser de tres tipos: la degradación

enzimática, la remediación microbiana, y la fitorremediación. 

 Degradación enzimática

Consiste en el empleo de enzimas en el sitio contaminado con el fin de degradar las

sustancias nocivas. Dichas enzimas son previamente producidas en bacterias
transformadas genéticamente. Esta aplicación de la biotecnología lleva décadas en el
mercado y hoy las compañías biotecnológicas ofrecen las enzimas y los microorganismos
genéticamente modificados para tal fin.  

Remediación microbiana

Se refiere al uso de microorganismos directamente en el foco de la contaminación. Estos

microorganismos pueden ya existir en ese sitio o pueden provenir de otros ecosistemas,
en cuyo caso deben ser inoculados en el sitio contaminado (proceso de inoculación).
Cuando no es necesaria la inoculación de microorganismos, suelen administrarse más
nutrientes, como fósforo y nitrógeno con el fin de acelerar el proceso.

Hay bacterias y hongos que pueden degradar con relativa facilidad petróleo y sus
derivados, benceno, tolueno, acetona, pesticidas, herbicidas, éteres, alcoholes simples,
entre otros.

Algunos desarrollos en curso relacionados con la remediación microbiana:

 Bacterias Pseudomonas transgénicas capaces de degradar compuestos tóxicos

que contienen cloro (como el cloruro de vinilo).
 Bacterias capaces de degradar algunos de los componentes del petróleo.
  Bacterias capaces de reducir las formas altamente tóxicas de mercurio en otras
menos tóxicas y volátiles.
 Bacterias que transforman metales del suelo (como el cromo) en formas menos
tóxicas o insolubles.
 Microorganismos capaces de degradar TNT, un explosivo de gran potencia y muy
agresivo para el entorno.
 Bacterias que pueden eliminar el azufre de los combustibles fósiles, como en el
caso del carbón o del petróleo, para permitir combustiones más limpias.
 La utilización de la bacteria Deinococcus radiodurans para eliminar elementos
radiactivos presentes en el suelo y aguas subterráneas. Este microorganismo es
un extremófilo que resiste la radiación, la sequedad, agentes oxidantes y diversos
compuestos mutagénicos.
 Cianobacterias a las que se le han introducido genes de bacterias Pseudomonas
con capacidad de degradar diferentes hidrocarburos o pesticidas.
 Bacterias transgénicas que se usan para extraer metales valiosos a partir de
residuos de fábricas o de minas, o para eliminar los vertidos de petróleo, o el
sulfuro causante de la lluvia ácida que producen las centrales energéticas de
carbón.

Actinomicetos:

Los actinomicetos, son microorganismos del suelo caracterizados por ser organismos
intermedios entre los hongos y las bacterias. Tienen aspecto filamentoso y, al igual que
los hongos, la capacidad de segregar antibióticos (estreptomicina, aureomicina,
terramicina, cloromicetina y tetraciclina).

Por otro lado, como las bacterias, los actinomicetos realizan numerosas reacciones
bioquímicas y participan en el proceso de formación de humus y en la alimentación de las
plantas al mineralizar la materia orgánica. Algunas especies pueden fijar nitrógeno
atmosférico en asociación con algunas especies de árboles. Su número en el suelo
agrícola es elevado (un millón a cien millones por gramo de tierra). Su peso medio es de
una tonelada por hectárea.

Las más importantes por su abundancia son:

1. Streptomycetes: constituyen el 95% de los Actinomicetales. Tienen hifas no

fragmentadas, un micelio aéreo extenso, esporas o conidias en cadena. Los géneros
representativos son: Streptomyces, Microeliobosporia y Sporichthya.
2. Actinomycetes del tipo Nocardia: constituyen el 1,98% de los Actinomicetales.  
Poseen hifas fragmentadas con pequeñas estructuras redondeadas. Los géneros más
representativos son: Pseudonocardia, Nocardioides y Terrabacter.

