T Uce 0008 091

UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR
FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICAS

CARRERA DE QUÍMICA DE ALIMENTOS
“ESTUDIO COMPARATIVO DEL CONTENIDO DE

RIBOFLAVINA EN DIFERENTES MARCAS DE HARINA
DE TRIGO COMERCIALIZADAS EN QUITO”
Tesis de Grado para optar por el Título profesional de

QUÍMICO DE ALIMENTOS
Autor:
Christian Santiago Robles Ortiz
santiago6667@hotmail.com
Tutor:
Dr. Eduardo Mayorga
emayorga@uce.edu.ec
Quito, Julio 2015

Christian Santiago Robles Ortiz (2015). Estudio comparativo
del contenido de riboflavina en diferentes marcas harinas de
trigo comercializadas en Quito. Trabajo de investigación para
optar por el grado de Química de Alimentos. Carrera de
Química de Alimentos. Quito: UCE 121 p.
ii
DEDICATORIA
A mi abuelo Tobías, mi abuela Marina, mi tíos Susana, Lucho, Pepe, a mis primos Luis,
Diego, a Leidy, por haberme brindado todo el apoyo en cada una de las etapas de mi
vida.
A mis profesores de toda mi carrera universitaria, por brindarme todo su conocimiento y
experiencia en esta etapa estudiantil.
A la Universidad Central del Ecuador en especial a la facultad de Ciencias Químicas por
haberme abierto las puertas y por facilitarme todo los implementos necesarios para mi
formación profesional.
Finalmente quiero dedicar este trabajo a mi madre que donde quiera que ella se
encuentre estoy seguro que estará muy orgullosa de mi.
iii
AGRADECIMIENTO
A el laboratorio OSP alimentos, la Doctora Ana María Hidalgo, Doctor Geovanny

Garófalo, gracias por todos sus conocimientos brindados y apoyo durante toda esta
investigación.
Al Doctor Eduardo Mayorga, Doctor Raúl Baamonde, doctora Verónica Taco por haber
encaminado toda esta investigación.
A mi familia por todos los momentos buenos, malos que hemos pasado gracias por todo
su apoyo y ejemplo que me han ayudado en convertirme en la persona que soy hoy en
día.
A Leidy por todo su apoyo brindado en los últimos semestres de mi carrera.
A dios por darme salud y vida para concluir con esta etapa universitaria
iv
v
CONSTANCIA Y APROBACIÓN DEL TUTOR
vi
vii
LUGAR DONDE SE REALIZÓ LA INVESTIGACIÓN
El presente trabajo se realizó en la Facultad de Ciencias Químicas, el laboratorio de

Oferta y Servicio al Público OSP, en el área de Análisis de Alimentos. Las muestras
fueran tomadas en el punto de venta supermercados. Los equipos, materiales y reactivos
fueron facilitados por el laboratorio OSP.
viii
CONTENIDO
DEDICATORIA…..........................................................................................................iii
AGRADECIMIENTO...................................................................................................iviv
CESIÓN DE DERECHO..................................................................................................v
CONSTANCIA DE APROBACIÓN DEL TUTOR........................................................vi
CONTENIDOS................................................................................................................ix
LISTA DE TABLAS......................................................................................................xiii
LISTA DE GRÁFICOS..................................................................................................xiv
LISTA DE ANEXOS......................................................................................................xv
RESUMEN.....................................................................................................................xvi
ABSTRACT.................................................................................................................xviii
CAPÍTULO I...................................................................................................................18
1 EL PROBLEMA...........................................................................................18
1.1 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA.....................................................18
1.2 FORMULACIÓN DEL PROBLEMA.........................................................19
1.3 OBJETIVOS.................................................................................................19
1.3.1 Objetivo general...........................................................................................19
1.3.2 Objetivos específicos....................................................................................19
1.4 IMPORTANCIA Y JUSTIFICACIÓN DE LA INVESTIGACIÓN...........20
CAPÍTULO II..................................................................................................................22
2 MARCO TEÓRICO.....................................................................................22
2.1 ANTECEDENTES.......................................................................................22
2.2 FUNDAMENTO TEÓRICO........................................................................22
2.2.1 HARINA DE TRIGO:..................................................................................22
2.2.2 OBTENCIÓN Y CLASES DE HARINA DE TRIGO:................................23

ix
2.2.3 TIPIFICACIÓN DE LAS HARINAS:.........................................................24
2.2.4 CLASIFICACIÓN DE LA HARINAS........................................................24
2.2.4.1 HARINA PANIFICABLE:...........................................................................24
2.2.4.2 HARINA INTEGRAL..................................................................................25
2.2.4.3 HARINAS ESPECIALES............................................................................25
2.2.4.4 HARINAS PARA TODO USO:...................................................................26
2.2.5 VITAMINAS:...............................................................................................26
2.2.5.1 VITAMINAS DEL GRUPO B.....................................................................26
2.2.5.1.1 RIBOFLAVINA:..........................................................................................27
2.2.5.1.2 TIAMINA.....................................................................................................31
2.2.5.1.3 NIACINA.....................................................................................................31
2.2.6 CROMATOGRAFIA LIQUIDA DE ALTA EFICIENCIA:.......................32
2.2.7 MÉTODOS DE DETERMINACIÓN DE LAS VITAMINAS DEL

GRUPO B .......................................................................................................
..................................................................................................................... 32
2.3 FUNDAMENTO LEGAL............................................................................33
2.4 HIPÓTESIS DE TRABAJO.........................................................................34
CAPÍTULO III................................................................................................................36
3 METODOLOGÍA.........................................................................................36
3.1 TIPO DE INVESTIGACIÓN.......................................................................36
3.2 POBLACIÓN Y MUESTRA.......................................................................36
3.3 DISEÑO EXPERIMENTAL........................................................................37
3.3.1 DISEÑO DE BLOQUES COMPLETOS AL AZAR CON

SUBMUESTRAS:.........................................................................................37
3.3.2 PRUEBA DE TUKEY..................................................................................39
3.3.3 PRUEBA T – STUDENT (UNA COLA O UNILATERAL) Y

COMPARACIÓN CON UN VALOR DEREFERENCIA...........................39
x
3.4 VARIABLES DE LA INVESTIGACIÓN...................................................40
1.1 TÉCNICAS E INSTRUMENTOS ANALÍTICOS PARA LA

EXTRACCIÓN Y LA DETERMINACIÓN DE LA RIBOFLAVINA.......40
3.4.1 MATERIALES, EQUIPOS Y REACTIVOS:..............................................40
3.4.2 PREPARACIÓN DEL ESTANDAR DE RIBOFLAVINA DE 50 ug / ml.
41 3.4.3 SOLUCIÓN INTERMEDIA DE 5 ug / ml:......................................................41
3.4.4 CURVA DE TRABAJO DE 0,02 – 0,05 – 0,07 Y 0,1 ug / ml:...................42
3.4.5 PREPARACIÓN DE LA MUESTRA:.........................................................42
3.4.6 HIDRÓLISIS ACIDA DE LA MUESTRA:.................................................42
3.4.7 CONDICIONES CROMATOGRÁFICAS PARA ANÁLISIS DE

RIBOFLAVINA:...........................................................................................43
3.5 VERIFICACIÓN DEL MÉTODO CROMATOGRÁFICO.........................45
3.5.1 EXACTITUD...............................................................................................46
3.5.2 SENSIBILIDAD...........................................................................................46
CAPÍTULO IV................................................................................................................47
4 ANÁLISIS E INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS............................47
4.1 RESULATADOS DE LA ESTANDARIZACIÓN DEL METODO

ANALÍTICO.................................................................................................47

RIBOFLAVINA:...........................................................................................52
4.2 RESULTADOS DEL CÁLCULO DE LA CONCENTRACIÓN DE

RIBOFLAVINA EN LAS DIFERENTES MARCAS DE HARINA................56
4.3 CÁLCULO DEL ADEVA...........................................................................58
4.4 CÁLCULO DE LA PRUEBA DE TUKEY.................................................60
4.5 CÁLCULO DE T – STUDENT PARA LA COMPARACIÓN CON UN

VALOR DE REFERENCIA..........................................................................62
CAPÍTULO V.................................................................................................................65
xi
5 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES...........................................65
5.1 CONCLUSIONES........................................................................................65
5.2 RECOMENDACIONES..............................................................................66
ANEXOS.........................................................................................................................69
xi
i
LISTA DE TABLAS
Tabla 1Sustancias de fortificación...................................................................................26

Tabla 2. Esquema de población y muestra......................................................................36
Tabla 3. Plan de muestreo...............................................................................................37
Tabla 4 Esquema del Diseño Experimental.....................................................................38
Tabla 5 Parámetros de verificación de acuerdo al tipo de método..................................45
Tabla 6 Áreas de muestras de harina con enzimas y sin enzimas..................................49
Tabla 7 Concentraciones de HCl y Acetato de Sodio con sus respectivas áreas en
muestras de harina............................................................................................51
Tabla 8 Curvas de calibración.........................................................................................53
Tabla 9 Cálculo de la concentración de riboflavina (mg / kg) para la harina A..............57
Tabla 10 Cálculo de la concentración de riboflavina (mg / kg) para la harina B............57
Tabla 11 Cálculo de la concentración de riboflavina (mg/kg) para la harina C.............57
Tabla 12 Cálculo de la concentración de riboflavina (mg/kg) para la harina D.............58
Tabla 13 Cálculo de la concentración de riboflavina (mg / kg) para harina E................58
Tabla 14 Cálculo de la concentración de riboflavina (mg/kg) para la harina F.............58
Tabla 15 Cálculo del Adeva............................................................................................59
Tabla 16 Tratamientos, bloques y muestras....................................................................59
Tabla 17.Niveles de Significancia...................................................................................60
Tabla 18 Ordenamiento de medias..................................................................................61
Tabla 19 Comparación múltiple entre las medias y los tratamientos..............................61
Tabla 20 Tabla de rangos................................................................................................62
Tabla 21 Prueba t –student..............................................................................................63
xiii
LISTA DE GRÁFICOS
Gráfica 1. Fórmula de la Riboflavina..............................................................................27

Gráfica 2. Esquema general del proceso.........................................................................44
Gráfica 3. Cromatograma de riboflavina con enzima.....................................................48
Gráfica 4. Cromatograma de riboflavina sin enzima.......................................................48
Gráfica 5. Cromatograma de riboflavina utilizando soluciones de HCl 1 N y Acetato de
sodio 2.5 M....................................................................................................50
Gráfica 6. Cromatograma de riboflavina utilizando soluciones de ácido clorhídrico HCl
2 N Y Acetato de sodio 3,5 M......................................................................50
xiv
LISTA DE ANEXOS
Anexo 1.Norma INEN 616:2006.....................................................................................69
Anexo 2.Norma INEN 616:2015.....................................................................................80
Anexo 3. Lineamientos del programa de fortificación de las harinas.............................91
Anexo 4.Procedimiento para determinación de riboflavina Instituto de Salud Pública

Gobierno de Chile...........................................................................................................108
Anexo 5.Método para la determinación de riboflavina 970.65 AOAC........................114
Anexo 6.Guía de muestreo de alimentos FAO..............................................................116
Anexo 7. Cálculos de linealidad…................................................................................117
Anexo 8 Cálculos de Exactitud….................................................................................121
xv
RESUMEN
Las harinas son el producto que se obtiene de la molienda y tamizado del endospermo
del grano de trigo, y además son la fuente principal del material panificable de todo el
mundo, debido a la presencia en ella de sustancias proteicas y amiláceas.
Las harinas poseen vitaminas que son nutrientes orgánicos imprescindibles en los
procesos metabólicos, sin ellas el organismo no es capaz de aprovechar los elementos
constructivos y energéticos suministrados por la alimentación. Una de las vitaminas
importantes es la riboflavina que mantiene las funciones del metabolismo en
condiciones normales. Esta vitamina interviene en los procesos de respiración celular,
desintoxicación hepática, desarrollo del embrión y mantenimiento de la envoltura de los
nervios. También ayuda al crecimiento, reproducción, mejora el estado de la piel, uñas
y el cabello.
Esta investigación tiene como objetivo realizar un estudio comparativo del contenido de
riboflavina en diferentes marcas de harina de trigo comercializadas en Quito, para lo
cual se realizó una estandarización del método 970.65 AOAC riboflavina o vitamina B2
en alimentos y preparación de vitaminas así como también del procedimiento para
determinar riboflavina en harina de trigo del instituto de salud pública de Chile para
extraer, identificar y cuantificar la vitamina B 2, mediante el uso de cromatografía
líquida con detector de fluorescencia ajustada a una longitud de onda de excitación de
450 nm y emisión de 528 nm.
Los resultados de este estudio se compararon con el sistema de control de calidad del
proceso de fortificación de harina de trigo, descrito el programa de fortificación de
harina de trigo del ministerio de salud pública del Ecuador , donde 5 de las 6 harinas
analizadas cumplen con la norma.
PALABRAS CLAVE: HARINA, RIBOFLAVINA, CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA

DE ALTA RESOLUCIÓN, FLUORIMETRÍA, DIGESTIÓN, HIDRÓLISIS
xvi
ABSTRACT
The flours are products we get from the milling and sifting the wheat grain endosperm,
and it are also the main source of bread-making material worldwide, because of the
presence there of protein and starchy substances. The flours have vitamins that are
organic nutrients in the metabolic processes, without them the organism is not able to
take advantages of the constructive elements and energy provided by food. One of the
most important vitamins is riboflavin, because maintains metabolic functions normally.
This vitamin intervenes in the process of cellular breathing, liver detoxification,
embryonic development and maintenance of nerve envelope. Also helps the growth,
reproduction, improves the condition of skin, nails and hair. This research has as
objective to conduct a comparative study of the content of riboflavin in different brands
of flour sold in Quito, for which we did the AOAC 970.65 standardization method of
Riboflavin or vitamin B2 in foods and vitamin preparation as well as the procedure is
performed to determine riboflavin in wheat flour in the Institute of Public Health of
Chile to extract, identify and quantify vitamin B 2, By using liquid chromatography
with fluorescence detector set to a wavelength of 450 nm excitation, and emission 528
nm.
The result of this study were compared with the system of quality in the process of
fortification of wheat flour, described the program of wheat flour fortification public
health ministry of Ecuador, where 5 of the 6 meals analyzed meet the standard.
KEYWORDS: FLOUR, RIBOFLAVIN, HIGH RESOLUTION LIQUID

CHROMATOGRAPHY, FLUORIMETRY, DIGESTION, HYDROLYSIS
xvii
CAPÍTULO I
1 EL PROBLEMA
1.1 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
La nutrición es muy importante en el desarrollo del ser humano desde su concepción.

Hay estudios realizados que prueban que en el ciclo de vida existe una deficiencia de
hierro y vitaminas en los ecuatorianos, cuyas cifras superan el 50 por ciento.
(Ministerio de Salud Pública del Ecuador, 2012)
Los antecedentes marcan la importancia de la nutrición en la salud de la población,

responsabilidad que está a cargo del Ministerio de Salud Pública y que por su valor se
han implementado programas dirigidos a revertir este problema.
Debido a que el Ecuador no cuenta con un procedimiento para la determinación de la

riboflavina y que en la norma INEN 616:2015 harina de trigo requisitos, se utiliza el
método AOAC 970.65 riboflavina vitamina B 2 en alimentos y preparaciones
vitamínicas como método de referencia para la determinación de esta vitamina, es
necesario que se realice un método en el laboratorio mediante el cual se pueda
controlar la fortificación adecuada de las harinas con riboflavina en el país.
Por esta razón se han desarrollado normas, protocolos, manuales y procedimientos

orientados a la estandarización de la fortificación de la harina de trigo. El Ecuador
cuenta con un Reglamento de Fortificación y Enriquecimiento de la harina de trigo
nombrado en el acuerdo ministerial No. 00000370, según este reglamento tiene como
objetivo la prevención de anemias nutricionales en la población, y cuenta con la norma
INEN 616:2015, que establece los requisitos que deben cumplir las harinas de trigo
destinadas al consumo humano y al uso en la elaboración de otros productos
alimenticios.
18
1.2 FORMULACIÓN DEL PROBLEMA
Frente a esta realidad y una vez estandarizado el método de determinación de

riboflavina.
¿Es necesario realizar un estudio del contenido de riboflavina de las harinas de trigo
fortificadas en Quito?
¿Cumplen o no las harinas comercializadas en los supermercados con el sistema de control

de calidad del proceso de fortificación de harina de trigo con el contenido promedio de
riboflavina 4,0 mg / kg, descrito el programa de fortificación de harina de trigo del
Ministerio de Salud Pública del Ecuador?
1.3 OBJETIVOS
1.3.1 Objetivo general
Evaluar el contenido de riboflavina en diferentes marcas de harinas de trigo

comercializadas en los supermercados en Quito.
1.3.2 Objetivos específicos
Primera etapa:
 Realizar la estandarización del método 970.65 AOAC riboflavina o vitamina B2 en

alimentos y preparación de vitaminas así como también del procedimiento para
determinar riboflavina en harina de trigo del instituto de salud pública de Chile para
la determinación de riboflavina o vitamina B2 en harina de trigo, modificando la
extracción y las condiciones cromatográficas con el propósito de optimizar el
tiempo de corrida.
19
Segunda etapa:
 Determinar el contenido de riboflavina en seis marcas de harina de trigo fortificada,

por el método de cromatografía líquida de alta resolución HPLC utilizando un
detector de fluorescencia, con el fin de obtener datos sin variación u homogéneos.
Tercera etapa:
 Analizar y comparar los resultados de cada harina con el sistema de control de

calidad del proceso de fortificación de harina de trigo, descrito el programa de
fortificación de harina de trigo del Ministerio de Salud Pública del Ecuador para
verificar su cumplimento.
1.4 IMPORTANCIA Y JUSTIFICACIÓN DE LA INVESTIGACIÓN
La principal característica de la riboflavina es intervenir en la respiración celular, además

se relaciona con el desarrollo fetal y la producción de energía a través de las mitocondrias.
(Rodriguez, 2001)
Esta vitamina actúa de manera sinérgica con la tiamina, hierro, cobre, fosfatos; y actúa de
manera antagonista con el ácido bórico y las flavinas. (Martín, 2000)
En el Reglamento de Fortificación y Enriquecimiento de la harina de trigo en el Ecuador

se establece la obligatoriedad de fortificar y enriquecer todas las harinas de trigo con
riboflavina y otras vitaminas, pero en nuestro país no hay un técnica estandarizada que
puede determinar el contenido de esta vitamina, por lo que esta investigación busca
desarrollar un método utilizando cromatografía líquida de alta resolución con detector de
fluorescencia para la determinación de riboflavina.
La mayoría del trigo producido en el Ecuador está destinado para la panificación, y esto
se va incrementando cada año, para el 2012 el consumo de pan se ha incrementado en
un 5, 7 % en relación al año 2011 y se espera que estos 5 años alcance un 8%. (PRO
ECUADOR, 2012)
20
En los últimos años el Instituto Nacional de Estadística y Censo ha proporcionado datos
acerca del número de panaderías que existen el Ecuador que son 7957, generando un
ingreso anual de 769 millones dólares al año. (INEC, 2010)
La industria molinera en el país es pequeña encontrándose 22 molinos a nivel nacional, que

producen alrededor de 800 000 toneladas de harina al año.
En el país existen 5000 hectáreas de trigo sembradas en la sierra, que pertenece a los
pequeños agricultores. (Asemol , 2008)
La producción de harina en el país está destinada:

50% - 60% para panificación
20% - 30% para fideos
5% - 7% para balanceados
Utilizando exclusivamente para panadería 314234 toneladas al año. (Asemol , 2008) A
continuación se detalla información sobre el consumo de harina en el país.

