Resumen

Memoria T Las células inducidas por patógenos previos

pueden determinar la susceptibilidad y la gravedad clínica
de infecciones posteriores 1 . Poco se sabe sobre la
presencia de memoria preexistenteT células en humanos
con el potencial de reconocer SARS-CoV-2. Aquí, primero
estudiamosT célula respuestas a regiones estructurales
(proteína nucleocápsida, NP) y no estructurales (NSP-7 y
NSP13 de ORF1) de SARS-CoV-2 en Convalecientes de
COVID-19 (n = 36). En todos ellos demostramos la presencia
de CD4 y CD8 Tcélulas que reconocen múltiples regiones de
la proteína NP. Luego demostramos queSARSpacientes
recuperados (n = 23) todavía poseen memoria duradera T
células reactivas a SARS-NP 17 años después del brote de
2003, que mostró una fuerte reactividad cruzada a SARS-
CoV-2 NP. Sorprendentemente, también detectamos con
frecuenciaSARS-CoV-2 específico T células en individuos sin
antecedentes de SARS, COVID-19 o contacto con SARS/
COVID-19 pacientes (n = 37). SARS-CoV-2 T células en no
infectadolos donantes exhibieron un patrón diferente de
inmunodominancia, con frecuencia dirigido a las proteínas
codificadas por ORF-1 NSP7 y 13, así como a la proteína
estructural NP. Caracterización de epítopos específicos de
NSP7TLas células mostraron reconocimiento de fragmentos
de proteínas con baja homología con los coronavirus
humanos de "resfriado común" pero conservados entre los
betacoranavirus animales. Por lo tanto, la infección con
betacoronavirus induce multiespecífico y de larga
duración.T célula inmunidad a la proteína estructural NP.
Comprender cómo NP-y ORF-1 preexistentes específicos T
células presentes en La susceptibilidad al impacto general
de la población y la patogénesis de SARS La infección por
CoV-2 es de suma importancia para el manejo de la actual
pandemia de COVID-19. © 2020, The Author (s), bajo
licencia exclusiva de Springer Nature Limited.
Las células T específicas de SARS-CoV-2 en pacientes
recuperados con COVID-19 Las células T específicas de
SARS-CoV-2 acaban de comenzar a caracterizarse en
pacientes con COVID-193.14 y su potencial papel protector
se ha inferido de los estudios en SARS "y pacientes con
MERS. Para estudiar las células T específicas del SARS-CoV-2
asociadas con la eliminación viral, recolectamos sangre
periférica de 36 individuos después de la recuperación de
COVID-19 leve a grave (la información demográfica, clínica y
virológica se resume en Extended Data Table 1) y estudió la
respuesta de las células T contra proteínas estructurales
seleccionadas (proteína NP de nucleocápside) y proteínas
no estructurales (NSP7 y NSP13 de ORF1) del proteoma
SARS-CoV-2 grande (Fig. La). Seleccionamos nucleocápside
proteína, ya que es una de las proteínas estructurales más
abundantes producidas "y tiene un alto grado de homología
entre diferentes betacoranavirus (Datos extendidos Fig. 1)
18. NSP7 y NSP13 se seleccionaron por su homología
completa entre SARS-CoV-1, SARS-CoV-2 y otros
coronavirus animales que pertenecen al género
betacoranavirus (Datos extendidos Fig. 2) ", y porque son
representativos de la poliproteína ORF1A / b codificando el
complejo replicasa-transcriptasa ". Esta poliproteína es la
primera que se traduce tras la infección por coronavirus y es
esencial para la transcripción posterior de las especies de
ARN genómico y subgenómico que codifican proteínas
estructurales ". Sintetizamos 216 péptidos de 15 meros
superpuestos por 10 aminoácidos (aa) cubriendo la
longitud total de NSP7 (83aa), NSP13 (60laa) y NP (422aa)
que se dividieron en 5 grupos de aproximadamente 40
péptidos cada uno (NP-1, NP-2, NSP13-1, NSP13-2, NSP13-3)
y un grupo único de 15 péptidos que abarcan NSP7 (Fig. 1b).
