O contenwwos © Introduccion © Las enzimas como catalizadores bialogicos (© Mecanismo de accién de las enzimas © Cinética enzimatica (© Regulacién enrimitica © owjenvos Det APRENDIZAJE © Conocer la funcion de las enzimas y comprender su mecenismo de accion. © Comprender el significado de los principales perdmetros cinéticos. © Interpretar los datos obtenids en estudios de cinética de un solo sus treto. © Diterenciar tos diferentes tipos de inhibicion reversible mediante la terpretacion de los parimetros cinéticos, © Diferenciar los principales mecenismos de regulacién enzimatica, Una vez comprendidos los principios que rigen la espontanei- dad de las reacciones biologicas es necesario establecer otro aspecto que va a condicionar su eficacia: la velocidad a la que se producen en la célula. En este capitulo se descrite el mecanismo mediante el cual las enzimas aceleran las reacciones insistiendo en su relacién con la estructura proteica descrita en el capitulo 5_y con los funda- mentos energéticos analizados en el capitulo 7. Acontinuacién se realiza un andlisis de los datos experimentales que se obtienen en las cinéticas de un solo sustrato resaltando como su interpretacion puede facilitar la comprensién del me- ‘canisme por el que transcurre la reaccién catalizada. Por tiltimo se exponen los principios que rigen la regulacion de la actividad enzimatica necesarios para la coordinacién de las, numerosas vias que se desarrollan en la célula y que se estudian con detalle en los capitulos del metabolismo celular.122 SECCION I. LA ENERGIA V LAS FUNCIONES CELULARES QINTRODUCCION En el capftulo anterior se ha descrico cémo los valores de energia libre de los sustratos y productes determinan que una reaccién sea favorable miencras que otras reqiicran energia para poder tedlizarse. Pero el hecho de que una reaccion sea exergénica no implica que se desarvolle a una velocidad eficaz en condicio. ines fisioldgicas (pH, temperatura y encomo idnico). En este capitulo se va a es tudiar el papel de las enzimas, unas moléculas sintetizadas en la eéiula que acele- tan de forma muy selectiva y eficiente las reacciones que se dan en el entorno celular. La mayor parte son procefnas, aunque existe un pequefio grupo de mo- léculas de RNA oon actividad caalica atiboximas, Como sever lo largo de este capitulo, el mecanismo de actuacién de las enzimas implica la necesidad de mantener su'estructura tridimensional y, en aquellas proceinas oligomésicas, su estructura cuaternaria a principal vencaja de las enzimas frente 2 lor catalizadores inorgénicos es aque actian en condiciones suaves de pH y temperatura, con una gran eficiencia y.ademas, de forma muy especifica. Existen numerosas enfermedades celacionadas con Ia alteracién de la activi. dad de clettas enzimas. Por ese moto, las enaimas cienen. un gran interés parz las ciencias biomédicas ya que son las principales dianas de un gran ntimero de firmacos, Por ejemplo, Ia aspirina, tiene efecto anvipirético y antiinflamatorio orque inbibe a la prostaglandina H, sincasa, una de las enaimas implicadas en (E ciesc de prostaplancdina (yete tapi 3}. Tabi lx enaaas que sn vitales para la supervivencia de bacterias y virus constituyen el blanco de algunos férmacos contra estos organismos infecciosos, como es el caso de la transcriptase inversa del virus del SIDA. El capitulo empieza analizando el mecenismo por el que las enzimas consi sguen acclerar las reacciones desde un punto de vista energético, A continuacion Se muestra cémo los datos obtenidos de los estudios experimentales de cinética cenzimavica pueden aportar informaciSn para compreneler el mecanismo de ac- tuaci6n de las enzimas y los mecanismos de las reacciones qufmicas que cata an, Para finalizar el capitulo se exponen los principios mediance los que se ce- sult a actividad de estos catalizadores biolégicos. LAS ENZIMAS COMO CATALIZADORES Clasificaci6n de las enzimas ‘Existe un sistema internacional para la nomenclatura y clasificacién de las enzi- mas creado por la Enzyme Commision (EC) de la TUBMB (International Union of Biochemisery and Molecular Biolog) que evita imprecisiones y ambigtiedades. Segiin este sistema, las enzimas pueden clasficarse en varios grapos, segin el tipo ‘de reacciones que catalicen, Como puede verse en la tabla 8-1, exsten seis clases principales, cada una con diferentes subclases, Las reacciones catalizadas por las Ciferentes cases de enzimas e explican con mis detalle en et recuadro 8-1. COS 1. Oridorreductasas | Deshidrogenasas oxdase,recuctasas, peronidass,catalasa, oxgenaas, hdroxlasas 2 Transteasas | Transulcolasas y transcetlaas,fosoritransterasas, quinasas, Fostomtaes 3. Hirolaae starsat, lucosdaras,peptidaea,fosfatsar, tole, fosolipaas iridicae,decaminaeae, ronureseae 4. Lines Deicerboxiass,algolsas,Hidratasas, deshieratass,snass, ass 5. Isomerasas Racemasas,epimerasas, somerasis, mutasas 6. Ligases Simeiasas, carboxdasasccaviruto s.eNzMas VcaTAUSIS 133 4. Osidorreductatas: catlizan resccienas de ovidaion y reduceén. Les electones que resultan limirades ce la sistancia que se oxida son aceptados por el agente que causa la oxcacion (genie cxidante), que suite asi un proceso de reduccion. Ei princi agente oidante eset {ue esta implicado en numerosasreacciones ce oxidacion jeversbles. 7 los satemasbiclop= ‘os, ©: FAD 3 NAD" partici en nimierosesreaccones de oxidorreduccon, 2, Transferasas: tanifieren un grupo quimico de una molécula a ota. Las quinasas, muy impor- tantes en muchos precesos bogies, sen un bpo especal de trarsferases que cataliza (a Hansforenca de un grupo fotato 3 att mslécula dete sin nuclegsic tnfostato 2. Hidrolasas 507 un tad especial de transferases ue arsferen un grypo OM deste el agua ‘otto sistate Se sagregan del amerisr grupo ce ensimas po! su caractr rrevercble Fl cutrato ‘ipico suele ser un enlace éster (nclayende el fosiodéster de ls cidos nuclics) 9 amid 4. Listae: goneraimente catslzan ls cision reversible de ences carhone-cxboro ome ene ‘aio ce ls aldoiasss (vase figura). Fn algunos casos, como consecuencia dela rupture dl en~ lace, se goneran nuoves dobles enlaces o aniles, tras enzimas de.esta case forman y rompen feniaces C—N1 ollberar CO, (esarboxtacom), el caso de formacion de enlaces estas ena- imat ro roquiran energia de nuclobsios trifseste y se denomiran sintasas. Un ejemplo ce Sletata esa itrato siotasa que cataliza la primera etapa del cico cel scido elie’ Ia condensi- ion cel acetilCoA con el oxaacetato para da’ civato. 5. Isomerasas: catalizn reatciones que supaner un movimiento de un grupo 0 un doble enlace destro de la melécila, lo que hace que se obtenga un nuevo isbmero (conversion ¢€ formas O 21, epimerasas Sie cambia a poscion de un grupe fefato la erzia so ame mutasa, 6, Ligasas: cataizan la formacion de enlaces carbono-catbono, pero, a diferencia de ts tases ‘giupo 4) requieren enerpa que obiienen de la ndrolsk de ATP ye denominan sintetasas. Para nombraila, se puede utilizar el nombre tradicional, que suele obtenerse aftadiendo al sufiio “asa” al nombre del sustraco 0 al tipo de reaccién que catali- zan, Pero existe un nombre sistemético que indica mas detalles sobre la reaccién, Cada enzima se designa con las letras E.C, con tn subindice de cuatro nimeros que indican los siguientes aspectos: + Primer digito: nombre de la clase de enrimas (del 1 al 6, siguiendo la clasi- ficacién de la tabla 8-1), + Segundo digito: subclase (normalmente el tipo de sustrato, el donador de electrones o el enlace afectado). + Tercer digito: aspectos especificos de la reaccién (sustrato, grupo funcional que participa en la reaccion, etc.) + El cuarto digito sefala el ntimero concreto que ocupa la enzima dentio de ba subclase Un ejemplo determinado seria Ia lactato deshideogenasa, cuyo nombre sste- mético completo seria L-lactaro: NADY oxidorreductasa, que indica que el L taro actia como donador de dectrones y el NAD* como aceptor. Mediante el sistema de cuatro digitos esta enzima es la E.C, >. en la que el primer digito indica que pertenece ala clae de ls oxidorreductasas, el segundo que el L-lactato es el donador de clectrones y el tercero que el aceptor de elecirones es el NAD". El cuarto digito permite diferenciar esta enzima de otras que catalizan Ia misma reaccién sobre un sustrato diferente. Por ejemplo la