Guía de Práctica Del Curso de Clonamiento 2016

UNIVERSIDAD PERUANA
CAYETANO HEREDIA
Facultad de Ciencias y Filosofa
Laboratorio de Bioinformtica y Biologa Molecular
Capacitacin Terico Prctico: Clonamiento de Genes y Expresin de protenas por
tecnologa de ADN recombinante
UNIVERSIDAD PERUANA CAYETANO HEREDIA
VICERRECTORADO ACADMICO
DIRECCIN UNIVERSITARIA DE GESTIN DE LA DOCENCIA
FORMATO DE ACTIVIDADES DE
EDUCACIN CONTINUA (AEC)
Aprobado en Comit Tcnico DUGED
2016
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ANEXO I
DOCENTES PARTICIPANTES
Grado Nombre Apellidos Departamento Acadmico

PhD. Patricia Sheen Cortavarria Ciencias celulares y moleculares
PhD. Mirko Zimic Peralta Ciencias celulares y moleculares
MSc(c). Ricardo Antiparra Villa Ciencias celulares y moleculares
MSc(c). Elisa Roncal Ros Ciencias celulares y moleculares
MSc(c). Marco Santos Chvez Ciencias celulares y moleculares
MSc(c). Katherine Vallejo Snchez Ciencias celulares y moleculares
MSc(c). Ruddy Liendo Picoaga Ciencias celulares y moleculares
MSc(c). Sueline Luis Lam Ciencias celulares y moleculares
MSc(c). Roberto Alcntara Estela Ciencias celulares y moleculares
Bach. Hctor Arteaga Pillaca Ciencias celulares y moleculares
Bach. Hugo Valdivia Olarte Ciencias celulares y moleculares
ANEXO 2
PROGRAMACIN DE ACTIVIDADES
Horrio Teoras: Prcticas:

Lunes 16 al Mircoles 18 de Lunes 16 al Mircoles 18 de
Mayo: 3:00-5:00 pm Mayo: 5:00 8:00 pm
Jueves 19 y Viernes 20 de Jueves 19 y Viernes 20 de
Mayo: 3:00 4:00 pm Mayo: 4:00 8:00 pm
Lunes 23 al Jueves 26 de Sbado 21 de Mayo
Mayo: 3:00 4:00 pm 3:00 8:00 pm
Viernes 27 y Sbado 28 de Lunes 23 al Jueves 26 de
Mayo: 3:00-5:00 pm Mayo del 2016: 4:00-8:00 pm
Duracin de la asignatura 2 Semanas ( 60 horas )

Del: Lunes 16 de Mayo del 2016
Al: Sbado 28 de Mayo del 2016
Lugar Teoras y Prcticas:
Laboratorio de Bioqumica y Biologa Molecular (3er piso -
Pabelln central).
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CRONOGRAMA DE PRACTICAS DE LABORATORIO
MDULO 1: Anlisis de Bases de Datos, Diseo de Primers, Clonacin y Manipulacin de

genes (Lunes 16 al Sbado 23 de Mayo del 2016)
Lunes 16 de Mayo
Extraccin de ADN genmico de Escherichia coli. Anlisis de los ADN extrados por electroforesis
en geles de agarosa.
Martes 17 de Mayo:
Reaccin en Cadena de la Polimerasa (PCR) del gen pncA de Mycobacterium tuberculosis. Anlisis
de los productos de amplificacin por electroforesis en geles de agarosa. Purificacin de los
productos de amplificacin (PA) por columna. Purificacin de los PA y del plsmido de
clonamiento pet28a digeridos con enzimas de restriccin, empleando columnas.
Mircoles 18 de Mayo:
Digestin enzimtica de los productos de amplificacin y del plsmido de clonamiento pET28a
Jueves 19 de Mayo:
Ligacin del plsmido-PA (pET28a-pncA). Transformacin del producto de ligacin por shock
trmico y electroporacin en clulas competentes E.coli Novablue.
Viernes 20 de Mayo:
Repique de transformantes post-ligacin en caldo nutritivo. Identificacin de recombinantes por
PCR colonia. Calculo de la eficiencia de transformacin de clulas competentes y
electrocompetentes. Identificacin de clulas E.coli Novablue con vector pUC18.
Sbado 21 de Mayo:
Extraccin de plsmidos de clulas transformantes por lisis alcalina y kit comercial. Identificacin
de recombinantes digestin enzimtica. Anlisis de recombinantes por electroforesis en geles de
agarosa.
MODULO 2: Expresin y Purificacion de Protenas recombinantes (Lunes 23 al Sbado 28 de

Mayo del 2016)
Lunes 23 de Mayo:
Lunes 23 de Mayo:
Transformacin por shock trmico en clulas de expresin E.coli BL21. Preparacin de geles de
poliacrilamida denaturante para SDS-PAGE.
Martes 24 de Mayo:
Expresin en mini escala de la enzima Pirazinamidasa de Mycobacterium tuberculosis. Anlisis de
la induccin de expresin por SDS-PAGE
Mircoles 25 de Mayo:
Purificacin de la enzima Pirazinamidasa por cromatografa de afinidad. Anlisis del mtodo de
purificacin por SDS-PAGE.
Jueves 26 de Mayo:
Ensayo de Wayne cualitativo para el anlisis de la actividad enzimtica de la protena
Pirazinamidasa purificada. Ensayo de Bradford para la cuantificacin de la protena purificada.
Viernes 27 de Mayo:
Preparacin de informes
Sbado 28 de Mayo:
Discusin final de resultados. Presentacin de trabajo final del curso.
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CRONOGRAMA DE CLASES TERICAS
Tema 1: Bsqueda de genes candidatos para clonacin y expresin, orientados al desarrollo de

vacunas, pruebas de diagnstico, e investigacin bsica.
Mirko Zimic, PhD
Tema 2: Fundamento terico de la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) y tipos de PCR.
Estudio de aspectos bsicos para el anlisis y aislamiento de la secuencia del gen pncA de
Mycobacterium tuberculosis.
Katherine Vallejo, MSc(c).
Tema 3: Diseo de primers: Primer3, Primer Blast. Uso de programas y definicin de los
criterios para un buen diseo de primers de clonamiento usando como modelo al gen pncA de
Mycobacterium tuberculosis
Katherine Vallejo, MSc(c).
Tema 4: Tcnica del ADN recombinante. Tipos de enzimas de restriccin utilizadas en la
manipulacin del DNA. Tcnica de Ligacin.
Ricardo Antiparra, MSc(c).
Tema 5: Vectores de clonacin y expresin. Principales caractersticas funcionales. Marcadores
genticos: tipos y utilidades. Sistemas de seleccin de recombinantes.
Ricardo Antiparra, MSc(c).
Tema 6: Expresin. Cdigo gentico, transcripcin, expresin de genes, regulacin
transcripcional y post-transcripcional.
Sueline Luis, MSc(c).
Tema 7: Caracterizacin de protenas. Propiedades fisicoqumicas, actividad biolgica,
propiedades inmunoqumicas, pureza, impurezas, contaminantes. Estabilidad conformacional.
Ruddy Liendo, MSc(c).
Tema 8: Expresin heterloga. Bacterias utilizadas en la expresin (BL21, roseta). Ventajas y
limitaciones. Introduccin a la expresin en levaduras.
Elisa Roncal, MSc (c).
Tema 9: Purificacin de protenas. Tipos de cromatografa: afinidad, de exclusin e intercambio
inico.
Marco Santos, MSc(c).
Tema 10: Manejo y visualizacin de estructuras tridimensionales de protenas.
Hugo Valdivia, MSc(c).
Tema 11: Procesos de Fermentacin. Tipos de cultivos celulares y tipos de Bioreactores.
Roberto Alcntara, MSc(c).
Tema 12: Aplicaciones del clonamiento y expresin de genes por tecnologa de ADN
recombinante en la investigacin cientfico.
Patricia Sheen, PhD.
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GUA DE PRCTICAS
Reglas generales de laboratorio
El ambiente donde se realizarn las prcticas es un laboratorio de investigacin, donde se

maneja una variedad de organismos patgenos para el hombre, as como una variedad de
productos qumicos que pueden afectar la salud. Por tanto, es obligatorio el cumplimiento de
ciertas pautas de bioseguridad, las cuales estn diseadas para prevenir la diseminacin de
infecciones u ocasionar problemas de salud a los estudiantes y personal que labora en estos
ambientes.
Ingresar a laboratorio dejando fuera casacas, sacos u otras vestimentas extras incluyendo
mochilas.
Es obligatorio el uso de mandil para laboratorio. No se permitir el ingreso con chaquetas.
No es permitido usar pantalones cortos ni sandalias.
Est terminantemente prohibido comer, beber, fumar, manipular lentes de contacto o
ingresar alimentos a las reas de trabajo.
Evitar masticar lpices, gomas y otros hbitos de introducir objetos contaminados en la
boca.
Est prohibido manipular materiales y reactivos presentes en el laboratorio que no sean los
indicados para la prctica.
Est prohibido el pipetear con la boca. Se debe emplear siempre dispositivos pipeteadores
mecnicos.
Emplear guantes durante la manipulacin de sustancias cancergenas (Bromuro de etidio).
Reportar inmediatamente cualquier accidente durante la prctica.
Est prohibido retirar cualquier tipo de material de los laboratorios sin previa autorizacin
del coordinador del curso.
Lavarse las manos despus de sacarse los guantes y antes de retirarse del laboratorio
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Instrucciones para el manejo adecuado de una pipeta automtica