Este método imparcial con péptidos superpuestos se utilizó
en lugar de la selección bioinformática de péptidos, ya que
el rendimiento de tales algoritmos a menudo es subóptimo
en las poblaciones asiáticas20. Células mononucleares de
sangre periférica ( PBMC) de 36 pacientes con COVID-19
recuperados fueron estimulados durante 18 h con los
diferentes grupos de péptidos y las respuestas específicas
de virus se analizaron mediante el ensayo IFN-y ELISpot. En
todos los individuos analizados (36/36) detectamos
manchas de IFN-y después de la estimulación con las
piscinas de syn péptidos temáticos que cubren NP (Fig. 1c,
d). En casi todos los individuos, se pudieron identificar
respuestas específicas de NP contra múltiples regiones de la
proteína: 34/36 para la región 1-215aa (NP-1) y 36/36 para
206-419aa (NP-2). En marcado contraste, las respuestas a
los grupos de péptidos NSP7 y NSP13 se detectaron a
niveles muy bajos en 12 de los 36 convalecientes de COVID-
19 analizados. Se realizó una tinción de citocina intracelular
directa ex vivo (ICS) para confirmar y definir la respuesta
ELISpot IFN-y EL específica de NP. Debido a su relativa baja
frecuencia, las células T específicas de NP fueron más
difíciles de visualizar por ICS que por ELISpot, pero se
detectó una población clara de células CD4 y / o CD8T que
producen IFN-yand / o TNF-a en 7 de los 9 sujetos probados
(Fig. Le; Datos extendidos Figs. 3 y 4). Además, a pesar del
pequeño tamaño de la muestra, comparamos las
frecuencias de IFN-y específicas de SARS-COV-2 con la
presencia de anticuerpos neutralizantes de virus, la
duración de la infección y la gravedad de la enfermedad,
pero no encontramos correlaciones (Datos extendidos Fig.
5). Para confirmar y delinear aún más la multiespecificidad
de las respuestas específicas de NP detectadas exvivo en
pacientes recuperados con COVID-19, mapeamos las
regiones precisas de NP capaces de activar respuestas de
IFN en nueve individuos. Organizamos los 82 péptidos
superpuestos que cubren todo el NP en pequeños grupos
de péptidos (de 7-8 péptidos) que se usaron para estimular
PBMC directamente ex vivo o después de un protocolo de
expansión in vitro utilizado previamente en sujetos
recuperados de VHB2 o SARS ". La representación
asquemática de los grupos de péptidos se muestra en la Fig.
2a.
encontraron que 8 de cada 9 pacientes con COVID-19
recuperados poseen PBMC que reconocen múltiples
regiones de NP de SARS-CoV-2 (Fig. 2a). Es importante
destacar que luego definimos péptidos individuales que
pudieron activar las células T en 7 pacientes. Utilizando una
estrategia de matriz peptídica ", primero desconvoluvimos
péptidos individuales responsables de la respuesta
detectada por IFN-y ELISpot. Posteriormente, confirmamos
el péptido único identificado mediante pruebas, con ICS, de
su capacidad para activar las células T CD4 o CD8 (Tabla 1 y
Fig. 2b). La Tabla 1 resume los diferentes epítopos de
células T definidos por ELISpot e ICS, en 7 individuos
recuperados de COVID-19. Notablemente, observamos que
los convalecientes de COVID-19 desarrollaron células T
específicas para regiones que también fueron atacadas por
células T de sujetos recuperados del SARS. Por ejemplo, la
región NP 101-120, que es un epítopo de células T CD4
descrito en individuos expuestos al SARS-CoV-1 "22,
