Documentos de Académico
Documentos de Profesional
Documentos de Cultura
1946-Texto Del Manuscrito Completo (Cuadros y Figuras Insertos) - 7316-1-10-20130818 PDF
1946-Texto Del Manuscrito Completo (Cuadros y Figuras Insertos) - 7316-1-10-20130818 PDF
centrifugados de la misma forma. Una vez eliminado lavado con 0.5 m1 de etanol absoluto y recuperado
el sobrenandante, el precipitado fue suspendido en 1 nuevamente por centrifugación a 12000xg durante 10
m1 de tampón STE (IOmM Tris HCl pH 8.0 - l00mM minutos, a 4°C. El sobrenadante fue eliminado y el
NaCl - 1mM EDTA) y precipitado nuevamente por precipitado se dejó secar colocando el tubo invertido
centrifugación a 1600xg durante 10 minutos a 4°C. sobre un papel absorbente. Una vez seco, el precipi-
El sobrenadante fue eliminado por aspiración dejando tado fue disuelto en 50 u1 de tampón TE conteniendo
el precipitado lo más seco posible. ribonucleasa A en una concentración final de 50 uglml.
La solución fue incubada por 10 minutos a 37°C e
El precipitado fue resuspendido en 0,2 m1 de tampón inmediatamente después analizada por electroforesis.
de lisis (50mm glucosa - lOmm EDTA - 25mM Tris-
HCl pH 8.0 - lisozima 10 mglml), homogenizado y Electroforesis y Digestión
mantenido 10 minutos a temperatura ambiente. Poste-
riormente, 0,4 ml de solución alcalina fría (NaOH Con el fin de determinar la concentración de ADN
0,2N-SDS 1%) preparada en el momento de usar, plasmídico obtenido, una pequeña cantidad del prepa-
fueron agregados a la suspensión. La solución fue rado final (2-5111) fue comparada con ADN plasmídico
mezclada por inversión del tubo y mantenida en hielo patrón, de concentración conocida, mediante electro-
por 5 minutos. Luego fueron agregados 0,3 ml de una foresis en un gel de agarosa al 1%. Alternativamente,
solución de acetato de potasio 3M (pH 4.8) (16), mez- también se usó la técnica de fluorescencia, emitida
clados durante 10 segundos y la mezcla final fue incu- por coloración con bromuro de etidio para determinar
bada en hielo por 15 minutos; posteriormente fue cen- la concentración de ADN plasmídico obtenido (16).
trifugada a 6&0xg durante O¡ minutos a 4°C y el
sobrenadante fue transferido a un nuevo tubo, teniendo Una vez establecida la concentración de ADN plas-
cuidado de no pasar partículas de precipitado. El vo- mídico, se digirieron con la enzima de restricción
lumen correspondiente al sobrenadanterecuperado os- apropiada entre 100 y 300 nanogramos del plásmido
ciló en todos los experimentos entre 0,80 y 0,85 rnl. a 37°C; los fragmentos generados por la digestión
fueron separados por electroforesis.
Una mezcla fenol-cloroformo en un volumen de 0,6.
ml, fue agregada al sobrenadante y la solución resul- RESULTADOS
tante fue mezclada por inversión suave varias veces Para determinar la presencia de plásmidos recombi-
durante 5 minutos, a temperatura ambiente. Después nantes a partir de varios clones provenientes de una
de la centrifugación a 800xg durante 5 minutos, a Genoteca de ADN de Plasmodium falcipmm, se usó
temperatura ambiente, la fase acuosa superior fue re- el método de minipreparación por lisis alcalina (1).
cuperada (0,75 ml), transferida a un nuevo tubo y
extraída nuevamente con 0,75 m1 de una nueva mezcla Inicialmente se hicieron ensayos omitiendo la diges-
fenol-cloroformo. Después de centrifugar como se tión del preparado final con ribonucleasa A y precipi-
describió anteriormente, la fase acuosa fue recuperada tando el ADN plasmídico con etanol absoluto, en lugar
(0,6 ml) y extraida con un volumen igual de clorofor- de isopropanol. En la Figura 1 se muestra claramente
mo. La fase acuosa (0,45 - 0,50 ml) fue transferida la cantidad de ARN presente en los minipreparad os
a un nuevo tubo y extraida 2 veces con igual volumen (carriles b-k) comparados con plásmido purificado en
de éter etílico saturado en tampón TE (lOmM Tris-HC1 gradiente de cloruro de cesio usado como control (ca-
pH 7.5-lmM EDTA). El éter fue eliminado comple- rriles a, l ' m).
tamente por calentamiento a 68°C durante 10 minutos.