ProvinciaConsumo anual (kg) Número de panaderías
por provincia
Guayas 91 873 284 2326
Pichincha 67 489 858 2117
Manabí 1 180 375 678
Los Ríos 650 709 86
Azuay 598 504 344
Tungurahua 441 389 688
Cotopaxi 350 450 164
Imbabura 435 781 356
(Asemol , 2008)
21
CAPÍTULO II
2 MARCO TEÓRICO
2.1 ANTECEDENTES.
Según un informe difundido por UNICEF y MICRONUTRIENT INICIATIVE, al menos

la tercera parte de los habitantes del planeta no alcanzarán su potencial físico e intelectual
total debido a la carencia de vitaminas y minerales. Este informe describe los efectos
causados por estas insuficiencias en 80 países. (Revista Chilena de nutrición, 2013)
En lo que se refiere a Latinoamérica y el Caribe, es del caso destacar que en virtud de la

Declaración de Lima, la industria molinera de América Latina y de El Caribe, afiliadas a la
Asociación Latinoamericana de Industriales Molineros (ALIM), se comprometió a
promover, impulsar y apoyar las legislaciones necesarias para establecer en sus respectivos
países, se obligue a enriquecer las harinas de trigo y maíz con los micronutrientes
recomendados por la Organización Mundial de la Salud OMS. Una encuesta realizada en
septiembre 2002 a 31 países de América Latina y el Caribe, detectó que ya cuentan con las
respectivas legislaciones. (Revista Chilena de nutrición, 2013)
No obstante, el incremento de las tasas de anemia ferro priva revela la necesidad urgente
de realizar una evaluación de la real situación actual, de manera que sea factible establecer
las causas del incremento de las tasas de anemia ferro priva y desnutrición infantil.
(Revista Chilena de nutrición, 2013)
2.2 FUNDAMENTO TEÓRICO
2.2.1 HARINA DE TRIGO:
Es el producto que se obtiene de la molienda y tamizado del endospermo del grano de

trigo, hasta un grado de extracción determinado. Considerando el restante como un
subproducto (residuos de endospermo, germen y salvado). (Sevicio Ecuatoriano de
Normalización, 2006)
22
El trigo es una planta gramínea, herbácea, anual del género Tricticu, que comprende un
número considerable de especies silvestres y cultivadas. Es el cereal más importante,
constituye la fuente principal de la harina panificable de todo el mundo, debido a la
presencia en ella de sustancias proteicas y amiláceas. (Bernal Ramirez , 2014)
Se cultivan muchos tipos de trigo, pero en la alimentación se emplean dos tipos Triticum
vulgare, triticum durum, el primero se usa para obtener pan y en pastelería y el segundo
para la fabricación de fideos y similares. (Alimentacionsana, 2012)
2.2.2 OBTENCIÓN Y CLASES DE HARINA DE TRIGO:
La molienda del trigo tiene como finalidad básica la obtención de harinas a partir de los
granos de trigo, para la fabricación de pan, pastas alimenticias, o galletas.
Los pasos que se siguen para obtener la harina son:
a. Limpieza preliminar de los granos, mediante corrientes de aire que separan el

polvo, la paja y los granos vacíos.
b. Escogido de granos mediante cilindros cribados, que separan los granos por su
tamaño y su forma.
c. Despuntado y descascarillado, en esta fase se eliminan el embrión y las cubiertas
del grano.
d. Cepillado de la superficie de los granos, para que queden totalmente limpios.
e. Molturación, finalmente se pasa a la molienda mediante unos rodillos metálicos de
superficie áspera o lisa que van triturando el grano y obteniendo la harina.
f. Refinado, una vez obtenida la harina pasa a través de una serie de tamices que van
separando las diferentes calidades de la harina. Este constituirá la harina de primera
extracción.
El resto retenido por el tamiz pasa a una segunda extracción esta vez ligeramente más
intensa y nuevamente se separa y tamiza esta harina y se llamara de segunda extracción.
(Salinas, 1993)
23
Quedaran otros restos para ser sometidos a una nueva trituración cada vez como mayos
precisión y con menor distancia entre los rodillos. La operación se repite hasta conseguir
una harina blanca que posee un índice de aprovechamiento medio de 72% respecto a la
cantidad inicial del gran. Cuando el porcentaje global extraído supera esta cifra, se
obtienen las denominadas harinas integrales y oscuras que contienen la cascara del grano
además de su meollo. (Alimentacionsana, 2012)
2.2.3 TIPIFICACIÓN DE LAS HARINAS:
Comercialmente las harinas son tipificadas con las denominaciones de: cuatro ceros
(0000), tres ceros (000), dos ceros (00), cero (0), medio cero 1⁄2(0), harinilla de primera y
harinilla de segunda corresponderán a los productos que se obtienen de la molienda
gradual y metódica del endospermo en cantidad de 70% y 80% de grano limpio.
(Argentino, 2011)
La harina (000) se utiliza siempre para la elaboración de panes, ya que su alto contenido de
proteínas posibilita la formación del gluten y se consigue un buen leudado sin que las
piezas pierdan su forma. (Argentino, 2011)
La (0000) es la harina más refinada y la más blanca, al tener escasa formación de gluten no
es un buen contenedor de gas y los panes pierden forma. Por este motivo se utiliza en
panes de molde o en pastelería, en batido de tortas, hojaldres, etc. (Argentino, 2011)
2.2.4 CLASIFICACIÓN DE LA HARINAS
La harina de trigo de acuerdo a su uso se clasifica en:
2.2.4.1 HARINA PANIFICABLE:
HARINA EXTRA: Es la harina elaborada hasta un grado de extracción determinado, que

puede ser tratada con blanqueadores y / o mejoradores, productos málticos, enzimas
diastáticas, y fortificadas con vitaminas y minerales. (Sevicio Ecuatoriano de
24
2.2.4.2 HARINA INTEGRAL:
Es la harina obtenida de la molienda de granos limpios de trigo y que contiene todas las
partes de este, que puede ser tratada con mejoradores, productos málticos, enzimas
diastáticas, y fortificada con vitaminas y minerales. (Sevicio Ecuatoriano de
2.2.4.3 HARINAS ESPECIALES:
Son harinas con un grado de extracción bajo, como lo permita el proceso de

industrialización, cuyo destino es la fabricación de productos de pastificio, galletería y
derivados de harinas auto leudantes, que pueden ser tratadas con mejoradores, productos
málticos, enzimas diastáticas y fortificadas con vitaminas y minerales. (Sevicio
Ecuatoriano de Normalización, 2006)
HARINA PARA PASTIFICIO.- Es el producto definido anteriormente, elaborado a partir

de trigos aptos para esos productos, que puede ser tratada con blanqueadores, mejoradores,
productos málticos, enzimas diastáticas y fortificadas con vitaminas y minerales. (Sevicio
Ecuatoriano de Normalización, 2006)
HARINAS PARA GALLETAS.- Es el producto definido en harinas especiales, elaborado

a partir de trigos blandos y suaves o con otros trigos aptos para su elaboración., que puede
ser tratada con blanqueadores, mejoradores, productos málticos, enzimas diastáticas y
fortificadas con vitaminas y minerales. (Sevicio Ecuatoriano de Normalización, 2006)
HARINA AUTOLEUDANTE.- Es el producto definido en harinas especiales, que

contiene agentes leudantes y que puede ser tratada con agentes blanqueadores,
mejoradores, productos málticos, enzimas diastáticas y fortificadas con vitaminas y
minerales. (Sevicio Ecuatoriano de Normalización, 2006)
25
2.2.4.4 HARINAS PARA TODO USO:
Es el producto definido en 2.2.1 proveniente de las variedades de trigo Hard Red Spring o
Norther SpringHard Red Winter, homólogos canadienses o trigos de otras orígenes que
sean aptos para la fabricación de pan, fideos galletas, etc.
Tratada o no con blanqueadores y / o mejoradores, productos málticos, enzimas
diastáticas, y fortificada con vitaminas y minerales (Ver tabla 1) (Sevicio Ecuatoriano de
Tabla 1Sustancias de fortificación
SUSTANCIAS UNIDAD MINIMO PROMEDIO MAXIMO
Hierro reducido o micronizado mg / kg 37 55 73
Tiamina (vitamina B1) mg / kg 2,2 4 5,8
Riboflavina (vitamina B2) mg / kg 2,2 4 5,8
Ácido Fólico mg / kg 0.9 1,7 2,5
Niacina mg / kg 22,1 40 57,9
Modificado por Santiago Robles
2.2.5 VITAMINAS:
Son nutrientes orgánicos imprescindibles en los procesos metabólicos que tienen lugar en
la nutrición de los seres vivos. Sin ellas el organismo de capaz de aprovechar los elementos
constructivos y energéticos suministrados por la alimentación. Normalmente se utilizan en
el interior de las células como precursoras de coenzimas, a partir de las cuales se elaboran
las miles de enzimas que regulan las reacciones químicas de las que viven las células.
(biopsicologia, 2010)
Se clasifican por su solubilidad en liposolubles e hidrosolubles.
2.2.5.1 VITAMINAS DEL GRUPO B.
Son hidrosolubles, se caracterizan porque se disuelven en agua de lavado o cocción de los

alimentos. Solo se almacenan en una cantidad limitada y se requiere consumo frecuente
para conservar la saturación de los tejidos. (Uned, 2009)
Participan como coenzimas en números sistemas enzimáticos. Se diferencian de las demás

vitaminas porque sus moléculas contienen átomos de nitrógeno. (Uned, 2009)
26
2.2.5.1.1 RIBOFLAVINA:
Gráfica 1. Fórmula de la Riboflavina.
También llamada vitamina B2 está formada por un anillo heterocíclico de isoaloxacina

combinado con una molécula de azúcar-alcohol ribitol, derivado de la ribosa, dentro de
esta designación se incluyen varios compuestos. En general la riboflavina se encuentra
fosforilada e integra el di nucleótido de flavina y adenina FAD y el mono nucleótido de
flavina FMN que se sintetizan y almacenan en el hígado; ambos funcionan como
coenzimas de oxidación reducción de aminoácidos y de otros compuestos. (Badui, 2006)
Su principal característica es su foto sensibilidad. En soluciones ácidas o neutras, pierde su

cadena de ribitol y se transforma en lumicromo, sustancia que tiene fluorescencia azul,
mientras que a pH alcalino se foto oxida a lumiflavina, ambas si actividad biológica.
(Badui, 2006)
La vitamina B2 interviene en los procesos de respiración celular, desintoxicación hepática,

desarrollo del embrión y mantenimiento de la envoltura de los nervios. También ayuda al
crecimiento y la reproducción y mejora el estado de la piel, las uñas y el cabello. (Uned,
2009)
La riboflavina es un nutriente esencial que mantiene las funciones del metabolismo en

condiciones normales, actuando como cofactor en reacciones enzimática, principalmente
27
en el sistema de trasporte de electrones relacionando la conversión de las oxidaciones de
sustratos de energía utilizable (Delgadillo, 2013).
La riboflavina está presente en los tejidos de los mamíferos bajo las formas de Flavin
Adenin Dinucleótido (FAD) actuando como parte de las enzimas denominadas
flavoporteínas que intervienen en el metabolismo de los carbohidratos grasas y proteínas.
(Delgadillo, 2013)
Estudios realizados sobre deficiencia de riboflavina en humanos, manifiestan síntomas

como debilidad, fatiga, dolor y sensibilidad en la boca; sensación de quemazón y prurito en
los ojos. En la deficiencia más avanzada ocasiona rigidez en la comisura labial y
alteraciones en la piel, queilosis, estomatitis angular, así como lesiones oculares.
(Delgadillo, 2013)
Comercialmente se puede encontrar en forma cristalina, soluble en agua, se añade para

fortificar alimentos. Su cuantificación se realiza por métodos tradicionales microbiológicos
(lactobacillus casei) y fluorimétricos, o bien por cromatografía líquida de alta resolución.
(Badui, 2006)
Propiedades:
Polvo cristalino naranja – amarillento soluble en agua

Formula: C17H20N4O6
Denominación IUPAC: 7,8 – dimethyl – 10 – (2S, 3S, 4R) – 2, 3, 4, 5,- tetrahydroxypentyl
– benzo (g) pteridine – 2, 4 dione.
Masa molar: 376.36 g / mol
Punto de fusión: 282 grados centígrados
Máximo de absorción: 220, 267, 336, 446 nm
Fuentes de vitamina B2:
Las principales fuentes de vitamina B 2 son:

Levadura de cerveza, germen de trigo, verduras, cereales adicionados, lentejas, hígado,
leche, carne, coco, pan, queso.
28
El 60% se la riboflavina se pierde al moler la harina sin embargo los cereales y las harinas
enriquecidos contribuyen de manera apreciable a la ingestión diaria total. Esta vitamina es
destruida fácilmente por la luz, especialmente por la ultravioleta. Durante su cocción se
pierde muy poca cantidad, es muy estable frente al calor en medio ácido, ligeramente
estable en medio neutro, y muy inestable en medio alcalino situación que raramente
aparece en los alimentos. (Codeconutrilife, 2010)
Beneficios de la Vitamina B2:
La Vitamina B2 es beneficiosa para:

 Prevención de los dolores de cabeza. Tomar altas dosis de Riboflavina (400
mg/día) parece reducir significativamente el número de ataques de migraña. Sin
embargo, tomar Riboflavina no parece disminuir el dolor o el tiempo que dura una
migraña
 Prevención de las cataratas
 Tratamiento de la acidosis láctica (un grave desequilibrio del ácido en la sangre) en
personas con el síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA) causada por
medicamentos llamados inhibidores de los nucleósidos de la transcriptasa reversa
(INTI)
 Prevención del cáncer del cuello uterino. Hay pruebas que indican que el aumento
de la ingesta de Riboflavina de fuentes dietéticas y de suplementos, junto con
tiamina, el ácido fólico y la vitamina B12, podría disminuir el riesgo de desarrollar
manchas precancerosas en el cuello uterino
 Tratar el acné
 Mejorar los calambres musculares
 Impulsar el sistema inmunológico
 Retrasar el envejecimiento
 Mantener saludable la piel y el cabello
 Tratar las aftas
 Mejorar la pérdida de memoria, por ejemplo, en casos de Alzheimer
(Codeconutrilife, 2010)
29
Toxicidad
La Riboflavina es segura para la mayoría de las personas. Pero en otras podría hacer que la
orina se vuelva de color amarillo-anaranjado. Cuando es tomada en dosis altas mayor a 1,6
mg / día, puede ocasionar diarrea y aumento de la diuresis. (Codeconutrilife, 2010)
Embarazo y lactancia: la Riboflavina es probablemente segura si es ingerida en las

cantidades recomendadas: 1,4 mg por día para las mujeres embarazadas y 1,7 mg por día
para las mujeres en período de lactancia (Codeconutrilife, 2010)
Interacciones de la Riboflavina con medicamentos:
 Fenobarbital: el fenobarbital podría aumentar la rapidez con la que se descompone

la Riboflavina en el cuerpo
 Antidepresivos tricíclicos: pueden reducir la cantidad de Riboflavina en el cuerpo
 Medicamentos que secan las secreciones (anticolinérgicos): pueden aumentar la
cantidad de Riboflavina que el cuerpo absorbe
 Probenecid: puede aumentar la cantidad de Riboflavina que hay en el cuerpo.
Interacciones de la Riboflavina con hierbas y suplementos:
 Hierro: la Riboflavina puede mejorar el funcionamiento de los suplementos de

hierro
 Psyllium: reduce la absorción de Riboflavina
La absorción de la riboflavina presente en los suplementos aumenta cuando estos son

ingeridos junto con las comidas.
30
2.2.5.1.2 TIAMINA:
Vitamina B1, también llamada antineurítica, ayuda a las células del organismo a convertir
hidratos de carbono en energía. También es esencial para el funcionamiento del corazón,
los músculos y el sistema nervio. (Lifespan, 2009)
La carencia de esta vitamina puede dar lugar al beriberi (enfermedad de tipo nervioso que
se caracteriza por debilidad muscular y parálisis). Si la carencia no es tanta se manifiesta
en forma de trastornos cardiovasculares (brazos y piernas dormidos, sensación de opresión
en el pecho, cansancio, perdida de la concentración, irritabilidad, o depresión. (Lifespan,
2009)
El tabaco y el alcohol reducen la capacidad de asimilación de esta vitamina, por lo que las
personas que beben, fuman o consumen mucha azúcar, necesitan más vitamina B1.
(Lifespan, 2009) (Uned, 2009)
2.2.5.1.3 NIACINA:
La vitamina B 2 interviene en el funcionamiento del sistema digestivo, piel y nervios.

También es importante en la conversión de los alimentos en energía. Tiene efectos
reductores sobre el colesterol. Es poco frecuente encontrarse con estados carenciales ya
que nuestro organismo es capaz de producir una cierta cantidad de niacina a partir del
triptófano, aminoácido que forma parte de muchas proteínas que se toman en una
alimentación mixta. (Uned, 2009)
La deficiencia de la niacina causa pelagra, enfermedad caracterizada por dermatitis, diarrea

y demencia. (Uned, 2009)
La vitamina B9, actúa para ayudar en la formación de glóbulos rojos y es necesario para la
producción de ADN, que controla el crecimiento tisular y la función celular. (Uned, 2009)
Las necesidades aumentan durante el embarazo.
31
Por este motivo se describe en forma preventiva a las embarazadas. Actúa conjuntamente
con la vitamina B12 y su carencia se manifiesta en forma muy parecida a la de esta
(debilidad, fatiga, irritabilidad). Se llama ácido fólico por encontrarse principalmente en las
hojas de los vegetales (latínfolia significa hoja). (Uned, 2009)
La deficiencia del folato al momento de la concepción y en el primer trimestre del
embarazo puede producir defectos congénitos del tubo neural. En el adulto la deficiencia
del folato produce una forma característica de anemia (megaloblástica). (Uned, 2009)
(Eroski, 2009)
2.2.6 CROMATOGRAFIA LIQUIDA DE ALTA EFICIENCIA:
La cromatografía líquida HPLC es una técnica utilizada para separar componentes de una
mezcla. Consiste en una fase estacionaria no polar columna y una fase móvil. La fase
estacionaria es sílica. La fase móvil actúa como portador de la muestra, la muestra en
solución es inyectada en la fase móvil, y los componentes emigran de acuerdo a las
interacciones químicas, que determinan la separación de los contenidos en la muestra.
(Skoog, 2001)
DETECTOR DE FLUORESENCIA: Se utiliza en analitos fluorescentes por naturaleza o

derivados fluorescentes. Son de alta selectividad, debido a que no interfieren los
disolventes. (Skoog, 2001)
2.2.7 MÉTODOS DE DETERMINACIÓN DE LAS VITAMINAS DEL GRUPO

B
 Método eléctrico o voltamperométrico: en esta técnica se utiliza un electrodo de

trabajo, que está diseñado a base de una gota de mercurio ayudado de pulsos
cíclicos. El mecanismo de reacción del electrodo es el siguiente: todos los
compuestos orgánicos con grupo funcional tiol se adsorben al electrodo de
mercurio y reaccionan químicamente con este formando en la superficie del
electrodo un film del compuesto Hg – tiol, luego de esta acumulación se realiza un
barrido voltamperométrico. (Llerena, 1999)
32
 Método cromatográfico: esta técnica está basada en el paso del compuesto a
través de una columna cromatográfica que posee una fase estacionaria, la muestra
a analizar es introducida en cantidades pequeñas y sus componentes se retrasan o
eluyen dependiendo de sus interacciones físicas y químicas con la fase estacionaria.
Esta técnica es utiliza en lugar de la fluorimétrica debido a que muchos alimentos
contienen sustancias que interfieren en su separación. (Greenfield, 2003)
Debido a sus propiedades físico-químicas, la riboflavina puede determinarse

fluorimetricamente. Este modo de detección posee claras ventajas dado que es más
específico que el UV. Sin embargo, todavía existen distintos componentes en los alimentos
que interfieren, lo cual complica el análisis. Se han utilizado diferentes métodos en el
pasado que incluyen la irradiación de un extracto de muestra purificada con luz lo que lleva
a la formación del llamado lumicromo.
Este es un compuesto que tiene fuertes propiedades fluorescentes y puede cuantificarse

fácilmente. Sin embargo, el procedimiento de trabajo requiere tiempo y trabajo. Por lo
tanto, los ensayos microbiológicos son utilizados rutinariamente además de los métodos
HPLC lo que permite una preparación más simple de la muestra que el método del
lumicromo. (Ollilainen, 1990) (FAO, 2013)
El método que se utilizará en el presente estudio es el fluoritmétrico – HPLC basado en el

método 970.65 AOAC
2.3 FUNDAMENTO LEGAL
 Norma INEN 616:2006 (Anexos)

 Norma INEN 616: 2015 (Anexos)
 Lineamientos para la implementación del sistema de monitoreo interno del
programa de fortificación de harina de trigo. Ministerio de Salud Pública 2012.
(Anexos)
 Procedimiento para determinar riboflavina vitamina B 2 en harina de trigo. método
fluorimétrico – HPLC basado en método 970.65 AOAC modificado. Instituto de
Salud Pública, Gobierno de Chile. (Anexos)
33
 Hurwitz, W. Latimer, G. (2005) “Official Methods of Analysis”, of AOAC
International, 18 the edition, Chapter 45 pp. 12 – 13, Meted 970.65 (Anexos)
 Guía de muestreo de alimentos FAO (Anexos)
2.4 HIPÓTESIS DE TRABAJO
Primera etapa:
 Hipótesis nula: se logró la estandarización de los métodos 970.65 AOAC

riboflavina o vitamina B2 en alimentos y preparación de vitaminas así como
también del procedimiento para determinar riboflavina en harina de trigo del
instituto de salud pública de Chile para la determinación de riboflavina
optimizando el tiempo de corrida.
 Hipótesis alternativa: no se logró la estandarización del método 970.65 AOAC
riboflavina o vitamina B2 en alimentos y preparación de vitaminas así como
también del procedimiento para determinar riboflavina en harina de trigo del
instituto de salud pública de Chile para la determinación de riboflavina
optimizando el tiempo de corrida.
Segunda etapa:
 Hipótesis nula: se obtuvieron datos sin variación u homogéneos al determinar el

contenido de riboflavina en seis marcas de harina de trigo fortificada por el método
de cromatografía líquida de alta resolución.
 Hipótesis alternativa: no se obtuvieron datos sin variación u homogéneos al
determinar el contenido de riboflavina en seis marcas de harina de trigo fortificada
por el método de cromatografía líquida de alta resolución.
Tercera etapa:
 Hipótesis nula: Todas las marcas de harina comercializadas en la ciudad de Quito

cumplen con el programa de fortificación de harina de trigo del ministerio de salud
pública del Ecuador.
34
 Hipótesis alternativa: No Todas las marcas de harina comercializadas en la ciudad
de Quito cumplen con el programa de fortificación de harina de trigo del ministerio
de salud pública del Ecuador.
35
CAPÍTULO III
3 METODOLOGÍA
3.1 TIPO DE INVESTIGACIÓN
Es una investigación es teórico – experimental, la parte teórica se realizó mediante la

investigación bibliográfica de normas, métodos, manuales, publicaciones, y páginas web.
La parte experimental se realizó en el Laboratorio de Oferta de Servicios y Productos
(OSP), en el área de alimentos, utilizando sus equipos, materiales y reactivos.
Los resultados obtenidos en el laboratorio de la determinación de riboflavina en diferentes
marcas de harinas de trigo comercializadas en Quito, serán utilizados en la estandarización
de los métodos 970.65 AOAC riboflavina o vitamina B2 en alimentos y preparación de
vitaminas así como también del procedimiento para determinar riboflavina en harina de
trigo del instituto de salud pública de Chile.
3.2 POBLACIÓN Y MUESTRA
La recolección de la muestras se realizara mediante la guía de muestreo de alimentos de la

FAO y se tomaran en cuenta principalmente las harinas que presenten mayor
comercialización entre la gente, es decir las harinas que más consumo tengan en percha.
Se tomaran muestras por verificación de marcas, de diferentes lotes de harinas de trigo
fortificadas y comercializadas en los siguientes establecimientos: MEGAMAXI, SANTA
MARIA, Y AKI.
Tabla 2. Esquema de población y muestra

Harinas de trigo fortificadas, comercializadas en
POBLACIÓN : supermercados
TAMAÑO DE MUESTRA: 1000 gramos presentación comercial
PROCEDIMIENTO DE
Guía de muestreo FAO
MUESTREO:
MUESTRA: Harina trigo fortificada
36
Tabla 3. Plan de muestreo
1 OBJETO DE MUESTREO Harina
RAZON DE EFECTUAR  Inspección del producto final
2
EL MUESTREO  Verificación con la norma
3 TIPO DE MUESTREO Muestreo por atributos
 Verificar si el contenido de riboflavina cumple
o no cumple con el programa de fortificación
de harina de trigo del ministerio de salud
CARACTERISTICAS A
4 pública del Ecuador.
EVALUAR
 Comprobar si hay o no diferencia del
contenido de riboflavina entre los lotes de las
diferentes marcas de harina
5 PUNTO DE MUESTREO Producto final en punto de venta (supermercados)
PLAN DE MUESTREO Muestreo simple según (Anexos 1). Plan de muestreo
6
ESTADISTICO por atributos.
CANTIDAD DE
7 MUESTRA 1000 gramos
INSTRUCCIÓN PARA LA Para un tamaño de lote de 9 a 15 muestras, el nivel de
8
TOMA DE MUESTRA inspección normal es de 3 muestras por lote
9 TIPO DE ENVASE Plástico funda – presentación comercial
Transportada en envase original sin exceder los 45
PRESERVACIÓN DE LA
10 grados centígrados y sin adición de sustancias
MUESTRA
químicas
3.3 DISEÑO EXPERIMENTAL
Primera etapa:
3.3.1 DISEÑO DE BLOQUES COMPLETOS AL AZAR CON SUBMUESTRAS:
Se realizó la determinación del contenido de riboflavina en 6 diferentes marcas de harina

de trigo fortificada, para los cuales se utilizó un diseño de bloques completos al azar con
sub muestras (DBCA), para 6 tratamientos de harinas A, B, C, D, E, F, 3 repeticiones lote
1, lote 2, lote 3, y 3 sub muestras, todo esto debido a que los tratamientos son homogéneos.
Lo que se busca es controlar la variabilidad del modelo debido a factores extraños. Además
se realizara una prueba de Tukey para comparar el contenido de riboflavina entre las
marcas.
37
Variable independiente
Posee 3 niveles que se detallan a continuación:
 Preparación de la muestra.
 Hidrólisis ácida de la muestra.
 Condiciones cromatográficas para el análisis de riboflavina: fase móvil, flujo,
detector.
Variable dependiente
 Concentración de riboflavina en mg / kg.
Variable de bloqueo
 En nuestro caso son los lotes, y se han escogido por cada marca de harina 3 lotes
diferentes.
Tratamientos
 Se han utilizado 6 marcas de harina y debido a esto tenemos 6 tratamientos
Tabla 4 Esquema del Diseño Experimental