Ajustar el volumen girando la rueda hasta que en la escala Botn pulsador
aparezca el volumen deseado. Cuando disminuya el volumen, Rueda

alcance lentamente el valor requerido, asegurndose de no
exceder la marca. Cuando eleve el volumen, sobrepase el valor
requerido por 1/3 de una vuelta y luego disminuya lentamente
hasta alcanzar el volumen requerido, asegurndose de no exceder
la marca.
Colocar una punta de plstico (adecuada) en la punta de la pipeta haciendo una leve
presin para lograr un buen ajuste. Tomar la muestra como sigue:
1) Oprimir el botn pulsador con el dedo pulgar, hasta el primer
tope y sin soltarlo introducir verticalmente la pipeta, hasta que la
punta se sumerja de 2 a 5 mm dentro del lquido.
2) Liberar lentamente la presin sobre el botn. Despus de 23

segundos retirar la pipeta del lquido, siempre de forma vertical,
deslizando la punta contra la pared del recipiente.
3) Apoyando la punta contra la pared del recipiente donde se quiere
colocar el lquido, presionar lentamente el botn pulsador hasta
el primer tope. Despus de un segundo, y sin soltar el botn
pulsador, terminar de vaciar la pipeta presionando hasta el
segundo tope.
4) Retirar la pipeta deslizando la punta contra la pared del
recipiente.
5) IMPORTANTE: No olvide retornar la pipeta a su volumen
mximo de capacidad, girando la rueda hasta su respectivo
nivel dependiendo de la pipeta.
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Prctica 1: Extraccin, purificacin y medicin de la concentracin de

ADN genmico de Escherichia coli
Jefe de Prctica: MSc(c). Katherine Vallejos
Muchas tcnicas para estudiar y entender algunas funciones genticas requieren de la

obtencin de ADN de alta pureza. Los mtodos de extraccin consisten bsicamente en
liberar el contenido bacteriano mediante la ruptura de la pared y membrana bacteriana;
evitar la degradacin del ADN por parte de DNAsas presentes en el medio a travs del
uso de agentes quelantes y proteasas que inhiben y/o degradan estas sustancias.
El mtodo de ruptura de la pared y membrana bacteriana depende del tipo de bacteria:

gram positiva o gram negativa, del grado de pureza del ADN y de la integridad del
ADN que se requiere. Finalmente el ADN es purificado y concentrado mediante
precipitacin. La cuantificacin del ADN es un paso importante para realizar
experimentos posteriores.
Objetivos
Comparar el ADN genmico obtenido de la extraccin y purificacin con 3 tcnicas
de extraccin y purificacin.
Interpretar los resultados en cuanto a la cantidad, pureza e integridad del ADN
obtenido.
Procedimiento
Cultivo de Escherichia coli

Sembrar una colonia aislada de E. coli en 10 ml de caldo LB.
Incubar a 37C en agitacin toda la noche.
Separar 3 ml de cada en 3 tubos de 1.5 ml (eppendorfs).
I.- Mtodos de extraccin de ADN
1) Extraccin de ADN mediante el mtodo de Digestin con Proteinasa K
Centrifugar el cultivo bacteriano a 3,500 rpm por 5 min.

Descartar el sobrenadante y agregar 500 ul de buffer TE.
Agregar 75 ul de SDS 10% y 10 ul de proteinasa K (20mg/ml), vortexear e
incubar a 56C por 10 min.
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Agregar 100 ul de NaCl 5M.

Agregar 100 ul de CTAB/NaCl calentada previamente a 56C, vortexear e
incubar a 56C por 10 min.
Agregar 750 ul de fenol-cloroformo-alcohol isoamyl (25:24:1), vortexear y
centrifugar a 10,000 rpm por 3 min.
Obtener el sobrenadante y traspasarlo a un tubo eppendorf nuevo.
Agregar 750 ul de cloroformo-alcohol isoamyl (24:1), vortexear y centrifugar
a 10,000 rpm por 3 min.
Obtener el sobrenadante y traspasarlo a otro tubo.
Agregar 1 ml de etanol absoluto fro y congelar a -20C por 10 min.
Centrifugar 5 min a 10,000 rpm. Descartar la parte lquida.
Agregar 1 ml de etanol 70% fro y centrifugar 3 min a 10,000 rpm.
Descartar la parte lquida y secar el pellet.
Diluir el ADN en 200 ul de TE.
2) Extraccin de ADN mediante el mtodo de hervido con Chelex

Decantar el sobrenadante y agregar 200 ul de buffer TE ms 10% de Chelex.
Hervir por 5 min.
Centrifugar a 13,000 rpm por 5 min.
Recuperar el sobrenadante donde se encuentra el ADN extrado a un tubo
eppendorf.
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3) Extraccin de ADN usando el Kit de QIAGEN (QIAamp DNA miniKit)

Decantar el sobrenadante y agregar 180 ul de buffer ASL.
Agregar 5ul de proteinasa K, mezclar empleando vortex e incubar a 56C por
10 min.
Opcional: Agregar 4 ul de RNase (100mg/ml), mezclar en vortex por 15 seg.
incubar 2 min a temperatura ambiente.
Agregar 200 ul de buffer AL. Mezclar en vortex por 15 seg e incubar a 70C por
10 min.
Agregar 200 ul de etanol absoluto, mezclar en vortex por 15 seg.
Cuidadosamente aplicar la mezcla (incluido el precipitado) a una columna
QIAamp Spin (en un tubo de coleccin de 2.0ml), tapar y centrifugar a 8,000
rpm por 1 min. Descartar el contenido obtenido del tubo colector.
Abrir la columna cuidadosamente y agregar 500 ul de buffer AW1, tapar y
centrifugar a 8,000 rpm por 1 min. Descartar el contenido obtenido del tubo
colector.
Abrir la columna cuidadosamente y agregar 500 ul de buffer AW2, tapar y
centrifugar a 12,000 rpm por 3 min. Descartar el contenido obtenido del tubo
colector.
Centrifugar nuevamente a 12,000rpm por 1 min (remueve cualquier excedente).
Colocar la columna en un tubo nuevo de 1.5 ml. Destapar cuidadosamente y
agregar 200 ul de buffer AE, incubar a temperatura ambiente por 5 min.
Centrifugar a 8,000 rpm por 1 min. El ADN extrado ahora se encuentra presente
en el tubo eppendorf.
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II.- Preparacin de gel de 0.8% agarosa
1. Pesar 0.8 gr de agarosa y transferirlo a 100 ml de 1X TAE en un matraz.

2. Calentar en el microondas por 1 min, sacar del microondas y homogenizar. Repetir
el calentamiento en el microondas, evitar hervido.
3. Agregar esta mezcla a la cmara formadora de gel juntamente con los peines
formadores de los pozos. Esperar que gelifique, aproximadamente en 20 min.
4. Transferir la cmara formadora de gel hacia la cmara de electroforesis y cubrirlo
con buffer TAE 1X. Sacar suavemente los peines del gel.
III.- Electroforesis de ADN en 0.8% agarosa
Preparar las muestras de ADN (obtenidas previamente con los 3 mtodos de

extraccin) con y sin dilucin de la siguiente manera:
Sin Dilucin Tomar 20 ul de muestra de ADN.

Dilucin 1:5 Tomar 5 ul de muestra de ADN y mezclarlo con 20 ul de TE.
Dilucin 1:25 Tomar 5 ul de muestra de ADN diluida 1:5 y mezclarlo con 20 ul de
TE. Tomar 5 ul de esta nueva mezcla y descartar.
Agregar 4 ul de 6X buffer de muestra (sample buffer o loading buffer) a cada uno de

las 2 muestras de ADN preparadas (con sus respectivas diluciones).
Transferir 6ul de la mezcla de ADN en un pozo del gel de 0.8%.
A 3 pozos agregar 3, 6 y 9 ul de fago lambda (10ng/ul).
Ajustar el voltaje a 90 Voltios y un tiempo aprox. de 40 minutos para la
electroforesis.
Asegurarse que la electroforesis inicie en el polo negativo debido a que el ADN, el
cual se encuentra cargado negativamente migra hacia el polo positivo.
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IV.- Tincin del gel de agarosa
Una vez se ha finalizado la electroforesis, desconectar la fuente antes de manipular

el gel. Transportar el gel de forma adecuada hacia el cuarto de electroforesis y
sumergirlo en una solucin de bromuro de etidio (0.5 ug/ml) por 15 minutos.
Retirar el gel de la solucin de bromuro de etidio y sumergirlo en agua destilada por
10 segundos.
Transferir el gel de la cmara de electroforesis al transiluminador (luz ultravioleta).
Cerrar el transiluminador con la pantalla protectora y observar el gel.
Tomar una foto de la imagen y descartar el gel en un contenedor apropiado.
V.- Medicin del rendimiento (cantidad en ng) y concentracin de ADN (ng/ul)

mediante la comparacin de cantidades conocidas de ADN en gel de agarosa
Comparar la cantidad de ADN de cada muestra con la cantidad estndar de ADN del
fago lambda (30 ng, 60 ng y 90 ng), tomando en cuenta el ancho y la intensidad de
la banda.
Determinar la concentracin mediante la divisin de la cantidad de ADN (ng) con el
volumen usado en el gel (ul), finalmente multiplicarlo por la dilucin (de ser
necesario).
Calcular la concentracin de las muestras de ADN no diluidas y diluidas.
Obtener una concentracin por cada muestra promediando las concentraciones de la
muestra no diluida y de las muestras diluidas.
Ejemplo:
Si deseamos medir la concentracin del ADN diluido 1:5. Comparamos la banda de
esta muestra y determinamos que tiene 60 ng, entonces:
[ADN] = 60 ng/6 ul x 5 = 50 ng/ul
Calcular la cantidad total de ADN obtenido para cada uno de los 3 mtodos usados.
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VI.- Medicin del rendimiento (cantidad en ng) y concentracin de ADN (ng/ul)

mediante lectura de su absorbancia en el nanodrop (espectrofotometra)
La concentracin del ADN puede tambin ser calculado a travs de la obtencin de su

absorbancia a 260 nm y su pureza puede ser determinado a travs del clculo de la razn
de las absorbancias de 260 con la absorbancia a 280 nm. ADNs puros tienen una
razn de Abs260/Abs280 de 1.7 1.9.
Al inicio, limpiar el cabezal del nanodrop con un papel suave especial.