E.C, , designa a la enzima alcohol deshidrogenasa, que cataliza la oxidacion de un alcohol a un aldehido. Cofactores, coenzimas y el papel de las vitaminas Los analisis de cristalografia de rayos X y RM (Resonancia Magnética Nuclear) hhan demostrado que numerosas enzimas tienen un componente no proreico, denominado cofactor (cationes mevilicos) 0 coenzima (moléculas o1génicas), que es necesario para su correcto funcionamiento. En este tipo de enaimas que requieren un componente adicional, la porcién proteica se denomina apoentima y la molécula completa holoenzima (la apoen- zima més un cofactor o coenzima) (Fig, 8-1). ‘Numerosas enzimas utilizan cationes metilicos como cofactores (Tabla 8-2). ‘Como se indica en posteriores apartados, estos cationes tienen diferentes funcio nes dependiendo de la enzima concreta. Por ejemplo, las quinasas no son activas cen ausencia de Mg™ (véase Fig, 8-11). G4,0H Dinidroxiacetona fostato HcoH cH,0PO} -Gliceraldehido- “Hrostato134 _SECOON U. La ENERGIA ¥ LAS FUNCIONES CFLULARES —wW Figura 8-1. Holoendima y apoenzima. Al- unas enzimas necesitn una porcién no * FF Dratelca para desempetar su furcién: «i or un eatin metdice s2 deromina cofactor y 41 es una moléculs orgies, coensima. La porcln proteica se deromina spoenzina, y Apeerzima Cofactor 0 coenzime Holoenzims ls emma compet, holverzima, (porcion proteica) (porcion no proteica) (toda la ersima) Las coenzimas son necesarias para transportar de forma transitoria grupos Funcionales durante la reaccién catalizda por la enzima, Muchas von productos derivados de vitaminas y su unidn a la porcién protica puede ser covalente 0 Citecromo oxdaia, amino | 9 covalente (Fig. 8-2). Por ejemplo la mayoria de las carboxilasas (ensimas que ease : catalizan la incorporacion de CO.) requieren biorina, que «sti unida por un Sag) lace aida a un residuo de Lys de la enzima, mientras que la tiamina pirofos ‘cocrorro oxitasa, fato (que proced dela vitamin B, o tamins) se une por interacciones no cova perondas, casa lentes (Recuadro 8-2), ¥ remoqe Muchas de las reacciones de oxidorreduccion que se dan en la oélula son ca- We! Neaunas gasp | Tlizadas por deshidrogenasis que utilizan dos coenzimas que son derivados de me" | hesoquras, gucon § Ja molécula de niacina: el NAD y el NADP" (véaee capil 6). La alterancia feiss Prue gut _| de estos compuestos entre su forma oxidada y redueida permite que actden re como aceptores o dadores de electiones seg reacci6n, En la oxidacion de un susttato como el malato se produce una perdida de dos dtomos de H (que se = pueden considerar como 2 «+2 H') de la siguiente forma: el in hidkuro ee e+ 1H) es transferido desde el susteao directamente a la cocnzima mich. se lutatin perovies tas que el otro protén es liberado al medio (Fig. 8-3). EI NAD" suele utilizarse a scrogeraa | S00 coenzim en las reacciones de oxidacion de las rutas catabslicas, mientras ze Giboupeptaser nya | que el NADP* participa en las reaciones anabilicas de reducidn (weanse capi a i tulos 67). ena eee QUMECANISMO DE ACCIGN DE LAS ENZIMAS Gerina puede compete ser Funcién de las enzimas. Principios energéticos paren de getlogis debs 8 mies . mes cuninie, mene dlinii Sehelala Weconctseeccanoraet, [4S enzimas(E) tienen un papel fundamental: acelera las reaccones biolégieas Protens con el P), se representa en un diagrama del curso de Ja reaccién I energfa libre de Gibbs frente al progreso de la reaccién. En una reaccién quimica espontinea (exergénica), la energia basal del sustraro 3 mayor que la del producto, por lo que el AG tiene un valor negativo (Fig, 8.5) (véase capieulo 7). La presencia de una envimna no va a vatiar esta situactén cenergétice, que seguir definida por sus parsimetros termodinémicos, Si se obser- va la reaccién (1) Ta encima aparece en ambos lados de la reaccidn (siendo, por lo tanto, un reactivo y un producto), por lo que no se modifica el valor de la ccnergfa libre de Gibbs del sistema, que contintia siendo: AG?= @ siendo [P)/[S], la K'de equilibrio (K,). Por tanto, se puede concluir que las enzimas no akteran el equilibrio entre productos y sustratos pero, al acelerar la velocidad de reaccidn, consiguen que se alcance de forma més répida este equilibrio. De esta forma, si existe suficiente «cantidad de sustrato ([S)), se podrén conseguir mayores concentraciones de pro- ducto ({P.) por unidad de tiempo en presencia de enzima que en st ausencia (Fig. 8-6), La energia de activacién y el estado de transicién ‘Como ya se ha indicado, para que se produzca la transformacidn del sustraro en producto hay que pasar por una situacién intermedia que supone la distorsion de enlaces y la orientacion de grupos funcionales que lleva ala formacion de un cexado molecular transitori: cl estado de transicidn (Recuadro 8-3), que se en uentra en un nivel energético superior al etado del que parte e sustrato o es tado basil (véase Fig. 8-3). Esto implica que, aunque la reacein sea espontdnes, se tiene que superar esta barrera energética (AG") que se conoce como energia de activacién, 1 catilisis ensimética se consigue rebajando esa barrera mediante la ventaja energética que supone la creaciSn del complejo enzima-sistrato. La velocidad esta relacionada con la energia de activacién En el grifico de coordenadz o curso de la reaccidn en el que se representan las vvatiaciones energécicas de la misma reaccién en presencia y ausencia de enzima (ig, 8-7), se puede ver que el catalizador consigue rebajat la energja de activa- ion. Como yase ha expuesto en ol capitulo de termodinimica la via por la que tn sistema pasa de un estado inicial a uno final no altera la esportaneidad de la reaccién (AG es una funcién de estado) pero, como veremas a continuacién, si tiene una gran influencia sobre la velocidad a la que se desarrolla, Las enzimas aceleran las reacciones quimicas creando vias alternativas de me- nor energia de activacién y lo hacen fundamencalmente por dos mecanismos:CAPITULO 8. ENZIMAS ¥ CATALISIS 137 So Provedles qumics deren: produ. etado de tanscon er ura etruun qe a Sine urs tansomacn y ue no ene la popes dl susrat de padi, Nose Ge eUnpuee coe Vcc cee ter nett cereei eae Oe eee te ee ® fis ye se coat por tener una eae ener re de Gibbs Ena reicelon no cla b Ehlghra ee estado enegece upon aon bares Gea econ, ise analizan ls etapas que se dan en na reaccén quimicay se tienen en cuenta sus aypectos ‘energeticos, se pueden entender 10s motvos por los que Hl paso desde e esac ica al estado ids transién supore un aumenta de energia. Fara que se forme una especie molecular rueva 3 partir de un sustrata, tene que producirse una dstorsion en sus enlaces que supone un consumo ‘de calor por parte del sistema. por Io que el incremento de entajpia sera positvo |AH> 0) Ade- ‘ras, ls grupos funcionles que reaccionan se tienen que oventar an el expacio de una forma 55 productos concreta para que cueéan eacionar, Esto supone una feduccion ce libertad de rovimientos to ‘que implica una disminucion ce a ertropia y hace que el AS tenga ur valor negatho. Ey los con~ Eeptes Ge termodinamica Gescitos en el captule 7, se Gescbe que la energie Ubye Ge GDS de UN Sitema carrsponde a la eigubnts formula: AG= AM TAS de [a que te deduce que al valor de [Ng para la formacign cel estado ge tanscion Tene un valor positvo, Remontar esta bareraener- gets (energia Ge activacion) es datermirante para que et sustatolgue 9 acanzar este estaco de ‘ransieién y se eanwerta on produto. Estado de transicion 1, La formacién de enlaces covalences o la transferencia de grupos funciona. Jes entre determinadas grupos funcionales de la enzima y del suscrat. 