PRODUCTO LOTE 1 LOTE 2 LOTE 3
HARINA A M1 M2 M3 M1 M2 M3 M1 M2 M3
EM 167 -13 EM 211 -13 EM 241 -13
HARINA B M1 M2 M3 M1 M2 M3 M1 M2 M3
YA -0077 61 YA -0080 61 YA-0081 61
HARINA C M1 M2 M3 M1 M2 M3 M1 M2 M3
SPX-171-G1 SPX-174-G1 SPX-0079-G1
HARINA D M1 M2 M3 M1 M2 M3 M1 M2 M3
82013 92013 102013
HARINA E M1 M2 M3 M1 M2 M3 M1 M2 M3
OB-82013 OB-92013 OB-102013
HARINA F M1 M2 M3 M1 M2 M3 M1 M2 M3
EM-177 13 EM-224 13 EM-241 13
38
En la siguiente tabla se explica el esquema del diseño experimental, donde se encuentran
las 6 diferentes marcas de harina con sus respectivos lotes, en este caso para cada marca de
harina son 3 lotes diferentes y además se idéntica con la letra M a las sub muestras.
Segunda etapa:
3.3.2 PRUEBA DE TUKEY
Esta prueba se realiza siempre que se rechaza la hipótesis nula, se detalla a continuación
𝑉𝑇 = (𝑝 𝑥 𝑓)(∝)(𝑆
� )
−
𝑝 = 𝑛ú𝑚𝑒𝑟𝑜 𝑑𝑒 𝑡𝑟𝑎𝑡𝑎𝑚𝑖𝑒𝑛𝑡𝑜𝑠
𝑓 = 𝑔𝑟𝑎𝑑𝑜𝑠 𝑑𝑒 𝑙𝑖𝑏𝑒𝑟𝑡𝑎𝑑 𝑑𝑒𝑙 𝑒𝑟𝑟𝑜𝑟
𝛼 = 𝑛𝑖𝑣𝑒𝑙 𝑑𝑒 𝑠𝑖𝑔𝑛𝑖𝑔𝑖𝑐𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑎𝑙 5%, 𝑒𝑛 𝑡𝑎𝑏𝑙𝑎 𝑑𝑒 𝑡𝑢𝑘𝑒𝑦
𝑆− =
� 𝑒𝑟𝑟𝑟𝑜𝑟 𝑒𝑠𝑡𝑎𝑛𝑑𝑎𝑟 𝑑𝑒 𝑙𝑎𝑠 𝑚𝑒𝑑𝑖𝑎𝑠
𝑥
𝑟
𝐶𝑀𝐸 = 𝑐𝑢𝑎𝑑𝑟𝑎𝑑𝑜 𝑚𝑒𝑑𝑖𝑜 𝑑𝑒𝑙 𝑒𝑟𝑟𝑜𝑟
𝑟 = 𝑛ú𝑒𝑚𝑒𝑟𝑜 𝑑𝑒 𝑟𝑒𝑝𝑒𝑡𝑖𝑐𝑖𝑜𝑛𝑒𝑠 𝑝𝑜𝑟 𝑡𝑟𝑎𝑡𝑎𝑚𝑖𝑒𝑛𝑡𝑜
Tercera etapa:
3.3.3 PRUEBA T – STUDENT (UNA COLA O UNILATERAL) Y

COMPARACIÓN CON UN VALOR DEREFERENCIA.
Se puede realizar este cálculo para comparar los valores obtenidos con un valor de
referencia, los cálculos se detallan a continuación.
𝑋−
𝑡𝑐𝑎𝑙 =
𝜇
𝑆
( )
√𝑛
Observaciones n= 9
S = desviación estándar
39
X= media de la concentraciones mg / kg
gl = n – 1 = 9
μ = valor de referencia
3.4 VARIABLES DE LA INVESTIGACIÓN
La variable dependiente: concentración de riboflavina mg / Kg.
Las variables independientes:
 Preparación de la muestra.
 Hidrólisis ácida de la muestra.
 Condiciones cromatográficas para el análisis de riboflavina: fase móvil, flujo,
detector.
3.5 TÉCNICAS E INSTRUMENTOS ANALÍTICOS PARA LA EXTRACCIÓN Y

LA DETERMINACIÓN DE LA RIBOFLAVINA.
Se basa en la extracción de la riboflavina a través de un tratamiento enzimático. Seguido

por hidrólisis ácida, filtración por membrana y posterior identificación y cuantificación de
esta por cromatografía liquida en fase reversa con detector de fluorescencia, ajustada a una
longitud de onda de excitación de 450 nm y de emisión de 528 nm. (Horwitz, 2005)
3.5.1 MATERIALES, EQUIPOS Y REACTIVOS:
MATERIALES:
 Columna HPLC C18

 Matraz aforado de 1000, 500, 100, 50, ml
 Erlenmeyers de 250 y 150 ml
 Pipetas de 5 y 10 ml
 Papel filtro
 Probetas
 Membranas milipore 0,22 micras
40
(Horwitz, 2005)
EQUIPOS:
 HPLC con detector de fluorescencia

 Balanza analítica sensibilidad de 0,001 g.
 PH metro
 Bomba de vacío
(Horwitz, 2005)
REACTIVOS:
 Ácido clorhídrico concentrado (HCl) 37 % p.a.

 Ácido clorhídrico 1N
 N-N dimetilformamida grado HPLC
 Hidrogeno fosfato de di – potasio tri – hidratado p.a.
 Estándar de riboflavina: Spectrum, lote ZE 0017
 Acetato de sodio trihidratado
(Horwitz, 2005)
3.5.2 PREPARACIÓN DEL ESTANDAR DE RIBOFLAVINA DE 50 ug / ml.
Pesar en un porta muestras 25 mg de riboflavina estándar. Trasvasar a un matraz aforado

de 500 ml, agregar 350 ml de agua desionizada y 0,6 ml de ácido acético glacial, en caso
necesario poner en baño maría y / o en ultrasonido hasta su disolución total. Enfriar y
aforar con agua desionizada. Esta solución es estable durante 6 meses a 4 grados
centígrados.
3.5.3 SOLUCIÓN INTERMEDIA DE 5 ug / ml:
Pipetear 5,0 ml de la solución anterior en un matraz aforado de 50 ml y aforar con agua

desionizada.
41
3.5.4 CURVA DE TRABAJO DE 0, 02 – 0, 05 – 0, 07 Y 0, 1 ug / ml:
Tomar alícuotas de 200, 500, 700, y 1000 uL de la solución anterior, y llevar a matraces
aforados de 50 ml y aforar con agua desionizada.
3.5.5 PREPARACIÓN DE LA MUESTRA:
Homogenizar toda la muestra en forma manual, agitando todo el contenido en el envase sin
abrir la bolsa, pesar y anotar en forma exacta entre 0,9 y 5 g de muestra en un erlenmeyer
de 250 ml.
3.5.6 HIDRÓLISIS ACIDA DE LA MUESTRA:
Añadir 5 ml de HCl 1N a los matraces una vez realizada la digestión enzimática. Mezclar
bien tapar con papel aluminio y calentar por 45 minutos a baño maría agitando para evitar
grumos.
Enfriar y añadir 5 ml de acetato de sodio 2,5. Mezclar bien y transferir cuantitativamente a

un matraz aforado de 100 ml y aforar.
Filtrar y microfiltrar cantidad suficiente para trasvasar al vial de vidrio de 2 ml.
3.5.7 DETERMINICACIÓN CROMATOGRÁFICA DE RIBOFLAVINA

Según los métodos: 970.65 AOAC riboflavina o vitamina B 2 en alimentos y preparación
de vitaminas, y del procedimiento para determinar riboflavina en harina de trigo del
instituto de salud pública de chile
Inyectar por triplicado 20 uL de cada una de las soluciones estándar entre 0,02 y 0,1 ug /
ml.
42
RIBOFLAVINA:
 Columna: C18
 Fase móvil: mezcla de N, N – dimetilformamida + hidrogeno fosfato de di –
potasio, pH 7,2
 Inyección: 20 µL
 Flujo o caudal: 0,8 ml / min
 Detector: Espectrofluorómetro, excitación 450 nm y emisión 538 nm
 Tiempo de la corrida: 15 min
CUANTIFICACIÓN DE RIBOFLAVINA EN MUESTRAS:
Ingresar a una hoja de excel la curva de calibración obtenida de concentración (C) en

mg/mL e interpolar la muestra para cuantificar el resultado del área vs concentración.
Valor C (mg/ml). (Instituto de Salud Público de Chile, 2008)
Cálculo e informe de resultados:

𝐶𝑥𝑉𝑥𝑃
𝑚 =
𝑔 𝑀
𝑘
𝑔
Donde:
C = Concentración en μg/mL obtenidos por la interpolación en la curva de calibración de

la muestra.
V = Volumen de la muestra final
M = Masa de la muestra en gramos
P = Porcentaje de Pureza del Estándar dividido por 100 (Instituto de Salud Público de
Chile, 2008)
43
Gráfica 2. Esquema general del proceso
INICIO
1000 gramos, para un tamaño de lote de 9 a 15 muestras, el nivel de inspección normal

Muestreo
Preparación de la Homogenice
muestra y pese de 4 a 5 gramos de muestra
Preparación de la curva de calibración
Hidrólisis
Agregar 5 ml de HCl 1N y 20 ml de Agua destilada, dejar por 45 min de
a baño maría
la muestra
Determinación cromatográfica de la riboflavina

Inyectar 20 µl de la muestra y / o estándar Equipohplc-
detectorde
fluorescencia
Fin
Este esquema resume la técnica de preparación y extracción de la riboflavina utilizados

para la determinación cromatográfica de la riboflavina en las muestras de harina.
44
3.6 VERIFICACIÓN DEL MÉTODO CROMATOGRÁFICO
Se utilizara como métodos de referencia a el método analítico 970.65 AOAC riboflavina o

vitamina B2 en alimentos y preparación de vitaminas y al procedimiento para determinar
riboflavina en harina de trigo del instituto de salud pública de Chile. Debido a que son
métodos normalizados, procederemos a realizar verificaciones con el objetivo de que el
método del laboratorio sea el adecuado para la aplicación en la que se propone utilizar.
Tabla 5 Parámetros de verificación de acuerdo al tipo de método.

PARAMETRO A METODO METODO CUANTITATIVO
EVALUAR CARACTERISTICAS CUALITATIVO NORMALIZADO MODIFICADO NUEVO
identificación del analito,
SELECTIVIDAD interferencia de matriz si no si si
LINEALIDAD rango lineal no si si si
SENSIBILIDAD Pendiente no si o no si si
crítico LC, detección LOD,

LIMETES cuantificación LQD si si o no si si
repetitividad,
PRECISION reproducibilidad no si si si
EXACTITUD sesgo S, recuperación R no si o no si o no si
ROBUSTEZ test de Youden Steiner no no si o no si
APLICABILIDAD …………. si si si si
Elaborado por Santiago Robles (Ministerio de Salud pública Chile , 2010)
3.6.1 LINEALIDAD
A partir de los estándares preparados de 0,02 – 0,05 – 0,07 – 0,1 ug/l, se realizaran lecturas
en diferentes días manteniendo las mismas condiciones cromatográficas. De todas las
curvas de calibración realizadas se escogerán 5 curvas, las cueles presenten un coeficiente
de correlación más cercano a 1. En el caso de trazas se acepta un valor de r mayor o
igual a 0.99.
45
3.6.2 EXACTITUD
Para realizar la determinación de la exactitud, se empleara un material de referencia que

previamente será analizado y cuantificado el contenido de riboflavina. De esta muestra se
conoce la concentración de riboflavina y se posee un certificado de análisis. La
recuperación permite ver el rendimiento del método analítico en cuento al proceso de
extracción y la cantidad del analito existente en la muestra original.
3.6.3 SENSIBILIDAD:
Se determinara mediante el estudio de la pendiente de la curva de calibración global donde

se busca establecer que de una pequeña variación de concentración se genera una gran
variación de respuesta. La sensibilidad nos permite establecer una respuesta instrumental
frente a una cantidad de analito.
3.6.4 LIMITE DE DETECCIÓN:
Concentración o cantidad real del analito mínima que puede ser detectada con fiabilidad
por un método analítico determinado. Es decir seria la concentración mínima obtenida a
partir de la medida de una muestra que seriamos capaces de discriminar a partir de una
medida de una blanco o muestra que no tiene analito presente en ella.
46
CAPÍTULO IV
4 ANÁLISIS E INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS
Primera Etapa:
4.1 RESULATADOS DE LA ESTANDARIZACIÓN DEL METODO ANALÍTICO

Según el método 970.65 AOAC riboflavina o vitamina B2 en alimentos y preparación de
vitaminas y del procedimiento para determinar riboflavina en harina de trigo del instituto
de salud pública de Chile.
Luego de realizar varios ensayos y de haber variado algunos parámetros en el

procedimiento, se obtuvo el método analítico más adecuado el cual se describe a
continuación:
4.1.1 PREPARACIÓN DE LA MUESTRA:
El valor mínimo que se puede pesar es de 0,9 gramos debido a que con este peso se logra
llegar al mínimo valor de norma establecido que es de 2,2 mg / kg.
A continuación se detallan los cálculos:
0,02 𝑚𝑔 𝑥 1000 𝑚𝑔
= 100
𝑚𝑙 0,002 𝑚𝑙
100
𝑚𝑙
2,2 𝑚𝑔 𝑥 1000 𝑔
= 0,9 𝑔
0,002
𝑚𝑔
𝑚𝑔 𝐶𝑥𝑉𝑃
=
𝑘𝑔 𝑀
𝑚𝑔 𝑘𝑔 0,0 2 𝑚𝑔 𝑥 100 𝑚
=
47
0,9 𝑔 𝑚𝑔
= 2, 2
𝑘𝑔
48
4.1.2 DIGESTIÓN DE LA MUESTA:
Luego de hacer varias extracciones con la utilización de enzimas (papaína 0.25 g y

takadiastasa 0.50 g) y sin ellas, se determinó que en la extracción no es necesario utilizar
las enzimas en la digestión, debido a que en las áreas y las concentraciones de los
cromatogramas de las muestras en las que se utilizó enzimas no se observa ninguna
variación considerable con respecto a las áreas de los cromatogramas en las que no se
utilizó enzimas.
En las gráficas 3 y 4 se puede observar los picos característicos de riboflavina, los cuales
presentan áreas y tiempo de retención similares.
Gráfica 3. Cromatograma de riboflavina con enzima
Tiempo de retención: 3,48

Área: 788835
Gráfica 4. Cromatograma de riboflavina sin enzima

Área: 757651
48
Tabla 6 Áreas de muestras de harina con enzimas y sin enzimas
Muestras Áreas utilizando Concentración Áreas sin Concentración sin
de Harina papaína y utilizando papaína utilizar papaína utilizar papaína y
takadiastasa y takadiastasa y takadiastasa takadiastasa
mg / kg mg/ kg
1 788835 2.3264 757651 2.2371
2 693245 2.1060 697012 2.1205
3 721080 2.1699 728391 2.1680
4 701279 2.1235 700338 2.1096
En la siguiente se tabla se puede establecer una comparación entre las muestras de harina
que utilizaron papaína y takadiastasa y las harinas que no utilizaron estas enzimas.
Prueba F para varianzas de dos muestras
Variable 1 Variable 2
Media 2.18145 2.1588
Varianza 0.0100649 0.0033677
Observaciones 4 4
Grados de libertad 3 3
F 2.9886797
P(F<=f) una cola 0.1962838
Valor crítico para F (una cola) 9.2766282
En la tabla anterior se realiza una distribución de Fisher, por medio de la cual establecemos
que los dos métodos de digestión de la muestra no tienen diferencia, al comparar el valor
de F calculado con el valor de F crítico, obtenemos como resultado que el F calculado es
menor que el F crítico, aprobando de la hipótesis nula, es decir que las concentraciones de
las muestras que utilizaron las enzimas papaína y takadistasa no tienen diferencia con las
concentraciones de las muestras que no utilizaron las enzimas papaína y takadiastasa.
49
4.1.3 HIDRÓLISIS ACIDA DE LA MUESTRA:
Después de hacer varios ensayos en la hidrolisis de la muestra con solución de ácido

clorhídrico y acetato de sodio, se estableció utilizar la concentración de HCl 1 N y Acetato
de sodio 2,5 M debido a que al comparar las áreas de riboflavina resultantes de las
concentraciones el HCl 1 N y el acetato de sodio 2,5 M son muy parecidas a las del HCl 2
N y acetato de sodio 3.5 M. Es decir estas áreas no tienen mucha diferencia.
Se optó también por una hidrólisis mediante la utilización de matraces ámbar o forrados
con papel filtro, debido a que la riboflavina no es estable a la luz solar; en presencia de luz
solar y con pH ácido puede convertirse en hemicromo.
En las gráficas 5 y 6 se puede observar y comparar los picos de riboflavina así como sus
áreas de las muestras de harina con la utilización de soluciones de ácido clorhídrico HCl 1
N y 2 N y Acetato de sodio 2.5 y 3.5 M.
Gráfica 5. Cromatograma de riboflavina utilizando soluciones de HCl 1 N y Acetato

de sodio 2.5 M.

Área: 644046
Gráfica 6. Cromatograma de riboflavina utilizando soluciones de ácido clorhídrico

HCl 2 N Y Acetato de sodio 3,5 M.

Área: 652919
50
Tabla 7 Concentraciones de HCl y Acetato de Sodio con sus respectivas áreas en
muestras de harina.
Concentración Molaridad Concentración
Normalidad Áreas de Áreas de
mg / kg de Acetato mg / kg
de HCl Harinas Harinas
de Na
0.25 241263 1.1706 1.75 241263 1.1585
0.50 474502 1.6483 2.0 474502 1.6535
1.0 644046 2.0083 2.5 644046 1.9924
2.0 652919 2.0223 3.5 652919 2.0109
En la siguiente tabla se puede comparar las áreas y las concentraciones de riboflavina en

las muestras de harina que utilizaron diferentes concentraciones de ácido clorhídrico y de
acetato de sodio.
Prueba F para varianzas de dos muestras
Variable 1 Variable 2
Media 1.712375 1.703825
Varianza 0.160416956 0.15916085
Observaciones 4 4
Grados de libertad 3 3
F 1.007892058
P(F<=f) una cola 0.49749776
Valor crítico para F (una cola) 9.276628153
En la tabla anterior se realiza una distribución de Fisher para las muestras que utilizaron
ácido clorhídrico y acetato de sodio a diferentes concentraciones. Obteniendo como
resultado que no existe diferencia entre la utilización de ácido clorhídrico y acetato de
sodio en mayor concentración, debido a que F calculada es menor que F crítica, lo cual
acepta la hipótesis nula.
4.1.4 DETERMINICACIÓN CROMATOGRÁFICA DE RIBOFLAVINA

Según el método 970.65 AOAC riboflavina o vitamina B 2 en alimentos y
preparación de vitaminas y del procedimiento para determinar riboflavina en harina
de trigo del instituto de salud pública de Chile.
51
4.1.4.1 CONDICIONES CROMATOGRÁFICAS PARA ANÁLISIS DE
RIBOFLAVINA:
CONDICIÓN CROMATOGRÁFICA 1:
 Columna: C18
potasio 30:70, pH 7,2
Gráfica 7. Condición Cromatográfica 1.
En la gráfica se observa el pico característico de la riboflavina en el minuto 3.4 bajo la

condición cromatográfica 1.
La condición cromatográfica que se va a utilizar en el presente estudio será la condición

cromatográfica 1, porque permitió la mejor separación del analito, además se logró
disminuir el tiempo de corrida a 10 minutos, lo cual optimiza el tiempo de trabajo
permitiendo hacer más análisis en menor tiempo.
CONDICIÓN CROMATOGRÁFICA 2:
 Columna: C18
potasio 50:50, pH 7,2
52
Gráfica 8. Condición Cromatográfica 2.
En la gráfica se observa el pico característico de la riboflavina en el minuto 8.02 bajo la

condición cromatográfica 2.
Segunda etapa:
4.2 OBTENCIÓN DE LA CURVA DE CALIBRACIÓN:
Se analizaron 9 curvas de calibración de las cuales se escogieron 5 que fueron las que
presentaron un coeficiente de correlación cercano a 1. Posteriormente se realizó una
evaluación de la curva de calibración global (constituida por las 5 curvas de calibración
mencionadas), en esta curva se realizó una prueba estadística de t – student como indicador
de modelo lineal.
Tabla 8 Curvas de calibración

CURVA CURVA CURVA CURVA CURVA PROMEDIO
ESTANDAR 1 2 3 4 5
DE
RIBOFLAVINA Área 1 Área 2 Área 3 Área 4 Área 5
ug /kg
0,02 407855 283604 327577 393767 323213 347203
0,05 1151427 1149615 1152814 1195567 1137541 1157393
0,07 2025131 1887058 1813243 1907180 1806449 1887812
0,10 3008570 2964898 2524003 2869782 2645679 2802586
r 0,9984 0,9983 0,9983 0,9984 0,9993 0,9985
R2 0,9968 0,9966 0,9965 0,9968 0,9987 0,9972
53
Gráfico 1 Gráfico de la curva de calibración global
concentración mg/kg vs area