también estimuló las células T CD4 de dos convalecientes
COVID-19. De manera similar, la región NP 321-340
contenía epítopos que desencadenan células T CD4 y CD8
en pacientes recuperados de COVID-19 y SARS ". La
demostración de que los pacientes recuperados de COVID-
19 y SARS pueden montar respuestas de células T contra
determinantes virales compartidos implica que SARS- La
linfección con CoV puede inducir a las células T capaces de
reaccionar de forma cruzada contra el SARS-CoV-2. Células T
específicas del SARS-CoV-2 en pacientes recuperados con
SARS Para el tratamiento de la pandemia actual y para el
desarrollo de vacunas contra el SARS-CoV -2, es importante
entender si la inmunidad adquirida será duradera. Hemos
demostrado previamente que los pacientes cubiertos de
SARS contienen células T específicas para epítopos dentro
de diferentes proteínas de SARS-CoV-1 que persisten
durante 11 años después de la infección ". Aquí,
recolectamos PBMC 17 años después de la infección por
SARS-CoV-1 y probamos si todavía albergan células
reactivas contra SARS-CoV-1 y si tienen potencial de
reacción cruzada contra péptidos de SARS-CoV-2. Las PBMC
de los que resolvieron el SARS (n = 15) se estimularon
directamente ex vivo con agrupaciones de péptidos que
cubren el SARS-CoV-1 NP (NP-1 y NP-2), NSP7 y NSP13 (Fig.
3a). Esto reveló que 17 años después de la infección, las
respuestas de IFN-y a los péptidos SARS-CoV-1 todavía
estaban presentes y se centraron casi exclusivamente en NP
en lugar de los grupos de péptidos NSP (Fig. 3b).
Posteriormente, probamos si los péptidos NP de SARS-CoV-
2 (aa identidad = 94%) inducen respuestas de IFN-y de
PBMC de resolvers de SARS. De hecho, las PBMC de los 23
individuos analizados reaccionaron a los péptidos NP del
SARS-CoV-2 (Fig. 3c, d). Para probar si estas respuestas de
baja frecuencia en los que resuelven el SARS podrían
expandirse después del encuentro con el SARS-CoV-2 NP, se
analizó la cantidad de células productoras de IFN que
respondían al SARS-CoV-2 NP, NSP7 y NSP13 después de 10
días de cultivo celular en presencia de los péptidos
relevantes. Se detectó una expansión clara y robusta de
células reactivas a NP en 7 de los 8 individuos evaluados
(Fig. 3e) y la tinción con ICS confirmó que el SARS recuperó
células CD4 y CD8T específicas de NP con memoria de SARS
"(Datos extendidos Fig. 6). y en marcado contraste con la
respuesta a los péptidos NP, no pudimos detectar ninguna
célula que reaccionara a las agrupaciones de péptidos que
cubren NSP13 y solo 1 de 8 reaccionó a NSP7 (Fig. 3e). Por
lo tanto, SARS-CoV-2 NP- Las células T específicas son parte
del repertorio de células T de individuos con antecedentes
de infección por SARS-CoV-1 y son capaces de expandirse de
manera sólida después del encuentro con péptidos NP de
SARS-CoV-2. Estos hallazgos demuestran que las células T
específicas de virus inducidas por La infección por
betacoro- nanvirus es duradera, lo que respalda la idea de
que los pacientes con COVID-19 desarrollarán inmunidad a
largo plazo con células T. Nuestros hallazgos también
aumentan la posibilidad intrigante de que las células T de
larga duración generadas después de la infección con virus
relacionados puedan ser capaces de para proteger o
modificar la patología Gy causada por la infección por
SARS-CoV-2.