2. La creacién de interacciones no covalentes entre la enzima y el sustrato que van acompafiadas de una liberacién de energfa libre (XG-), llamada energja de unién o fijacidn, que rebaja la energia de activacién, Ftado de transicion ) Ambas situsciones se dan gracias a la formacién del complejo binario enzi- ma-sustrato que, ademds, confiere a las enzimas una gran especificidad, Aunque mas adelante se analizarin con detalle estos mecanismos, ahora se va a considerar qué consecuencias tiene esa disminucién de la energia de activacin sobre la velocidad de reaccion. En primer lugar, hay que tener en cuenta que Ia velocidad de cualquier reaccién (S— P) estd determinada por la concentiacién de sustrato y una corstante la constante de velocidad (4), con la que se selacio- Conrderada Be eacaon nan mediante la expresion matemtica ve Energia bore ge ides Figura 6-7, Diagrama del curso de una re- is} (3) accién catalizada y sin catalizar. En fre Sin entrar en detalles sobre la deduccién de la formula, y sise aplica la teoria 3060 coils os teetioies ¥ del estado de tansicién, se obtiene una expresién matematica que relaciona la 26uPanairss memes 7's Sagar 3 magnitud de la constante de velocidad (&) con la energia de acrivicion (AG): (Hen Seacdeacaete s raccoe cole ia 3 AG.) es rence que Bde a misma eat AE oer (4) lon si eaiaar QC) Donde Ay ¢s la constance de Bolezman, / es la constance de Plank, R la constan: cede los gases nobles y Ta temperatura absolura. Lo importante de esta ecuaciOn es que refieja cOmo 1x constante de velocidad (# esti relacionada con la energia de activacion de forma inversa y exponencial Esto nos indica que un pequetio descenso en la energia de activacién supone un aumento considerable de la velocidad de la reaccién, Las interacciones en el complejo enzima-sustrato son éptimas en el estado de transicién ara entender cémo se ealizan las interacciones en el complejo ES se han pos- tulado varios modelos. EI primero fe el denominado modelo “llave y cerradu- 12” propuesto por Emil Fischer en 1894, En este modeo, las enzimas se consi- deraban estruccuras rigidas complementarias a sus susttatos a los que se acopla- than de igual forma que lo hace una lave a una cerradura, Esce modelo explica la cexpecifiidad entre enzima y sustrato, pero no permite explicar cbmo se produce la reaccién de una forma cficiente. Para su mcjor comprensin se puede recurrit alejemplo de la siguicnce reaccidn: la wansformacion de un sustrao esférico con ccargas elétricas negativas en su superficle en un producto cubico sin carga (Fig,13R_secciOn LA EWERGIA Y LAS FUNCIONES CHLULARES 8-82). Searin el modelo de Fischer; la formacién del complejo ES estan estable ‘que cualquier transformacién posterior haria que se perdieran interacciones dando lugar a una situacién menos esable que el complejo ES y, por anto, no tendria higar la formacién del producto (Fig. 8-8b). Sin emburgo, siel sitio ac- tivo es complementario al extaclo de transiciin, ea una primera etapa se puede crear un complejo ES en el que se establecen unas interacciones débiles y esta craps puede pasar de forma espontinea a otra mis extable de interaceién entre la enzima y cl estado de transicién en la que se ganan interacciones. La transfor macidn del exado de cansicién en dl producto hace que la exzima pierda su afinidad por esta nueva molécula, que 6 liberada del cencro activo (Fig. 8-80). Fue Linus Pauling en 1946 quien propuso que el verdadero encaje Tlave-ce- ‘radura no ocurria entre el sustrato y la enzima, sino entre el estado de transi- cidn y la enzima. Posteriormente, Daniel Koshland postulé un mecanismo que permitia explicar el aumento en ia eficiencia de las interacciones no covalentes ue se establecen entre la enzima y el sustrato. El modelo propone que la inte- raccidn entre ambas moléculas hace que la protein suira un cambio de confor- ‘macién que permite la formacién de interacciones adicionales entre la enzima y el estado de rransicién y se conoce como el modelo de encaje inducido (Fig. 8.9), Los estudios sobre la estructura tridimensional de proteinas han confiema do que excasituacién oeurre realmente. (a) Reaceiin sin ctaizar Sustrato Estado de Producto Energia lnre. Enzima con centro activo 3 sustrata complementario. (b) Modelo de Fischer (lave y cerraaura) Susrato ag s 2 compl complejo s| cumeuarte exameetto ‘uy cate deumeigon é or pees interaccianes) (© Nodelo de estado de tarsicn 2: @- @-@ complemertario at estado se tronsicin Complejo (Ge crean Ineeracciones) Complejo sorima cstado Ge transiién Producto (se ganan Interacciones) Energia bee, G Figura #8. Modelos de formacion del complejo enzima-sustrato. (2) Reaccin sin ctalizar en la que el sustato pasa or a formacién de un estado de transicion nesteble.(b) En la reacion en lz que el cent activo ¢e la ensima es comalementaro al sustrato se forma un complejo FS ‘muy estahle cue no favarece que el strato <8 transforme en estilo de transcion, porque se perderan interacrienes cris energeicamente Gesfavorabe. (c)S [senza es eomplamertaria al estado de wansicén, se forma un prime” eomplsjo ES can una interaccianes vee qua fe ¥o- fan mejores cuando el susvate se warsforma al estado de Wanskidn, La reacién 4 ve favored y € estado de franiién converte en producto: al perder ls cargasnegatras,pleide ainidad po! la enzima, dela que Se Usocu, Se muesta el cagrama de curso dela reaccion en [bs tres stuacores aesents,CAPITULO 6. ENZINAS Y CATALISIS 139 Las interacciones entre enrima y sustrato son de naturaleza no covalente, de forma que una porcién polar del sustrato interacciona con una porcién polar del centro activo y una regién apolar interacciona con las cadencs laterales de residuos apolares que se suele denominar “bolst hidrofébica” (véase Fig. &-4). Mecanismos quimicos para la estabilizacion del estado de transicion La energia de fijacién proporciona especificidad y catalisis Se ha descrito en apartades anteviores cémo la fijacién del sustrao en el centro activo proporciona un AG negative que rebaja la energia de activacién. En este apartado se analizan los principales factores que contribuyen a esta disminucién de Ia enengia de activacén. En primer lugar, la formacién del complejo ES mantiene al sustrato en la orientacion correcta y facilta las interacciones entre los grupos funcionales que van a reaccionar, a diferencia de lo que ocurre en una reaccion en disolucién en Ia que las colisiones se producen al azar Por otra parte, las interacciones débiles que se forman entre ensima y sustra- to sustiruyen las interacciones que existian entre las moléculas y el agua. De esta forma, si se elimina la capa de salvatacién del sustrato, se facilita su transforma cién en producto, Es importante resefiar que la ausencia de moléculas de agua en la belsa hidrofdbica del centro activo aumenta las interacclones no covaleates centze la enzima y el estado de transicién del sustrato. Mediance el "secsestro” dlel sustrato en eite centro activo, se elimina la barrers energética impuiesta por las interacciones de las moléculas de agua con el propio sustrato, y el incremen- to de interacciones no covalentes entre enzima y sustrato acelera la reaccidn. Por iiltimo, las interacciones dbiles creadas entre la enzima y el estado de transicion compensin situaciones termodinamicas inestables, como la posible aparicién de cargas debidas a redistiibuciones electwnicas durante el proceso de transformacién de sustravo a producto (véanse Recuadro 8-3 y Fig, 8-10¢) La presencia de grupos cataliticos especificos permite crear rutas alternativas de menor energia de activacion Hay numerosas reacciones enzimaticas en las que se producen reacciones transi corias entre la enzima y el sustrato que, junto con la enengia de fijaci6n, contr buena reba a energ de activactn aeerando de forma epeffica las reac ciones catalizadas Los mecanismos por los que la enzima consigue rebajar la energia de activa cin mediante la unién con ciertos residuos se pueden clasficar en cuatro gru- pos principales: Catdtisis dcido-bose generat Una forma de estabilizar ls cargas que aparecen en un estado de transicibn es la transferencia de protones desde o hacia el sustrata. Como se ha visto en el capi tulo 4, existen cadenas larerales de ciertos aminoscidos que pueden acruar como aceptores o dadlores de prorones (véase Fig. 4-8) que son las que participan en seis reacciones (Fig. 8-10a y b). Este tipo de reaceién se da en mischas protea- sas en las que este papel lo desempefia el grupo imidazol de la His, Fore mecanismo se diferencia de la carilsis 4cida-base specifica, en que la transferencia de protones en este tipo de catilisis se realiga entre el sustrato y el agua Catalisis covatente En este tipo de reacciones se crea un enlace covalente transicorio entre la enzima y el susteato, que produce catdisis sempre que esa nueva via para alcarnzar dl producto final tenga menor energia de activacién que la que se desarrolla en ausencia de catalzador. Un cjemplo de este mecanismo es la formacién de un enlace éster