3000000
2500000
2000000
1500000
área
y = 3E+07x - 313361
R² = 0.9972
1000000
500000
0
0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.1 0.12

mg/kg
concentración mg/kg vs área
Para obtener y calcular el contenido de riboflavina se realizó una curva de calibración

global constituida por las medias de las áreas vs las concentraciones.
4.3 LINEALIDAD:
Para realizar este cálculo se utilizó las áreas y las concentraciones de la curva de
calibración global.
𝑟 𝑥 √𝑛 − 2
𝑡𝑟 =
√1 − 𝑟2
tr =valor t – student obtenido para el coeficiente de correlación
r = valor del coeficiente de correlación
n-2 = número de grados de libertad
r2= valor del coeficiente de determinación
0,9985 𝑥 √2
𝑡𝑟 =
√1 − 0,9972
0,9985 𝑥 √2
𝑡𝑟 =
√1 − 0,9972
𝑡𝑟 = 26,68
Comprobación de correlación significativa

HO= no existe correlación entre x e y.
54
Ha= existe correlación entre x e y.
El valor de t crítico obtenido de la tabla para 2 grados de libertad, con un α = 0,05 y 2 colas
es: 4,303
𝑡𝑟 = 26,68 >t crítico = 4,303
Como el valor de tr es mayor que t crítico, se rechaza la hipótesis nula Ho, siendo la
correlación lineal significativa con la probabilidad calculada.
Los rangos de aplicabilidad se detallan a continuación:
r = 0,99
a = 1578444,891 a - 2205166,015
b = 59700281,19 a 2370025,873
Los resultados de la linealidad para las 5 curvas de calibración analizadas se encuentran en
la sección anexos 7.
4.4 RECUPERABILIDAD:
Se determinó mediante el cálculo del contenido de riboflavina en una pre mezcla, la cual
tiene un % de recuperación del 106 % y obtuvo un valor de Z score de – 1,96. El material
de referencia que se utilizó se detalla a continuación:
Material: PREM. VIT. TRIGECU
Código: COHE 169250
Cantidad: 1,600 Kg
Lote: CO 00026961
Lote de inspección: 40000325782
Fecha de fabricación: 10.06.2013
Usar antes de: 10.06.2015
X declarado = 3,4 mg / kg
Desviación estándar = 0,10
Los cálculos de la recuperabilidad se detallan en la sección de anexos 8.
55
4.5 SENSIBILIDAD:
Se realizó este cálculo en la curva de calibración global y se detalla a continuación:

Σ𝑋𝑖Σ𝑌𝑗
Σ𝑋𝑖𝑌𝑗 − ( )
𝑚 = (Σ𝑋𝑛 )2
Σ𝑋 2𝑖 − ( �1 )
4.6 LIMITE DE DETECCIÓN: �
Para realizar este cálculo se utilizó una plantilla de calibración lineal obteniendo los
siguientes resultados:
Riesgo = 5 %
Coeficiente de correlación = 0,998
Riesgo de que no sea la recta = 0,1391
Límite de detección estimado = 0,012 mg riboflavina/kg de Harina
4.7 RESULTADOS DEL CÁLCULO DE LA CONCENTRACIÓN DE

RIBOFLAVINA EN LAS DIFERENTES MARCAS DE HARINA.
Para realizar el cálculo de las concentraciones de riboflavina en las diferentes harinas, se

determinó el valor de la pendiente en la recta obtenida (Área vs concentración). La
concentración (x) esta expresada en mg/l y para su cálculo se reemplaza las áreas obtenidas
de la integración de los picos cromatográficos en (y) en la siguiente ecuación:
𝑦 + 279210
𝑥 = 3𝐸 + 07
Para calcular las concentraciones de riboflavina en mg / Kg es necesario utilizar la

siguiente ecuación: (Horwitz, 2005)
𝑚𝑔 = 𝐶 𝑥 𝑉 𝑥 𝑃
𝑘𝑔 𝑀
Dónde:
C= concentración en mg/l, obtenidos de la interpolación en la curva de calibración. (X mg

/ l)
V=volumen de la muestra final. (100 ml)
56
M=masa de la muestra en gramos. (Peso)
P=porcentaje de pureza del estándar dividido para 100
A continuación en las tablas se detalla los cálculos de la concentración de riboflavina en
mg / kg para las 6 marcas de harina con sus respectivos lotes y repeticiones.
Tabla 9 Cálculo de la concentración de riboflavina (mg / kg) para la harina A.

Harina A Concentración Concentración de
Lote Masa (g)
(Áreas) (mg/l) riboflavina (mg/kg)
EM - 167 13 731474 0.0337 1.5266 2.2053
EM - 167 13 664906 0.0315 1.5401 2.0467
EM - 167 13 773415 0.0350 1.5361 2.2796
EM - 211 13 716382 0.0332 1.5396 2.1551
EM - 211 13 693612 0.0324 1.5341 2.1150
EM - 211 13 695793 0.0325 1.5303 2.1248
EM - 241 13 750959 0.0343 1.5299 2.2416
EM - 241 13 783213 0.0353 1.5392 2.2956
EM - 241 13 797117 0.0358 1.5355 2.3303
Tabla 10 Cálculo de la concentración de riboflavina (mg / kg) para la harina B.

Harina B concentración Masa Concentración de
Lote
(Áreas) (mg/l) (g) riboflavina (mg/Kg)
YA - 0077 61 441132 0.0243 1.5343 1.5845
YA - 0077 61 486728 0.0258 1.5347 1.6798
YA - 0077 61 473485 0.0254 1.5329 1.6539
YA - 0080 61 497801 0.0261 1.5332 1.7047
YA - 0080 61 536217 0.0274 1.5321 1.7867
YA - 0080 61 502431 0.0263 1.5109 1.7398
YA - 0081 61 473137 0.0253 1.5099 1.6784
YA - 0081 61 438817 0.0242 1.5118 1.6031
YA - 0081 61 495717 0.0261 1.5095 1.7270
Tabla 11 Cálculo de la concentración de riboflavina (mg/kg) para la harina C.

Concentración de
Harina C Concentración Masa
Lote riboflavina
(Áreas) (mg/l) (g)
(mg/Kg)
SPX - 171 - G1 789530 0.0355 1.5426 2.3037
SPX - 171 - G1 709021 0.0329 1.5353 2.1457
SPX - 171 - G1 788835 0.0355 1.5483 2.2938
SPX - 174 - G1 773755 0.0350 1.5483 2.2624
SPX - 174 - G1 756868 0.0345 1.5440 2.2334
SPX - 174 - G1 779464 0.0352 1.5399 2.2867
SPX - 0079 - G1 737587 0.0339 1.5361 2.2045
SPX - 0079 - G1 707636 0.0329 1.5289 2.1517
SPX - 0079 - G1 786330 0.0354 1.5339 2.3100
57
Tabla 12 Cálculo de la concentración de riboflavina (mg/kg) para la harina D.
Concentración de
Harina D Concentración Masa
Lote riboflavina
(Áreas) (mg/l) (g)
(mg/Kg)
82013 741166 0.0340 1.5366 2.2113
82013 773236 0.0350 1.5281 2.2912
82013 757614 0.0345 1.5378 2.2440
92013 644046 0.0308 1.5273 2.0198
92013 691585 0.0324 1.5324 2.1131
92013 652919 0.0311 1.5300 2.0350
102013 667522 0.0316 1.5377 2.0554
102013 676114 0.0319 1.5395 2.0710
102013 769819 0.0349 1.5339 2.2754
Tabla 13 Cálculo de la concentración de riboflavina (mg / kg) para harina E.

Concentración de
Harina E Concentración Masa
Lote riboflavina
(Áreas) (mg/l) (g)
(mg/Kg)
OB -82013 865178 0.0380 1.5228 2.4937
OB -82013 845977 0.0374 1.5323 2.4379
OB -82013 785459 0.0354 1.5332 2.3093
0B -92013 642114 0.0308 1.5323 2.0092
0B -92013 757651 0.0345 1.5274 2.2594
0B -92013 510892 0.0266 1.5256 1.7409
OB - 102013 734169 0.0338 1.5201 2.2204
OB - 102013 791772 0.0356 1.5376 2.3159
OB - 102013 725902 0.0335 1.5367 2.1791
Tabla 14 Cálculo de la concentración de riboflavina (mg/kg) para la harina F.

Harina F Concentración Masa Concentración de
Lote (áreas) (mg/l) (g) riboflavina (mg/kg)
EM - 177 13 764745 0.0347 1.5328 2.2663
EM - 177 13 766595 0.0348 1.5305 2.2736
EM - 177 13 753534 0.0344 1.5231 2.2570
EM 224 - 13 781096 0.0353 1.5256 2.3116
EM 224 - 13 761394 0.0346 1.5339 2.2577
EM 224 - 13 789128 0.0355 1.5239 2.3311
EM - 241 13 780407 0.0352 1.5294 2.3044
EM - 241 13 753406 0.0344 1.5287 2.2485
EM - 241 13 762393 0.0347 1.5206 2.2795
4.8 CÁLCULO DEL ADEVA PARA LAS CONCENTRACIONES DE LA

DIFERENTES MARCAS DE HARINA DE TRIGO.
Con los resultados de las concentraciones de las harinas procedemos a realizar los cálculos
del ADEVA utilizando un diseño de bloques completos al azar con submuestras.
58
HIPOTESIS:
Tabla 15 Cálculo del Adeva
Lote 1 Lote 2 Lote3
PRODUCTO Concentración de Concentración de Concentración de SUMATORIA MEDIA
riboflavina (mg/kg) riboflavina (mg/kg) riboflavina (mg/kg)
2,2053 2,0467 2,2796 2,1551 2,1150 2,1248 2,2416 2,2956 2,3303
HARINA A 6,5316 6,3949 6,8674 19,7940 2,1993
1,5845 1,6798 1,6539 1,7047 1,7867 1,7398 1,6784 1,6031 1,7270
HARINA B 4,9183 5,2312 5,0086 15,1581 1,6842
2,3037 2,1457 2,2938 2,2624 2,2334 2,2867 2,2045 2,1517 2,3100
HARINA C 6,7431 6,7825 6,6663 20,1919 2,2435
2,2113 2,2912 2,2440 2,0198 2,1131 2,0350 2,0554 2,0710 2,2754
HARINA D 6,7465 6,1679 6,4017 19,3161 2,1462
2,4937 2,4379 2,3093 2,0092 2,2594 1,7409 2,2204 2,3159 2,1791
HARINA E 7,2409 6,0094 6,7155 19,9657 2,2184
2,2663 2,2736 2,2570 2,3116 2,2577 2,3311 2,3044 2,2485 2,2795
HARINA F 6,7970 6,9003 6,8324 20,5297 2,2811
SUMATORIA 38,9774 37,4863 38,4918 114,9555 2,1288
MEDIA 6,4962 6,2477 6,4153
Para el cálculo de ANOVA se utilizó un diseño de bloques completos al azar con sub
muestras, para 6 tratamientos de harina A, B, C, D, E, F, 3 repeticiones que son lote 1, lote
2, lote 3, y 3submuestras. Que se resumen tabla 20.
Tabla 16 Tratamientos, bloques y muestras.

TRATAMIENTOS t=6
BLOQUES r=3
MUESTRAS m=3
𝐹𝐶 = 114,95552
𝑋2 = = 244,7179
𝑡𝑥𝑟𝑥 6𝑥3𝑥
𝑚 3
𝑆𝐶𝑇 = Σ𝑋 2 𝑖𝑗𝑘 − 𝐹𝐶 = 247.6002 − 244,7179 = 2,8823
𝑆𝐶𝐵 = Σ𝑋2 𝑗
− 𝐹𝐶 4406,0806 − 244,7179 = 0,0643
𝑡𝑥 18
𝑆𝐶𝑡 = 𝑚 =
Σ𝑋2 𝑖 2222,4939 − 244,7179 = 2,2258
− 𝐹𝐶
𝑟𝑥 = 3𝑥3
𝑚
Σ𝑋 2
𝑘 − 𝐹𝐶] − (𝑆𝐶𝐵 + 𝑆𝐶𝑡) 741,9470 − 244,7179]
𝑆𝐶𝐸 exp = [ =[ 3
𝑚
− (0,0643 + 2,2258) = 0,3076
𝑆𝐶𝐸 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎 = 𝑆𝑇𝐶 − (𝑆𝐶𝐸 exp + 𝑆𝐶𝐵 + 𝑆𝐶𝑡)
= 2,8823 − (0,3076 + 0,0643 + 2,2258) = 0,2846
59
Tabla 17.Niveles de Significancia
FV SC GL CM F CAL 5% F TAB 1%
TOTAL 2,8823 53
BLOQUES 0,0643 2 0,0322 1,0472 4,1 7,56
TRATAMIENTO
2,2258 5 0,4451 14,4984 3,33 5,64
S
Error
0,3076 10 0,0307 5,3954
Experimental
Error muestra 0,2846 50 0,0057
En los niveles de significancia se obtuvo un F calculado que es > F tabulado y debido a

este resultado se rechaza la hipótesis nula, es decir que existe diferencia en el contenido de
riboflavina entre las diferentes marcas de harina. No así para los bloques que fueron no
significativos debido a que F calculado es < F tabulado, es decir que no hay diferencia
entre bloques. Sin embargo al ser significativo para los tratamientos se realizara una prueba
de Tukey para verificar cual marca de harina tiene mayor contenido de riboflavina.
Hipótesis nula: harina A = harina B = harina C = harina D = harina E = harina F

Hipótesis alternativa: harina A ≠ harina B ≠ harina C ≠ harina D ≠ harina E ≠ harina F
4.9 CÁLCULO DE LA PRUEBA DE TUKEY.
Para este prueba se utilizaron las diferencias entre las mediad de los valores de la
concentración de riboflavina para luego ser comparados con un valor en tabla.
𝑉𝑇 = (𝑝 𝑥 𝑓)(∝)(𝑆
� )
−
𝑝 = 𝑛ú𝑚𝑒𝑟𝑜 𝑑𝑒 𝑡𝑟𝑎𝑡𝑎𝑚𝑖𝑒𝑛𝑡𝑜𝑠
𝑓 = 𝑔𝑟𝑎𝑑𝑜𝑠 𝑑𝑒 𝑙𝑖𝑏𝑒𝑟𝑡𝑎𝑑 𝑑𝑒𝑙 𝑒𝑟𝑟𝑜𝑟
𝛼 = 𝑛𝑖𝑣𝑒𝑙 𝑑𝑒 𝑠𝑖𝑔𝑛𝑖𝑔𝑖𝑐𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑎𝑙 5%, 𝑒𝑛 𝑡𝑎𝑏𝑙𝑎 𝑑𝑒 𝑡𝑢𝑘𝑒𝑦
𝑆− =
� 𝑒𝑟𝑟𝑟𝑜𝑟 𝑒𝑠𝑡𝑎𝑛𝑑𝑎𝑟 𝑑𝑒 𝑙𝑎𝑠 𝑚𝑒𝑑𝑖𝑎𝑠
𝑥
𝑟
𝐶𝑀𝐸 = 𝑐𝑢𝑎𝑑𝑟𝑎𝑑𝑜 𝑚𝑒𝑑𝑖𝑜 𝑑𝑒𝑙 𝑒𝑟𝑟𝑜𝑟
𝑟 = 𝑛ú𝑒𝑚𝑒𝑟𝑜 𝑑𝑒 𝑟𝑒𝑝𝑒𝑡𝑖𝑐𝑖𝑜𝑛𝑒𝑠 𝑝𝑜𝑟 𝑡𝑟𝑎𝑡𝑎𝑚𝑖𝑒𝑛𝑡𝑜
60
0,0307
𝑆− = √ = 0,0584
𝑋
3
CALCULO DEL VALOR DE TUKEY
𝑉𝑇 = (𝑝 𝑥 𝑓)(∝)(𝑆−)
�
𝑝=6
𝑓 = 10
𝛼 = 𝑛𝑖𝑣𝑒𝑙 𝑑𝑒 𝑠𝑖𝑔𝑛𝑖𝑔𝑖𝑐𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑎𝑙 5% = 4,91
𝑉𝑇 = 4,91 𝑥 0,0584
𝑉𝑇 = 0,2867
Tabla 18 Ordenamiento de medias

2,2811 HARINA F
2,2435 HARINA C
2,2184 HARINA E
2,1993 HARINA A
2,1462 HARINA D
1,6842 HARINA B
Elaborado por Santiago Robles
Tabla 19 Comparación múltiple entre las medias y los tratamientos.

VALOR
COMPARACIONES DIFERENCIA SIGNIFICANCIA
TUKEY
HF vs HC 0,0375 0,2867 NS
HF vs HE 0,0627 0,2867 NS
HF vs HA 0,0817 0,2867 NS
HF vs HD 0,1348 0,2867 NS
HF vs HB 0,5968 0,2867 SIG
61
Tabla 20 Tabla de rangos.
HARINA F A
HARINA C A
HARINA E A
HARINA A A
HARINA D A
HARINA B B
Para la prueba de Tukey en las comparaciones entre los tratamientos se puede determinar
que 5 de las 6 marcas de harina tienen un contenido de riboflavina similar a excepción de
una harina que posee un contenido de riboflavina diferente que las 6, es decir harina F =
harina C = harina E = harina A = harina D, y estas cinco difieren de harina B.
Tercera etapa:
4.10 CÁLCULO DE T – STUDENT PARA LA COMPARACIÓN CON UN VALOR

DE REFERENCIA.
Este cálculo se realizó mediante la comparación de la concentración de riboflavina en la

diferentes marcas de trigo con el valor mínimo de riboflavina especificado en la norma
INEN 616:2006 que es de 2,2 mg / kg. Para el caso de la harina A y F se compararon con
el contenido de riboflavina especificado en la funda de 1000 gramos.
𝑡𝑐𝑎𝑙 = 𝑋 −
𝜇
𝑆
Observaciones n= 9 ( )
√𝑛
S = desviación estándar
X= media de la concentraciones mg / kg
gl = n – 1 = 9
μ = valor de referencia
62
Hipótesis nula: harina A = 2.2 mg / kg
harina B = 2,2 mg / kg
harina C = 2,2 mg / kg
harina D = 2,2 mg / kg
harina E = 2,2 mg / kg
harina F = 2,2 mg / kg
Hipótesis alternativa:
harina B ≠ 2,2 mg / kg
harina C ≠ 2,2 mg / kg
harina D ≠ 2,2 mg / kg
harina E ≠ 2,2 mg / kg
harina F ≠ 2,2 mg / kg
Tabla 21 Prueba t –student

µ(mg/kg) t crítico para una Cumple/
Marcas de Desviación valor cola no cumple
X(mg/Kg) t(calculado)
harina estándar mínimo en
norma
No
HARINA A 2,2011 0,0985 4,0 0,03 -54.77
Cumple
No
HARINA B 1,6676 0,0667 4,0 -23,94 -104,87
cumple
No
HARINA C 2,2470 0,0660 4,0 2,14 -79,67
Cumple
No
HARINA D 2,1461 0,1127 4,0 -1,44 -49,87
Cumple
No
HARINA E 2,2205 0,2361 4,0 0,26 -22,61
Cumple
No
HARINA F 2,2853 0,0293 4,0 8,74 -175,77
Cumple
En la tabla anterior se puede observar los valores de t crítico y t calculado, estos valores
nos sirven para comparar y establecer que harinas cumplen o no con el programa de
fortificación de harinas de trigo del ministerio de salud pública del Ecuador.
63
64
En este caso las harinas A, B, C, D, E, F, no cumplen con el programa de fortificación de
harinas de trigo del ministerio de salud pública del Ecuador debido a que el valor de sus t
calculados es menor que t crítico, por lo cual rechazo el valor de la comparación del
contenido de riboflavina de estas harinas con el valor promedio del programa de
fortificación de harina de trigo del ministerio de salud pública del Ecuador, es decir
rechazo la hipótesis nula. Tomando en cuenta el contenido mínimo de riboflavina que
pueden contener las harinas que es de 2,2 mg / kg las harinas A, C, D, E, F, cumplen con la
norma a excepción de la harina B.
64
CAPÍTULO V
5 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
5.1 CONCLUSIONES
Primera etapa
 Se realizaron varios ensayos utilizando el método 970.65 AOAC riboflavina o

vitamina B2 en alimentos y preparación de vitaminas y del procedimiento para
determinar riboflavina en harina de trigo del instituto de salud pública de Chile,
aplicando diferentes variaciones en el método como son: preparación de la
muestra, digestión de la muestra, hidrolisis de la muestra y condiciones
cromatográficas para la determinación de riboflavina, logrando así una
estandarización del método más adecuado para la determinación de riboflavina en
harinas de trigo en el laboratorio. (ver sección 4.1).
 El método que se estandarizó para la extracción de riboflavina es el siguiente: en la
preparación de la muestra se homogenizara la muestra y se deberá pesar entre 0,9 y
5 mg de harina, en la hidrolisis ácida se añadirá 5 ml de ácido clorhídrico HCl 1
normal y se calentara por 45 minutos en baño María luego se enfriara la solución y
añadirá 5ml de acetato de sodio 2,5 molar, se mezclara y aforara a un balón de
100ml, para posteriormente filtrar y microfiltrar cantidad suficiente para trasvasar a
un vial de vidrio de 2 ml.
 Las condiciones cromatográficas que se estandarizaron para la determinación de
riboflavina son las siguientes: se utilizará una columna C18, la fase móvil será una
mezcla de N, N – dimetilformamida con hidrogeno fosfato de di – potasio 30:70
regulada a un pH 7,2, se inyectara 20 uL de muestra a un flujo de 0,8 ml / min, se
utilizara un Espectrofluorómetro como detector con una excitación 450 nm y
emisión 538 nm, el tiempo de corrida será de 10 min.
Segunda etapa
 Una vez analizados los resultados de los tratamientos y de los bloques se puede
establecer que hubo uno homogeneidad en los resultados de las concentraciones de
65
riboflavina entre lotes, no así en los tratamientos en los que las concentraciones de
riboflavina fueron diferentes para cada tipo de harina. (ver sección 4.2 a 4,8).
Tercera etapa
 Una vez analizados los resultados se puede concluir que las harinas A, B, C, D, E, F
no cumplen con el programa de fortificación de harina de trigo del ministerio de
Salud Pública del Ecuador, debido a que al ser comparadas con el valor promedio
del contenido de riboflavina que debe poseer cada harina que es de 4,0 mg / kg, las
6 harinas no cumplen con el programa de fortificación. Pero al comparar las
muestras de harina con el valor mínimo del contenido de riboflavina que es 2,2 mg
/ kg las harinas A, C, D, E, F cumplen con la norma a excepción de la harina B que
no cumple con el programa de fortificación de harina de trigo del ministerio de
salud pública del Ecuador. (ver sección 4.9).
5.2 RECOMENDACIONES
 Realizar un control periódico a las harinas comercializadas en Quito, puesto que el

estudio realizado arrojo datos en los cuales una de las 6 harinas analizadas no
cumplen con el programa de fortificación de harina de trigo del ministerio de salud
pública del Ecuador.
 Mejorar el proceso de etiquetado en las muestras comercializadas en percha, debido
a que la 2 de las 6 harinas analizadas tienen especificado el contenido de
riboflavina por porción.
 Antes empezar a realizar el análisis en el cromatógrafo, se recomienda esperar unos
30 minutos para que el equipo logre acondicionarse especialmente en sus
parámetros de presión y flujo.
 Previamente antes de proceder a la inyección de la muestra esta debe pasar por un
pre – filtro, logrando eliminar cualquier impureza que podría ocasionar un
taponamiento en el inyector.
 Utilizar en la hidrólisis ácida balones ámbar, debido a que la riboflavina es muy
sensible a la luz.
66
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68
ANEXOS
Anexo 1.Norma INEN 616:2006
INSTITUTO ECUATORIANO DE NORMALIZACIÓN

Quito - Ecuador
NORMA TÉCNICA ECUATORIANA NTE INEN 616:2006

Tercera revisión
HARINA DE TRIGO. REQUISITOS.
Primera Edición
WHEAT FLOUR. SPECIFICATIONS.
First Edition
DESCRIPTORES: Trigo, harina, productos de molinería.