Leer una muestra de agua.
Leer una muestra blanco que puede ser TE o AE (segn el mtodo de extraccin
usado). Poner 1 ul de esta muestra en el nanodrop y realizar la lectura de acuerdo a
las instrucciones del profesor o responsable de la prctica.
Limpiar el contendedor de la muestra y el cabezal del nanodrop.
Luego, colocar 1 ul de una muestra de ADN sin diluir y realizar las mediciones.
Limpiar nuevamente el contenedor de la muestra y el cabezal.
Continuar con las siguientes mediciones de esta manera.
Calcular la cantidad total de ADN obtenido por cada mtodo.
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Prctica 2: Anlisis de bases de datos de secuencias y

diseo de primers
Jefe de prctica: MSc(c). Katherine Vallejos
2.1. Bsqueda de secuencias de nucletidos en la Base de Datos del NCBI
o Nosotros deseamos obtener la secuencia de nucletidos del gen pnca que

codifica para la enzima Pirazinamidasa de Mycobacterium. Para esto, ingrese a
la base de datos del NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/), a continuacin,
coloque pnca en la barra de bsqueda en la parte superior y seleccione Gene
como base de datos. Haga clic en Search. Observe los resultados de las
bsquedas, y comprelo cuando ejecuta la misma bsqueda pero en la base datos
de Nucleotide, que diferencias observa en los resultados?
o Como nos interesa obtener la secuencia de nucletidos del gen pnca, ubicaremos
la bsqueda en la base de datos Gene y obtendremos lo siguiente:
o Haga clic en el acceso a la secuencia pncA de Mycobacterium tuberculosis

H37RV. Explore el reporte y todos los contenidos incluidos. Identifique el GEN
ID.
o Ud. puede revisar el significado de cada item de las bsquedas aqu:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Sitemap/samplerecord.html#LocusNameB
o En el reporte obtenido ubique mRNA and Protein(s) y haga clic en el nmero
de acceso (Accession Number). El nmero de acceso puede utilizarse para hacer
bsquedas directas a travs de todas las bases de datos. Explore toda la
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informacin contenida en este nuevo reporte. Haga clic en la secuencia codante

del gen (CDS), y en la parte inferior de la pantalla haga clic en FASTA. Aqu, se
nos mostrar la secuencia codante completa del gen pnca desde el codn de
inicio ATG al codn stop TGA. Nota: hasta aqu hemos completado la bsqueda
de una secuencia dentro de las bases de datos del NCBI-GenPept, es decir,
ubicando secuencias de nucletidos a partir de un acceso de secuencias de
protenas. Para hacer bsquedas en la base del Genbank, en esta misma pantalla,
haga clic en Genbank y observe los cambios en el reporte general de la
secuencia.
o Para descargar la secuencia, ubique Send en la parte superior, elija File en

Choose destinations y haga clic en Create File. Otra alternativa es, copiar la
secuencia incluyendo el titulo FASTA y pegarla en un block de notas. Asegrese
de colocar un nombre al archivo que le permita identificar rpidamente la
secuencia descargada.
o Ahora que usted puede descargar secuencias de nucletidos de la base del
Genbank, vamos a realizar un breve ejercicio. Descargue las secuencias del gen
pnca de Mycobacterium bovis BCG str. Pasteur 1173P2, Mycobacterium canettii
CIPT 140010059, Mycobacterium tuberculosis CDC1551, Mycobacterium
ulcerans Agy99, Mycobacterium marinum. Se recomienda descargar todas estas
secuencias en un solo archivo block de notas, cada secuencia debe llevar un
ttulo FASTA apropiado y fcil de identificar.
o Para una fcil identificacin de las secuencias de nucletidos, vamos a obtener la
reversa complementaria de cada secuencia codante obtenida, de esta manera
podremos tener ordenadas a todas las secuencias descargadas en sentido 5 3.
Si se requiere, guarde la reversa complementaria de cada archivo obtenido. Una
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herramienta online para obtener la reversa complementaria de secuencias se

encuentra disponible en el siguiente enlace:
http://www.bioinformatics.org/sms/rev_comp.html
Un ejemplo de secuencia de ADN que obtendremos es el siguiente reverso

complementario. Observe, como son fcilmente identificables el codn de inicio (ATG)
y el codn STOP (TGA):
>mycobacterium_sp
ATGCGGGCGTTGATCATCGTCGACGTGCAGAACGACTTCTGCGAGGGTGGCTCGCTGGCGGTAACCGG
TGGCGCCGCGCTGGCCCGCGCCATCAGCGACTACCTGGCCGAAGCGGCGGACTACCATCACGTCGTGG
CAACCAAGGACTTCCACATCGACCCGGGTGACGACTTCTCCGGCACACCGGACTATTCCTCGTCGTGGC
CACCGCATTGCGTCAGCGGTACTCCCGGCGCGGACTTCCATCCCAGTCTGGACACGTCGGCAATCGAGG
CGGTGTTCTACAAGGGTGCCTACACCGGAGCGTACAGCGGCTTCGAAGGAGTCGACGAGAACGGCACG
CCACTGCTGAATTGGCTGCGGCAACGCGGCGTCGATGAGGTCGATGTGGTCGGTATTGCCACCGATCAT
TGTGTGCGCCAGACGGCCGAGGACGCGGTACGCAATGGCTTGGCCACCAGGGTGCTGGTGGACCTGAC
AGCGGGTGTGTCGGCCGATACCACCGTCGCCGCGCTGGAGGAGATGCGCACCGCCAGCGTCGAGTTGG
TTTGCAGCTCCTGA
2.2 Bsqueda de secuencias de aminocidos en la base de datos del NCBI,

UniProtKb/Swiss-Prot y UniProtKb/TrEMBL
Ingresar a la base de datos del NCBI y explore la base en bsqueda de la

secuencia de aminocidos de la enzima pyrazinamidase (PZAsa). Para esto,
realice una bsqueda similar a la ejecutada para las secuencias de nucletidos,
pero en lugar de ingresar a CDS, haga clic en la parte superior de la pantalla en
FASTA. Aqu, habr accedido a la base de datos NCBI-GenPept.
A continuacin, copie la secuencia de aminocidos en formato FASTA en un
archivo de block de notas y coloque un ttulo FASTA apropiado. Obtenga las
secuencias de aminocidos del gen pnca de Mycobacterium bovis y las otras
especies de mycobacterias mencionadas anteriormente. Grabar todas las
secuencias en formato FASTA en un documento de texto (block de notas)
dndole un nombre apropiado a cada una de ellas. Recuerde, que el nombre debe
ser fcil de identificar y distinguir entre secuencias.
UnitProt es un recurso de bases de datos de protenas ubicado en la web del EBI

(European Bioinformatics Institute), entre sus bases de datos, se encuentra el
UniProtKB que contiene secuencias de proteinas anotadas y/o revisadas manualmente.
Vamos a revisar, brevemente, esta base de datos de protenas de gran importancia en la
investigacin biomdica, y que suele ser un punto de inicio en el conocimiento de las
caractersticas de una protena en estudio.
Ingresar a la base de datos de UniProt (http://www.uniprot.org/help/uniprotkb) y
en la parte superior de la barra de bsqueda (Query) digite mouse albumin.
Seleccione UniProtKB como base datos de protenas para la bsqueda.
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Usted debera obtener una ventana as:
Identifique la diferencia entre las estrellas amarillas y grises al costado de cada

acceso que obtuvimos en la bsqueda al ingresar mouse albumin.
Haga clic en el primer nmero de acceso Serum Albumin (mus musculus) e

identifique la informacin contenida en los resultados presentados. Que
caracterstica me podra dar informacin con respecto al proceso de maduracin
de la protena? Que caracterstica contiene informacin sobre el peso molecular
y punto isoelctrico de la protena? Esta base datos se encuentra aislada de otras
bases o presenta interconexin?
Vaya a Sequences y en Tools modifique la herramienta a Compute pI/MW.

Determine el peso molecular terico y el punto isoelctrico de la protena. Qu
importancia pueden tener estos datos a nivel experimental?
2.3 Anlisis de herramientas proteomicas en el portal ExPASy: identificacin

de MW, PI y pptido seal
Como habr observado, la herramienta Compute pI/MW se encuentra dentro

del Portal de recursos bioinformaticos ExPASy, el cual forma parte del Instituto
Bioinformatico Suizo (SIB). En este portal (http://www.expasy.org/), ubique la
seccin de categoras y haga clic en proteomics. Explore las bases de datos y las
herramientas presentes. Ubique la herramienta compute pI/MW e ingrese la
secuencia de aminocidos de la protena PZAsa de Mycobacterium tuberculosis
H37RV sin ttulo FASTA, seleccione el clculo de la masa promedio (Average
Resolution) y haga clic en Compute pI/MW. Cul es el punto isoelctrico y peso
molecular terico de esta protena?
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De acuerdo a la base de datos UniProtKB, sabemos que la secuencia albumina

de ratn es procesada post-traduccionalmente antes de madurar y activarse. Que
sucedera si no conocisemos previamente esta informacin? A continuacin,
vamos a utilizar una herramienta conocida como SignalP 4.1 para determinar la
existencia de pptido seal dentro de una secuencia de protenas. Este servidor
utiliza redes neuronales para asociar puntajes a la ubicacin e identidad del
pptido seal en una secuencia dada.
Ingrese a SignalP 4.1 (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)
Descargue la secuencia de aminocidos de la protena albumina de ratn del

Genbank. Utilice la secuencia de 608 aminocidos de longitud en formato
FASTA. Colquela en un archivo de texto (block de notas).
Pegue esta secuencia en la ventana Submission del programa SignalP. Seleccione

Eucariotas en Organism group y deje el resto de opciones por defecto. Haga clic
en Submit. Usted obtendr una grfica como sigue:
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En la grfica resultante explica los resultados de la prediccin. Aqu, se observan

una serie de curvas de colores, cada color est asociado a un tipo de score o
puntaje. El S-Score y el C-score, nos van a permitir ubicar los aminocidos que
conforman el pptido seal y el sitio de corte, respectivamente. Cuando el valor
del score de discriminacin D score supera el valor de corte 0.450 se dice que SI
hay pptido seal. Este valor discrimina pptidos seal de otro tipo de pptidos.
El valor promedio S mean S nos permite ubicar la posicin 1 al ltimo
aminocido que incluye el pptido seal. El score-C y score-Y tendrn su
mximo pico en el aminocido inmediato-posterior al ltimo aminocido del
pptido seal, es decir, despus del sitio de corte. En qu posicin se encuentra
el pptido seal? Compare estos resultados con la informacin contenida en la
base de datos UniProtKB/Swiss-Prot. Qu diferencias encuentra?
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2.4.- Diseo de primers de clonacin
Construccin de primers de clonacin para el Gen pncA