La solución se dejó enfriar a temperatura ambiente y Con el fin de eliminar el ARN, los preparados fueron
0.6 volúmenes de isopropanol fueron agregados. Des- incubados con ribonucleasa A.como se describió en
pués de mezclar suavemente, el ADN fue precipitado materiales y métodos. Bajo estas condiciones el ARN
a temperatura ambiente durante 5 minutos. fue eliminado en gran parte pero no totalmente (resul-
tados no mostrados). La precipitación con isopropa-
El ADN precipitado fue recuperado por centrifuga- nol, además de la digestión con ribonucleasa A, per-
ción a 7000xg por 30 minutos, a temperatura ambiente. mitieron eliminar el ARN eficientemente como se ob-
El sobrenadante fue eliminado y el precipitado fue serva en la Figura 2.
ANALlSlS DE PLASMIDOS RECOMBINANTES CON INSERTOS DE ADN GENOMICO DE Plasmodium falcigarum
os con ribonucleasa A
describid en
Los preparados ya libres de ARN fueron analizados ADN del parásito y analizados en este trabajo, oscila
por electroforesisen geles de agarosa, antes y después entre 0,3 Kb y 10 Kb. Además mostraron claramente
de digestión. Los preparados sin digerir muestran los que éstos están libres de contaminación por ADN bac-
diferentes grados de enrollamiento que presentan las teriano y por ARN. La eliminación total del ARN es
moléculas de ADN circulares (Figura 3A). muy importante ya que la presencia de éste enmarca-
raría fácilmente fragmentos de bajo peso molecular
Los preparados digeridos con la enzima EcoRI mos- como es el caso de 4 de los fragmentos analizados
traron que el tamaño de los fragmentos clonados de (Figura 3B, carriles d, e, f, g).
F. ANGEL, R. MANTILLA. M . WASSERMAN
a: plásmido pUC18
b: mezcla de plásmidos recombinados
c-z: diferentes preparados digeridos
A: ADN de lambda diferido con Hind III
Los pesos moleculares son expresados en kilobases (kb).
ANALlSlS DE PLASMIDOS RECOMBINANTES CON INSERTOS DE ADN GENOMICO DE Plasmodium falciparum
El método de minipreparación por lisis alcalina nos 7. Eckhardt T. A rapid method for the identification of plasmid
permitió hacer un análisis de 25 muestras en un solo deoxyr¡bonucleic acid in bacteria. Plasmid 1978; 1: 584.
día, 10 cual es ~ n ventaja
a cuando se quieren analiza 8. Klein RD, selsing E, Wells,RD, A rapid microscale tech-
clones recombinantes provenientes de la construcción nique for isolation of recombinant plasmid DNA for restic-
de una biblioteca genómica. tion enzyme analysis. Plasmid 1980; 3: 68.
Los fragmentos analizados aquí deberán ser estudia- 9. Birnboin HC, Doly J. A rapid alkaline extraction procedure
dos en más detalle, debido a que son elementos muy for screening recombinat plasmid DNA. Nucleic Acids Res.
1979; 7: 1513.
útiles para el diagnóstico de la malaria por hibridación
mO1eculary para llevar a cabo sobre la biolo- 10. Angel F, Mantilla R, Wasserman M. Clonaje molecular
gía del parásito. del DNA de Plasmoúium falcipamm (FCB-1). 11 Congreso
Latinoamericano de Medicina Tropical, Mayo 25-29, 1987.
Süi'i4MAi?Y . Bogotá (Colombia).
12. López E, Acosta H. Caracterización de fragmentos genómi- 15. Tartof KD, Hobbs CA. Improved media for growingplasmid
cos de ADN de Plasmodium falciparum generados con la and cosmid clones. Focus, BRL 1987; 9(2): 12.
enzima EcoRI y clonados en el plásmido pUC18. Tesis de
Grado, Facultad de Química, Universidad Nacional de Co- 16. Maniatis T, Fritsch EF, Sambrook J. Molecular Cloning.
lombia, 1988. A laboratory manual. Cold Spnng Harbor Laboratory; Cold
Spring Harbor 1982.
13. Viera J, Messing J. ThepUCplasmids, anM13mp7denved
system for insertion mutagenesis and sequencing with synthe- 17. Kado CI, Liu ST. Rapid procedure for detection and isolation.
tic universal primers. Gene 1982; 19: 259. of latge and small plasmids. J Bacteriol. 1981; 141: 1365.
14. Ruther U. Constmction and properties of a new cloning 18. Gibson TJ, Sulston JC. Preparation of large numbers of
vehicle, allowing d i t screening for recombinant plasmids. plasmid DNA samples in microtiter plates by the alkalyne
Molec Gen Genet. 1980; 178: 475. lysis method. Gene Anal Techn. 1987; 4: 41.