Estos microorganismos son un grupo muy importante desde el punto de vista

biotecnológico debido a que producen vitaminas (principalmente del grupo B), antibióticos
y pigmentos de gran interés industrial.

Principales funciones de los actinomicetos.

Producción de estreptomicina.

Una vez se tiene una idea de qué son los actinomicetos y qué clases hay, es necesario
conocer sus funciones más características, para así entender sus múltiples aplicaciones
biotecnológicas.

Las principales funciones que presentan los actinomicetos, según Waksman, son las
siguientes:

Actúan en la descomposición de residuos animales y vegetales liberando amoníaco y

ácidos orgánicos. Estos últimos son capaces de formar complejos muy importantes en
edafogénesis (proceso de formación y evolución de un suelo) y en la nutrición vegetal, ya
que tienen una gran movilidad y capacidad quelante para ceder a las raíces el nutriente
que se requiera.

Mineralización del humus con la consiguiente liberación de principios útiles para la

nutrición de las plantas.

Participan activamente en los procesos de humificación, particularmente en la formación

de sustancias melánicas.

Su micelio presenta una parte interesante de la materia prima para la síntesis

de compuestos húmicos, además posee unas proteínas (hidrofobinas) que tienen
capacidad para que el micelio resista a la falta de agua. Estas proteínas han adquirido un
importancia ya que uno de sus componentes, rico en cisteínas (SC3), está relacionado
con el Alzheimer.

Secreción de sustancias antibióticas como la estreptomicina, tetraciclina, etc., con el fin

de producir equilibrios genéricos o antagónicos específicos hacia los componentes de la
microflora bacteriana. Incluso son capaces de producir una acción fitopatogénica ejercida
por algunas especies sobre plantas de interés agrícola.
Microorganismos que degradan celulosa 

Los microorganismos celulolíticos (que degradan celulosa) desempeñan un papel

importante en la biosfera reciclando este polímero.  Existe una diversidad de estos
microorganismos, bacterias y hongos aeróbicos o anaeróbicos, mesófilos o termófilos que
producen las enzimas celulosas. Algunos de ellos son: 
Dentro del grupo de hongos aeróbicos, el hongo filamentoso Trichoderma reesei es uno
de los más estudiados y se caracteriza por su efectividad en la degradación de la celulosa
nativa y cristalina mediante su complejo celulolítico que presenta las tres actividades
necesarias para la hidrólisis de la celulosa (endoglucanasa, exoglucanasa y β-
glucosidasa). Otra ventaja que presenta el uso de este microorganismo, es su estabilidad
en reactores agitados bajo condiciones de pH ácido y a 50 ºC durante 48 hs.

Entre los microorganismos, los termófilos son de interés por su capacidad para producir
enzimas celulolíticas termoestables, las cuales son en general estables bajo condiciones
severas, incluso en niveles de pH altamente ácidos o alcalinos así como temperaturas de
hasta 90 °C. 

Las enzimas celulolíticas producidas por las bacterias del género Bacillus presentan
básicamente actividad endo-β-1,4-glucanasa y exo-β-1,4-glucanasa; pero tienen una
característica particular, en especial las enzimas de Bacillus subtillis y es la resistencia a
ser inhibida por la propia glucosa o celobiosa que producen.

En la actualidad existen disponibles numerosos preparados enzimáticos comerciales que

contienen principalmente actividad celulolítica (endo-β-1,4-glucanasa, exo-β-1,4-
glucanasa, β-1,4-glucosidasa). Estos preparados enzimáticos son obtenidos de
microorganismos de origen fúngico y bacteriano, que principalmente provienen de los
microorganismos Trichoderma sp., Aspergillus níger y Bacillus subtillis.
 2. PROBLEMA
2-1 problema general
¿Cómo se degrada los sustratos vegetales utilizando actinomicetos de estiércol de
ganado vacuno?