Mutaciones en el gen pncA, un gen codificante de la pirazinamidasa, causa resistencia a
las droga anti-tuberculosis pyrazinamida en los bacilos de M. tuberculosis. Para la
elaboracin de primers de clonacin, usaremos el programa Primer3, el cual puede ser
descargado en el siguiente link: http://primer3.ut.ee/
Ud. observar una ventana como esta:
Colocar la secuencia completa del gen pncA de M. tuberculosis para disear los primers
dentro del recuadro.
Secuencia del gen pncA
ATGCGGGCGTTGATCATCGTCGACGTGCAGAACGACTTCTGCGAGGGTGGC
TCGCTGGCGGTAACCGGTGGCGCCGCGCTGGCCCGCGCCATCAGCGACTAC
CTGGCCGAAGCGGCGGACTACCATCACGTCGTGGCAACCAAGGACTTCCAC
ATCGACCCGGGTGACCACTTCTCCGGCACACCGGACTATTCCTCGTCGTGGC
CACCGCATTGCGTCAGCGGTACTCCCGGCGCGGACTTCCATCCCAGTCTGGA
CACGTCGGCAATCGAGGCGGTGTTCTACAAGGGTGCCTACACCGGAGCGTA
CAGCGGCTTCGAAGGAGTCGACGAGAACGGCACGCCACTGCTGAATTGGCT
GCGGCAACGCGGCGTCGATGAGGTCGATGTGGTCGGTATTGCCACCGATCA
TTGTGTGCGCCAGACGGCCGAGGACGCGGTACGCAATGGCTTGGCCACCAG
GGTGCTGGTGGACCTGACAGCGGGTGTGTCGGCCGATACCACCGTCGCCGC
GCTGGAGGAGATGCGCACCGCCAGCGTCGAGTTGGTTTGCAGCTCCTGA
Dejar los casilleros por defecto y dar click a Pick primers.

Ud. Observar un resultado como este:
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Primers en posiciones 5 3
Secuencia de consulta
mostrando posiciones y
direccin de los primers
NOTA
El ejercicio anterior servir cuando uno necesite primers de cualquier porcin conocida
del gen consultado. En el caso se desee clonar el GEN COMPLETO, el diseo deber
incluir la totalidad del gen. Para ello se deben incluir en cada extremo los sitios de
restriccin que correspondern al vector a usar.
En el caso de los experimentos que vendrn en adelante como parte del curso. Lo que se
realizar es clonar la totalidad del gen PncA de M. tuberculosis. Para ello se toman los
primers desde el inicio (Forward) y extremo final (Reverse) de la secuencia, sin obviar
que en el caso del primer Reverse se debe considerar su reversa complementaria. Luego
se deben adicionar las secuencias de los sitios de restriccin de esta manera: NcoI para
el primer Forward y XhoI para el Reverse, ambos adicionados en los extremos 5
Los primers una vez diseados son solicitados a un fabricante que se encargar de
sintetizar la longitud de cada primer. Para ello es MUY IMPORTANTE enviar la
secuencia en el sentido 5 3.
Ejm de primers para solicitar su sntesis:
Nombre del primer: Rv2005c F

Secuencia del primer: 5' CTCTTTACGCTGAGCTTTCGAT 3'
Descripcin: Qty: 50nmoles, purit: Desalted, 3modification: none, 5modification:
none
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Enzimas de restriccin a usar en el clonamiento
XhoI: 5.CTCGAG3
3.GAGCTC5
NcoI: 5.CCATGG3
3.GGTACC3
Vector de clonacin
Plsmido pET28a
Mapa (ver anexo 1 con mapa del vector)
Diseo:
Forward:
Reverse:
Herramientas de prediccin de estructuras secundarias entre los primers.

Si se desea revisar las estructuras secundarias que se pudieran formar, se debe realizar
un anlisis de estas. Hay muchas herramientas para realizar ello. Mostraremos una de
ellas.
Ingrese a http://www.idtdna.com/analyzer/applications/oligoanalyzer/
Y coloque all sus secuencias a predecir sus estructuras secundarias.
Tambin podra hacer uso de la herramienta Oligo Calc:

http://www.basic.northwestern.edu/biotools/oligocalc.html
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Prctica 3: Reaccin en Cadena de la Polimerasa (PCR) del gen pncA

de Mycobacterium tuberculosis
Jefe de prctica: MSc(c). Roberto Alcntara
Introduccin
La reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) es la amplificacin in vitro de secuencias

especficas de cidos nucleicos. Partiendo de un DNA molde, una enzima polimerasa incorpora
nucletidos complementarios a partir de la zona de doble cadena originada por la unin de los
cebadores al molde. Los cambios de temperatura constituyen la base para que se completen los
pasos necesarios. El proceso se lleva a cabo en tres fases: (1) la denaturacin por calor de la
molcula de DNA blanco a ser copiada, (2) la hibridacin de un par de oligonucletidos de
secuencias especificas (primers) construidas para ser homlogas a secuencias dentro de la
molcula de DNA blanco, (3) la extensin de los primers para copiar la molcula de DNA
blanco, gracias a la accin de la DNA polimerasa. Estos tres pasos bsicos son repetidos muchas
veces (muchos ciclos) para amplificar el DNA blanco. Si en cada ciclo, se genera una copia de
cada hebra del blanco, el nmero de molculas de DNA producidas se duplica cada ciclo.
La PCR se completa repitiendo entre 25 y 35 veces las tres fases descritas previamente,
es decir, realizando entre 25 y 35 ciclos. Si se analiza lo que sucede a partir del primer ciclo se
comprueba que tras varios ciclos se forman fragmentos cuyo tamao est limitado por los
puntos en los que hayan hibridado los cebadores. En realidad, transcurridos varios ciclos
ms, los fragmentos mayoritarios sern aquellos limitados en sus extremos por los cebadores.
En la prctica, se amplificar la secuencia del gen de la pirazinamidasa. Esta protena est
presente en Mycobacterium tuberculosis y se encarga de hidrolizar en el citosol a la
pirazinamida, principal antibitico en la terapia antituberculosa. Producto de esta hidrolisis se
libera un grupo amonio y se produce el cido pirazinoico El cido pirazinoico es expulsado al
ambiente extracelular mediante un sistema de bombas de eflujo, donde en condiciones cidas de
protona y por difusin reingresar a la bacteria reduciendo de manera significativa el pH
intracelular y alterando el potencial de membrana (Wade y Zhang, 2004).
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3.1. AMPLIFICACIN PCR DEL GEN pncA DE M. tuberculosis.
Para la amplificacin se emplear la enzima Taq polimerasa de Invitrogen

Se realizara la amplificacin de la secuencia del gen pnca a partir de ADN genmico de una
cepa wild type de Mycobacterium tuberculosis (25 ng/ul)
PCR
Reactivos Conc. Stock Conc. Final Vol 50 ul
Agua - - 23.75
Buffer 10 x 1x 5
dNTPs 2.5 mM 0.25 mM 5
Mg2Cl 25 mM 2.5 mM 5
Primer P1 10 uM 0.1 uM 0.5
Primer P2 10 uM 0.1 uM 0.5
DMSO 100% 10% 5
Taq 5 U/ul 1.25U 0.25ul
Master mix 45ul
ADN - - 5ul
Volumen total 50ul
Cada grupo preparar 2 reacciones de volumen de 50ul cada una.

(Control negativo y Reaccin problema)
Se mezclan los reactivos en un tubo de PCR.
Se homogeniza bien el master mix usando el vrtex por unos 15 seg.
Realizar un spin para colectar todo el volumen del master mix.
Se dispensa el volumen total de 45 ul en tubos de PCR y se agrega 5 ul de los ADN
genmico de Mycobacterium tuberculosis a la Reaccin problema Para el control
negativo se utilizar 5 uL de agua.
El volumen final de la reaccin ser de 50ul.
CONDICIONES DE PCR:
94 C x 5 min
94 C x 1min
60 C x 1min 35 ciclos
72 C x 45seg
72 C x 7 minutos
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3.2. ANLISIS DE LOS FRAGMENTOS DE AMPLIFICACIN: (A realizar en la

prctica 4 del da 18)
Los productos de amplificacin sern separados por electroforesis en gel de agarosa de la

siguiente manera:
1. Se emplear Agarosa Promega al 1 % en Buffer TAE 1X

2. Las muestras sern sembradas en el gel de la siguiente manera:
- 5 L del marcador Ladder 100 bp en el pozo central de la corrida.
- Para cada producto de amplificacin: Se mezclar 2 L del producto de PCR (PA)
con 1 L del loading buffer 6x y 3ul de Agua de PCR. Se cargara la mezcla en cada
pozo del gel de agarosa.
3. Se realizar la electroforesis por 1 hora a 90 V.
4. Terminada la electroforesis, el gel se teir en una solucin de SybrSafe 1:10000 de
buffer TBE y se proceder a obtener un reporte fotogrfico del gel, con la ayuda de un
analizador de imgenes en el espectro ultravioleta.
3.3. Purificacin de los Productos de Amplificacin por Quick PCR kit
1. Transferir el volumen completo de la PCR en un tubo de microcentrifuga y agregar un

volumen de Binding buffer (Buffer de unin) en una relacin 1:10. Mezclar por
inversin.
2. Despus de mezclar, incubar por 1 minuto a temperatura ambiente.
3. Aadir esta mezcla a las columnas (kit) y centrifugar a 13,000 rpm por 1 min. Luego
descartar el contenido presente en el tubo colector.
4. Lavar la columna con 500 ul de Washing buffer (Buffer de lavado), centrifugar a
13,000 rpm por 1 min, descartar el contenido del tubo colector.
5. Lavar una vez ms pero ahora con 200 ul de Washing buffer (Buffer de lavado),
centrifugar a 13,000 rpm por 1 min, descartar el contenido del tubo colector.
6. Se centrifuga una vez ms (slo la columna) para descartar el residuo de etanol.
7. Poner la columna en un nuevo tubo de microcentrfuga (rotulado), y agregar 40 ul de
buffer EB. Esperar 10 minutos y centrifugar a 13,000 rpm por 1 min.
8. Medir la concentracin en el nanodrop.
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Prctica 4: Digestin de los productos de amplificacin (PA) y

vector pET28a empleando enzimas de restriccin
Jefe de prctica: Blgo. Hctor Arteaga
Un enzima de restriccin (o endonucleasa de restriccin) es aquella que puede reconocer una

secuencia caracterstica de nucletidos dentro de una molcula de ADN y cortar el ADN en ese
punto en concreto, llamado sitio o diana de restriccin, o en un sitio no muy lejano a este.
Los sitios de restriccin cuentan con entre 4 y 6 pares de bases, con las que son reconocidos.
En la prctica, el plsmido pET28(a) ser digerido con las enzimas de restriccin NcoI y XhoI.
Procedimiento
4.1. Digestin de los Productos de Amplificacin (PA) y del vector pET28a
Reactivos [ ] final Volumen
Buffer NEB 2.1 10x 1x 5