Células T específicas de SARS-CoV-2 en SARS-CoV-1/2 no
expuestas
donantes
Para explorar esta posibilidad, probamos los péptidos NP y
NSP7 / 13 reactivos
Respuestas de IFN-γ en 37 donantes no expuestos al SARS-
CoV-1/2. Los donantes fueron
muestreados antes de julio de 2019 (n = 26) o fueron
serológicamente negativos tanto para los anticuerpos
neutralizantes del SARS-CoV-2 como para los anticuerpos
contra el SARS-CoV-2 NP (n = 11). Diferentes coronavirus
que se sabe que causan resfriados comunes en humanos
como OC43, HKU1, NL63 y 229E presentan diferentes
grados de homología de aminoácidos con SARS-CoV-2
(Extended Data Figs.land 2) y los datos recientes
demostraron la presencia del cruce de SARS-CoV-2 células T
CD4 reactivas (principalmente específicas para Spike) en
donantes no expuestos al SARS-CoV-2 ".
Sorprendentemente, detectamos respuestas IFN-y
específicas del SARS-CoV-2 en 19 de 37 individuos no
expuestos al SARS-CoV-1/2 - als (Fig. 4a, b). La proporción
acumulativa de todos los individuos estudiados que
responden a péptidos que cubren NPP y ORP-1 codificados
NSP7 y 13 proteínas se muestra en la Fig. 4b. SARS-CoV-1/2
individuos no expuestos mostraron un patrón distinto de
reactividad; mientras que los donantes recuperados de
COVID-19 y SARS reaccionaron preferentemente a los
grupos de péptidos NP (66% de los individuos recuperados
de COVID-19 y 91% de SARS respondieron solo a los grupos
NP), el grupo no expuesto mostró una respuesta mixta a NP
y NSP7 / 13 (Fig. 4a-c). Además, mientras que los péptidos
NSP estimularon una respuesta dominante en solo un par
de 59 Resolvedores de COVID-19 / SARS, desencadenaron
la reactividad dominante en 9 de 19 donantes no expuestos
con células reactivas al SARS-CoV-2 (Fig. 4c, Datos
extendidos Fig.7). Estas células reactivas al SARS-CoV-2 de
donantes no expuestos al SARS-CoV-1/2 tenían la capacidad
de expandirse tras la estimulación con péptidos del SARS-
CoV-2 (Fig. 4d). Luego delineamos la respuesta específica
del SARS-CoV-2 detectada en los individuos no expuestos al
SARS-CoV-1/2 con más detalle. La caracterización de la
respuesta específica de NP en un donante (H-2) identificó
células CD4T reactivas para un epítopo dentro de la región
NP 101-20. Este mismo epítopo también se detectó en
pacientes con recuperación de COVID-19 y SARS (Fig. 2b y
8.22). Tiene un alto grado de homología con las secuencias
MERS-CoV, OC43 y HKU1 NP (Fig. 4e). En el mismo
donante, analizamos el PBMC recolectado en múltiples
puntos de tiempo, lo que demuestra la persistencia de la
respuesta NP-101-20 durante el período de 1 año (Datos
extendidos, Fig. 8a). En otros tres donantes no expuestos al
SARS-CoV-1/2, identificamos células T CD4 específicas para
la región NSP7 26-40 (SKLWAQCVQLHNDIL; donante H-7) y
células T CD8 específicas para un epítopo comprendido
dentro de la región NSP7 36- 50 (HNDILLAKDT-TEAFE;
donantes H-3 y H-21; Fig. 4e, Datos extendidos Fig. 8b).
Estas últimas especificidades de las células dosT fueron
particularmente interesantes ya que la homología entre las
dos regiones proteicas de SARS-CoV-1/2 y otros coronavirus
"resfriado común" (OC43, HKUI NL63 y 229E) fue mínima
(Fig. 4e), especialmente para el Epítopo del péptido CD8.