AL 02.02-401
CDU: 664.633.11
CIIU: 3116
69
CDU: 664.633.11 CIIU: 3116
ICS: 67.060 AL 02.02-401
NTE INEN
Norma Técnica HARINA DE TRIGO.
616:2006
Ecuatoriana REQUISITOS.
Tercera revisión
Obligatoria
2006-01
1. OBJETO
1.1 Esta norma establece los requisitos que deben cumplir las harinas de trigo para consumo
Instituto Ecuatoriano de Normalización, INEN – Casilla 17-01-3999 – Baquerizo Moreno E8-29 y Almagro – Quito-Ecuador – Prohibida la reproducción
humano.
2. ALCANCE
2.1 Esta norma se aplica a la harina de trigo fortificada o enriquecida que se destina al consumo
directo y al uso industrial, principalmente para la elaboración de pan, pastas, fideos y galletas.
3. DEFINICIONES
3.1 Harina de trigo. Es el producto que se obtiene de la molienda y tamizado del endospermo del
grano de trigo (Triticum vulgare, Triticum durum) hasta un grado de extracción determinado,
considerando al restante como un subproducto (residuos de endospermo, germen y salvado).
3.2 Grado de extracción. Es el rendimiento, en porcentaje de harina, que se obtiene en kilogramos

por cada 100 kg de trigo limpio.
3.3 Gluten. Es una sustancia de naturaleza proteica que se forma por hidratación de la harina de
trigo y que tiene la característica especial de ligar los demás componentes de la harina.
3.4 Leudante. Es toda sustancia química u organismo que en presencia de agua, con o sin acción
del calor, provoca la producción de anhídrido carbónico.
3.5 Harina autoleudante. Es la harina que contiene una cierta cantidad de sustancias leudantes.
3.6 Harina fortificada. Es la harina que contiene agregados de vitaminas, sales minerales u otros
micronutrientes. El producto que corresponde a esta definición debe contener todos los elementos
de enriquecimiento descritos en la tabla 1.
4. CLASIFICACIÓN
La harina de trigo, de acuerdo a su uso se clasifica en:
4.1 Harina panificable
4.1.1 Extra. Es la harina elaborada hasta un grado de extracción determinado, que puede ser tratada
con blanqueadores y/o mejoradores, productos málticos, enzimas diastásicas y fortificada con
vitaminas y minerales, descritos en la tabla 1.
4.2 Harina integral. Es la harina obtenida de la molienda de granos limpios de trigo y que contiene
todas las partes de éste, que puede ser tratada con mejoradores, productos málticos, enzimas
diastásicas y fortificada con vitaminas y minerales, descritos en la tabla 1.
(Continúa
)
70
NTE INEN 616 2006-01
4.3 Harinas especiales. Son harinas con un grado de extracción bajo, como lo permita el proceso
de industrialización, cuyo destino es la fabricación de productos de pastificio, galletería y derivados
de harinas autoleudantes, que 'pueden ser tratadas con mejorad ores, productos málticos, enzimas .
diastásicas y fortificada con vitaminas y minerales, descritos en la tabla 1.
4.3.1 Harina para pastificio. Es el producto definido en 4.3, elaborado a partir de trigos aptos para
estos productos, que puede ser tratada con blanqueadores, mejoradores, productos málticos,
enzimas diastásicas y fortificada con vitaminas y minerales, descritos en la tabla 1. .
4.3.2 Harina para galletas. .Es el producto definido en 4.3, elaborado a partir de trigos blandos y
suaves o con otros trigos aptos para su elaboración, que puede ser tratada con blanqueadores,
mejoradores, productos málticos, enzimas diastásicas y fortificada con vitaminas y minerales,
descritos en la tabla 1. .
4.3.3 Harina autoleudante. Es el producto definido en 4.3, que contiene agentes leudantes y que
puede ser tratada con blanqueadores, mejoradores y fortificada con vitaminas y minerales, descritos
en la tabla 1.
4.4 Harina para todo uso. Es el producto definido en 3.1, proveniente de las variedades de trigo
Hard Red Spring o Norther SpringHard Red Winter, homólogos canadienses y trigos de otros
orígenes que sean aptos para la fabricación de pan, fideos, galletas, etc. Tratada o no con
blanqueadores y/o mejoradores, productos málticos, enzimas diastásicas y fortificada con vitaminas
y minerales, descritos en la tabla 1.
5. REQUISITOS
5.1 Generales
5.1.1 La harina de trigo debe presentar un color uniforme, variando del blanco al blanco-amarillento,
que se determinará de acuerdo a la NTE INEN 528.
5.1.2 La harina de trigo debe tener el olor y sabor característico del grano de trigo molido, sin
indicios de rancidez o enmohecimiento.
5.1.3 La harina de trigo presentará ausencia total de otro tipo de harina, tal como se define en 2.1.
5.1.4 No deberá contener insectos vivos ni sus formas intermedias de desarrollo.
5.1.5 Debe estar libre de excretas animales.
5.1.6 Cuando la harina de trigo sea sometida a un ensayo normalizado de tamizado, mínimo 95%
deberá pasar por un tamiz INEN 210 µm (No. 70).
5.2 Generales de aditivos
5.2.1 Agentes leudantes
5.2.1.1 Las harinas autoleudantes pueden contener agentes leudantes, tales como:
bicarbonato de sodio y fosfato monocálcico o pirofosfato ácido de sodio o tartrato ácido de potasio o
fosfato ácido de sodio y aluminio.
5.2.1.2 Las harinas autoleudantes pueden contener, a más del agente leudante: grasas, sal,
azúcar, emulsificantes, saborizantes, sustancias de enriquecimiento y otros ingredientes autorizados.
5.2.1.3 Bicarbonato de sodio y fosfato monocálcico, leudante artificiales más comunes,

pueden usarse combinados hasta un Iímite máximo de 4,5% (m/m).
5.2.2 Mejoradores y/o blanqueadores
5.2.2.1 Cloro; blanqueador de harina, máximo 100 mg/kg, sólo en harinas destinadas para
repostería.
(Continúa
)
71
(Continúa
)
72
-2- 2005-078
NTE INEN 616 2006-01
5.2.2.2 Dióxido de cloro; blanqueador y madurador de harina, máximo 30 mg/kg .
5.2.2.3 Peróxido de benzoilo; blanqueador de harina, máximo 30 mg/kg .
5.2.2.4 Ácido ascórbico; mejorador de harina, máximo 200 mg/kg .
5.2.2.5 Azodicarbonamida; mejorador de harina, máximo 45 mg/kg .
5.2.2.6 Bromato de potasio; no se admite su uso en harinas para panificación y su valor

determinado según la NTE INEN 525 debe ser “ausencia”.
5.2.3 Sustancias de fortificación
5.2.3.1 Todas las harinas de trigo, independientemente de sí, son blanqueadas, mejoradas. con
productos málticos, enzimas diastásicas, leudantes, etc., deberán ser fortificadas con las siguientes
sustancias micronutrientes, de acuerdo a lo especificado en la tabla 1.
TABLA 1. Sustancias de fortificación.
REQUISITO
SUSTANCIAS UNIDAD MÍNIMO
Hierro reducido o micronizado mg/kg 55,0
Tiamina (vitamina B1) mg/kg 4,0
Riboflavina (vitamina B2) mg/kg 7,0
Ácido fólico mg/kg 0,6
Niacina mg/kg 40
5.3 Requisitos físicos y químicos, se indican en la tabla 2.
TABLA 2. Requisitos físicos y químicos de la harina de trigo.
Harina Harina
panificable Integral Harinas especiales Harinas para todo uso Método
REQUISITOS Unid. de
Extra Pastificios Galletas Autoleud. ensayo
Min. Máx. Min. Máx. Min. Máx. Min. Máx. Min. Máx. Min. Máx.
Humedad % - 14,5 - 15 - 14,5 - 14,5 - 14,5 - 14,5 NTE INEN 518
Proteína (base seca) % 10 - 11 - 10 - 9 - 9 - 9 - NTE IN EN 519

Cenizas (base seca) % - *0,75 - 2,0 - 0,8 - 0,75 - 3,5 - 0,85 NTE INEN 520
Acidez (Exp. en ácido
sulfúrico) % - 0,1 - 0,1 - 0,1 - 0,1 - 0,1 - 0,1 NTE INEN 521
Gluten húmedo % 25 - - - 23 - 23 - 23 - 25 - NTE INEN 529
* Para el caso de harina panificables enriquecida extra, el porcentaje de cenizas será máximo de 1,6%.
72
(Continúa)
-3- 2005-078
NTE INEN 616 2006-01
5.4 Requisitos microbiológicos. La harina de trigo debe cumplir con los requisitos microbiológicos
indicados en la tabla 3.
TABLA 3. Requisitos microbiológicos.
Limite Método
Requisitos Unidad máximo de ensayo
Aerobios mesófilos ufc/g 100 000 NTE INEN 1 529-5

Col iformes ufc/g 100 NTE INEN 1 529-7
E. Coli ufc/g 0 NTE INEN 1 529-8
Salmonella ufc/25 g 0 NTE INEN 1 529-15
Mohos y levaduras ufc/g 500 NTE INEN 1 529-10
5.4.1 Para la aceptación de lotes (o partidas) de harina, se debe cumplir con los requisitos
microbiológicos del Anexo A.
6. INSPECCIÓN
6.1 El muestreo debe realizarse de acuerdo a lo establecido en la NTE INEN 617.
6.2 Criterios de aceptación y rechazo
6.2.1 Defectos críticos corresponde al incumplimiento de los requisitos establecidos en 5.4 y Anexo
A, con el consiguiente rechazo del lote.
6.2.2 Defectos mayores; corresponde al incumplimiento de alguno de los requisitos establecidos en

5.1, 5.2 y 5.3.
En caso de discrepancia, se repetirán los ensayos sobre las muestras reservadas para el efecto. Si
se repite en el análisis un requisito no satisfactorio, la decisión de aceptación o rechazo del lote se
tomará en común acuerdo entre el comprador y el vendedor, según el plan de muestreo acordado y
a lo estipulado en la NTE INEN 617.
7. REQUISITOS COMPLEMENTARIOS
7.1 La harina de trigo debe almacenarse en sitios que se encuentren ventilados, protegidos de la
humedad, infestación y/o contaminantes.
7.2 Envasado. La harina debe envasarse en recipientes limpios, resistentes a la acción del
producto, de tal manera que no alteren las cualidades higiénicas, nutritivas y técnicas del producto.
7.3 Rotulado. Los envases deben llevar etiquetas de material que pueda ser cocido o de fácil
adherencia a los mismos. Cada etiqueta llevará impresa, con características legibles e indelebles, la
siguiente información:
a) número de Registro Sanitario,

b) número de identificación del lote,
c) designación del producto, ejemplo: “Harina de trigo panificable extra fortificada”,
d) marca comercial registrada,
(Continúa)
-4- 2005-078
73
NTE INEN 616 2006-01
e) razón social del fabricante,

f) ingredientes, se mencionarán por sus nombres específicos, ejemplo: trigo, hierro, tiamina
(Vitamina B1), riboflavina (Vitamina B2), ácido fólico, niacina, y otros como blanqueadores,
mejoradores, etc. en caso de que sean agregados, en orden decreciente de sus masas. Para
envases pequeños de plástico o papel, deberá registrarse la fórmula cuantitativa de sus
componentes.
g) contenido neto expresado en unidades del SI,
h) fecha de elaboración,
i) fecha de caducidad o duración mínima,
j) instrucciones para su conservación,
k) norma NTE INEN de referencia,
1) lugar de origen (ciudad, país), y
m) en caso de exportación, podrá agregarse cualquier información adicional que el país de destino
así lo exija.
(Continúa)
-5- 2005-078
74
ANEXO A
A.1 Podrán aceptarse los lotes (o partidas) de harina que cumplan con los requisitos microbiológicos
del programa de atributos constante en la tabla A.1.
TABLA A.1 Requisitos microbiol6gicos de la harina (lotes o partidas)
Requisitos Unidad n e m M Método

de ensayo
5 6
Aerobios mesófilos ufc/g 5 1 10 10 NTE INEN 1 529-5
2 3
Coliformes ufc/g 5 2 10 10 NTE INEN 1 529-7
E. coli ufc/g 5 2 0 NTE IN EN 1 529-8
Salmonella ufc/25 g 5 0 0 NTE INEN 1 529-15
2 3
Mohos y levaduras ufc/g 5 2 5x10 10 NTE INEN 1 529-10
En donde:
n = número de muestras de lote que deben analizarse, c

= número de muestras defectuosas aceptables,
m = límite de aceptación,
M = límite de rechazo.
(Continúa)
-6- 2005-078
NTE INEN 616 2006-01
APÉNDICE Z
Z.1 DOCUMENTOS NORMATIVOS A CONSULTAR
Norma Técnica Ecuatoriana NTE INEN 517:1981 Harina de origen vegetal. Determinación
del tamaño de las partículas.
Norma Técnica Ecuatoriana NTE INEN 518:1981 Harina de origen vegetal. Determinación de
la pérdida por calentamiento.
la proteína.
la ceniza.
Norma Técnica Ecuatoriana NTE INEN 521 :1981 Harina de origen vegetal. Determinación de
la acidez titulable.
la fibra cruda.
la grasa.
Norma Técnica Ecuatoriana NTE INEN 525:1981 Harina de origen vegetal. Determinación
del bromato de potasio en harinas
blanqueadas y en harina integral. (Método
cualitativo y cuantitativo).
la concentración del ion hidrógeno.
Norma Técnica Ecuatoriana NTE INEN 528:1981 Harina de trigo. Apreciación del color.
Norma Técnica Ecuatoriana NTE INEN 529:1981 Harina de trigo. Determinación del gluten.
Norma Técnica Ecuatoriana NTE INEN 530:1981 Harina de trigo. Ensayo de panificación.
Norma Técnica Ecuatoriana NTE INEN 531:1981 Harina de trigo. Determinación de la
sedimentación.
Norma Técnica Ecuatoriana NTE INEN 617:1981 Harina de origen vegetal. Muestreo.
Norma Técnica Ecuatoriana NTE INEN 1 529-5:1995 Control microbiológico de los alimentos.
Determinación del número de
microorganismos aerobios mesófilos.
Determinación de microorganismos
coliformes por la técnica de recuento de
colonias.
Determinación de coliformes fecales y E.
coli.
Determinación de mohos y levaduras
viables.
Determinación de la presencia o ausencia
de salmonella.
Z.2 BASES DE ESTUDIO
Norma Venezolana COVENIN 217 (Harina de trigo (2da. revisión). Comisión Venezolana de Norma
Industriales, Caracas. 1989.
Norma Colombiana ICONTEC 267. Harina de trigo para panificación. Instituto Colombiano de
Normas Técnicas. Bogotá. 1986 (2da. revisión).
Norma Centroamericana ICAITI 34083. Harina de origen vegetal. Harina de trigo. Instituto
Centroamericano de Investigación y Tecnología Industrial. 1986.
Norma Española UNE 34400. Harina de trigo. Instituto Nacional de Racionalización del Trabajo.
Madrid. 1952.
Continúa)
- 2005-078
76
NTE INEN 616 2006-01
Codex Alimentarius Volumen XVIII. Normas del Códex para cereales, legumbres y productos.
Programa conjunto FAO/OMS sobre normas alimentarias.
Microbiologfa de los Alimentos; W. C. FRAZIER. Contaminación, conservación y alteración de los

cereales y productos derivados. Zaragoza. 1976.
Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives (JECFA) Food Additives (Uses other than as
flavoring agents) Database Roma, 2005.
Decreto Ejecutivo 4139 del Ministerio de Salud Pública. Reglamento de fortificación y

enriquecimiento de la harina de trigo en Ecuador para la prevención de las anemias nutricionales.
Expedido en Quito en 1996-08-09y publicado en el Registro Oficial No. 1 008 en 1996-08-10.
-8- 2005-078
77
INFORMACIÓN COMPLEMENTARIA
Documento: TITULO: HARINA DE TRIGO. REQUISITOS. Código:

NTE INEN 616 AL 02.02-401
Tercera revisión
ORIGINAL: REVISIÓN:
Fecha de iniciación del estudio: Fecha de aprobación anterior por Consejo Directivo 1998-01-28
Oficialización con el Carácter de Obligatoria
por Acuerdo No. 0163 de 1998-03-16
publicado en el Registro Oficial No. 286 de 1998-03-30
Fecha de iniciación del estudio: 2005-02-17
Fechas de consulta pública: de a
Subcomité Técnico: HARINAS

Fecha de iniciación: 2005-08-24 Fecha de aprobación: 2005-08-24
Integrantes del Subcomité Técnico:
NOMBRES: INSTITUCIÓN REPRESENTADA:
Carlos Guerrero (Presidente) MOLINOS “LA UNIÓN”

Ángel Ulloa UTA-FCIAL
Juan Jalil SUPAN
Isidro Cayambe MOLINIO ELECTRO MODERNO
Carlos San Lucas SUPAN
Ivo Klaric MOLINOS DEL ECUADOR
Daniel Rivero MOLINOS POULTIER
Eduardo López MOLINOS POULTIER
Loyde Triana INSTITUTO NACIONAL DE HIGIENE DE
GUAYAQUIL
Ramiro Ruano MOLINERA MANTA
Jorge Carvajal MICIP
Alexandra Asimbaya GRUPO SUPERIOR
Erika Mosquera LA INDUSTRIA HARINERA
Hernán Riofrío DIRECCIÓN METROPOLITANA DE SALUD
Gloria Bajaña ESPOL
Gonzalo Arteaga (Secretario Técnico) INEN
Otros trámites:
El Consejo Directivo del INEN aprobó este proyecto de norma en sesión de 2005-12-14
Oficializada como: Obligatoria Por Acuerdo Ministerial No. 06-024 de 2006-01-12

Registro Oficial No. 195 de 2006-01-25
78
Instituto Ecuatoriano de Normalización, INEN - Baquerizo Moreno E8-29 y Av. 6 de Diciembre Casilla 17-01-3999 - Telfs: (593 2)2
501885 al 2 501891 - Fax: (593 2) 2 567815
Dirección General: E-Mail:furresta@inen.gov.ec
Área Técnica de Normalización: E-Mail:normalizacion@inen.gov.ec Área Técnica de Certificación: E-
Mail:certificacion@inen.gov.ec Área Técnica de Verificación: E-Mail:verificacion@inen.gov.ec Área
Técnica de Servicios Tecnológicos: E-Mail:inencati@inen.gov.ec Regional Guayas: E-
Mail:inenguayas@inen.gov.ec
Regional Azuay: E-Mail:inencuenca@inen.gov.ec
Regional Chimborazo: E-Mail:inenriobamba@inen.gov.ec
URL:www.inen.gov.ec
79
Anexo 2.Norma INEN 616:2015
Quito – Ecuador
NORMA NTE INEN 616

TÉCNICA Cuarta revisión
ECUATORIANA 2015-01
HARINA DE TRIGO. REQUISITOS
WHEAT FLOUR. REQUIREMENTS
DESCRIPTORES: Productos alimenticios, cereales, productos derivados, harina de trigo, requisitos 8

ICS: 67.060 Páginas
80
Norma
Técnica HARINA DE TRIGO NTE INEN
616:2015
Ecuatoriana REQUISITOS
Cuarta revisión
Voluntaria
2015-01
1. OBJETO
Esta norma establece los requisitos que deben cumplir las harinas de trigo destinadas al consumo
humano y al uso en la elaboración de otros productos alimenticios.
2. REFERENCIAS NORMATIVAS
Los siguientes documentos normativos referenciados son indispensables para la aplicación de este
documento normativo. Para referencias con fecha, solamente aplica la edición citada. Para
referencias sin fecha, se aplica la última edición del documento normativo referenciado (incluida
cualquier enmienda).
NTE INEN 517, Harina de origen vegetal. Determinación del tamaño de partículas
NTE INEN 520, Harinas de origen vegetal. Determinación de la ceniza
NTE INEN 521, Harinas de origen vegetal. Determinación de la acidez titulable
NTE INEN 525, Determinación del bromato de potasio en harinas blanqueadas y en harina
integral (Método cualitativo y cuantitativo)
NTE INEN 1334-1, Rotulado de productos alimenticios para consumo humano. Parte 1. Requisitos
NTE INEN 1334-2, Rotulado de productos alimenticios para consumo humano. Parte 2. Rotulado
nutricional. Requisitos
NTE INEN 1334-3, Rotulado de productos alimenticios para consumo humano. Parte 3.
Requisitos para declaraciones nutricionales y declaraciones saludables
NTE INEN 1529-8, Control microbiológico de los alimentos. Determinación de coliformes fecales y
E.coli
NTE INEN 1529-10, Control microbiológico de los alimentos. Mohos y levaduras viables. Recuento
en placa por siembra en profundidad
NTE INEN-CODEX 192, Norma general del Codex para los aditivos alimentarios (Mod)
NTE INEN-CODEX 193, Norma general para los contaminantes y las Toxinas presentes en los
alimentos y piensos
NTE INEN-CODEX STAN 228, Métodos de análisis generales para los contaminantes
NTE INEN-ISO 712, Cereales y productos de cereales. Determinación del contenido de humedad.
Método de referencia
NTE INEN-ISO 2171, Cereales, leguminosas y subproductos. Determinación del rendimiento de

cenizas por incineración
NTE INEN-ISO 20483, Cereales y leguminosas. Determinación del contenido de nitrógeno y cálculo
del contenido de proteína bruta. Método Kjeldahl
2015-0013 1 de 8
81
82
NTE INEN 616 2015-01
NTE INEN-ISO 24333, Cereales y productos derivados. Toma de muestras
NTE INEN-ISO 2859-1, Procedimientos de muestreo para inspección por atributos. Parte 1.
Programas de muestreo clasificados por el nivel aceptable de calidad (AQL) para inspección lote a
lote
NTE INEN-ISO 11085, Cereales, productos a base de cereales y alimentos para animales.
Determinación del contenido de grasa bruta y grasa total mediante el método de extracción Randall
NTE INEN-ISO 21415-1, Trigo y harina de trigo. Contenido de gluten. Parte 1: Determinación
de gluten húmedo mediante un método manual
NTE INEN-ISO 21415-2, Trigo y harina de trigo. Contenido de gluten. Parte 2: Determinación
de gluten húmedo por medios mecánicos
ISO 15141-1, Productos alimenticios. Determinación de Ocratoxina A en cereales y productos

derivados. Parte 1: Método de cromatografía líquida de alta resolución con lavado en gel de sílice
ISO 15141-2, Productos alimenticios. Determinación de Ocratoxina A en cereales y productos

derivados. Parte 2: Método de cromatografía líquida de alta resolución con lavado en bicarbonato
Rec. TE INEN-OIML R 87, Cantidad de producto en paquetes
AOAC 2003.06, Grasa bruta en piensos, granos de cereales y forrajes. Método de extracción
Randall/Soxtec
AOAC 997.02, Contaje de mohos y levaduras en alimentos. Película seca rehidratable.