NcoI (10 U/ul) 20U 2
XhoI (20U/ul) 20U 1
H2O - 12
PA o Vector 30
Vf 50
El volumen final de digestin, depende de las concentraciones obtenidas tanto para el

producto como para el plsmido. Incubar a 37 C por 2 horas o toda la noche.
4.2. Purificacin de los PA posterior al proceso de digestin
1. Transferir el volumen completo de la PCR en un tubo de microcentrifuga y agregar

un volumen de Binding buffer (Buffer de unin) en una relacin 1:10. Mezclar por
inversin.
2. Despus de mezclar, incubar por 1 minuto a temperatura ambiente.
3. Aadir esta mezcla a las columnas (kit) y centrifugar a 13,000 rpm por 1 min. Luego
descartar el contenido presente en el tubo colector.
4. Lavar la columna con 500 ul de Washing buffer (Buffer de lavado), centrifugar a
13,000 rpm por 1 min, descartar el contenido del tubo colector.
5. Lavar una vez ms pero ahora con 200 ul de Washing buffer (Buffer de lavado),
centrifugar a 13,000 rpm por 1 min, descartar lo del tubo colector.
6. Se centrifuga una vez ms (slo columna) para descartar el residuo de etanol.
7. Poner la columna en un nuevo tubo de microcentrfuga (rotulado), y agregar 40 ul de
buffer EB. Esperar 10 minutos y centrifugar a 13,000 rpm por 1 min.
8. Medir la concentracin en el nanodrop.
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Prctica 5: Reaccin de ligacin y transformacin
Jefe de Prctica: MSc(c). Ricardo Antiparra
Los objetivos de la prctica consisten en los PA purificados en el plsmido pET28a

(DNA vector) mediante un proceso denominado ligacin. Para que esta construccin
(DNA recombinante) persista en el tiempo y se amplifique in vivo es necesario introducirla en
un hospedador apropiado, en nuestro caso emplearemos a Escherichia coli Novablue
(el cual previamente se ha hecho competente para favorecer la entrada del DNA
recombinante). Finalmente, mediante el empleo de un sistema de seleccin positiva (cassette de
resistencia a antibitico) podremos obtener y seleccionar aquellas clulas que llevan consigo el
DNA recombinante.
5.1 Reaccin de Ligacin empleando T4 DNA Ligasa.
1) Al iniciar debemos dejar a temperatura ambiente el Buffer de ligacin 10X y H2O,

as como mantener la T4 DNA Ligasa (Ligasa) a -20C.
2) En un tubo para PCR se proceder a agregar los siguientes reactivos:
[ ] Final Volumen
Buffer 10X 1X 2 L
Vector pET28a *10-100ng 1 L
PA o inserto **variable
T4 DNA Ligasa 1 L
H2O MQ csp 20 L
Volumen Total 20 L
* Se considera como cantidad.

** El ratio molar ptimo inserto/vector para esta reaccin de ligacin es de 3:1.
Peso del vector (ng) x Tamao del inserto (Kb) x relacin molar = ng (inserto)
Tamao del vector (Kb) (inserto:vector)
3) Incubar a 16C por 1 hora.

4) La reaccin de ligacin puede almacenarse a 4 C hasta su transformacin.
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5.2. Transformacin con reaccin de ligacin en Escherichia coli (Novablue) empleando

Shock trmico
1) Tomar 1 tubo de microcentrfuga con clulas competentes E. coli (Novablue), colocar
en hielo por 10 minutos.
2) Aadir al tubo 5 ul de la reaccin de ligacin plsmido pET28a-pncA
3) Dejar en hielo por 30 minutos, luego colocar los tubos en un bao Mara a 42C por 1
minuto. Retirarlo y dejarlo en hielo picado por 2 min.
4) Agregar 1000 L de medio SOC estril e incubar a 37C por 1 hora.
5) Incubar los tubos a 37C por 1 hora en agitacin a 225 rpm.
6) Centrifugar los tubos a 6,000 rpm por 5 minutos.
7) Descartar el sobrenadante y resuspender el pellet con 100 uL de caldo SOC.
8) Sembrar 80 L en placas con agar LB + kanamicina (40 g/ml) con un asa de Driglasky
(usar etanol para desinfectar el sembrador).
9) Incubar al menos 24 horas a 37C.
5.3. Transformacin de clulas E. coli Novablue por electroporacin
Materiales
Cubetas de 0.1 cm o 0.2 cm de gap
Tubos eppendorf estriles
Clulas electrocompetentes
Alcuotas de 1mL caldo SOC
Electroporador BTX.
Metodologa
Descongelar las clulas en hielo. Colocar un tubo eppendorf de 1.5 mL en hielo, una
cubeta electroporacin de 0.1 o 0.2 cm tambin en hielo, y tener un tubo eppendorf con
1 mL de SOC a temperatura ambiente.
En 100 uL de la suspensin de clulas electrocompetentes, agregar 5 ul de la reaccin
de ligacin. Mezclar bien e incubar en hielo por 1 min.
Transferir la mezcla de clulas y DNA a cubetas de electroporacin fras, asegurarse
que la suspensin llegue al fondo de la cubeta. Colocar la cubeta en la cmara de
electroporacin. Cerrar bien la tapa de la cmara.
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Pulsar una vez bajo estas condiciones:

Cubetas de 0.1 cm: C=25uF; R=200 ohm; V=1.8kV
Cubetas de 0.2 cm: C=25uF; R=200 ohm; V=2.5kV,
C=25uF; R=200 ohm; V=3.0kV
Remover la cubeta de la cmara y agregar inmediatamente 1 mL de medio SOC.
Resuspender las clulas con el uso de la pipeta. El periodo entre la aplicacin del pulso
y la transferencia de las clulas al medio de crecimiento es crucial para recuperar gran
cantidad de transformantes.
Incubar los tubos a 37C por 1 hora en agitacin a 225 rpm.
Centrifugar los tubos a 6,000 rpm por 5 minutos.
Descartar el sobrenadante y resuspender el pellet con 100 uL de caldo SOC.
Sembrar 80 L en placas con agar LB + kanamicina (40 g/ml) con un asa de Driglasky
(usar etanol para desinfectar el sembrador).
Incubar al menos 24 horas a 37C.
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Practica 6: Repique para PCR colonia y extraccin de plsmido.

Clculo y comparacin de eficiencia entre la transformacin por
electroporacin y shock trmico. Evaluacin de transformacin del
vector pUC18.
Jefe de Prctica: MSc(c). Marco Santos
Introduccin
El repique de clulas transformantes en placa de agar nutritivo con antibitico es el proceso
inicial para la ejecucin del PCR colonia (PCR colonia), que consiste en ejecutar un PCR
usando cebadores que amplifiquen, nicamente, el producto insertado en el plsmido de
clonamiento. De esta manera, si la colonia tomada contiene el plsmido con el producto
insertado, el PCR dar como resultado la amplificacin de este producto. Por otro lado, tambin
permitir la obtencin de plsmidos por el mtodo de lisis alcalina.
6.1 Repique de transformantes en caldo y placa de agar nutritivo.
Observe la presencia de colonias en la placa de agar LB con kanamicina. Asegrese, de

que la morfologa de las colonias sea similar.
Divida su placa de agar LB con kanamicina (40 g/ml) en la cantidad de espacios
indicados por el jefe de prctica.
Queme el asa de siembra y tome una asada de una colonia transformante, realice una
siembra pequea en un espacio dibujado en la placa.
Queme el asa de siembra y repita estos pasos para la cantidad de colonias que el jefe de
practica indique.
Procedimiento:
1. Tome una asada de una colonia transformante y colquela en un tubo con 5ml de
caldo LB con kanamicina (20 g/ml).
2. Dejar incubar a 37C en agitacin por 16 a 18 horas.
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6.2. Test de confirmacin de clonas recombinantes
Mtodo de confirmacin empleando PCR colony
Con la ayuda de un tip amarillo agregar una pequea cantidad de la colonia sospechosa
en un tubo eppendorf que contiene 100 l de buffer TE. La cantidad de la colonia debe
ser pequea para no inhibir el PCR.
Disolver la colonia con el buffer y repetir el procedimiento para las otras 2 colonias
sospechosas elegidas.
Hervir las muestras a 95C por 5 min.
Dejar enfriar 5 min a Temp. amb. para ser usadas en el Mix de PCR.
Preparar el Mix de PCR segn la tabla adjunta:
Concentracin Concentracin 1 Vol 4 Vol