De hecho, los péptidos de baja homología que cubren las
secuencias de coronavirus "resfriado común" no lograron
estimular las PBMC de los individuos sensibles a NSP736-50
(Datos extendidos, Fig. 8c). Aunque no podemos excluir
que algunas células T reactivas al SARS-CoV-2 puedan ser
ingenuas o inducidas por patógenos completamente no
relacionados, este hallazgo sugiere que otros coronavirus
actualmente desconocidos, posiblemente de origen animal,
podrían inducir SARS-CoV-2T con reactividad cruzada
células en la población general. Además, caracterizamos las
células T CD4 y CD8 específicas de NSP7 presentes en los
tres individuos no infectados. Las células T reactivas se
expandieron eficientemente in vitro y fueron
principalmente productores de IFN-yand TNF-a doble
(células T CD8) o IFN-y (células T CD4) (Datos extendidos Fig.
9a). También determinamos que las células CD8T
específicas de NSP7-36-50 están restringidas por HLA-B35 y
presentan un fenotipo diferenciado en memoria / terminal
diferenciado (CCR7 / CD45RA ") (Datos extendidos Fig. 9b,
c).
Conclusiones Por qué las células T específicas de NSP7 / 13
se detectan y a menudo son dominantes en donantes no
expuestos al SARS-CoV-1/2, mientras que representa una
población menor en individuos recuperados del SARS-Cov-
1/2 no está claro. Sin embargo, es consistente con los
hallazgos de Grifoni et al ", quienes detectaron células T
específicas de ORF-1 preferentemente en algunos donantes
no expuestos al SARS-CoV-2, mientras que las células T de
COVID-19 recuperaron proteínas estructurales reconocidas
preferentemente. Inducción del virus las células T
específicas de individuos "expuestos pero no infectados" se
han demostrado en otras infecciones virales 24-26.
Teóricamente, los individuos expuestos a coronavirus
podrían simplemente cebe las células T específicas de ORF-
1, ya que las proteínas codificadas con ORF-1 son
producido primero en células infectadas por coronavirus y
son necesarias para la
formación del complejo viral replicasa-transcriptasa
esencial para
La transcripción posterior del genoma viral que conduce a
varios
Especies de ARN 18. Por lo tanto, las células T específicas
de ORF-1 podrían hipotéticamente
abortar la producción viral al lisar las células infectadas con
SARS-CoV-2 antes
La formación de viriones maduros. Por el contrario, en
COVID-19 y SARS
pacientes, la proteína NP, que se produce abundantemente
en células secretas
se espera que los viriones maduros17 den como resultado
un impulso preferencial
ing de células T específicas de NP.
Es importante destacar que la región ORF-1 contiene
dominios que son extremadamente
conservado entre muchos diferentes coronavirus9
. La distribución
de estos virus en diferentes especies animales podrían
resultar en periódicas
células T específicas de ORF-1 inductoras de contacto
humano con capacidad de reacción cruzada
ity contra SARS-CoV-2. Comprender la distribución,
frecuencia
y capacidad protectora de estructuras preexistentes