con el grupo ~OH de la Seren numerosas proteasas (Fig. 8-10e) o Figura 8-8, Modelo del encaje Inducido de Konstand. (a) Represemacien oe ta hexo- ‘quinasa en aurencia ce sstrto PDE TH«G), (b) En presencia del sustrato, la enzina sure Cambios e1 su conformacién que aumentan las imteracciones entre amas moleculas (@o8 GLK)140 __StCOs6ni 1. LA ENERGIA V LAS FUNCIONES CRLULARES @ o © © centro actvo de la proteaca Zo HN New Hh kro Ht Ho RoN—C—k, 2 ih thin Ry-Ni, CR, 40 Enlace nif peptidco Nw ly Ser Figura #10, Catalisisicido-base general y covalente en una proteasa. én slguras proteases la ruptura del enlace peptiico combina dos me- anisms de estabilzactn del estado de tansicién. Se muestan, de forma smpificada, algunas etapas. (a) Fl grupo ruclsfio dela Ser pierde un proton, que es aceptaco por el grupo imidazol ce una his (atlssacido-base genera). (®) Como consecuercia aumenta a reactwidzd det r= Alobilo de fa serina (0°, que atzca al grupe catborifo del enlace peptdic. (6) Se forma un intermedia inastable con una earga negatva que resulta estabilizada por dos hid 6genos con carga parcial postiva del enlace pepidic de des residuns dl centro activo. El péptido queda undo de forma transtoria mediante un enlace covaiente a residue de Ser (catlss covalente), (@) El enlace pegtidco se rompe mediante la adicion de una molecula de agua. quecanco lz enzima en su stuacion inal [En muchas de estas reacciones intervienen reactivos electdiilos y nucleofilos por lo que conviene recordar estos concepces (Reeuadro 8-4). Catilisis por iones metéticos Los jones metilicos pueden actuar de diversas formas en la reaccién catalizada: + Orientando el suserato de la forma adecuada para gue reaccione, + Estabilizando cargas en un estado de transicién inestable, ne Nuceéfios tlecréfioe ruptra det erlace Coratente se sel product con un reparto ee a desgil de los clecrones comparios ee supone baparicgn de -9 £ {soeces nica: Ese tipo de enccon se cenomina eteolitica as Se produca como consecuenta dela interencion de dos tipes de Oxifeno cargado negatiramente 5 reactor nuceofibsy elecréflos. Para smtender bs cacti ticas y la forma de actuar de estos reactivos es necesario estable- oe Atomo de carbono de un See ee eae sees {Gh is que se repesenan is pce acclcnes que e pode, Suid cargo cegatvarente —aoupe DGS ne ‘ah en fermoctny atin de enares easoe ttle Par de electrones no enlazados (GH) t, (9) Movimiento de pares de elecrones Carbanién (~) Moemiento Ge un solo electron = eee los reactvos nuctedfites (en azul en (a figura) son especies quimi- i Srupo imino protorado (5 que tienen afinidad por zonas con una baja densidad slecioni- eats pel sage eli te «que ee aad ot nascon naga densa eco. apipg no anaes amnta tc electrofilos (« {a figura). ide ‘ce ie os actos electtes (en open fur) teen gran aide a De o-f=0 por centros de elevada densidad electrénica, Son especies defi- NAY Le Gentes er electrones que tienen orale: vacos y pueden tener en ° oe aueecme rae Sow pore eae la elininacion de un poten de certo eartvos nue puede He ce ee ete) eee at nea tn heronkdo ie rin guns Alona F7OW) 6 colhtnle a sees ae proten fantom en 0" y —S que tenen ut coc m poten Fleafio miy superior al de le formae arotonsdae neutra.CAPITULO 8. ENZINAS Y CATALISIS 144 + Facilitando reacciones de oxidorreduccién gracias al paso rever- sible de su estado de oxidacién. * Cambiando la polaridad de ciertos enlaces para hacerlos més suscepribles a ciertos reactivos Esta tltima fancies necesaria cn las reacciones de fosforilaciin de ciertor aminodeidos que tienen un grupo hidroxilo, La fosfola ciéa se produce por la transferencia del grupo fosfato desde el ATP 0 el GTP (ig. 8-11). Los cationes de magnesio hacen que los eleciro- nes se alien mds del fésforo (ceactivo electrfile) que queda més susceptible al ataque por el grupo nuclesfilo (~OH de Ser, Thr 0 paw: HB on OF Tyo) con lo que se promueve la hidrolsis de! enlace fosfoanhidrido y se consigue su cransferencia desde el ATP a la cadena lateral del ami- bead noicido. Figura 6-11, Los catlones metaicos como cofecto- En muchos casos las enzimas utilizan una combinacién de estos rat en tas quinasas. La fstoriacion de las cacense ‘mecanismos para conseguir un aumento de la velocidad de la reac- laters de Ser, Thr Ty catalzada por las quinsas ciéa. Un ejemplo de esta combinacién se da en la quimotripsina, _cemienza por el ataque del grupo nuclesflo OH 3 tuna proteasa que combina la catilisis covalente con la catdlisis écido- base general gracias a la presencia de dos residuos cataliticos: una Ser y una His, En esta proteasa, le reaccién comienza con la transferencia de an procén de la Ser « la His (réase Pig. 8-10a yb). Esto crea en la Ser un grupo —O” muy nucledfilo que aeaca al earbono del grupo carbonilo que posee una haja densidad electronica (wéase Fig. 8-10b). A conti- nnuacién se forma un enlace covalente transitorio que hace que se desplacen dos electrones del doble enlace C=O hacia el oxigeno (mis electronegativo) que adquiere carga negativa (véase Fig. 8-10c), Esta carga negativa es estbilizada Por interacciones no covalentes con otros aminoicidos del centro activo (los comes del enlace peptidico de una Gly y una Set). El resultado de esta accin combinada es la hidvblisis del enlace peptidico mediance una ruta con una me- nor energia de activacién QLOINETICA ENZIMATICA — La cinética quimica estudia las velocidades de reacci6n Realizar ensayos en el liboratorio en diferentes condiciones expetimentaks para estudiar la velocidad de las reacciones catalizadas por enzimas aporta informa cién sobre aspectos como la afinidad de la enzima por el sustrao o la eficiencia con la que s¢ transforma ese sustrato en el producco de la reaccida, Tambien pueden proporciona informacidn sobre ciertos detalles del mecanismo quimico por el que transcurre Ia reaccién cetalizada, Estos davos ayudan a predecir su comportamiento en el ambiente celular © su respuesta ante cualquier variacién de las condiciones habicuales (Reeuadeo 8-5) Cinética de las reacciones de un solo sustrato Los estudios de la velocidad de las reacciones enzimiticas de un solo sustrato se realizan mezclando una concentracién conocida de enzima con una concentra- cidn concreta de sustraro, y midiendo la desaparicién de sustrato o la aparicién de producto a lo largo del tiempo (Fig. 8-12). El método analitico de medida de sustrato 0 de producto dependerd de sus caracteristicas quimicas, pero son habi- tales los métodos espectroscépicos, de fluorescencis o radiométricos. Sisse realiza una representacién grifica de este tipo de ensayo se obtiene una curva de progreso como Ia que se muestra en la figura 8-13. Como puede apreciarse, en la primera etapa la reaccién sigue una cinética de primer orden hasta que la desaparicién de sustrato es suficientemente elevada (aproximadamente a partir de un 10 96) para que esta relaci6n deje de ser lineal. aor este motivo las medidas de velocidad se miden en la primera etapa lineal, se denominan velocidades iniciales (V) y se determinan como la pendiente de la curva de progreso al principio de la reaccién. Si en el mismo tipo de grafico re- presentamos ensayos realizados con diferentes concentraciones de sustrato, se lun grupo fosate de un nuclectid trifostato, El Mg” avae a los ectones cel enlace P=0 hacierdo que fl tenga ina defeiencia ce electrones y sea mic suscentibe al ataque por el nuciedfilo, ‘aipio Protucto ) Goncentecion Sustrato ©) Tiempo Figura 8-12. Diagrama de desaparicion de sustrato y aparicion de producto en una reaccién catalzads, ls etapa nial dela reaccién se observa ana desaparicién prov sativa de sstrato y una aparcién de pro- ucio hasta Uegar al equilbrio. Para una re- accion reversible, en el equiltrio no hay Cambio neto en las concentraciones de sus- trato y product.142_SECCION Ih LA ENERGIA Y LAS FUNCIONES CELULARES La citi quirica estudia la vlocided de les reaccones y los procesos qui una reaccén SP a \elozided se puede exoresar matematicamente como: Senso ts ae 2 dP} cosas et Ls nidades de velaciad seran, por tanto, unicades de concentracion dviddas por uridades de tiempo se suelen expresar como Ms zs reacciones culmicas se pueden clsifcar.sesinsu comportamiento cnétco, en receciones de primer orden, de segundo arden y de orden eto. En cada aso la velocidad es