(Método Petrifilm™)
AOAC 991.14, Coliformes y Escherichia coli. Contaje en alimentos. Película seca rehidratable
(Método PetrifilmTM E. coli/Coliform)
AOAC 2000.03, Ocratoxina A en Cebada. Inmunoafinidad por columna de HPLC columna
3. DEFINICIONES
Para los efectos de esta norma, se adoptan las siguientes definiciones.
2 Harina de trigo. Producto que se obtiene de la molienda de los granos de trigo. Puede o no tener
aditivos alimentarios.
3 Fortificación o enriquecimiento. Adición de uno o más micronutrientes a un alimento, tanto si

está como si no está contenido normalmente en el alimento, con el fin de prevenir o corregir una
deficiencia demostrada de uno o más nutrientes en la población o en grupos específicos de la
población.
4 Harina fortificada. Harina de trigo a la que se ha adicionado vitaminas, sales minerales u otros
micronutrientes.
5 Agentes de tratamiento de harinas. Aditivos alimentarios que se añaden a la harina de trigo

para mejorar su funcionalidad.
6 Gluten. Sustancia viscoelástica compuesta principalmente por dos fracciones proteicas (gliadina
y glutenina) hidratadas.
7 Leudante. Toda sustancia química u organismo que actúa como agente de gasificación mediante
la producción de dióxido de carbono (CO2).
2 de 8
82
NTE INEN 616 2015-01
8 Harina autoleudante. Harina de trigo que contiene sustancias leudantes.
3 de 8
82
NTE INEN 616 2015-01
3.8 Harina integral. Harina elaborada a partir de granos de trigo que conserva el salvado y el
germen.
4. CLASIFICACIÓN
La harina de trigo se clasifica de acuerdo a su uso en:
4.1 Harina de trigo para panificación,
4.2 Harina de trigo para pastificios,
4.3 Harina de trigo para pastelería y galletería,
4.4 Harina de trigo autoleudante,
4.5 Harina de trigo para todo uso,
4.6 Harina de trigo integral.
5. REQUISITOS
5.1 Generalidades
La harina de trigo debe cumplir los siguientes requisitos:
a) Estar exenta de cualquier peligro físico, químico o biológico que afecte la inocuidad del producto,
b) Tener un olor y sabor característico del grano de trigo molido.
5.2 Requisitos físicos y químicos
Para efectos de esta norma deben cumplirse los requisitos físicos y químicos indicados en la Tabla 1.
TABLA 1. Requisitos físicos y químicos para la harina de trigo

Panificació n
Pastificios
Para todouso
Auto-leudantes
Integral
Pastelería ygalletería
MÉTODO DE
REQUISTOS Unidad ENSAYO
Humedad, máximo % 14,5 14,5 14,5 14,5 14,5 15,0 NTE INEN-ISO 712
Proteína (materia seca)*, NTE INEN-ISO

mínimo % 10,5 10 7 7 9 11 20483
Cenizas (materia seca), NTE INEN-ISO

máximo % 0,85 1 0,8 3,5 0,8 2,0 2171
Acidez (expresado en
ácido sulfúrico), máximo % 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,3 NTE INEN 521
3 de 8
83
NTE INEN 616 2015-01
Pastificios
Para todouso
Auto-leudantes
Panificació n
Pastelería ygalletería
MÉTODO DE
Integral
REQUISTOS Unidad ENSAYO
NTE INEN-ISO
Gluten húmedo, mínimo % 28 28 20 20 25 - 21415-1 o NTE
INEN-ISO 21415-2
NTE INEN-ISO
Grasa (materia seca),
% 2 2 2 2 2 3 11085
máximo AOAC 2003.06**
Tamaño de partícula
Pasa por un tamiz de 212 % 95 - NTE INEN 517

μm, mínimo
* Factor de conversión de nitrógeno a proteína para trigo wN × 5,7.
** Los métodos AOAC pueden ser utilizados para fines de control de calidad.
5.3 Ingredientes facultativos
Los siguientes ingredientes pueden agregarse a la harina de trigo en las cantidades necesarias para
fines tecnológicos:
– productos malteados con actividad enzimática, fabricados con trigo, centeno o cebada;
– gluten vital de trigo;
– harina de soja y harina de leguminosas.
NOTA: La harina de trigo puede ser tratada con enzimas como coadyuvantes tecnológicos, el nivel de uso debe estár de
acuerdo a las buenas prácticas de fabricación, BPF.
5.4 Aditivos alimentarios
5.4.1 La harina de trigo debe cumplir con el nivel máximo permitido de los aditivos y de los agentes
de tratamiento de harinas, conforme a lo establecido en la NTE INEN-CODEX 192.
5.4.2 Bromato de potasio
En la harina de trigo no se admite el uso de bromato de potasio. La determinación debe realizarse

según la NTE INEN 525, cuyo resultado debe ser “ausencia”.
5.5 Sustancias de fortificación
La harina de trigo debe fortificarse conforme al “Reglamento de fortificación y enriquecimiento de la

harina de trigo en el Ecuador para la prevención de las anemias nutricionales” y sus reformas
vigentes.
Los métodos de ensayo para determinar las sustancias de fortificación en la harina de trigo, utilizados
con fines de control de calidad, se muestran en el apéndice Y.
5.6 Requisitos microbiológicos
La harina de trigo debe cumplir con los requisitos microbiológicos indicados en la Tabla 2.
4 de 8
84
NTE INEN 616 2015-01
TABLA 2. Requisitos microbiológicos para la harina de trigo
MÉTODO DE
REQUISITO UNIDAD Caso n c m M ENSAYO
3 4
Mohos y levaduras UFC/g 5 5 2 1 X 10 1 X 10 NTE INEN 1529-10
AOAC 997.02*
NTE INEN 1529-8
E. Coli UFC/g 5 5 2 < 10 - AOAC 991.14*
* Los métodos AOAC pueden ser utilizados para fines de control de calidad.
donde
n Número de muestras del lote que deben analizarse, c

Número de muestras defectuosas aceptables,
m Límite de aceptación,
5. Límite de rechazo.
5.7 Contaminantes
La harina de trigo debe ser elaborada con granos de trigo que cumpla los niveles máximos de
contaminantes establecidos en la Tabla 3 y Tabla 4, según la NTE INEN-CODEX 193.
TABLA 3. Metales pesados en granos de trigo
Nivel máximo
Metal mg/kg
Cadmio 0,2
Plomo 0,2
El análisis de contaminantes para fines de control de calidad puede realizarse de acuerdo a los
métodos indicados en la NTE INEN-CODEX STAN 228.
TABLA 4. Micotoxinas en granos de trigo

Nivel máximo Micotoxina
g/kg
Ocratoxina A 5
El análisis de ocratoxina A puede realizarse de acuerdo a las ISO 15141-1 o ISO 15141-2. El método
AOAC 2000.03 puede ser utilizado para fines de control de calidad.
6. INSPECCIÓN
6.1 Muestreo
Las muestras que se tomen para el ensayo pueden realizarse de acuerdo a la NTE INEN-ISO 24333
y para la determinación de la cantidad de muestras puede realizarse de acuerdo a la NTE INEN-ISO
2859-1.
5 de 8
85
NTE INEN 616 2015-01
7. ENVASADO Y ROTULADO
7.1 Envasado
La harina debe envasarse en recipientes de tal manera que no alteren las cualidades higiénicas,
nutritivas y técnicas del producto. Como requisito metrológico debe utilizarse la Recomendación
Técnica INEN-OIML R 87.
7.2 Rotulado
El rotulado del producto contemplado en esta norma debe cumplir con lo especificado en las NTE
INEN 1334-1, NTE INEN 1334-2 y NTE INEN 1334-3.
6 de 8
86
NTE INEN 616 2015-01
APÉNDICE Y
MÉTODOS DE ENSAYO PARA LAS SUSTANCIAS DE FORTIFICACIÓN
TABLA Y.1 Métodos de ensayo para la determinación de las sustancias

de fortificación
Sustancia de fortificación Método de ensayo

Hierro AOAC 944.02, Hierro en harina. Método espectrofotométrico.
AOAC 999.11, Plomo, cadmio, cobre, hierro y zinc en alimentos.

Espectrofotometría de absorción atómica tras incineración en
seco
Niacina AOAC 975.41, Niacina y niacinamida en productos cereales.
Método automatizado
AOAC 961.14, Niacina y niacinamida en medicamentos, alimentos

y piensos. Método colorimétrico
Tiamina AOAC 953.17, Tiamina (vitamina B1) en productos de granos.

Método fluorométrico (rápido)
AOAC 957.17, Tiamina (vitamina B1). Método fluorométrico
Riboflavina AOAC 970.65, Riboflavina (vitamina B2) en alimentos y

preparaciones vitamínicas. Método fluorométrico
AOAC 981.15, Riboflavina (vitamina B2) en alimentos y
preparaciones vitamínicas. Método automatizado
1 AOAC 944.12, Acido fólico (ácido pteroilglutámico) en
Acido fólico
preparaciones vitamínicas
1
Otro método de ensayo para determinar ácido fólico en cereales fortificados puede ser: Elolo S Osseyi, Randy L Wehling,
Julie A Albrecht. Liquid chromatographic method for determining added folic acid in fortified cereal products. Journal of
Chromatography A, Volume 826, Issue 2, 27 November 1998, Pages 235-240.
7 de 8
87
NTE INEN 616 2015-01
APÉNDICE Z
BIBLIOGRAFÍA
CAC/GL 10-1979:2008 Listas de referencia de compuestos de nutrientes para su utilización en

alimentos para fines dietéticos especiales destinados a los lactantes y niños pequeños.
CODEX STAN 152-1985:1995, Norma del Codex para la harina de trigo.
CODEX STAN 178-1991:1995, Norma del Codex para la sémola y la harina de trigo duro.
CAC/GL 09-1987:1991, Principios generales para la adición de nutrientes esenciales a los alimentos.
NTC 267:2007, Harina de trigo.
NB 680:2006, Harina y derivados. Harina de trigo. Requisitos.
COVENIN 217:2001 Harina de trigo.
NTP 205.027:1986, Harina de trigo para consumo doméstico y uso industrial.
NMX-F-007-1982, Alimento para humanos. Harina de trigo.
Code of Federal Regulations Title 21: Food and Drugs. Part 184 Direct food substances affirmed
as generally recognized as safe. Food and Drug Administration.
Code of Federal Regulations Title 21: Food and Drugs. Part 137 Cereal flours and related products.
Food and Drug Administration.
PRESIDENTIAL DECREE N° 187 Regulation for the revision of laws concerning the production and
sale of milling products and pasta, pursuant to Article 50 of Law N° 146, dated 22 February 1994 .
Official Journal n. 117. Roma. 2001.
Seventy-first meeting of the Joint FAO/WHO and Expert Committee on Food Additives (JECFA) WHO
Food Additives series: 62 Safety evaluation of certain food additives. World Health Organization.
Ginebra. 2010.
United Nations Children’s Fund, United Nations University and World Health Organization Iron
Deficiency Anaemia. Assessment, Prevention and Control. World Health Organization. Ginebra. 2001.
Microorganisms in Foods 2. Sampling for microbiological analysis: Principles and Specific

applications. Second edition. International Commission on Microbiological Specifications for Foods.
1986.
8 de 8
88
INFORMACIÓN COMPLEMENTARIA
Documento: TÍTULO: HARINA DE TRIGO. REQUISITOS Código ICS: 67.060

NTE INEN 616
Cuarta revisión
ORIGINAL: REVISIÓN:
Fecha de aprobación anterior por Consejo Directivo 2005-
Fecha de iniciación del estudio: 12-14
Oficialización con el Carácter de Obligatoria
por Acuerdo Ministerial No. 06-024 de 2006-01-12
publicado en el Registro Oficial No. 195 de 2006-01-25
Fecha de iniciación del estudio: 201 4-04-07
Fechas de consulta pública: 2014-07-23 al 2014-08-07
Comité Técnico de: Cereales y leguminosas

Fecha de iniciación: 2014-08-06 Fecha de aprobación: 2014-10-08
Integrantes del Comité:
NOMBRES: INSTITUCIÓN REPRESENTADA:
Erika Mosquera (Presidenta) LA INDUSTRIA HARINERA S.A.

Alejandro Jaramillo MODERNA ALIMENTOS S.A.
Álvaro Mayorga Chávez MODERNA ALIMENTOS S.A.
Andrés Guerrón CORPORACIÓN SUPERIOR
Angélica Murillo MOLINOS POULTIER S.A.
Carolina Zambrano TIOSA
Clara Benavides GRANOTEC
Emiliano Zapata MODERNA ALIMENTOS S.A.
Fanny Fernández Guamán MINISTERIO DE SALUD PÚBLICA
Héctor Recalde MOLINOS MIRAFLORES S.A.
José Modesto Ponce ASEORIA TÉCNICA
Katherine Carrera MINISTERIO DE INDUSTRIAS Y PRODUCTIVIDAD
Lucía Navas AGENCIA NACIONAL DE REGULACIÓN Y VIGILANCIA
SANITARIA
Marcela Balseca SUCESORES DE JACOBO PAREDES S.A (TOSCANA)
Medardo Garcés INDUSTRIAS CATEDRAL S.A.
Mireya Moya MOLINOS ROYAL
Paulina Arias Machado MODERNA ALIMENTOS S.A.
Víctor Campos 3M ECUADOR
Margoth Casco (Secretaría Técnica) SERVICIO ECUATORIANO DE NORMALIZACIÓN
Otros trámites: Esta norma NTE INEN 616:2015 (Cuarta revisión) reemplaza a la NTE INEN 616:2006
(Tercera revisión)
La Subsecretaría de la Calidad del Ministerio de Industrias y Productividad aprobó este proyecto de norma
Oficializada como: Voluntaria Por Resolución No. 14497 de 2014-12-04 Registro Oficial
No. 417 de 2015-01-15
89
Servicio Ecuatoriano de Normalización, INEN - Baquerizo Moreno E8-29 y Av. 6 de Diciembre Casilla 17-01-3999 - Telfs: (593 2)2
501885 al 2 501891
Dirección Ejecutiva: E-Mail: direccion@normalizacion.gob.ec
Dirección de Normalización: E-Mail: consultanormalizacion@normalizacion.gob.ec Dirección Zonal Guayas: E-Mail:
inenguayas@normalizacion.gob.ec Dirección Zonal Azuay: E-Mail: inencuenca@normalizacion.gob.ec
Dirección Zonal Chimborazo: E-Mail: inenriobamba@normalizacion.gob.ec URL:www.normalizacion.gob.ec
90
Anexo 3. Lineamientos del programa de fortificación de las harinas
91
CONTENIDO
1. Introducción 9
2. Aspectos Generales 9
3. Criterios para la selección de proveedores de premezcla 11
Lineamientos para la implementación del sistema de aseguramiento de
calidad del
proceso de recepción, almacenamiento y despacho de
premezcla 12.
Lineamientos para la implementación del sistema de garantía de calidad del Lineamientos
proceso de adición de premezcla 16
para la implementación del sistema de control de calidad del
proceso de fortifcación de la harina de trigo. 17
7. ANEXOS 21
Anexo 1: Norma para la Harina de Trigo NTE INEN 616:2006 21
Anexo 2: Reglamento de Fortificación y Enriquecimiento de la Harina de
Trigo
en el Ecuador para Prevención de Anemias Nutricionales, emitido bajo
Decreto
Ejecutivo N° 4139 32
Anexo 3: Norma INEN 1 334-2:2008 40
Anexo 4: Método de manchas para la determinación del hierro agregado
a la
harina de trigo fortificada con hierro 71
Anexo 5: Método para la determinación de hierro AOAC-Modificado /
PRT- 711.02-159 71
Anexo 6: Método para la determinación de niacina AOAC 45.1.10.17 79
Anexo 7: Método para la determinación de tiamina AOAC 953.17 82
Anexo 8: Método para la determinación de riboflavina, basado en AOAC
970.65 89
Anexo 9: Método para la determinación de ácido fólico Método UV-HPLC 95
92
Cuadro 1-1-Harina de Trigo Fortificada AC/CC
Formulario de Inspección para ingreso de premezcla de vitaminas y mineras................................................................................. 103
Cuadro 1-2-Harina de Trigo Fortificada AC/C

Control Diario de inventario de premezcla de vitaminas y minerales.............................................................................................................104
Cuadro 2-1-Harina de Trigo Fortificada AC/CC

Control del flujo del dosificador para harina de trigo fortificada...........................................................................................................................105
Cuadro 2-2- Harina de Trigo Fortificada AC/CC

Registro Diario de producción de harina de trigo fortificada.................................................................................................................................... 106
Cuadro 3-1- Harina de Trigo Fortificada AC/CC

Producción y control de calidad de harina de trigo fortificada................................................................................................................................107
8
COORDINACIÓN NACIONAL DE NUTRICIÓN MSP
93
1
Introducción
El 24 de mayo de 2011, el Ministerio de Salud Pública, a través de la Coordinación

Nacional de Nutrición, convocó a una reunión con los responsables del área de Garantía y
Control de Calidad de los molinos de harina de trigo del país, para revisar los manuales
para el Monitoreo Interno de la Harina de Trigo Fortificada (Aseguramiento de Calidad y
Control de Calidad, AC/CC), desarrollados por Makhumula y sus colaboradores, para ser
implementados en la región del West Bank (East, Central and Southern African Health
Community)1 y que en el año 2007 fueron traducidos y adaptados para ser implementados
en los países de Centroamérica y en República Dominicana. Estos manuales reúnen la
experiencia en este campo del Instituto de Nutrición de Centroamérica, de Panamá y de
otros países, por lo que se han considerado como guías internacionales para el desarrollo
de los lineamientos nacionales.
Además, la reunión tenía el objetivo de adaptar estos manuales de manera consensuada con
los funcionarios de los molinos a la realidad nacional. Como resultado de este esfuerzo se
produce este documento, que refleja los puntos de vista de representantes de 12 de los 18
molinos que operan en el país, de la oficina de Control Sanitario, de la Coordinación Nacional
de Nutrición y de la Organización Panamericana de la Salud.
2 Aspectos
Generales
El establecimiento de sistemas de monitoreo y evaluación (M&E) de los programas de

fortificación de alimentos, permite valorar la calidad de la implementación y entrega del
producto fortificado, determinar el grado al cual se alcanza a la población y hogares
meta, y la medida en que se logra contribuir a prevenir la deficiencia de
micronutrientes en la población beneficiaria del programa.
De acuerdo con las guías para la fortificación de alimentos con

micronutrientes 2, el sistema de M&E del programa incluye varios
subsistemas:
• Primero, el sistema de aseguramiento de la calidad de la premezcla de

vitaminas y minerales que van a ser adicionadas al vehículo alimentario, en
este caso a la harina de trigo.
• Segundo, un sistema de monitoreo interno del

proceso de fortificación, el cual refleja el
resultado de observaciones, registros,
determinaciones bioquímicas y medidas
correctivas implementadas como parte de las
acciones de aseguramiento y control de calidad
del proceso de producción.
• Tercero, un sistema de monitoreo externo

implementado por el Proceso de Control y
Mejoramiento en Vigilancia Sanitaria del
Ministerio de Salud Pública del Ecuador, el cual
consiste en la
1 Makhumulz, P., Guamuch, M., Dary, O. Manual for internal monitoring of fortified wheat flour. (Quality Assurance and Quality
Control, QA/QC). First edition, 2007. East, central and Southern African Health Community. Washington, DC. 2007.
2 Allen, L., de Benoist, B., Dary, O., Hurrell, R. Guidelines on food fortification with micronutrients. World Health Organization &
Food and Agricultural Organization of the United Nations. 2006.
inspección y auditoría en plantas de producción, para verificar que se cumpla con

los parámetros de producción y fortificación.
5.4.3 Cuarto, un sistema de monitoreo comercial, igualmente implementado por el Proceso de

Control y Mejoramiento en Vigilancia Sanitaria del Ministerio de Salud Pública del Ecuador, o
por agencias nacionales de orientación o protección al consumidor. El sistema consiste en la
inspección de la harina en sitios de venta al por mayor o en panaderías para verificar que se
cumpla con los parámetros regulatorios establecidos en las normas y regulaciones.
5.4.4 Quinto, un sistema de monitoreo en hogares e individuos, a través del cual se

determina la penetración y el consumo del alimento fortificado y la cobertura o
ingesta adicional de los micronutrientes en la población objetivo.
5.4.5 Sexto, un sistema de evaluación de impacto, que busca documentar el efecto

de la fortificación de alimentos sobre los biomarcadores y las manifestaciones
clínicas de una deficiencia nutricional. Cabe citar que el diseño e implementación
de estos dos últimos subsistemas está a cargo de la Coordinación Nacional de
Nutrición.
DIAGRAMA GENERAL DEL SISTEMA DE MONITOREO Y
EVALUACIÓN
DE LOS PROGRAMAS DE ALIMENTOS FORTIFICADOS
ALIMENTO Certificado de Calidad