estructurales o no estructurales
Las células T con reacción cruzada de SARS-CoV-2 podrían
ser de gran importancia para
Explicar algunas de las diferencias en las tasas de infección
o patología observadas
durante esta pandemia. Las células T específicas para
proteínas virales tienen protec-
capacidad tiva en modelos animales de infecciones de las
vías respiratorias27,28, pero el impacto
que las células T específicas de NP y / o ORF-1 preexistentes
podrían tener en el
la modulación diferencial de la infección por SARS-CoV-2
tendrá que ser cuidadosa
totalmente evaluado
Naturaleza | www.nature.com 9 Artículo Métodos Líneas
de Tcell ampliadas Declaración de ética Las líneas de Tcell se
generaron de la siguiente manera: 20% de las PBMC se
pulsaron con Todos los donantes dieron su consentimiento
por escrito. El estudio se realizó en 10 pg / ml de los
péptidos SARS-CoV-2 superpuestos (todos combinados) de
acuerdo con la Declaración de Helsinki y aprobado por el
NUS o péptidos individuales durante 1 hora a 37 ° C,
posteriormente lavado y junta de revisión institucional
institucional (H-20-006 ) y SingHealth Centralized tured con
el resto de celis en medio AIM V (Gibco: Thermo Fisher
Scientific) suplementado con suero humano AB al 2%
(Gibco: Thermo Fisher Scientific). Las células se cultivaron
durante 10 días en presencia de la Junta de Revisión
Institucional (referencia CIRB / F / 2018/2387). Se
reclutaron muestras de humanos en función de su historial
clínico de infección por SARS-CoV-1 o SARS-CoV-2. Se
obtuvieron muestras de Bloud de pacientes con COVID-19
recuperados Ensayo de restricción de HLA (n = 36) 2-28 días
después de la negatividad de la PCR: del SARS recuperado El
tipo HLA del donante sano H-3 fue desterninado y
diferentes pacientes con EBV (n-23) 17 años después de la
infección . Las muestras de donantes sanos se
transformaron en líneas celulares con una comunidad
común, cada una se seleccionó o se recolectó antes de junio
de 2019 para estudios de la función de las células T en el
virus para la presentación del péptido NSP7 36-50 (ver más
abajo), Bcels fueron enfermedades pulsadas (n-26) o en
marzo de abril de 2020 y dio negativo para RBD con 10 g /
ml del péptido durante 1 hora a 37 "C. lavado tres veces,
neutralizando anticuerpos y negativo en un ELISA para NP
IgG (n-11". y cultivado con el Toell expandido línea
ataratioof1: l en la presión de 20 U / ml de IL-2
recombinante (Sistemas RAD) de 10 ug / ml de brefeldina A
(Sigma-Aldrichi. Las células B no pulsadas sirven como un
control negativo que detecta respuestas
potenciallogenéticas PBMCisolation Células mononucleares
de sangre periférica (PBMC) se aislaron y las células
pulsadas con péptido autólogo sirvieron como control
positivo, centrifugación en gradiente de densidad usando
Ficol-Paque. Las PBMC aisladas fueron haplotipo HLA-clase I
de las diferentes líneas de células B: CM780 = A24: 02, ya
sea estudiadas directamente o Eryop reservado y
almacenado en nitrógeno líquido A'33: 03, B "58:01, B"