propotcional a una constant de velocidad (ky 2 la concentraion de uno o ms susratos en unas condico- ‘es deteiminadss,comro veremos a contnuacion, ktlene dstitas undades depenlendo del orden we ls reaccion. Reacciones de primer orden Son reacciones del po A—*8 en las que la velocidad depence de un slo sustrato: VeKtAl este tpe de reacciones, k sa da en unidades de iempo' (6").Unvalerelovado de implica una velocidhd elevada ts caso de reacciones revenibies AB: Vesely Vink [BD ‘Como en et equllbrio la velocidad de transfornacion ée reactivos en productos es igual que a de products en reactivs igualando as ecia- ones anteriores ydespejando, se obtiene que h/t = [BJIAL Le relacin entre las constantes de velocidac de la eaccion drectay a inversa (h/k) es elvalor ce le eanstante de equibio de la reaccon: ky, (vease capitulo 1) ‘Reacciones de segundo orden ‘Se trata de reaccones en las ue intervenen dos sustratos para dar un producte: 2A3B 9 As BC Fr este tho de toacciones. la vlecidad cpenders de bs concentraién ds lox doe sctatow V= KIA} 0 V= F{AILB) En ambos eaeoe ae una des de la constante de velocidad serdn Mss" Reacciones de orden cero En ete tpo de reacciones la velocidad es independiente de (a sorcentracén de sustrats, Puede depender de otto faetores como, por elempo, ln corcentrarion de catalizador pueden comparar las velocidader iniiales en cada sieuacién (Fig. 8-14). Esta Infocmacién se puede llevar a otro ipo de gréficaen la que cada punto represen- ta V, frente a una concentracign de sustrato (Fig. 8-15). Pars la mayoria de las reacciones catallzadae por enzimas, lox dares experimentales proporcionan grif- Equtibio ae coma la mostrada en la figura 8-15 en la que e identifican tres zonas clara- mente diferenciadas. * Una primera etapa lineal, a bajas concentraciones de sustrate, en la que la reaclin se comport como s feta de primer orden * Una segunda etapa curvilinea, a concentraciones de sustrato intermedia, fen la que hay un descenso cn la respuesta al aumento de la conceatracién de sustrato. + Una tletma exapa, a elevadas concentraciones de susteato en la gue la velo- cidad no varia al aumentar la concenteaciéa de sustrato, La reaccion sigue tuna cineiica de orden cevo. Producto (uM) Temper SCiEste comportamiento se puede explicar de una forma cualiativa saponiendo Tempo P puede exp I ret ue fa reaction enzimatica transcurre mediante la reaccin gue ya se ha visto al Figura 813, curso de una reaciin catall principio del capitulo: zaéa con una concentraion de ens Constante. (3 concentraion de producto v2 E4S 2 ES 4s E+? reaccién (1) aumertando de forma neal hasta que & a Sunrato va desaporecendo en el trarscure Uniéndd_Eeapa del tiempo, y i reacién alanza el equi roteete cate bya, La veloccad ica (te determina . como la pendiente de areca en ciniie de-_A bajas concentraciones de sustrato, la velocidad seri proporcional a la con- ta veaccn La velocdad.a cualuer tiempo centracién de sustrato [S]}; pero a concentraciones elevadas de sustrato, toda la tse represerta como V, enzima estard saturada formando el complejo ES, por lo que la velocidad depen-CAPITULO 8 ENZINAS Y CATAUISS 143 derd de su concentracién y se podri expresar como v= ky [ES]. Es decir, depen- dera de la velocidad de transformacién quimica de ES a EP y de la liberacién de producto y enzima libre, En esas condiciones, la adicidn de més sustraco no afecta ala velocidad, por lo que la reaccién muestra un comportamiento de or den cero y-se dice que hay un efecto de saturacién de la enzima por el susteato. Para expresar este comportamiento mediante una expresién matemitica Leo- ror Michaelis y Maud Menten en (913, desarrollaron un razonamiento que se bbasaba en asuinir clertos supuestos: 1. La primera ecapa de la reaccién enzimatica es la formacién ripida del ‘complejo ES mediance una reaccién reversible. En este supuesce se puede definir una constate &, (constante de disociacién) que es la inversa de, (constante de asociacién). [Ee oe @bAde ta J = TRY. ~ (EST. Se waitin loa valoves de, on lager da los de &, porgue los primezos tienen unidades de concentracién y esto permi- te comparar su valor con el de la concentracién que sustrato. Cuanto més fuerte sea la unin de la enzima al sustrato menor seri el valor de la h, 5) E48 ot ES Sustituyendo el valor de [Ejj,] en ka ecua bn (5) por [Eital = = [Eyal — [ESI y despejando, obtenemos que: © 2. En una segunda etapa mucho mas lenta (b., << &;) el complejo ES se ‘wansforma en producto y enzima libre en unao varias teacciones. En exe caso, la velocidad depende de la concentracién de complejo enzima-sus- trato [ES] y de la constante de velocidad de la etapa mis lenta, que se denomina &.,, (constante catalitica): SAS E4P Ve hy [ESI o Combinando las reacciones (6} y (7), y simplificando, podemos calcular la velocidad de a reacci6n que describe la velocidad de reaccién como una funcién hipesbelica en funcion de la [3]. Cuando [S] tiende al infinito, toda la enzima se encuentra como complejo ES, por lo que se puede considerar que Vo = ka El 6) Conia ce eaatticene leannerloe obeengina Vous eres) ° que explica el comportamiento cinético de aquellas reacciones en las que hay tuna formacién ripida del complejo FS, seguidas de una eraps posterior mis lenta en la que se produce y libera el producto de la reaccidn. El modeto del estado estacionario y la ecuacién de Michaelis-Menten En algunas ocasiones no se cumple que &.. <« &,, por lo que Brigs y Haldane llegaron 2 una expresién maremtica mas general, que se puede ajustara exta si ‘uacién siempre que se cumpla que la [ES] permanezca constante, por lo que se denomina cinética del estado estacionario. Fste tipo decinésica se obticne evan do la [S] 22 [Esa], lejos de las condiciones celulares pero en unas condiciones Producto (uM) Tiempo @) Figura 8-14. Curvas de progrese pera una. serie de reacciones con diferentes con- Centraciones inicales de sustrato. L2 Vy (pendiente de tas rectas) aumenta a medida que lo hace la [8], $1 3 §7 g V= velocidad inci ‘une an "O0b OW Figura 8-15. Diagrama de velocidadesin- ales de reaccién frente a concentracion de sustrato, Em este tno de wafea: cade velocidad nicial(pendiente de l2 recta de lz figura anterior) se represeta frente a a(S] 13 Vou Solo se obtiene como un valor aprodiiads. La K,, representa la [S) que co- ince com fa mit 63 Via SSECCION IL. LA ENERGIA V LAS FUNCIONES CELULARES muy Ficiles de obtener en el laborarorio, Fn esta situacién, la [ES] depende de la velocidad de formacién del complejo ES (controlada por é,) y de la velocidad de desaparicién del complejo ES, que puede producirse por dos situaciones: 1. Por la disociacién del complejo ES para dar Ej. y sustrato, controlada pork, 2, Por la formacién de producto y liberacién de Eye, controlada por ka Igualando la velocidad de formacion del complejo ES con la velocidad de desaparicida (ituacion de estado estacionario}, y despejando, se obtiene un nuevo valor para la [ES} | ves) = gal Sal % En esta ecuncidn se define una nueva constante que surge de la combinacion de las constantes de velocidad de la reaceién que se denomina la constante de Mi- chaelis-Menten y se denomina K,, de forma abreviada. La ecuacién anterior puede ahora simplificarse: [Es]= Eane| Sic. “Teniendo en cuenta que la disminucién de sustrato en la fase estacionaria es priccicamente insignificante, se puede sustituir [Sy..] por la [S]. De igual forma, sabjendo que [Ei = [Eyal] ~ [ES], se llega a la siguiente ccuscién: tes) ~ Ful Caleulando la velocidad en funcién de la [FS] y cenienda en cuenta que cuando, la concentracién de sustrato tiende a infinite, Vi, = kay [E], obtenemos: Vis (5) K+) Aunque esta ecuacién difiere de la obtenida inicialmente por Michaelis- Menten, se conoce universaimente como la ecuacién de Michaelis-Menten. ‘Como se muestra en el recuadto 8-6, esia expresion matemitica se ajusta a los datos expetimentales obsenidos para las reacciones de un Gnico sustrato re- presentados en la figura 8-15. % Parametros enzimaticos caracteristicos de una enzima Una ver encontrada una expresién matemitica que describe los datos experi- mmencales se veri a continuacién qué informaciin aportan los diferentes parime- tos cinéticos de esta expresién. También se examinard cémo la vatiacién de es tos valores en distintas condiciones experimentales ayuda