PREMEZ. VITAMINAS
Nacional o Importado (Control de Alimentos y Aduanas)
CC/AC de Fábricas
ALIMENTOS FORTIF. MONITOREO
(Dept. de CC/ACINTERNO
de Fábricas y Envasadoras)
(Fábricas y envasadoras)
IMPORTADOS
Inspección a Fábricas (visitas de corroboración) y Auditoría Técnica (Unidades gubernamentales de
Almacenes de Importación
Control de Alimentos)
Certificado de MONITOREO EXTERNO MONITOREO
Conformidad e (Fábricas y envasadoras) REGULATORIO
Inspección
(Corroboración)
(Control de Alimentos V
erificación del cumplimiento legal nsayos de corroboración en sitios venta)
Y Aduanas) MONITOREO(Unidades
COMERCIAL (e de Alimentos
de Control
de Venta) de
Protección al Consumidor)
Auditoría de Calidad (Sitios de
con Evaluación de Conformidad y
(Control de Alimentos y Testigos)
Indicadores
MONITOREO de provisión, utilización y cobertura
EN HOGARES
/INDIVIDUOS HOGARES INDIVIDUOS
Monitoreo
Evaluación de impacto en resultados de consumo, bioquímica, clínica yyfuncionales
evaluación
EVALUACIÓN IMPACTO
(Individuos, familias)
96
En el Ecuador, los subsistemas de monitoreo interno y externo se implementan con el propósito de asegurar y
garantizar que la harina de trigo producida y comercializada en el país cumpla con las Normas de Harina de
Trigo (en modificación) y con el Reglamento de Fortificación y Enriquecimiento de la Harina de Trigo en el
Ecuador para Prevención de Anemias Nutricionales, emitido bajo Decreto Ejecutivo No. 4139, publicado en el
Registro Oficial No. 1008, con fecha 10 de agosto de 1996, y sus modificaciones (Anexo 2). Se reconoce que
los molinos o plantas procesadoras de trigo deben establecer un sistema interno de garantía y control de
calidad, que la Coordinación Nacional de Nutrición debe establecer los mecanismos para implementar el
sistema de monitoreo externo y el Proceso de Control y Mejoramiento en Vigilancia Sanitaria. En coordinación
con las direcciones provinciales de Salud y con el Instituto de Higiene y Medicina Tropical Leopoldo Izquieta
Pérez. Y como parte de la evaluación Posregistro Sanitario, deben establecer el sistema de
monitoreo comercial.
Para efectos de este manual se entiende por Garantía

de Calidad a todas las actividades planificadas y
ejecutadas de forma sistemática, necesarias para
conseguir que los productos o los servicios cumplan
con los normas establecidas; y por Control de
Calidad a los procedimientos usados para
documentar —mediante el uso
de pruebas — el cumplimiento
de las especificaciones y
normas
técnicas aplicables a la harina de
trigo.
En tal sentido, la Coordinación Nacional de

Nutrición, en consenso con los responsables
del área de Garantía y Control de Calidad de los Molinos de Trigo, establecen los
siguientes lineamientos que deben ser interpretados como condiciones, observaciones, registros y
acciones mínimas que deben ser implementados en las plantas de producción para asegurar el
cumplimiento de la norma y el reglamento de fortificación vigentes. Cabe resaltar que estos lineamientos,
así como la frecuencia de las observaciones, el número de muestras analizadas y las medidas
correctivas, están sujetos a ser revisados y mejorados de acuerdo a los avances científicos y
tecnológicos en este campo, la capacidad instalada de los molinos y a los resultados del sistema de
monitoreo interno y externo. Siempre que las propuestas de mejora contribuyan a garantizar el
cumplimiento de las normas, la calidad e inocuidad del alimento fortificado y a prevenir una deficiencia
nutricional.
3 Criterios para la selección de

proveedores de premezcla
Con el objetivo de garantizar la calidad de la premezcla de
vitaminas y minerales, se establece que un proveedor de premezcla
97
es confiable cuando es capaz de presentar como mínimo:
a. Constancia de buenas prácticas de fabricación: descripción

detallada del sistema de gestión de la calidad o certificación por
autoridad competente del sistema de gestión de la calidad (ej.:
ISO, SGS, AIB u otra reconocida en el Ecuador).
b. Hoja técnica del lote u hoja de especificaciones del lote.
c. Certificado de análisis que incluya concentración de

micronutrientes y método analítico utilizado.
Adicionalmente puede presentar:
• Descripción detallada de la capacidad instalada y del

sistema de cumplimiento de los requisitos previos a las
buenas prácticas de manufactura en la planta de
producción (ej.: Registro Sanitario vigente en el país de
origen).
• Descripción del sistema de gestión de la inocuidad de alimentos establecido en la planta de producción.
La empresa queda en libertad de solicitar al proveedor un certificado de análisis de conformidad del/los

lote(s) de la premezcla de vitaminas y minerales adquirida, realizado por un laboratorio dentro o fuera del
territorio nacional, que tenga acreditadas las pruebas analíticas para cada uno de los micronutrientes
considerados en la Norma de Fortificación vigente. El costo del análisis de conformidad será asumido por
el proveedor de la premezcla.
La empresa tiene la responsabilidad de mantener un archivo actualizado con la documentación que demuestra
la confiabilidad del fabricante o proveedor de la premezcla. Además de proporcionar instructivos y de capacitar
e informar al personal responsable sobre el formato y los criterios de evaluación de la documentación
solicitada, para asegurar la confiabilidad de un fabricante o proveedor de premezcla.
Se recomienda que la empresa designe a la persona responsable de esta actividad; se sugiere que sea el
Gerente General o el Gerente de Producción.
Lineamientos para la
implementación del sistema
de aseguramiento de calidad
del proceso de recepción,
almacenamiento y despacho
de premezcla
Este componente del sistema de aseguramiento de calidad tiene como objetivos
implementar acciones que permitan asegurar que:
3.7 La premezcla de vitaminas y minerales cumpla con las especificaciones técnicas (calidad, pureza y
grado alimenticio); que en las cantidades recomendadas para su uso aporta la cantidad suficiente de
micronutrientes (g por Tm de harina) para cumplir con la Norma Harina de Trigo (en modificación) y el
Reglamento de Fortificación y Enriquecimiento de la Harina de Trigo en el Ecuador para Prevención de
Anemias Nutricionales, emitido bajo Decreto Ejecutivo No. 4139, y las condiciones de empaque que
garantizan la calidad del producto y las normas de etiquetado establecidas en las normas INEN 1334-2 y
1334-3 (Anexo 3) o normas internacionales para este producto.
3.8 La premezcla se almacena de acuerdo a las condiciones de temperatura, humedad e higiene

recomendadas por el proveedor de premezcla.
3.9 La premezcla se despacha y utiliza siguiendo el sistema “primero en entrar, primero en salir” (PEPS).
a. La cantidad recibida esté conforme a la cantidad y tipo indicados en la orden de compra.
b. Esté acompañada de una hoja técnica de lote u hoja de especificaciones del lote, y que el producto
cumpla con las normas de calidad e inocuidad establecidas en la Norma Harina de Trigo (en
modificación) y el Reglamento de Fortificación y Enriquecimiento de la Harina de Trigo en el
Ecuador para Prevención de Anemias Nutricionales, emitido bajo Decreto Ejecutivo No. 4139; otras
normas nacionales relacionadas o en su defecto con las normas del códex de alimentos. La hoja
técnica del lote deberá incluir la siguiente información:
• Nombre y dirección del fabricante.

• Información de contacto.
• Nombre del producto.
• Características físicas, químicas y microbiológicas.
• Composición, proporciones o pesos específicos de las materias primas incluyendo los fortificantes.
• Especificaciones de calidad, pureza y grado alimentario de las materias primas utilizadas.
• Vida útil, condiciones de empaque, almacenamiento y manejo.
• Recomendaciones para su uso y aplicación.
c. Se muestre un certificado de análisis y que el producto cumpla con las normas de calidad e inocuidad
establecidas en la Norma Harina de Trigo (en modificación) y el Reglamento de Fortificación y
Enriquecimiento de la Harina de Trigo en el Ecuador para Prevención de Anemias Nutricionales, emitido
bajo Decreto Ejecutivo No. 4139. El certificado de análisis deberá incluir la siguiente información:
99
• Número de lote.
• Fecha de la fabricación del lote.
• Fecha de vencimiento o caducidad del lote.
• Fecha de análisis.
• Concentración de cada uno de los micronutrientes en la premezcla.
• Métodos de laboratorio empleados en la determinación de los micronutrientes.
• Especificaciones técnicas (humedad y granulometría).
• Análisis microbiológico.
d. Que las cajas o embalaje externo estén apropiadamente selladas, no estén dañadas o adulteradas
y que estén etiquetadas según las normas INEN 1334-2 y 1334-3.
e. Cuando sea requerido por el molino, estar acompañado de un certificado de conformidad, que muestre
que el producto cumple con las normas de calidad e inocuidad establecidas en normas internacionales
y, cuando corresponda, con la Norma Harina de Trigo (en modificación) o con el Reglamento de
Fortificación y Enriquecimiento de la Harina de Trigo en el Ecuador para Prevención de Anemias
Nutricionales, emitido bajo Decreto Ejecutivo No. 4139. Con los siguientes datos:

• Número de lote.
• Fecha de la fabricación.
• Fecha de vencimiento o caducidad.
• Fecha de análisis.
• Concentración de cada uno de los micronutrientes en la premezcla.
• Análisis microbiológico a requerimiento del molino.
f. Que la documentación adjunta corresponda al número de lote de la premezcla recibida.
La empresa tiene la responsabilidad de implementar y mantener un archivo actualizado con la documentación

que demuestre la recepción adecuada de la premezcla, y que esta permite cumplir con las normas y
regulaciones vigentes relacionadas con la fortificación de harina de trigo en el país. Además de proporcionar
instructivos y de capacitar e informar al personal responsable sobre el formato, criterios de evaluación y cotejo
de la documentación adjuntada al producto y sobre las acciones a tomar en caso de incumplimiento.
Se recomienda que la empresa designe a la persona responsable de esta actividad; se sugiere que sea el
responsable del Área de Control de Calidad.
Almacenamiento y despacho de premezcla:
6.3Se almacena de acuerdo a las recomendaciones del proveedor; sin embargo, se

sugiere que sea en un lugar limpio y cerrado, protegido de la luz, del calor y la
humedad, sobre tarimas o estantes separados del suelo o de contaminantes
potenciales.
6.4Los lotes de premezcla se ordenan y despachan tomando en cuenta la fecha de
vencimiento y siguiendo el sistema “primero en entrar, primero en salir” (PEPS).
6.5Se establece y mantiene actualizado un sistema de registro e inventario, tipo

kárdex, donde se anotan ingreso (compra), derrames, despacho, descargos y el
balance mensual de premezcla de la bodega, así como la justificación de la
100
variación del inventario.
La empresa tiene la responsabilidad de proveer el espacio y las condiciones mínimas

para asegurar el almacenamiento adecuado de la premezcla, de implementar y
mantener un sistema de registro e inventario y de implementar el sistema PEPS.
Además, de proporcionar instructivos y de capacitar e informar periódicamente al
personal responsable sobre los procedimientos de almacenamiento y despacho de la
premezcla.
Se recomienda que la empresa identifique a la persona responsable de esta actividad; se sugiere que sea el
Encargado de Bodega o el responsable del Área de Control de Calidad.
101
Lineamientos para la
implementación del sistema de
garantía de calidad del proceso
de adición de premezcla
Este componente del sistema de aseguramiento de calidad tiene como objetivo el implementar acciones
que permitan asegurar que:
a. La premezcla se agregue en la cantidad necesaria y de manera continua para cumplir con la

Norma y Reglamento para la Harina de Trigo.
b.El dosificador trabaje adecuadamente y la cantidad de premezcla adicionada esté conforme con el
flujo de producción de harina.
c. La proporción de harina de trigo producida/premezcla utilizada, sea cercana a la proporción teórica

calculada, balance de masas.
Para el efecto, el molino debe establecer mecanismos para observar, registrar e implementar acciones
correctivas que aseguren que:
• El dosificador esté cargado con suficiente premezcla para fortificar el volumen de harina
producida por unidad de tiempo; las observaciones deben realizarse por lo menos cada cuatro
horas o con la frecuencia necesaria de acuerdo a la capacidad de la tolva del dosificador.
• El dosificador descargue la cantidad adecuada de premezcla por flujo de harina por minuto. El
control de flujo debe realizarse por lo menos cada cuatro horas y debe ser documentado.
• El balance mensual de harina producida y premezcla utilizada o balance de masa corresponda

a una desviación menor al 10%, con el cálculo teórico de adición de premezcla.
• Se informe al técnico superior y se implementen las medidas correctivas cuando haya

inconformidades o anomalías en el proceso.
La empresa tiene la responsabilidad de implementar y mantener un cronograma de observación, un

sistema de control de flujo del dosificador y un sistema de registro de la información que permitan estimar
la cantidad de premezcla agregada por cantidad de harina producida, realizar el balance mensual de
masa y de las acciones correctivas implementadas en caso de inconformidades. Además, proporcionar
instructivos y capacitar e informar periódicamente al personal responsable sobre los procedimientos para
realizar el control de flujo y el balance de masas, así como para implementar las acciones correctivas
necesarias.
Se recomienda que la empresa identifique a la persona responsable de esta actividad; se sugiere que sea el
Encargado de Producción.
102
Dilución de la premezcla (si aplica)
Dependiendo del tipo de dosificador instalado en el molino, podría ser necesario

diluir la premezcla previo a su uso. Si este es el caso, el molino debe validar el
procedimiento de mezclado y verificar su homogeneidad; para el efecto debe:
• Tomar diez muestras aleatorias independientes del lote de premezcla diluida.
• Determinar el contenido de hierro por un método cuantitativo (ej. el método espectrofotométrico).

*
• Determinar el coeficiente de variación del proceso ( Desviación estandard 100 ) , este debería ser menor
Promedio
al 10%.
• La cantidad de premezcla a adicionar a la harina de trigo en g/TM se calculará multiplicando la

cantidad expresada en la Hoja de Especificaciones, provista por el fabricante de premezcla,
por el factor de dilución usado para preparar la dilución de premezcla en el molino.
Se recomienda preparar solamente la cantidad de premezcla diluida necesaria para 12 horas de

trabajo, o según la frecuencia que haya determinado el molino, para evitar que esta se aglomere.
6 Lineamientos para la
implementación del
sistema de control de
calidad del proceso de
fortificación de la harina de trigo
Este componente del sistema de aseguramiento de calidad tiene como objetivo implementar acciones que
permitan:
• Comprobar a través de pruebas cualitativas o semicualitativas la presencia de hierro y/u otras

vitaminas en la harina de trigo.
• Comprobar a través de pruebas cuantitativas que la harina fortificada cumpla con los niveles de
fortificación establecidos en la Norma de Fortificación de Harina Trigo.
El molino debe establecer mecanismos para tomar, analizar y preservar muestras de harina, registrar
resultados e implementar acciones correctivas cuando se establezcan inconformidades. Pare el efecto,
debe:
e) Realizar determinaciones cualitativas y semicuantitativas de hierro: (Anexo 4). Método de manchas
para la determinación de hierro en harina de trigo), siguiendo los siguientes pasos:
f) Cada cuatro horas tome en la zona de empaque una muestra simple de harina de por lo menos 1000 g.
103
g)Mezcle adecuadamente y separe dos submuestras de 500 g cada una (muestra A y muestra B).
En un turno de 24 horas habrá acumulado cinco submuestras A (A1, A2, A3, A4, A5) y cinco
submuestras B (B1, B2, B3, B4, B5).
h)Determine la presencia de hierro en cada una de las submuestras A (A1, A2, A3, A4, A5), para el
efecto realice la prueba de manchas de hierro en harina de trigo de acuerdo al protocolo del anexo
4.
i) Registre los resultados, expresados en los intervalos: 0-30 mg/kg, 30-40 mg/kg, 40-50 mg/kg,
50-60 mg/kg y > 60 mg/kg.
j) Empaque cada submuestra B (B1, B2, B3, B4, B5) en un recipiente opaco, rotule con
fecha, hora y número de lote de harina que se está produciendo y colóquela en un lugar
seguro.
k)Al final de día mezcle todas las muestras B recolectadas durante el día (B1, B2, B3, B4, B5) y
extraiga una submuestra D, de por lo menos 1000 g.
l) Empaque la muestra D en un recipiente opaco, rotule con fecha, número de lote de harina que
se está produciendo, y almacene en un banco de muestras. Al final del mes habrá acumulado
30 muestras D, una por cada día de producción (D1, D2, D3, ..., D30).
104
• El resultado de la prueba de manchas de hierro en harina de trigo debe demostrar:
»» Presencia de hierro en las cinco muestras A (A1, A2, A3, A4, A5) tomadas durante
el día (prueba cualitativa).
»» Que los niveles de hierro estén por arriba de 44 mg/kg en por lo menos cuatro de
las cinco muestras A tomadas durante el día (prueba semicuantitativa).
• Inconformidades requieren la revisión inmediata del proceso de fortificación.
La empresa tiene la responsabilidad de establecer un cronograma diario para la toma de

muestras, proveer un espacio físico adecuado para el Banco de Muestras, implementar la
metodología para la comprobación de la presencia de hierro a través de la prueba de manchas,
determinar un sistema de registro y archivo de resultados, tomar las acciones correctivas en caso
de inconformidades y facilitar al personal de la Coordinación Nacional de Nutrición y a los
inspectores de las direcciones provinciales de Salud la observación de los procedimientos, revisar
los registros y archivos y tomar las muestras de harina correspondientes tal como se propone en
estos lineamientos. Además de proporcionar instructivos y de capacitar e informar periódicamente
al personal responsable sobre los procedimientos para realizar la toma de muestras, la prueba de
manchas de hierro e implementar las acciones correctivas necesarias.
Se recomienda que la empresa identifique a la persona responsable de esta actividad; se sugiere

que sea el Encargado de Control de Calidad.
l) Realizar las determinaciones cuantitativas de hierro y por lo menos de una vitamina del
complejo B. »» La empresa tiene la obligación de realizar trimestralmente
determinaciones cuantitativas de hierro y de por lo menos una vitamina de complejo B;
sin embargo, para evitar duplicaciones y hasta que no se establezca lo contrario esta
función será asumida por la Coordinación Nacional de Nutrición, que realizará
inspecciones y determinaciones cuatrimestrales, y por las direcciones provinciales de
Salud que, como parte de la evaluación Posregistro Sanitario,
realizarán inspecciones y determinaciones semestrales.
m) Del Banco de Muestras seleccione de manera aleatoria tres muestras D del conjunto de
muestras diarias (D1, D2, D3…, D30) recolectadas durante los últimos 30 días. Recuerde
que cada muestra D representa un día de producción.
n) Mezcle entre sí cada una de las muestras diarias seleccionadas, luego separe cada
muestra D en dos submuestras diarias de 500 g cada una. Muestras X1, X2, V1, V2,
W1, W2.
o) De la línea de producción, previo al punto de empaque y con intervalos de cinco minutos,

tome cinco muestras simples de 500 g cada. Mezcle las cinco muestras y prepare dos
submuestras de 500 g cada una (Y1, Y2).
105
p) En la bodega seleccione de manera aleatoria una estriba de harina y tome cinco
muestras simples de cinco sacos diferentes. Seleccione los sacos que coinciden con
cada uno de los puntos de intersección de una M imaginaria. Mezcle las cinco
muestras simples y extraiga dos muestras de 500 g cada Z1, Z2. En situaciones
especiales y siempre que se especifique, se puede adoptar otro tipo de muestreo
aleatorio que garantice la recolección de muestras representativas del producto
disponible en bodega al momento de la inspección. De no haber producto en bodega
se tomará una muestra adicional del Banco de Muestras.
q) Cada muestra debe ser empacada en un recipiente oscuro, resistente al calor, a la humedad y
rotulado con el nombre del molino, la fecha de preparación de la muestra y el número de lote
que representa.
• Las muestras X1, V1, W1, Y1, Z1 deben ser enviadas por la empresa, por el personal de la
Coordinación Nacional de Nutrición o por el inspector de las direcciones provinciales, al Instituto
Izquieta Pérez o a un laboratorio reconocido para determinación de hierro y por lo menos una
vitamina del complejo B.
• Las muestras X2, V2, W2, Y2, Z2 deben guardarse en el Banco de Muestras como
respaldo hasta que el laboratorio informe de los resultados de las determinaciones de
hierro y de una de las vitaminas del complejo B.
• El contenido de hierro y vitaminas del complejo B debe estar entre los rangos establecidos
en la Norma de Fortificación de la Harina de Trigo.
LÍMITES
NUTRIENTES EN
NUTRIENTES (mg/kg)
Min Promedio Max FORMA QUÍMICA
Hierro 37 55.0 73 Fumarato ferroso
Tiamina (B1) 2.2 4.0 5.8 Mononitrato de tiamina
Riboflavina 2.2 4.0 5.8 Riboflavina
Ácido fólico 0.9 1.7 2.5 Ácido fólico
Niacina 22.1 40.0 57.9 Niacinamina
La empresa tiene la responsabilidad de establecer un cronograma diario para la toma de

muestras, proveer un espacio físico adecuado para el Banco de Muestras, preparar en conjunto
con el personal de la Coordinación de Nutrición o los inspectores de las direcciones provinciales
de Salud las muestras que se enviarán al laboratorio, establecer un sistema de registro y archivo
de resultados, y tomar las acciones correctivas en caso de inconformidades. Los resultados de
las pruebas podrán ser utilizados para la evaluación Posresgistro Sanitario.
Se recomienda que la empresa identifique a la persona responsable de esta actividad; se sugiere

que sea el Encargado de Control de Calidad de la empresa.
COSTOS DE LAS DETERMINACIONES DE HIERRO VITAMINAS DEL COMPLEJO B
En los primeros seis meses después de entrar en vigor la Norma de Fortificación de Harina de Trigo.
La empresa asumirá los costos de todos los análisis de laboratorio y/o determinaciones de
micronutrientes necesarios para completar el trámite del Registro Sanitario; incluyendo las
pruebas necesarias para demostrar la estabilidad de los nutrientes en el producto. Los
análisis podrán ser realizados en laboratorios ecuatorianos acreditados por la OAE.
El costo de las muestras cuatrimestrales tomadas por el Área

de Nutrición será asumido por la Coordinación de Nutrición.
Estos forman parte del sistema de monitoreo externo que
actualmente se realiza.
El costo de las muestras semestrales recolectadas por los

inspectores de las direcciones provinciales de Salud, serán
asumidos por la empresa y tal como lo establece la ley serán parte
de la evaluación Posregistro Sanitario.
107
Anexo 4.Procedimiento para determinación de riboflavina Instituto de Salud Pública
Gobierno de Chile
Fecha emisión:
09/01/2008
PROCEDIMIENTO PARA DETERMINAR
Revisión: 3
RIBOFLAVINA (Vit. B2) EN HARINA DE
TRIGO. Método Fluorométrico – HPLC
Fecha revisión:
Basado en método 970.65 AOAC modificado
12/12/2011
Sección Química de Página 1 de 9
Alimentos y Nutrición PRT–711.02–046
9 OBJETIVO
Determinar la concentración de riboflavina por cromatografía liquida de alta resolución (HPLC)
en harina de trigo.
4.7 CAMPO DE APLICACIÓN Y ALCANCE