2-2 problema especifico

 ¿Se aíslan actinomicetos en el estiércol de ganado vacuno?
 ¿Cuál es la velocidad de degradación de los sustratos utilizando actinomicetos?

3. OBJETIVO
3-1 Objetivo general

 Determinar el porcentaje de degradación de los sustratos vegetales utilizando

cepas de actinomicetos
3-2Objetivo especifico

 Aíslar actinomicetos de estiércol de ganado vacuno

 Evaluar el tipo de degradación de los sustratos vegetales utilizando diferentes
cepas de actinomicetos aislados de estiércol de ganado.

4. HIPOTESIS
Hipotesis General

 Los actinomicetos aislaos del estiércol degradan x%

Hipótesis especifica:

 Se logra aislar actinomicetos del estiércol del ganado vacuno

 Se logra degradar los sustratos vegetales en 5 dias utilizando cepas de
actinomicetos (Un aprox- de 5 dias )

5. METODOLOGIA

Materiales:

 Incubadora
 Matraz
 Placas Petri
 Asa de kolle
 Porta Objetos
 Cascara de papa
 Caldo de cultivo
 Nistatina
 Guantes quirurgicos
 Avena
 Cicloheximira
 Tubos de ensayo
 Agua peptonada
 Encubadora Casera

PRESUPUESTO TOTAL DEL PROYECTO:

-Haciendo una breve recapitulación de los materiales el presupuesto del proyecto tendrá un
costo de S/ 257.40. El cual será dividido entre los 4 integrantes del grupo.
Aislamiento de actinomyces:

Hacemos uso del medio Agar Avena por recomendacion de Franco-Correa, junto
al método de diluciones seriadas; la composicion para un litro del medio: 30 g de
Avena en hojuelas, 15 g de agar-agar y 0,1% de nistatina; para el aislamiento
tomamos 10 g de suelo en 90 ml de Agua peptonada (AP) 0,1%, despues de esta
dilución inicial se prepara diluciones sucesivas tomando cada vez un mililitro de
solución y adicionando 10 ml de AP para poder alcanzar una dilución de 10 -9.
Luego se cembra 0,1 ml de cada dilución por superficie, en el Agar Avena vertido
en placas petri, realizamos tres veces la siembra para cada dilución. Para
finiquitar lo incubamos a 28°C durante 10 días. Desde del día 3 de incubación se
hace el recuento de todo el crecimiento microbiano que empieza en cada una de
las diluciones efectuadas en las placas, así, hasta llegar al día 10, para luego
clasificar las unidades formadoras de colonia (UFC) por gramo de suelo de cada
sub-ecosistema. El recuento permite identificar por morfología macroscópica
posibles colonias de Actinomicetos, ya una vez identificadas son aisladas para la
purificación por medio de repliques en Agar Avena.

Identificación de actinomyces:

Realizamos una identificación macro y microscópica de cada colonias

obtenidas en el medio del agar; macroscópicamente se observan las
características de crecimiento considerando textura, color, forma,
superficie y borde; microscópicamente hacemos el debido
reconocimiento mediante de la tinción de Gram y haciendo uso de la
técnica de Microcultivo de Ridell, para observar de major manera el
crecimiento de micelios aéreos de los posibles actinomicetos.

Para técnica de Microcultivo se necesita realizar una siembra por

agotamiento del posible Actinomiceto en medio agar avena, una vez se
observa el crecimiento de la colonia característica macroscópicamente,
se procede a realizar una cuadricula en el medio con un bisturí estéril asi
obtendremos unidades de 1 cm de lado por 3 mm de espesor y la
llevamos a un frasco con 50 ml de agua destilada estéril, realizandole
una agitacion continua. Tomamos una placa Petri con medio sin inocular
y se siembre 1 ml de la solución que ha sido ya agitada y para poder
homogenizer dbidamente esta siembra; posteriormente se toma un
cuadro medio recién inoculado y lo colocamos en un cubre objetos
soportado en dos palillos ubicados en la placa Petri (debidamente estéril);
este montaje requiere debida hidratación por lo que se ubica un poco de
algodón humedecido, en un extremo de la placa; se incuva a 28°C
durante 10 días