a comprender el me- canismo de las reacciones enzimiticas exudiadas, Significado de Vina. La velocidad maxima es la asa maxima tedrica que se obtiene en unas condicio- nes determinadas. El valor exacto no se obtiene experimentalmente: se obtiene tun valor aproximado cuando la velocidad comienza a ser independiente de la cconcentracién de sustrato ([S]—+), Para alcanzar la V.,. serfa necesario que todas las moléculas de enzima estuvieran escrechamente unidas con el sustrto. Como se veré més adelante algunas transformaciones matemticas permiten ob- tener un valor numérico de V.... a parti de los datos experimentales Significado de k, Como ya hemos visto, f= Jk, es una constante de disociaciéa del complejo ES derivads de conseantes de velocidad. Su valor puede servir de referencia para conocer la afinidad de la enzima por el sustrato. Un valor elevado de A, indicaCAPITULO 6. ENZINAS ¥ cATAUSIE 14S, nten y fas graficas exper {a ecuacion de Michats-Menten expica el comportamierto que se obtiene a pari de (os datos experimentales de loratorio y que refea la sii. 1. Concentraciones de sustrato bajas: sik, ==> [5] entonces godemos despreciar el valor dele [5] en el denominader, por lo-que la formux la de MichaelirMenten se puede expesar como sue Vou \ Adepende ce forma corstante ge (5) ‘es decir © comporta como na reaceén de primer orden (etapa lineal de ta gre), 2 Concentraciones de sustrato elevada: (noite cato se pusce desprecay el valor de Ky del deneminador con lo que la formula se simp fica como sigue Ve _ % Vee Se aust «la etapa de saturacion de le ergima en la que ios datos siguen un comportamiente cinétco de oréen cero (velocidad indepen ‘lente dee concentracion del surat) 3. La constante de Michaels: 5 se igual el valor de V, conta mitad dela velocidad maxima, se obtiene Vou 5] 2 Rt Bl De esta reiacion se device que Kes el valor de la concentracin de sustato necesario para acarzar a mtad de ia velocidad masima ysimlificands, —&, =15) é a 4 1K) z 2 Bis, x 2 Ilex, : K Concentracon de sustrato, (5) (mM) una baja afinidad y viceversa. Como &., es una constante de velocidad de primer orden idepende de la [ES] con unidades s") y &, es una constante de velocidad de segundo orden (depende de (E] y la [S] con unidades M's"), la &, tiene tunidades de concencracién (M). ificade de Ky no descrito en el recuadso 8-6, el valor de K., (también expresada en uni- dates de concentracién) equivale a la concentracién de sustrato que se requiere para alcarzar la mitad de Ia velocidad maxima. Tambien se puede expresar esta fequivalencia afrmando que el valor de K,, represents la concentracion de sustra to ala cual la mica de los centres activos de las mokéculas de enzima del ensayo extin ocupados por moléculas de sustrato (en el estado estacionario). ‘Aunguc no es una verdadera constante de disociacion del complejo ES, su valor se aprosima bastante cuando A, 2:4, ya que, en estes condiciones, el va- lor de A, seré semejante al de &,, la auténtica constante de disociacién. Por este motivo, en la mayoria de la situaciones el valor de K,, puede considerarse como tuna medida de la afinidad de la enzima por el sustrato, que sera inversamente proporcional a su afinidad. Un valor bajo de K,,s© puede relacionat con una ‘gfan estabilidad del complejo ES que indica una elevada afinidad de la encima por el sustrato y, también, que necesita menos sustrato para uninse al 50% de la Hl valor de K,, varia considerablemente de una enzima a otra (Tabla 8-3) y pata una misma encima difiere segin los dstincos sustrats, Experimentalmente se ha visto que el valor de Ky de ina enzima es semejante ala conceatracién del sustrato que es habitual para'esa enzima en el ambiente celular.146 SSECCION HLA ENERGIA V IAS FUNCIONES CELULARES cataase 149; a Hexcquinasa (cerebro) | ATP 04 b-stucos 05 o-fructosa 18 ‘ahidesa caoénics | COs 26 ‘Guimoviosina Gliitirosinigicina | 108 Neenzoitrosinamida | 25 PeGalacosidasa precios 40 ‘Treonina ceshicratasa | \Treonina 50 Un ejemplo de la importancia de la K,, en el papel fisiolégico de una encima se encuentra en las dos enzimas que catalizan la transformacién de le glucosa cn ‘lucosi-6-P en las células del higado: la hexoquinasa (K,,= 0,1 mM) y la gluco- ‘quinasa (K,,=5mM). En condiciones de ayuno, cuando Iz concentracién de ghicosa en sangre ex haja, acta Ia hexoquinasa: y después de una comida, cuan- do aumenta ls concentracién de glucosa, puede actuar también la glucoquin Estudiar ae variaciones del valor de X,, en diferentes enzimas mutantes 0 en diferentes condiciones experimencales puede ayudar 1 conocer las interacciones que se producen en la formacisn del complejo ES y los residuos que parcicipan Gn la formacion de estas interacciones no covalentes. Las variaciones en les valo- tes de X, indican alteraciones en la primera eeapa de la reaccida, donde se pro- duce la Gnién de la enzima al sutra. Significado de k... El nimero de recambio Kg sla constance de velocidad de la etapa limitante (la que gcurre més lenta) dé'la transformacin del sustrato en producto y liberacion de enzima libre y producto, en el caso de que ésta transcusra en mas de una etapi. ess sys Sy B+ Al tratarse de una constante de velocidad de primer orden se expresa en uni- dads recfprocas de ticmpo (min, s) (xéase Recuadro 8-5). Con los datos experimentales se puede calcular su valor, al despejar de la formula (8), mediante la expresién Este valor se conoce como el ntimera de recambio y representa el nsimero de ‘moléculas de sustraro que son transformadas en producto en unidad de tiempo cen una sola molécula de enzima cuando la concentracién de sustrate es elevada. Define, pot tanto, la V,,, a la que una reaccién enzimitica puede suceder, a una concentracién de enzima dete:minada y 2 una concentracion de sustrato muy clevada, muy diferente de las condiciones i ev ‘Como esta conscante refleja los cambios que se producen en las etapas poste- riores ala formacién del complejo ES, las alteraciones en el valor de la &.. pro- ducidos por mutagénesis, por comparacién de diferentes enzimas, 0 por la mo- dificacidn de las condiciones experimentales, reflejan perturbaciones en la etapa final de cransformacién del sustraco en producto. La eficiencia catalitica Kou/Ky La proporcién entre las constantes cinéticas &.,, ¥ fy se suele utilizar para com- parar la cficiencia catalitica de diferentes enzimas 0 de una misma enzima sobre dlscintos sustratos. Esta proporcién tiene unidades de constante de velocidad de segundo orden (M"Un valor elevado de esta proporsiéa supone una clevada capacidad de trans- formacién de sustrato en producto (elevado valor de f.,) y uns elevada afinidad aparente de la enzima por el sustrato (valor bajo de K,). Cuando se cumplen estas dos condiciones se obterdrs la mayor eficacia ya que, no solo hay une gran afinidad de la enzima por el sustrato sino que, ademas, la envima mucstra un gran poder de transformacidn del sustrato en producto La mayor 0 menor eficiencia caaaitica de una encima por un susirato puede verse claramente en el ejemplo de los valores cinéricos de la enzima fumarasa por dos sustratos distintos: el furnarato y el malato (Tabla 8-4), En el primer caso, la fumarasa tiene un valor de &., = 8 + 10's”! yun valor de K, de 5: 10° M, La misma enzima muestra para ef malato un mayor valor de aq (9+ 10" +") y un mayor valor de K,, 2;5+10™ M). Al calcular la eficiencia caalitica de la enzima para los diferentes sustratos se obtiene un valor de 1,6- 10" M's" para el fumarato y un valor de 3,6 107 M's" para el malato, En este ejemplo se observa que el hecho de que Ia enzima sea mis eficaz en la ctapa de cransformacién del malato en producto (mayor &.,) no implica que sea ‘més eficiente, ya que la afinidad de la enzima es mayor por el fumarato (menor valor de &). En condiciones cclulares, el valor de la eficiencia ¢s importante pero tam- bién hay que tener en cuenta la concentracién de enzima disponible, Como la velocidad tiene una relacién de primer orden con respecto a la concentracién de enzima, unos pocos picomoles de una enzima con una eficiencia de 10’ M's" pueden resultar menos eficientes que unos nanomoles de una enc ma con una eficiencia de 10” M's", Como se describird en el capitulo 11, uno de los niveles de regulacién de las reacciones enzimaticas en el metabolismo se lleva a cabo por un control de la concentracién de enima, bien por un control genético en Ia sintesis de la enzima o por un aumento en la velocidad de degra- dacién. Anilisis lineal de la ecuacién de Michaelis-Menten: representacion de Lineweaver-Burk ‘Aungue accualmente existen programas informaticos que permiten obtener da- tes cinéticos muy precisos a partir de los datos experimentales representados en curvas hiperbdlicas, en algunas ocasiones resulta uel transformer la ecuacién de ‘Michaelis-Menten en una expresion algebraica que porte datos numéricos con- cretos para los parimetins cinéticos (Vay. y K,). Una transformacisn habitual gue sl tanel ca acetaldtido (que no fects 3 los teldos) como. producto de ia reac cien,evtando que benzima utlice como sustato el metanoly predizce mas for Tmaléehio y dando tempo al organsmo {Telia al metanot mediante ls acien de los mores te comparar los parimettos cinéticos caracteristicos de la reaceién (V, can los obrenides en presencia de inkibidor (denominados Vag. ¥ metros cinéticos aparentes”). Los datos se reflejan en una gréfica de Bark para una mejor comparacién de los resultados. 