El método es aplicable a muestras de harinas, enriquecidas o no con riboflavina (vitamina B2).
c) FUNDAMENTO
Se basa en la extracción de la riboflavina a través de un tratamiento enzimático, seguido por
hidrólisis ácida, filtración por membrana 0,22 micras y posterior identificación y cuantificación
de ésta por cromatografía liquida isocrática en fase reversa con detector de fluorescencia,
ajustada a una longitud de onda de excitación de 450 nm y de emisión de 528 nm.
4. REFERENCIAS
4.1 Horwitz, W. Latimer, G. (2005) “Official Methods of Analysis”, of AOAC
International, 18 th edition, Chapter 45 pp. 12 – 13, Método 970.65
4.2 United State Pharmacopeia U.S.P. XIX, pág 441, año 1975.
4.3 Análisis de Vitaminas, Rolf Strobecker and Heinz M. Henning, páginas 120 – 150,
año 1967.
4.4 Methods for the determination of vitamins in food, G. Brubacher Muller Mulot and
A.T. Southgate, páginas 119-127, año 1986.
5. TERMINOLOGÍA
5.1 Riboflavina: La Riboflavina o Vitamina B2 es una sustancia amarilla fluorescente
ampliamente distribuida en los reinos vegetal y animal. Se encuentra la forma sintética
como Riboflavina 5’- Sodio Fosfato y corresponde a un grupo de vitaminas solubles
en agua que forman parte del grupo de vitaminas del complejo B. La Vitamina B 2 es
sensible a la luz, utilizar material de vidrio marrón o ámbar.
108
Fecha emisión:
09/01/2008
Revisión: 3
Fecha revisión:
12/12/2011
6. MATERIALES, INSUMOS Y EQUIPOS

6.1 Materiales
6.1.1 Columna HPLC C18 5 μm * 125 mm * 4,6 mm.
6.1.2 Precolumna C18 (5 µm) 4*4
6.1.3 Matraz aforado ámbar de 1000 mL
6.1.7 Matraces Erlenmeyer de 250 y 125 color ámbar y cuello esmerilado con tapa
6.1.8 Pipetas de 5 y 10 mL
6.1.9 Probetas
6.1.10 Embudos
6.1.11 Espátula
6.1.12 Jeringas desechables de 5 o 10 mL
6.1.13 Papel filtro Whatman Nº 2
6.1.14 Dispositivos de filtración sobre membrana Millipore
6.1.15 Membranas Millipore de 0,22 micras de 13 mm
6.1.16 Membranas Millipore de 0,22 micras de 47 mm
6.1.17 Navecillas
6.1.18 Material usual de laboratorio
6.2 Equipos
6.2.1 Cromatógrafo Liquido de Alta Resolución (HPLC) con detector de fluorescencia
6.2.2 Balanza analítica sensibilidad 0,01 g
6.2.3 Balanza analítica sensibilidad 0,001 g
6.2.4 Baño termorregulado con agitación magnética y rango de temperatura de 40 a 50 ºC
6.2.5 Baño termorregulado con rango de temperatura de 80 a 90 ºC
109
Fecha emisión:
09/01/2008
Revisión: 3
Fecha revisión:
12/12/2011
PHmetro
Estufa
Placa calefactora con agitación magnética
Bomba de vacío
Sonicador
Purificador de Agua Milli-Q
Campana de Extracción Química
6.3 Reactivos
6.3.1 Ácido clorhídrico concentrado (HCl) fumante 37 % p. a.
6.3.2 Ácido clorhídrico 1 N: En un matraz aforado de 1000 mL que contenga
aproximadamente 500 mL de agua destilada, añadir con cuidado 82 mL de HCl al 37
%. Enrasar con agua destilada.
6.3.3 N, N Dimetilformamida grado ACS.
6.3.4 Hidrógeno Fosfato de di-Potasio tri-hidrato p.a. (K2HPO4 · 3H2O)
6.3.5 Solución de Hidrógeno fosfato de di-potasio tri-hidrato, solución 10 mM, pH 7,2: En
un vaso de precipitado de 1000 mL, pesar 2,28 g de K 2HPO4 · 3H2O y disolver en
aproximadamente 800 mL de agua desionizada. Ajustar pH a 7,2 con HCl 1N.
Trasvasijar a un matraz aforado de 1000 mL y enrasar con agua desionizada. Filtrar a
través de membranas Millipore de 0,22 micras de 47 mm.
6.3.6 Fase móvil: Mezclar N,N-dimetilformamida + Hidrogenofosfato de Di-potasio, 10
mM pH 7,2. (30:70).
6.3.7 Papaína soluble. p. a.
6.3.8 Riboflavina estándar, almacenar en desecador con deshidratante adecuado.
6.3.9 Sodio Acetato trihidratado p.a.
6.3.10 Solución de acetato de sodio 2,5 M: En un vaso de precipitado de 500 mL, Pesar 340
g de g de acetato de sodio trihidratado y llevar a un matraz aforado de 1000 mL con
agua desionizada y enrasar.
6.3.11 Takadiastasa soluble p. a.
Fecha emisión:
09/01/2008
Revisión: 3
Fecha revisión:
12/12/2011
6.4 Preparación del estándar

6.4.1 Riboflavina estándar solución stock o concentrada de 50 g/mL: Pesar en una
navecilla 25 mg de riboflavina estándar. Arrastrar con agua desionizada + 60 ºC a un
matraz aforado de color ámbar de 500 mL, agregar 350 mL de agua desionizada + 60
ºC y 0.6 mL de ácido acético glacial, en caso de ser necesario poner a baño maría a +
60 ºC, y/o en sonicador, hasta su disolución total. Enfriar y enrasar con agua
desionizada. Esta solución es estable durante 6 meses a 4 ºC.
6.4.2 Solución intermedia de 5 g/mL: Pipetear 5,0 mL de la solución anterior 6.4.1 en un
matraz aforado de color ámbar de 50 mL y aforar con agua desionizada.
6.4.3 Curva de Trabajo de 0,02 – 0,05 – 0.07 y 0.1 g/mL: Tomar alícuotas de 200, 500,
700 y 1000 L de la solución 6.4.2. (Solución intermedia de 5 g/mL) y llevar a
matraces aforados color ámbar de 50 mL y enrasar. Filtrar cada solución con
membranas Millipore de 0,22 micras de 13 mm. La solución está lista para traspasar a
vial HPLC e inyectar.
2 DESARROLLO
7. El ingreso de la muestra para su análisis debe cumplir con el Instructivo de
Aceptación o Rechazo de muestras.
8. Profesional de laboratorio es el encargado de realizar el análisis HPLC, cálculo e
informa los resultados de ensayo.
9. Técnico del Laboratorio realiza la preparación y tratamiento de la muestra según
procedimiento.
10. Preparación de la muestra: Homogeneizar toda la muestra en forma manual,

agitando todo el contenido en el envase sin abrir la bolsa, pesar y anotar en forma
exacta entre 4 y 5 g. de muestra, en un matraz Erlenmeyer color ámbar y cuello
esmerilado con tapa de 250 mL.
11. Digestión Enzimática: Mezclar la muestra con 0,25 g de papaína y 0, 50 g de
Takadiastasa. Agregar 20 mL de agua desionizada a T° + 45 a 50 ºC. Mezclar bien a
fin de obtener una suspensión homogénea. Tapar el matraz y colocar durante 30
minutos en un baño con agua y agitación a Tº + 40 ºC a 50ºC. Agregar a continuación
50 mL de agua desionizada a T° + 45 a 50 ºC.
Fecha emisión:
09/01/2008
Revisión: 3
Fecha revisión:
12/12/2011
• Hidrólisis Ácida: Añadir 5 mL de HCl 1 N a los matraces respectivos, una vez

realizada la digestión enzimática. Mezclar bien tapar el matraz con papel alumnio y
calentar por 45 minutos a baño maría hirviente agitando ocasionalmente para evitar
aglomerados.
Enfriar y añadir 5 mL de acetato de sodio 2,5 M. Mezclar bien y transferir
cuantitativamente a un matraz aforado de 100 mL color ámbar y enrasar con agua
desionizada.
Filtrar a través de filtro plisado y luego volver a filtrar por filtro de membrana de 0,22
micras de 13 mm. Cantidad suficiente para traspasar a vial HPLC. La solución está
lista para inyectar.
• Determinación cromatográfica de Riboflavina

7.7.1 Curva de calibración de las soluciones estándar: Inyectar en triplicado 20 L de
cada una de las soluciones estándar entre 0.02 y 0,1 g/mL. Realizar la curva de
calibración utilizando el método de cálculo con estándar externo.
7.8 Condiciones cromatográficas para análisis de Riboflavina

Columna : C18 o RP-18 (5 m) 125 x 4,6 mm y Pre Columna RP -18 (5 m) 4 – 4
Fase móvil : Mezcla N,N-dimetilformamida + Hidrogenofosfato de Di-potasio, 10 mM
pH 7,2. (30:70)
Inyección : 20 L
Flujo o caudal : 0,8 mL / min.
Detector : Espectrofluorímetro, Excitación: 450 nm y Emisión 528 nm
Tiempo de la corrida : 7 minutos.
• Cuantificación de Riboflavina en muestras

Ingresar al HPLC en método Riboflavina (B2) que contiene la curva de calibración obtenida de
concentración (C) en g/mL e interpolar la muestra para cuantificar el resultado del área vs
concentración. Valor C (g/mL)
7.10 Cálculo e informe de resultados
CxVxP
mg /Kg = ----------------------
M
Fecha emisión:
09/01/2008
Revisión: 3
Fecha revisión:
12/12/2011
Donde:
C = Concentración en μg/mL obtenidos por la interpolación en la curva de
calibración de la muestra.
V = Volumen de la muestra final
M = Masa de la muestra en gramos
P = Porcentaje de Pureza del Estándar dividido por 100
Informar mg/Kg de Riboflavina con un decimal.
7.11 Control de Calidad

Se efectuarán controles sistemáticos y periódicos para comprobar la validez de los ensayos
realizados con el método analítico recogido en este procedimiento.
a) Nivel I: Ensayos de intercomparación, utilización de materiales de referencia certificados
y patrones de referencia certificados, según su disponibilidad.
b) Nivel II: Materiales de referencia sin certificación externa o muestras fortificadas por el
analista en la validación.
c) Nivel III: Durante el desarrollo de la serie de trabajo si es factible se incluirá:
- Control de blanco al inicio de la corrida cromatográfica.
- Inyección de uno o más puntos de solución patrón conocida.
- Inyección de material control de valor conocido (quality control), cuyo
resultado se grafica en una carta de control para su seguimiento.
8. REGISTROS
8.1 Libro de registro de resultados de análisis de vitaminas
9. ANEXOS
No Aplica
113
Anexo 5.Método para la determinación de riboflavina 970.65 AOAC
114
115
Anexo 6.Guía de muestreo de alimentos FAO
I. Tabla 1 Plan de muestreo por atributos
Nivel de Inspección
Tamaño del lote
(número de Reducido Normal Reforzado
elementos)
2-8 n 2 2 3
c para NCA = 0,65 0 0 0
c para NCA = 2,5 0 0 0
c para NCA = 6,5 0 0 0
9-15 n 2 3 5
c para NCA = 0,65 0 0 0
c para NCA = 2,5 0 0 0
c para NCA = 6,5 0 0 1
16-25 n 2 5 8
c para NCA = 0,65 0 0 0
c para NCA = 2,5 0 0 0
c para NCA = 6,5 0 1 1
26-50 n 2 8 13
c para NCA = 0,65 0 0 0
c para NCA = 2,5 0 0 1
c para NCA = 6,5 0 1 1
51-90 n 2 13 20
c para NCA = 0,65 0 0 0
c para NCA = 2,5 0 1 1
c para NCA = 6,5 0 2 2
91-150 n 3 20 32
c para NCA = 0,65 0 0 0
c para NCA = 2,5 0 1 1
c para NCA = 6,5 0 3 3
151-280 n 5 32 50
c para NCA = 0,65 0 0 1
c para NCA = 2,5 0 2 2
c para NCA = 6,5 1 5 5
281-500 n 8 50 80
c para NCA = 0,65 0 1 1
c para NCA = 2,5 0 3 3
c para NCA = 6,5 1 7 8
501-1 200 n 13 80 125
c para NCA = 0,65 0 1 1
c para NCA = 2,5 1 5 5
c para NCA = 6,5 2 10 12
1 201-3 200 n 20 125 200
c para NCA = 0,65 1 2 2
c para NCA = 2,5 1 7 8
c para NCA = 6,5 3 14 18
3 201-10 000 n 32 200 315
c para NCA = 0,65 1 3 3
c para NCA = 2,5 2 10 12
c para NCA = 6,5 5 21 18
[8] CODEX, Directrices Generales Sobre Muestreo, CAC/GL 50-2004. Cuadro 10 pág. 43-44
116
Continuación Tabla 1 Plan de muestreo por atributos
Nivel de Inspección
Tamaño del lote
(número de Reducido Normal Reforzado
elementos)
10 001-35 000 n 50 315 500
c para NCA = 0,65 1 5 5
c para NCA = 2,5 3 14 18
c para NCA = 6,5 7 21 18
35 001-150 000 n 80 500 800
c para NCA = 0,65 1 7 8
c para NCA = 2,5 5 21 18
c para NCA = 6,5 10 21 18
150 001-500 000 n 125 800 1 250
c para NCA = 0,65 2 10 12
c para NCA = 2,5 7 21 18
c para NCA = 6,5 12 21 18
Más de 500 000 n 200 1 250 2 000
c para NCA = 0,65 3 14 18
c para NCA = 2,5 10 21 18
c para NCA = 6,5 12 21 18
[8] CODEX, Directrices Generales Sobre Muestreo, CAC/GL 50-2004. Cuadro 10 pág. 43-44
117
Anexo 7 Cálculos de linealidad
CURVA 1
RESPUESTA
ESTÀNDAR (x-media)^2 x^2
(A)
0,02 407855 0,0016 0,0004
0,05 1151427 0,0001 0,0025
0,07 2025131 0,0001 0,0049
0,1 3008570 0,0016 0,01
promedio 0,06 sumatoria 0,0034 0,0178
a -341736,1324 b 33166364,71
Sa 2700750,593 Sb 40485963,07
Syx 137652,2744 r^2 0,989969012
t 3,182446305
amax a+t.Sa 8253257,613

amin a-t.Sa -8936729,878
bmax 162010768,3
bmin -95678038,87
CURVA 2
RESPUESTA
(A)
0,02 283604 0,0016 0,0004
0,05 1149615 0,0001 0,0025
0,07 1887058 0,0001 0,0049
0,1 2964898 0,0016 0,01
a -451521,3676 b 33713585,29
Sa 83563,02937 Sb 1400519,554
Syx 81663,62148 r^2 0,996560446
t 3,182446305
amax a+t.Sa -185586,5136

amin a-t.Sa -717456,2217
bmax 38170663,57
bmin 29256507,01
118
CURVA
3
RESPUESTA
(A)
0,02 327577 0,0016 0,0004
0,05 1152814 0,0001 0,0025
0,07 1813243 0,0001 0,0049
0,1 2524003 0,0016 0,01
a -212555,3971 b 27782744,12
Sa 69053,31603 Sb 1157336,206
Syx 67483,71744 r^2 0,996541449
t 3,182446305
amax a+t.Sa 7203,073393

amin a-t.Sa -432313,8675
bmax 31465904,45
bmin 24099583,78
CURVA
4
RESPUESTA
(A)
0,02 393767 0,0016 0,0004
0,05 1195567 0,0001 0,0025
0,07 1907180 0,0001 0,0049
0,1 2869782 0,0016 0,01
119
a -281780,0588
Sa 74143,24087 b 31222567,65
Syx 72457,94705 Sb 1242643,54
t 3,182446305 r^2 0,996841999
amax a+t.Sa -45823,17587

amin a-t.Sa -517736,9418
bmax 35177213,99
bmin 27267921,3
CURVA
5
RESPUESTA
(A)
0,02 323213 0,0016 0,0004
0,05 1137541 0,0001 0,0025
0,07 1806449 0,0001 0,0049
0,1 2645679 0,0016 0,01
a -279209,8529 b 29290505,88
Sa 44740,20898 Sb 749847,6062
Syx 43723,2532 r^2 0,998690959
t 3,182446305
amax a+t.Sa -136826,5402

amin a-t.Sa -421593,1657
bmax 31676855,63
bmin 26904156,14
120
curva 1 curva 2 curva 3 curva 4 curva 5 X
-
a max 8253257,613 -185586,5136 7203,073393 -45823,17587 1578444,891
136826,5402
-
a min -8936729,878 -717456,2217 -432313,8675 -517736,9418 -2205166,015
421593,1657
b max 162010768,3 38170663,57 31465904,45 35177213,99 31676855,63 59700281,19
b min -95678038,87 29256507,01 24099583,78 27267921,3 26904156,14 2370025,873
r 0,99
a 1578444,891 entre -2205166,015
b 59700281,19 entre 2370025,873
121
Anexo 8 Cálculo de la exactitud
MATERIAL DE
HARINA DE TRIGO FORTIFICADA
REFERENCIA
X DECLARADO 3,4 mg/Kg
S DECLARADO 0,10
REPETICIONES mg/Kg
1 3,09
2 3,20
3 3,18
4 3,25
5 3,30
X 3,20
S 0,08
X S X DECLARADO Z SCORE
3,20 0,08 3,4 -1,96
% RECUPERABILIDAD 106
122
123
1

T Uce 0008 091

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UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR

FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICAS

“ESTUDIO COMPARATIVO DEL CONTENIDO DE

Tesis de Grado para optar por el Título profesional de

Quito, Julio 2015

A el laboratorio OSP alimentos, la Doctora Ana María Hidalgo, Doctor Geovanny

A Leidy por todo su apoyo brindado en los últimos semestres de mi carrera.

El presente trabajo se realizó en la Facultad de Ciencias Químicas, el laboratorio de

CONSTANCIA DE APROBACIÓN DEL TUTOR........................................................vi

1.1 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA.....................................................18

1.2 FORMULACIÓN DEL PROBLEMA.........................................................19

1.3.1 Objetivo general...........................................................................................19

1.3.2 Objetivos específicos....................................................................................19

1.4 IMPORTANCIA Y JUSTIFICACIÓN DE LA INVESTIGACIÓN...........20

2.2 FUNDAMENTO TEÓRICO........................................................................22

2.2.1 HARINA DE TRIGO:..................................................................................22

2.2.2 OBTENCIÓN Y CLASES DE HARINA DE TRIGO:................................23

2.2.4 CLASIFICACIÓN DE LA HARINAS........................................................24

2.2.4.1 HARINA PANIFICABLE:...........................................................................24

2.2.4.2 HARINA INTEGRAL..................................................................................25

2.2.4.3 HARINAS ESPECIALES............................................................................25

2.2.4.4 HARINAS PARA TODO USO:...................................................................26

2.2.5.1 VITAMINAS DEL GRUPO B.....................................................................26

2.2.6 CROMATOGRAFIA LIQUIDA DE ALTA EFICIENCIA:.......................32

2.2.7 MÉTODOS DE DETERMINACIÓN DE LAS VITAMINAS DEL

2.3 FUNDAMENTO LEGAL............................................................................33

2.4 HIPÓTESIS DE TRABAJO.........................................................................34

3.1 TIPO DE INVESTIGACIÓN.......................................................................36

3.2 POBLACIÓN Y MUESTRA.......................................................................36

3.3 DISEÑO EXPERIMENTAL........................................................................37

3.3.1 DISEÑO DE BLOQUES COMPLETOS AL AZAR CON

3.3.2 PRUEBA DE TUKEY..................................................................................39

3.3.3 PRUEBA T – STUDENT (UNA COLA O UNILATERAL) Y

1.1 TÉCNICAS E INSTRUMENTOS ANALÍTICOS PARA LA

3.4.1 MATERIALES, EQUIPOS Y REACTIVOS:..............................................40

3.4.2 PREPARACIÓN DEL ESTANDAR DE RIBOFLAVINA DE 50 ug / ml.

41 3.4.3 SOLUCIÓN INTERMEDIA DE 5 ug / ml:......................................................41

3.4.4 CURVA DE TRABAJO DE 0,02 – 0,05 – 0,07 Y 0,1 ug / ml:...................42

3.4.5 PREPARACIÓN DE LA MUESTRA:.........................................................42

3.4.6 HIDRÓLISIS ACIDA DE LA MUESTRA:.................................................42

3.4.7 CONDICIONES CROMATOGRÁFICAS PARA ANÁLISIS DE

3.5 VERIFICACIÓN DEL MÉTODO CROMATOGRÁFICO.........................45

4 ANÁLISIS E INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS............................47

4.1 RESULATADOS DE LA ESTANDARIZACIÓN DEL METODO

4.1.1 CONDICIONES CROMATOGRÁFICAS PARA ANÁLISIS DE

4.2 RESULTADOS DEL CÁLCULO DE LA CONCENTRACIÓN DE

4.3 CÁLCULO DEL ADEVA...........................................................................58

4.4 CÁLCULO DE LA PRUEBA DE TUKEY.................................................60

4.5 CÁLCULO DE T – STUDENT PARA LA COMPARACIÓN CON UN

Tabla 1Sustancias de fortificación...................................................................................26

Gráfica 1. Fórmula de la Riboflavina..............................................................................27

Anexo 1.Norma INEN 616:2006.....................................................................................69

Anexo 2.Norma INEN 616:2015.....................................................................................80

Anexo 3. Lineamientos del programa de fortificación de las harinas.............................91

Anexo 4.Procedimiento para determinación de riboflavina Instituto de Salud Pública

Anexo 5.Método para la determinación de riboflavina 970.65 AOAC........................114

Anexo 6.Guía de muestreo de alimentos FAO..............................................................116

Anexo 7. Cálculos de linealidad…................................................................................117

Anexo 8 Cálculos de Exactitud….................................................................................121

PALABRAS CLAVE: HARINA, RIBOFLAVINA, CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA

KEYWORDS: FLOUR, RIBOFLAVIN, HIGH RESOLUTION LIQUID

1.1 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

La nutrición es muy importante en el desarrollo del ser humano desde su concepción.