Reactivos PCR
Inicial Final (20 l) (80 l)
H20 PCR - - 8.8 l 35.2 l

Buffer PCR 10 x 1x 2 l 8 l
dNTPs 2.5 mM 0.25 mM 2 l 8 l
MgCl2 25 mM 2.5 mM 2 l 8 l
DMSO 100 % 10 % 2 l 8 l
Primer pncA Fw 40 M 0.1 M 0.05 l 0.2 l
Primer pncA Rv 40 M 0.1 M 0.05 l 0.2 l
Taq polimerasa 5 U/l 0.5 U 0.1 l 0.4 l
ADN (Hervido) - - 3 l X
20 l
Alicuotar 17 l en cada uno de los 3 tubitos PCR y agregar respectivamente 3 l de

cada una de las muestras hervidas (3 colonias sospechosas).
Colocar en el termociclador y programar segn el esquema adjunto:
Posterior al PCR, realizar una electroforesis de agarosa al 1%. Programar la fuente de

poder a 95V y dejar correr hasta que el frente de corrida haya migrado hasta el final.
Teir el gel de agarosa con Bromuro de Etidio por 20 min y observar.
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6.3.- Clculo de la eficiencia de transformacin
Es importante saber que tres factores parecen ser crticos para obtener una alta eficiencia de
transformacin:
1. La pureza de los reactivos usados en los buffers de transformacin. es importante usar la
ms alta calidad de reactivos que se puedan obtener y almacenarlos en pequeas
alcuotas en un lugar oscuro y fresco.
2. El estado de crecimiento de las clulas. Las ms altas frecuencias de transformacin son
obtenidas con cultivos que han crecido directamente de un master stock almacenado
en medio congelado a -70C. Cultivos que han sido pasados continuamente en el
laboratorio o que han sido almacenados a 4C o a temperatura ambiente no deben ser
usados.
3. La esterilidad del material de vidrio y de plstico usado. Todo el material usado para la
preparacin debe ser lavado y secado a mano, as como, esterilizado con autoclave, para
garantizar la eficiencia de transformacin de las bacterias. La presencia de trazas de
detergente u otros qumicos reduce enormemente la eficiencia de transformacin de las
bacterias.
Eficiencia de Transformacin
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6.3. Evaluacin de la transformacin con plsmido circular pUC18 en Escherichia

coli Novablue (Demostrativo)
Los vectores pUC18, pUC19 son idnticos excepto, que contienen sitios de
multiclonamiento dispuestos en orientaciones opuestas. Los plsmidos pUC carecen del gen
rop, el cual normalmente est localizado cerca del origen de replicacin del ADN y est
involucrado en el nmero de copias. Como resultado, estos plsmidos se replican a una
mayor taza que otros plsmidos que llevan un origen pMB1 o ColE1. Los vectores pUC el
fragmento amino-terminal del producto del gen lacZ (-galactosidasa) y muestran una -
complementacin en los hospederos apropiados. De esta manera, las recombinantes pueden
ser identificadas por un screening histoquimico.
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Prctica 7: Extraccin de ADN plasmdico (Lisis Alcalina/Kit)

y ensayo de restriccin para verificacin de plsmidos
recombinantes
Jefe de Prctica: MSc(c) Elisa Roncal
Introduccin
Las tcnicas de extraccin de plsmidos obtenidos de clulas bacterianas son diversas.

Existen desde los mtodos caseros (Lisis Alcalina, Sales y Bromuro de etidio) hasta los
mtodos comerciales (Empleo de kits que emplean columnas de slice). Ambas metodologas se
diferencian ya sea por la cantidad y calidad del plsmido obtenido al final del proceso, as como
el costo total de los reactivos y accesorios empleados durante el proceso de purificacin.
La extraccin por el mtodo de Lisis alcalina tiene su fundamento en las diferencias de tamao
y en las propiedades de desnaturalizacin y renaturalizacin que existen entre el
ADN plasmdico (ADN circular cerrado covalentemente) y el ADN genmico. En tanto que los
kits comerciales emplean una columna de slice para una adsorcin selectiva del ADN
plasmdico en buffers con alto contenido de sales caotrpicas y una elucin en buffers de bajo
contenido de sales.
Ambos mtodos de extraccin de plsmidos sumados a la subsecuente digestin enzimtica y

PCR colony realizada previamente servirn para comprobar la clonacin del gen pncA en el
vector pET28a.
7.1. Extraccin de Plsmidos
A) Mtodo de Lisis Alcalina
Cultivar las bacterias (clonas transformantes) toda la noche a 37C en un tubo que
contenga 5 ml de cultivo con el antibitico de seleccin apropiada
(Kanamicina: 40 g/mL).
Centrifugar 1.5 ml a 6,000 g por 1 min en un tubo eppendorf y eliminar el sobrenadante.
Observar el pellet al fondo del tubo.
Concentrar las bacterias agregando a este mismo tubo eppendorf una vez ms 1.5 ml del
cultivo y volver a centrifugar a 6,000 g por 1 min.
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Descartar el sobrenadante e invertir el tubo en un papel toalla 30 segundos.

Posteriormente si se observa aun sobrenadante, retirarlo empleando una pipeta.
Resuspender el pellet con 150 L de Solucin I (Tubo LA 1, enfriado previamente
en hielo) empleando primero la pipeta y luego el vortex.
Agregar 300 l de la Solucin II (Tubo LA 2, Temperatura ambiente). Mezclar por
inversin 5 veces, no vortexear. Incubar 5 minutos a temp. ambiente.
Se observar al finalizar los 5 minutos que se formara una solucin viscosa
transparente al momento de destapar el eppendorf.
Agregar 225 L de la Solucin III (Tubo LA 3, enfriado previamente en hielo).
Incubar por 5 minutos en hielo. Se debe observar una solucin blanquecina.
Luego de la incubacin, centrifugar a 13,000 rpm por 5 min. Transferir el sobrenadante
transparente a un tubo eppendorf nuevo (emplear pipeta 100 l).
Agregar la solucin de Fenol-cloroformo-alcohol isoamilico (25:24:1) en un volumen
similar al del sobrenadante (aprox. 600 uL). Mezclar por inversin el tupo eppendorf 5
veces.
Centrifugar a 12,000 rpm por 2 min. Observar las 2 fases (Fase orgnica en la capa
inferior y fase acuosa en la capa superior).
Transferir el sobrenadante de la fase acuosa (capa superior) a un nuevo tubo.
Precipitar el ADN plasmdico contenido en la fase acuosa con 2 volmenes de Etanol
absoluto 100 % a temperatura ambiente (aprox. 1000 L). Mezclar por inversin el
tupo eppendorf 5 veces.
Incubar por 10 min a -20C. Centrifugar por 12,000 g por 5 minutos. Observar el pellet
blanquecino al fondo del tubo y marcarlo con un crculo.
Remover el sobrenadante con cuidado de no botar el pellet. Luego, invertir el tubo sobre
el papel toalla para que absorba todo el fluido (2 minutos).
Lavar el pellet con 1,000 L (1 ml) de Etanol al 70% (enfriado en hielo). Centrifugar
a 12,000 rpm por 5 minutos.
Remover el sobrenadante con cuidado de no botar el pellet. Luego, invertir el tubo sobre
el papel toalla para que absorba todo el fluido (5 minutos). De ser necesario retirar el
exceso de Alcohol 70% con ayuda de una pipeta.
Disolver el pellet con un volumen de 40 L de buffer EB (TRIS-HCl, pH 8).
Agregar 1 l de RNAsa (100g/ml) y dejar actuar por 10 minutos.
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B) Mtodo empleando kit comercial (High Pure Plasmid Isolation Kit)
Cultivar las bacterias (clonas transformantes) toda la noche a 37C en un tubo que
contenga 4 ml de cultivo con el antibitico de seleccin apropiada
(Kanamicina: 40 g/mL).
Centrifugar 1.5 ml a 6,000 g por 1 min en un tubo eppendorf y eliminar el sobrenadante.
Observar el pellet al fondo del tubo.
Concentrar las bacterias agregando a este mismo tubo eppendorf una vez mas 1.5 ml del
cultivo y volver a centrifugar a 6,000 g por 1 min.
Resuspender el pellet con 250 L de Buffer de resuspensin + RNAsa (Tubo Kit 1,
enfriado previamente en hielo) empleando primero la pipeta y luego el vortex.
Agregar 250 l del Buffer de Lisis (Tubo Kit 2, Temperatura ambiente). Mezclar
por inversin 5 veces, no vortexear. Incubar 5 minutos a temp. ambiente.
Se observar al finalizar los 5 minutos que se formara una solucin viscosa
transparente al momento de destapar el eppendorf.
Agregar 350 L del Binding buffer (Tubo Kit 3, enfriada previamente en hielo).
Incubar por 5 minutos en hielo. Se debe observar una solucin blanquecina.
Luego de la incubacin, centrifugar a 13,000 g por 15 min. Transferir el sobrenadante
transparente a un tubo eppendorf nuevo (emplear pipeta 100 l).
Agregar el contenido total de este eppendorf nuevo a la columna + tubo colector.
Centrifugar a 13,000 g por 1 min.
Remover el tubo colector de la columna y descartar su contenido. Reinsertar la columna
al tubo colector vaco y agregar 700 l de Washing Buffer (Tubo Kit 4, Temp. amb).
Centrifugar a 13,000 g por 1 min.
Remover el tubo colector de la columna y descartar su contenido. Reinsertar la columna
al tubo colector vaco y centrifugar al vaco a 13,000 g por 1 min.
Remover el tubo colector de la columna y descartar su contenido.
Insertar la columna a un tubo eppendorf nuevo y agregar al centro de la columna
un volumen de 40 L de buffer EB (TRIS-HCl, pH 8).
35
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7.2.- Mtodo de confirmacin Enzimas de restriccin.
Se usar el siguiente protocolo para cada una de los 3 plsmidos extrados.
Reactivos
Digestin enzimtica [ ] Inicial [ ] final Simple digestin Doble digestin
ADN plasmdico (Kit y LA) - - 10 L 10 L

Buffer NEB 2.1 10 x 1x 2 l 2 l
H2O PCR - - 7.5 l 6.5 l
NcoI 10 U/l 10 U ---- 1 l
XhoI 20 U/l 10 U 0.5 l 0.5 l
20 l 20 l
Digerir a 37C por 2 horas.