1 inhibidor se puede unir a la enzima en el centro activo formando un com- eo El que no da producto o en un lugar especifico para el inhibidor. En este “itso ois i Bjecioa pucks redictsw ste denote de uid dl mnzas y se forma un complejo ternario FSI. Fl complejo EI o ESI puede ser mis 0 me- nos estable y esté definido por las reacciones: Este Fl (10) sila enzima se une al inhibidor en el centro activo, impidiendo que se una el sustrato; o bien FS+1 = ES! ay cen el caso de que el inhibidor se una al complejo ES. De igual forma que el valor de A, refleja la afinidad de la enzima por el sus rraro, [a mayor o menor afinidad de la enzima por el inhibidor quedars reflejada ppor las constantes de disociacién de estos complejos por las formulas: fe) 0) «2 (13) Dependiendo del tipo de inhibidor se pueden diferenciar tres tipos de inhi- bicisn reversible (Fig. 8-20). Inhibicién competitiva Se caractetiza porque el inhibidor se une al mismo sitio que el sustrato, impi- dliendo, por tanto, la formacién del complejo ES y la formacién de producto. Suele ser una moléeutla semejante al sustrato de la reaccién de forma que los dos ligandos compiten por unirse al centro activo (Fig, 8-20.1-a), aunque algunos tienen una estructura diferente (Recuadro 8-8). Como la unién es reversible, cuando la concentracién de sustrato es elevada cs muy poco probable que el inhibidor se una a Ia enzima, por lo que la reacci6n muestra una Vag, HOtMal (Vy, = Vo)» Sia, embargo se necesita mas sustrace para aleanzar la'mitad de la V., por lo que la Ky tens un valor mayor. El cremento de este valor esté relacionado con la [I] y con la K; y se puede calcular ‘mediance la formula: (Fig. 8-20b-c-d) El factor mediante el que se telacionan los pardmeros cinéticos sin inhibidor y los “aparentes” (1 + I]/K) se denomina a 0 grado de inhibicion Inhibicién no competitive EL inhibidor muestra afinidad tanto por la ensima libre como por el complejo ES y la unin se realiza en un lugar distinto del centro activo. Por canto, su efec- t@ no se puede evitar aumentando la concentracién de sustrato y produce una disminucién de la V,.. va que el complejo ternario ESI no genera producto. La Vous disminuye por el efecto del inhibidor de forma que Vou = Vowel no, uunisse en d centeo activo la K., no cambia en presencia de inhibidor por lo que K, = K,, Fig, 8-20.2), Inhibicién acompetitiva o incompetitive Los inhibidores acompetitivs se unen exclusivamente al complejo ES en un la- ga® diferente al centro activo, El efecto aparente sobre los parimetros cinéticos(2) Reaccin CAPITULO 8. ENZIMAS ¥ CATALISIS 151 b+5——=6—> er 1 Ic 1K Pssst eer et-e—e. y ex (b) Representation gréfice (@ Ecuacion de Michaelis-Menten | Vou (5) Vines SI Figura 8-20. Tipos de inhibicién reversible: (1) nhibicién competitiva; (2) Inbibicin ne competitiva; (3) Inhibcién acompettiva En cada tipo de innbcion se muestra un esquema de ia reacion (a) La representacion de lareaccion en presencia y ausencia de inibidor en una grfica de Lineswever Burk (B, las fSrmulas que relaconen los pardmetroscineticos que cambian en cada caso (Oy la formula de MichaelicMenten para la eacci6n en presencia de inhibider () ‘en presencia de inhibidor es la disminueién de Vag, y Ky (Fig. 8-20.3), que se pueden calcular mediante las siguientes expresiones: Vat Rok Inhibidores irreversibles ‘Son moléculas que se sueen unica la enzima mediante enlaces covalentes con los, residuos imprescindibles para Ia cauisis, impidiendo su fancidn; aunque tam- bién pueden unirse mediante interacciones no covalentes muy cstables Este tipo de inhibidores no tienen un comportamiento cinético de Michaelis-Menten. Su principal utilided es la ereacién de férmacos, pero también se uciizan para conocer el mecanismo de reaccton de kas enzimas inhibidas,152 _ SECCION LA ENERGIA ¥ LAS FUNCIONES CFLUIARES. Figura 821. Emma alostérica. Ura ensina alostérca heterotpica muesta un sto de Lunién para el modulador derete del con- tro setvo. (3 unién del medulacor produce Un cambio de canformacion que hace que la feraima tenga mayor afniiad por & susrto {moduacor posto} cambio de confer- ‘macén del primera subunida se transmite ala segunda. que también presenters mayor afndad por el susat. (QLREGULACION ENZIMATICA En la célula exis Ia nce il de cooninar la actuacién de muchas enzimas en aquellas vias que se desarrollan de forma sexuencial, es decir, donde el producto do una reaccidn es el susttato de la siguiente. En estos sistemas existen una vvarias enzimas que tienen un mayor efecto sobre la velocidad global del proceso y se denominan enzimas reguladoras. Estas enzimas pueden cambiar su activi- ‘dad como respuesta a cieras modificaciones y suclen ser las que cataizan la pri- mera de las reacciones de la secuencia puesto que la regulacidn de la ruta en las tilimas etapas supondria un gasto innecesario, Faisten varios mecanismos mediante los que se modula su actividad. Las cenzimas alostéticas se unen de forma reversible no covalente a pequefias molé- culas, que regulan su actividad. Otras enzimas sufien modificaciones covalen- fet, que pueden ser sevetibles 0 irreversible, producindose cambios en ss Las enzimas alostéricas estn formadas por varias subunidades La actividad de algunas enzimas se modula mediante la unidn de uno o mis li gandos denominados moduladores, que se unen en otro lugar diferente al cen- tro activo pero que es especifico para cada modulador. Estos ligandos inducen tun cambio de conformaci6n que puede aumenrar (moduladores pesitivos) 0 disminuir (moduladores negativos) la afinidad de lz enzima por el sustrato. En aquellos casos en que el mismo sustrato tiene un efecto modulador se denomi- rnan interacciones homotrépicas y son casi slempre regulaciones positivas. En las enzimas homorrépicas, el centro activo y el sitio regulador son el mismo. Cuan- Jo el ligarndo es una sustancia diferente se dice que e una interaccién heverouré- pica y en este caso pueden ser positivas © negativas “Aunque existen algunas excepciones, la mayoria de las enzimas alostéricas son oligoméricas y estan formadas por varias subunidades. En este tipo de enzi- ‘mas la unién del modulador a una de las subunidades produec un cambio de conformacién que se transmite a las otras subunidades con lo que se consigue tun efecto cooperative (Fig. 8-21). Existen dos modelos que explican este efecto, El modelo secuencial propone que, cuando al ligando se une s la primera subu- idad, se produce un cambio de conformaciin que se transmite a las otras subunidades produciendo un aumento 0 una disminucién de la afinidad de la catina por d sustaro, Bl modelo eoncertado propone que; en auscaci de I gando, existe un equilibrio entre dos conformaciones de la enrima: una tensa y tuna relajada. Los moduladores negativos tienen mas afinidad por la forma ten~ sa: y los positivos y el sustraro, por la forma relajada. La presencia del modula- dor desplaza el equilbrio hacia la forma por la que presenta mayor afinidad, consigutendo una modulacén negative o posiva dependiendo dl tipo de mo- En algunas rutas metabélicas, el producto final de la ruta es la molécula gus aetia como modulador negative de la entma que cataliza a