Realizamos observaciones a los días 3, 6 y 9, tiñendo con azul de

lactofenol el agar y el cubreobjetos y despues se hace tinción de Gram al
portaobjeto; tambien se comparan las estructuras miceliares en los dias
planteados anteriormente con la clave taxonómica de Bergey.
(Identificación de género parcial).

METODOLOGIA DE DEGRADACION
Utilización del sustrato vegetal por parte de los microorganismos
celulolíticos seleccionados:
Para la realización de este proceso se emplearon dos medios: uno con sustrato vegetal a
concentraciones del 5%(p/v) y 10%(p/v) junto con los componentes del caldo celulosa
exceptuando la carboximetilcelulosa, llamado medio sustrato vegetal suplementado (SVS)
(Anexo 1) y otro, compuesto de sustrato vegetal en las mismas concentraciones, extracto
de levadura (2.5g/L) y peptona (2.5g/L) llamado medio sustrato vegetal (SV) (Anexo 1).

Pruebas preliminares de actividad celulolítica de las cepas seleccionadas

(Individualmente)

Las curvas preliminares para evaluar el comportamiento enzimático y la subsecuente

liberación de azúcares reductores utilizando las cepas aisladas y seleccionadas en las
pruebas de antagonismo, se llevaron a cabo en caldo CMC al 1%(p/v), 3%(p/v) y 5%(p/v)
y SVS al 10%(p/v).

Inicialmente estas cepas fueron reactivadas del banco en cajas de agar CMC al 1%(p/v) e
incubadas a 35ºC durante 48 horas. A partir de cada cepa se hizo un raspado en caldo
8
CMC 1%(p/v) llevando a una concentración de 3 x10 cel/ml e incubando a 35ºC y
120rpm durante 24 horas.

Las fermentaciones se llevaron a cabo por triplicado en un VET de 250ml adicionando el

10% de inóculo, con un tiempo de duración entre 18 y 24 horas, a 35ºC y 120rpm,
muestreando cada dos horas hasta completar el tiempo de fermentación. En cada una de
las horas de muestreo. En cada una de las horas de muestreo se realizó la determinación
de azúcares reductores por triplicado mediante la técnica de DNS (Numeral 5.7).

Además se evaluó Actividad enzimática en CMC al 1%(p/v) en buffer fosfato pH7 37ºC y
buffer acido cítrico pH5 50ºC relación 1:1 (numeral 5.8) con tiempos de reacción enzima-
sustrato de 30’, 60’ y 120’, realizando cada una de estas evaluaciones por triplicado.

Evaluación de la actividad celulolítica de las cepas seleccionadas (En consorcio)

Para evaluar la actividad hidrolítica de las cepas en consorcio se realizaron

fermentaciones en caldo CMC al 1%(p/v), caldo SV y SVS en concentraciones del 5%(p/v)
y 10%(p/v), cada uno, con un VET de 1000ml, . adicionando 10% de inóculo repartido en
volúmenes iguales de cada cepa a evaluar ; incubando a 35ºC y 120 rpm durante 18-24
horas. La biomasa inicial fue determinada mediante recuento en placa, en el caso de
bacterias y recuento de conidios en cámara de Neubawer, para microorganismos
filamentosos. A partir de los muestreos realizados la determinación de azúcares
reductores mediante DNS (numeral 5.7) y actividad enzimática en CMC al 1%(p/v) en
buffer fosfato pH7 37ºC y CMC al 1%(p/v) en buffer ácido cítrico pH5 50ºC, relación 1:1
(numeral 5.8) con tiempo de reacción enzima- sustrato de 60 minutos.