55:02, Cw07: 02. Cwr03: 02: WGP48 - A'02: 07. hasta que
se use en los ensayos. A'I: OL B'15: 25, B'46: 01. Cw01: 02,
Cw04: 03; NP378 - A'l1: 01, A'33: 03, B * 51: 51. B'35: 03,
Cw "07:02. Cw" 14:02: NgaBH - A'02: 01, A'33: 03. B'S8: 01,
B'13: 01, Cw03: 02. Los péptidos agrupan los péptidos de
15 mer que se superponen por 10 aminoácidos que amplían
la secuencia de proteínas completa de SARS COV 2 NP, NSP7
y NSPI3, así como la alineación de secuencia de SARS-CoV-I
NP se sintetizaron (GL Biochem Shanghai Ltd: ver
Segmentación de proteínas de referencia suplementaria
para ORFlab (ID de acceso: QHD4341S1, tablas 1. 21. Para
estimular PBMC, los péptidos se dividieron en 5 grupos NP
828849.2. YP 009047202.1, YP 009555238.1. YP 173236.1.
de aproximadamente 40 péptidos que cubren NP (NP-1, NP-
2 ) y NSPI3 (NSP13-1, YP 003766.2. NP 073549.1) y
Nucleocapsid Protein (Accession NSPI3-2, NSP13-31 y un
grupo de 15 péptidos que cubren NSP7. Para ID: YP
009724397.2. AAP33707.1 YP 009047211.1 YP
009555245.1. single identificación de péptidos, los péptidos
se organizaron en una matriz de YP 173242.1. YP 00377LL,
NP 073556.1) se descargaron de tbe 12 grupos numéricos y
7 alfabéticos para NP, y 4 bases de datos numéricas y 4 alfa-
NCBI. Las secuencias se alinearon usando el algoritmo
MUSCLE betic agrupaciones para NSP7 con parámetros
predeterminados y el porcentaje de identidad se calculó en
Geneious Prime 2020.1.2 (https://www.geneious.com). Las
figuras de alineación se realizaron en Snapgene 5.1 (GSL
Biotech). Ensayo ELISpot Las placas ELISpot (Millipore) se
revistieron con anticuerpo IFN-Y humano (1-DIK. Mabtech: 5
ug / ml) durante la noche a 4 ° C. 400,000 PBMC fueron
ensayo de neutralización del virus sustituto sembrado por
pocillo y estimulado durante 18 h con grupos de SARS COV-
1/2 Se usó una nueva prueba de neutralización del virus
sustituto (SVTN). Péptidos Spe (2ug / ml). Para la
estimulación con agrupaciones de matriz peptídica,
específicamente, mide la cantidad de anticuerpos anti-Spike
que bloquean los péptidos, se utilizó una concentración de
5 pg / ml. Subiseguently. Las interacciones proteína-
proteína de las placas entre el dominio de unión de la
espiga (RBD) se desarrollaron con el anticuerpo de
detección i Ny biotinilado humano para el receptor ACE2
usando un ensayo basado en ELISA ". (7-86-L Mabtech: L
2000), seguido de incubación con estreptavidina AP
(Mabtech) y sustrato de fosfatasa KPLBCIP / NBT (SeraCare).
Las unidades formadoras de análisis estadísticos puntuales
(SFU) se cuantificaron con ImmunoSpot. Para cuantificar
Todos los análisis estadísticos se realizaron en Prism
(software GraphPad). respuestas específicas de péptidos
positivos, 2 puntos medios de lo no estimulado y los
detalles se proporcionan en las leyendas de las figuras.Los
pozos latentes se sustrajeron de los pozos estimulados con
péptidos, y los resultados se expresaron como SFU /
A0PHMC. Excluimos los resultados si los pozos de control de
resumen de informe negativo tenían> 30 SFU / 10 PBMC o
pozos de control positivo (PMA / Más información sobre el
diseño de la investigación está disponible en Nature
lonomycin) fueron negativos. Resumen de informes de
investigación vinculado a este documento. Citometría de
flujo PEMC o Telfelf expandido se estimularon para Sh a 37
° C con o Disponibilidad de datos sin conjuntos de péptidos
SARS CoV-1/2 (2 ug / ml) en presencia de 10 ug / Secuencias
de proteínas de referencia para ORFlab y Proteína de
nucleocápside mlbrefeldina A (Sigma Aldrich). Las células se
tiñeron con yellowLIVE / se descargaron de la fase de datos
NCB, ver más arriba. Todos los datos están disponibles: kit
de tinción de células muertas reparable DEAD (Invitrogen) y
anti-CD3 (solo SK7: disponible en el texto principal o en los
materiales complementarios. 3: S0). anti-CD4 (clon SK3:
3:50) y anti-CDS (clon SKI; 150) anti-cuerpos. Para el análisis
del estado de diferenciación de células T, las células se
tiñeron adicionalmente contra CCR7 (clon 150503: L10) y
anti-CD45RA (clonar una prueba TanWetal.A SARS-C ogate
mon NTedon HIH00; L: 10). Posteriormente, los Celis se
fijaron y se permeabilizaron usando el kit Cytofix /
Cytoperm (BD Biosciences-Pharmingen) y se tiñeron con
anticuerpos anti-IFN-y (clon 25723, R & DSystems: 1:25) y
anti-YNFA (clon MABII; 125) y se analizaron en un escáner
BD-LSR I FACS. Flowjo (Tree Star Inc.) analizó los datos
Acknetedgereta Wtha Mala Munirverty Colege Lordon,
Kndth. Los anticuerpos se compraron de BD Biosciences
Pharmingen a menos que se indique lo contrario. biociage
meditado aitody de trowaction de proteína prasina ACEpke
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