primera etapa Je la ruta, Este tipo de regulacién se denomina recroinhibicion (feed-back) (Big. 8-22). ‘H comporamieny cnitico de cuascnsimas dire dl comporamionts dhicane pot sual Urs. catiga to atems ean a oaceoenalie medutador sisters > am — cares esto © te ® Foam alorteriea aia lotirica ‘in modtlaéor eon madulador + loca sfindd per §) Coumenta a afinidad por $)Ccapiruto f. eNZMAS VeArAUSIS 153. sustrato ¢s suffciencemente clevada. En los moduladores homotrépicos, en los ‘que fr unién de la primera molécula de sustrato hace que cambic la conforma cidin en todas las subunidades facilitando la incorporacidn de las siguientes mo- lgculas de suscrato, hay un descenso en el valor de ls 1, (aumento de la afini- dad) y el monémero alterado une mas Ficilmente sustrato y esti més saturado sin que aumente la concentracién de sustrato, Este efecto cooperativo hace que, al zepresentar la (S) frente ala velocidad inicial, se obrenga una curva sigmoidea, ya que la X,, va cambiando a medida que lo hace la concentracién de sustrato (Fig. 8-232). En sca curva sigmoidea hay un valor de [S) que coincide con la mnikad de la velocidad maxima y se denomina K,., pero no tiene el mismo signi- ficade que K., En el caso de los reguladores heterotropicos, ¢s mas dificil prede- ie la curva de saturacién. El caso mas habitual es que se modifique el valor de Ky, sin verse alterada la Ving (Fig. 8-23b), Numerosas enzimas modulan su actividad mediante modificaciones covalentes de su estructura La modificacién covalente de una enzima es también un mecanismo habitual para regular la actividad de numerosas enzimas. La modificacién puede set r= veribie o inreversible. La fosforilaci6n es la modificacién reversible mas frecuente Muchas cnzimas cambian su actividad como consecuencia de una medificacién covalente en su estructura. Alpunas cneimas sufien reacciones de adicién de gru- pos fosforilo, adenilile, uridililo, mevilo, etc. (Fig. 8-24), siendo las ands fre~ sin cooperatvidad | — coogeratvitac Velocidad (V) Fostotaiin | easing ae 0 {yt se Tm Hs tions traima—@ Aéeniaién be wr fram. Enaima: ADP-boslacien ‘Ave Gin, Cys Metlacion ° regulacion negatva eet-back) Figura 8-22. Retroinhibicion o feed beck. HH producto final dela ruta metatelica eel ‘mogulador negatwo de la enzima de la pri= mers eps Figura 8-23. Curvas de actividad de enai- zmas alostericas en funcion de la cancen- ‘vacion. (@) Cuna sginoidea caracerisica de una enzima homotépica postive, Lo Lnién de ls primeras meculae de suetrato hace que la velocidac aumente por el efecto cooperative. (b) Efectos de un modiiaéor Fositvo y uno negativo sobre una enzima osteria heterotopica, Con linea puntesda 3 color so sefala cima, para ls mms con ‘entracion de sustrato, moculadar regti- vo produce un descenso de la velaciéad Urespecto a la stuacion en ausencia de mo- dulagor) mentas que el modulader positvo provoca un incemenio de le veocdae Figura 824. Dierant rmodificacion covatente mecanismer de Tat ensimas,154 SECCION I. LA ENERGIA V LAS FUNCIONES CELULARES Ser-cadena cuentes las primeras. Estas eacciones estin catalizadas por sus correspondences taneeat enzimas especificas que, en el caso de la fosforilacién, se denominan quinasas. 9H ‘Como ya s vio en el capiculo 4, la fosforilacién se realiza en las cadens laterales cH, de residuos de Ser, Tyr 0 Thr. La adicién de un grupo cargado en la proceina puede afeccar tanto 2 su conformacién como a sus posibles interacciones con el Foxforisa® sustraco (Fig. 8-25). etic La modificacin es reversible porque los grupos fosfato pueden eliminarse por la accién de otras enzimas: las fasfatasas. Este tipo de modificacion en la so enzima puede hacer que la enzima se active 0 se inactive, dependiendo de la P= enzima, Como se vera en posteriores capitulos, el mecanismo de fosforlac fesftas ins desfosforilacin juega un papel decisivo en la regulacidn de numeresos procesos itt / biolégiens. ® la ruptura de un precursor enzimatico puede dar lugar p @ una forma activa & er En algunos casos la forma activa de una enzima surge tras la escisign de un frog. eato de h cadena polipeptidiea de un precursor inactivo denominado zimége- Fosforiisa Ano, Un ejemplo de exte tipo de regulacicn se encuentra en las proteasas del est (nas activa) mmago rripsina y quimotripsina. que se sintetiran como sus correspondientes formas inactivas, tipsinégeno y quimocripsinégeno. La pérdida de un fragmen- Fgura 8-25. Modificacién covalente de lato de [a caclena produce cambios conformacionales en estas enzimas que hacen ‘guicigeno fesforiasa. Cambio corforma- accesible su cencro activo. ‘ional producde por la fostoriacén de un" Como este tipo de inhibiciin es ireversible, se necesitan otros mecenismos Fesiduo de serina ge caca subundiae ce la fenzina glucogero fesforlass, por la aciién para a inactivacién de estas enzimas. {de una quinasaexpecifies La forms Fosfrla ¢& actha plerde actividad cuando une ena ra fosfatasa elimina les grupos fostato, CONCEPTOS CLAVE (© Las enzimas son catalizadores biol6gicos que aceleran las reacciones celulares de forma muy efectiva y especifica en condiciones fisiologicas. (© Su acci6n se consigue gracias a la formacién de un complejo erzima-sustrate que estabiliza el estado de tran- sicion: La unién enzima-sustrato se realiza en una zona de la enzima denominada centro active que posee la tonologia y a naturaleza adecuads para establecer interacciones no covalentes con el sustrato. El centro activo es complementario al estado de transicion Desde un punto de vista de (2 energia, las enzimas aceleran las reacciones porque consiguen rebajar lz energa ce activacion, Las entimas no alteran los equilibrios de reaccién pero consiguen que se alcancen de forma mas rapida. La energie de fiacién proporcona especficidad y catilisis. En algunas reacciones 2e producen enlaces covalentes transitorios entre [a enzima y el sustrato. La cinetica quimeca estudia las velocidaces de reaccion, Los datos cinéticos obteniios en el laborstorio nos peimiten conocer datos sobre el mecanismo de la reaccién enzimétice estudiada, AA elevadas concentraciones de sustrato, la velocidad de la reaccién no aumenta cuando lo hace la concentracién dd sustrato debido a un efecto de saturacion de la enzima, Se puede explicar el campartamiento de numerosas reacciones enziméticas suponiendo que la primera etapa es rapida y reversible y 12 velocidad esta condicionada por la transformacion mucio mas lenta del sustrato a producto.CAPITULO 8. ENZIMAS Y CATAUSIS 155 © La ecuacion de Micaeli-Menten explica el comportamiento de las reacciones en las que la concentracién del ‘complejo enzima-sustrato permanece constante y la concentraci6n de sustrata es muy superior a la de la encima (© Los parimetros cinéticos que definen una reaccién son: = Vx: velocidad maxima, obtenida con concentraciones de sustrato elevadas, ~ Ky: constante de Michaels-Menten. Aunque no es una verdadera constante de afinidad, en algunas ocasiones Su valor puede servir de referencia para estimar si existe una buena interaccién engima-sustrato, ~ Kas representa el nimero de moléculas de sustrato que resulta transformado en producto en unidad de tiem p9 con una sola moléculs de enzima cuando la concentracién de sustrato es elevada, © Ls eficiencie cataitica de una enzima se puede medir mediante el coclente Ku/Ky. Un valor elevado de esta pro- Porcién supone una elevada capacidad de transformaciOn de sustrato en producto y una elevada afinidad aparente de La enzima por el sustrato, (© Factores extemnos como ls temperatura o el pH pueden alterar la actividad enelmatica © Existen reacciones en las que participa mas de un sustrato que pueden tranccurrir mediante la formacién de un ‘complejo ternario ES\S; 0. de forma sucesiva, primero con un sustrato y después con el segundo. © Las enzimas se pueden inhibir de forma reversible o irreversible. ‘© Lop inhibidores reversibles pueden ser competitivs, no compeiitivos o acompetitivos, segiin su mecanismo de ac- cian y la modificacion de los parémetros cinéticos que producen. © En la mayor parte de las rutas metabolicas existen enzimas, denorinadas reguladores, que cambian su actividad como respuesta @ ciertas modificacones. Estas enimas sueten estar en la primera etapa de la ruta y tienen un ma- yor efecto sobre la velocidad global del proceso.