Posterior a la digestin enzimtica, realizar una electroforesis de agarosa al 1%.
Programar la fuente de poder a 95V y dejar correr hasta que el frente de corrida haya
migrado hasta el final.
Teir el gel de agarosa con Bromuro de Etidio por 20 min y observar con el
transiluminador UV para observar las bandas.
Reactivos de Lisis Alcalina
Solucin 1
25 mM Tris-HCl (pH 8.0)
10 mM EDTA (pH 8.0)
Solucin 2
0.2 N NaOH
1 % SDS
Solucin 3
5 M Acetato de Potasio 60.0 mL
cido Actico glacial 11.5 mL
H2O 28.5 mL
Fenol-Cloroformo-Alcohol isoamilico (25:24:1)

500 l 1 ml 5 ml
Fenol 250 l 500 l 2.5 ml
Cloroformo 240 l 480 l 2.4 ml
Alcohol isoamilico 10 l 20 l 0.1 ml
TE o EB + 20 g/ml RNAsa
TE o EB 1 mL
20 mg/mL RNAsa 1 L
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Prctica 8: Transformacin por shock trmico en clulas competentes

de expresin E.coli BL21 (DE3) pLysS. Preparacin de Geles de
Poliacrilamida Denaturante.
Jefe de Prctica: MSc(c) Sueline Luis
8.1. Transformacin de clulas E. coli BL21 (DE3) pLysS por shock trmico:
Introduccin:
La transformacin es un proceso por el cual las clulas captan DNA libre presente en el medio.
Este fenmeno ocurre de forma natural en muchas bacterias, pero la eficacia del proceso vara
enormemente de unas especies a otras. Para que la transformacin tenga lugar, la bacteria tiene
que encontrarse en estado de competencia, que ocurre en determinadas condiciones fisiolgicas;
en este estado, la bacteria presenta alteraciones en su pared y membrana celulares, que permiten
la entrada de cidos nucleicos en la clula.
En el laboratorio se ha conseguido poner en estado de competencia a bacterias que no lo
presentan de forma natural, como es el caso de E. coli. Estas tcnicas se basan en diversos
tratamientos qumicos o fsicos que producen microporos en la clula, lo que permite la
introduccin del DNA exgeno (transformacin) de modo bastante eficiente. Dicha
competencia se puede inducir con tratamientos qumicos utilizando compuestos como el cloruro
clcico. Hay que tener en cuenta sin embargo que tras estos tratamientos no todas las clulas del
cultivo se hacen competentes.
La transformacin en el laboratorio es una tcnica de enorme utilidad, que nos permite
introducir plsmidos en su forma circular o superenrollada en la bacteria.
Para detectar la transformacin, el DNA introducido llevar un marcador seleccionable en el
medio adecuado, que generalmente son genes de resistencia a antibiticos.
El mtodo de transformacin rutinario ms simple es el shock o choque trmico de clulas
competentes con cationes divalentes, dada la facilidad de realizacin del mismo y la no
necesidad de utilizar aparatos sofisticados, a diferencia de la electroporacin o la biobalstica.
Procedimiento:
Sacar los eppendorfs con clulas competentes de la congeladora -70.

Ponerlos en abundante hielo y dejar 10 min que descongelen.
Tomar 4 ul de la solucin de plsmido y mezclar con golpes suavemente.
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Dejar en hielo por 30min.

Incubar a 42C por 45 segundos.
Dejar en hielo por 2 min.
En cabina: Agregar 1ml de caldo LB o SOC e incubar a 37C en agitacin fuerte por 1
hora. (la centrifugacin?)
En cabina: Sembrar 50ul en placas con agar LB + kanamycin (40 g/ml) con una asa
de drigalsky (usar etanol para desinfectar el asa).
Incubar al menos 18 horas a 37C.
NOTA: Es recomendable agregar un control control negativo (sin plsmido), para verificar la
presencia de contaminantes.
8.2. Preparacin de Geles de Poliacrilamida Denaturante:
Introduccin
La Acrilamida es un monmero que en la presencia de radicales libres, que son usualmente

entregados por el persulfato de amonio y estabilizados por el TEMED (N,N,N,N-
tetrametiletilendiamina), se sucede una reaccin en la cual los monmeros de acrilamida son
polimerizados en cadenas largas. Cuando el agente bifuncional N,N-metilenbisacrilamida es
incluido en la reaccin de polimerizacin, las cadenas se entrecruzan (crosslinking) para formar
un gel, cuya porosidad es determinada por la longitud y el grado de entrecruzamiento. La
longitud de las cadenas est determinada por la concentracin de acrilamida en la reaccin de
polimerizacin (entre 3.5% y 20%): se incluye 1 molcula de agente entrecruzador (crosslinker)
por cada 29 monmeros de acrilamida.
Los geles de Poliacrilamida son ms molestos de preparar y correr que los geles de agarosa. Son
vertidos entre dos platos de vidrio que estn separados por espaciadores y sellados por una tapa
elctrica. En este arreglo, la mayora de la solucin de acrilamida esta sellada de la exposicin al
aire, de tal forma, que la inhibicin de la polimerizacin por el oxigeno esta confinada a una
capa estrecha en la parte superior del gel. La electroforesis en gel de Poliacrilamida usando
Dodecil sulfato de sodio (SDS-PAGE), permite tratar a las muestras de protenas como si
tuvieran una carga uniforme, de esa forma, la movilidad electrofortica depende,
principalmente, del tamao. Los pesos moleculares de las protenas pueden ser estimados si
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stas son sometidas a una electroforesis en presencia de algn detergente, como el SDS, y un
agente reductor de puentes disulfuro, como el -mercaptoethanol o el DTT. A esta tcnica se le
conoce como electroforesis denaturante.
Cuando a las protenas se les trata con SDS, el detergente rompe la estructura secundaria,
terciaria, y cuaternaria produciendo una cadena polipeptidica lineal cargada negativamente por
las molculas de SDS. La presencia del -mercaptoetanol o el DTT asiste en la denaturacin de
la protena reduciendo todos los puentes disulfuro. El detergente se une a las regiones
hidrofobicas de la cadena de protena denaturada a una taza constante de 1.4 g de SDS por
gramo de protena. Las molculas de detergente cargadas negativamente enmascaran la carga
nativa de la protena. La movilidad electrofortica de los complejos protena-SDS es
influenciada principalmente por el peso molecular, mientras ms grandes son las molculas ms
retardada es la movilidad causada por el tamizado de los polmeros del gel, y mientras ms
pequea es la molcula ms grande la movilidad. La electroforesis denaturante, se caracteriza
por 3 razones principales: (1) existen dos capas, una inferior llamada resolving y una superior
llamada stacking; (2) los buffers usados para preparar ambas capas son de diferente fuerza
inica y pH; y (3) el stacking tiene una menor concentracin de acrilamida, de tal forma, que
el tamao de los poros es ms grande. Estas tres caractersticas en condiciones experimentales
causan la formacin de bandas de la muestra altamente concentradas en el stacking y buena
resolucin de los componentes de la muestra en la parte inferior del gel.
Para esta prctica, nosotros prepararemos geles al 15%. Se emplear un gel separador
resolving con un 15 % de acrilamida y un gel acumulador stacking con un 5 % de
acrilamida. Los geles se preparan mezclando, en un vaso de precipitacin, los componentes
indicados en la tabla 1 (el persulfato y el TEMED inician la reaccin de polimerizacin, por lo
que se deben aadir en ltimo lugar) y rpidamente se coloca la mezcla entre los vidrios.
Procedimiento:
Montar el sandwich con dos placas de vidrio (uno tiene un rebaje) y los dos
separadores en vertical entre ellas y a ambos lados.
Introducirlo en el soporte formador de geles. Sujetar el conjunto.
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Agregar agua destilada en el espacio entre los vidrios, dejar por unos minutos y verificar
que no existen fugas de agua entre los vidrios, descartar el agua por inversin y secar con tiras
de papel whatman.
Primero se polimeriza el gel separador resolving con un 15 % de acrilamida (ver
tabla). Para ello se rellena, con la mezcla todava lquida, el espacio entre las dos placas hasta
unos 3 cm del borde superior del cristal corto. Aadir encima una pequea cantidad de agua
destilada (esto hace que la superficie del gel quede recta). Esperar a que polimerice el gel (entre
20 y 60 min, observar la mezcla sobrante en el vaso). Volcar para retirar el agua destilada. Secar
con un papel de filtro o whatman.
Posteriormente agregar gel acumulador o stacking y antes de que polimerice
introducir en la parte superior el peine, que formar en el gel acumulador los pocillos para
luego poder aplicar las muestras. Se guarda el gel en la cmara fra hasta el da de su uso.
TABLE 01: Solutions for Preparing Resolving Gels for Tris-glycine

SDS-Polyacrylamide Gel Electrophoresis
Component volumes (ml) per gel mold volume of
Solution components
5 ml 10 ml 15 ml 20 ml 25 ml 30 ml 40 ml 50 ml
6%
HO 2.6 5.3 7.9 10.6 13.2 15.9 21.2 26.5
30% acrylamide mix 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 8.0 10.0
1.5M Tris (pH 8.8) 1.3 2.5 3.8 5.0 6.3 7.5 10.0 12.5
10% SDS 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.4 0.5
10% ammonium persulfate 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.4 0.5
TEMED 0.004 0.008 0.012 0.016 0.02 0.024 0.032 0.04
8%
HO 2.3 4.6 6.9 9.3 11.5 13.9 18.5 23.2
30% acrylamide mix 1.3 2.7 4.0 5.3 6.7 8.0 10.7 13.3
1.5M Tris (pH 8.8) 1.3 2.5 3.8 5.0 6.3 7.5 10.0 12.5
10% SDS 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.4 0.5
TEMED 0.003 0.006 0.009 0.012 0.015 0.018 0.024 0.03
10%
HO 1.9 4.0 5.9 7.9 9.9 11.9 15.9 19.8
30% acrylamide mix 1.7 3.3 5.0 6.7 8.3 10.0 13.3 16.7
1.5M Tris (pH 8.8) 1.3 2.5 3.8 5.0 6.3 7.5 10.0 12.5
10% SDS 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.4 0.5
TEMED 0.002 0.004 0.006 0.008 0.01 0.012 0.016 0.02
12%
HO 1.6 3.3 4.9 6.6 8.2 9.9 13.2 16.5
30% acrylamide mix 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0 12.0 16.0 20.0
1.5M Tris (pH 8.8) 1.3 2.5 3.8 5.0 6.3 7.5 10.0 12.5
10% SDS 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.4 0.5
TEMED 0.002 0.004 0.006 0.008 0.01 0.012 0.016 0.02
15%
HO 1.1 2.3 3.4 4.6 5.7 6.9 9.2 11.5
30% acrylamide mix 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 20.0 25.0
1.5M Tris (pH 8.8) 1.3 2.5 3.8 5.0 6.3 7.5 10.0 12.5
10% SDS 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.4 0.5
TEMED 0.002 0.004 0.006 0.008 0.01 0.012 0.016 0.02
TABLE 02: Solutions for preparing 5% Stacking Gels for Tris-glycine
SDS-Polyacrylamide Gel Electrophoresis
Component volumes (ml) per gel mold volume of
Solution components
5 ml 10 ml 15 ml 20 ml 25 ml 30 ml 40 ml 50 ml
HO 0.68 1.4 2.1 2.7 3.4 4.1 5.5 6.8
30% acrylamide mix 0.17 0.33 0.5 0.67 0.83 1.0 1.3 1.7
1.5M Tris (pH 6.8) 0.13 0.25 0.38 0.5 0.63 0.75 1.0 1.25
10% SDS 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06 0.08 0.1
TEMED 0.001 0.002 0.003 0.004 0.005 0.006 0.008 0.01
Tables 01 and 02 are modified from Harlow and Lane (1988)
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Prctica 9: Expresin en mini escala de la enzima Pirazinamidasa de

Mycobacterium tuberculosis. Analisis de la induccin de expresin por
SDS-PAGE
Jefe de Prctica: MSc(c). Ricardo Antiparra
Las protenas recombinantes son producidas a partir de secuencias de ADN (las cuales codifican
para una enzima o una protena en particular) insertados en un determinado vector de expresin.
Los vectores son herramientas muy importantes en la manipulacin del ADN (Clonacin,
protenas recombinantes, mutagnesis dirigida etc), a menudo los vectores de expresin
producen una protena recombinante acompaada de un pequeo pptido, o incluso de una
pequea protena para facilitar su purificacin. La obtencin de una protena soluble y en una
forma biolgicamente activa sigue siendo un reto importante.
La mayora de sistemas de expresin procariota utilizan al operon lactosa (Operon lac), el cual
ha sido modificado genticamente, conservando su secuencia promotora, y el gen -
galactosidasa, por esta razn se suele utilizar IPTG como inductor artificial, ya que es capaz de
unirse al represor LacI, pero no es un sustrato para la -galactosidasa por lo que no puede ser
metabolizado por la bacteria. Adems, el IPTG es transportado eficientemente al interior de la
bacteria en ausencia de la permeasa, con lo que su entrada es independiente de la expresin del
gen lac Y.
Antes de iniciar la expresin de una protena recombinante, debemos tener en cuenta lo

siguiente: el husped en el que se expresar la protena, el vector de expresin y el sistema de
purificacin a usar. Para este ensayo de expresin a pequea escala (2 ml) emplearemos a la
clula husped E. coli BL21 (DE3), al vector pET28a-pncA recombinante, y como inductor de
expresin, el IPTG (Isopropil--D-1-tiogalactopiransido), un anlogo no hidrolizable de la
lactosa que dispara la transcripcin del opern lac.
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9.1. Expresin de la protena pncA (Pirazinamidasa) recombinante en 2 ml
1) Inocular una colonia de una cepa E. coli BL21 (DE3) recombinante en 1 ml de medio
LB + Kanamicina (40 g/ml). Colocarlo en un shaker a 220-250rpm a 37C por toda la
noche (16 h. aprox.).
2) En la maana siguiente, pipetear 200 ul de cada cultivo en una alcuota nueva de 2 ml
de LB + Kanamicina (40 g/ml). Colocar en un shaker a 220-250rpm a 37C por 2
horas.
3) Retirar 400 ul del cultivo y colocarlos en hielo hasta que se corra en un gel para
analizarlo. Estos sern los controles no inducidos.
4) Agregar IPTG a una concentracin final de 1 mM al resto del cultivo (1600 ul).
Colocar en un shaker a 220-250rpm a 37 C por 2 horas.
5) Tomar 400 ul del cultivo y colocarlo en hielo. Estas sern las muestras inducidas.
6) Centrifugar tanto la muestra no inducida e inducida por 5 min a 13,000 rpm.
7) Descartar el sobrenadante y agregar 20 ul de 2X sample buffer para cada tubo.
8) Calentar los tubos a 95C por 5 minutos.
9) Cargar 10 ul de muestras no inducidas junto a las muestras inducidas, y 4 ul del
marcador de peso molecular en un gel de poliacrilamida denaturante al 12% y se
proceder a la electroforesis en condiciones desnaturalizantes (SDS-PAGE) en un buffer
de corrida (Running Buffer 1X).
9.2. Coloracin con Azul de Coomassie 0.25% (Coomassie Blue)
Retirar el gel de la corrida electrofortica y colocarlo en un recipiente plstico para

microondas que contenga el colorante Azul de Coomassie. El gel debe ser cubierto por
el colorante. Existen 2 maneras de teir el gel:
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A. Se puede dejar el gel de poliacrilamida coloreando con el azul de Coomassie toda la

noche (overnight) en agitacin suave pero constante.
B. Se puede llevar el recipiente plstico al horno microondas y programar mxima potencia
por 45 seg. (3 veces), con sus respectivos intervalos de enfriamientos. NO DESTAPAR,
los vapores pueden ser peligrosos.
9.3. Revelado de gel
1) Cuando concluya la fase de coloracin y este frio el recipiente plstico usado en la

coloracin, regresar el colorante en su frasco de almacenamiento.
2) Agregar agua destilada al recipiente plstico y enjuagar el gel.
3) Agregar la solucin decolorante y cubrir todo el gel dentro del recipiente.
4) Llevar al horno microondas y programar mxima potencia por 45 seg. (3 veces), con sus
respectivos intervalos de enfriamientos. NO DESTAPAR, los vapores pueden ser
peligrosos.
5) Llevar todo el recipiente a la cabina de extraccin de vapores, eliminar la solucin
decolorante y enjuagar el gel con agua de cao.
6) Retirar y guardar el gel con agua. Tomar una fotografa.
Reactivos
Solucin colorante
0.25 g de comasie R250 en 90 mL Metanol:H20 (1:1 v/v) y 10 mL de cido actico glacial.
Solucin decolorante
Solucin que contiene 30% de metanol, 10% de cido actico glacial y 60% de H 20.
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Prctica 10: Purificacin de la enzima Pirazinamidasa por

cromatografa de afinidad. Anlisis del mtodo de purificacin por
SDS-PAGE.
Jefe de Prctica: MSc(c). Ruddy Liendo
La purificacin es el siguiente paso luego de la expresin de las protenas recombinantes que

tiene la finalidad de obtener una muestra que contenga la protena de inters libre del resto de
componentes celulares. Se han desarrollado diferentes mtodos de purificacin entre los que se
encuentran la cromatografa de filtracin en gel (exclusin molecular), la cromatografa de
intercambio inico o la cromatografa de afinidad, estas tcnicas de purificacin aprovechan
ciertas caractersticas de las protenas como el tamao o la carga elctrica; especficamente, la
cromatografa de afinidad se basa en las interacciones reversibles que se dan entre una protena
y un ligando especfico, el cual se encuentra acoplado a la matriz cromatogrfica. Dentro de las
interacciones tpicas utilizadas en este tipo de cromatografa se encuentra la gran afinidad que se
da entre ciertos aminocidos, como la histidina, y ciertos iones metlicos, como el niquel; la
protena a ser purificada debe, por lo tanto, contener en su estructura una etiqueta de afinidad
compuesta por una serie de residuos de histidina (denominada His tag). La obtencin de
protenas que contengan esta etiqueta de afinidad se da mediante el uso de ciertos vectores,
como los plsmidos pET-28a, que insertan esta etiqueta hacia el extremo N o C terminal de la
protena. En la prctica se emplear la cromatografa de afinidad para purificar a la
pirazinamidasa recombinante empleando columnas de nquel pre-empacadas.
10.1. Purificacin por cromatografa de afinidad
Lavar la columna de HisTrap conservada en 20% alcohol con al menos 10ml de agua
milliQ.
Equilibrar la columna agregando 6 ml de binding buffer (se puede usar un volumen que
sea de 5-10 veces el volumen de la columna).
De la muestra proporcionada separar 15 uL en un tubo de 1.5 mL (extracto crudo),
luego pasar 3 ml de muestra por la columna (NO sobrepasar la capacidad de la columna,
que es de 2 mg protena/ml de resina).
Pasar por la columna 8 ml binding buffer.
Pasar por la columna 8 ml de fosfato sdico 20 mM (pH 7.4), NaCl 0.5 M, imidazol 40
mM y colectar 2 fracciones de 4 ml.
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mM y colectar 2 fracciones de 4 ml.
mM y colectar 2 fracciones de 2 ml
Lavar la columna con 10 ml de agua MQ.
Lavar la columna con 10 ml de 20% etanol.
Sellar la columna para evitar la deshidratacin.
Guardar la columna a 4 a 8 C.
Soluciones a usar:
8x Buffer fosfato pH 7.4 (160mM buffer fosfato, 4 M NaCl; pH 7.4)
8x Buffer fosfato bsico pH 7.4 8x Buffer fosfato cido

(160mM buffer fosfato, 4 M NaCl) (160mM buffer fosfato, 4 M NaCl)
250ml 1 Litro 100ml
Na2HPO4 5.68 g 22.72 g NaH2PO4.H2O 2.20 g
NaCl 58.44 g 233.76 g NaCl 23.37 g
Medir el pH del 8x buffer fosfato bsico, si el pH es mayor de 7.4 bajar el pH con la solucin
cida.
2 M Imidazol
Pesar 13.62 g de imidazol y disolver en 60 ml de agua destilada, ajustar el pH con HCl
hasta pH 7.4. Enrasar a 100ml con agua destilada.
20mM Buffer fosfato, 0.5M NaCl con diferentes concentraciones de imidazol
Volumen final
50ml 250ml
Concentracin de 8x fosfato 2 M imidazol 8x fosfato 2 M imidazol
imidazol en fosfato pH 7.4 pH 7.4 pH 7.4 pH 7.4
20 (binding buffer) 6.25 0.50 31.25 2.50
40 6.25 1.00 31.25 5.00
60 6.25 1.50 31.25 7.50
500 6.25 12.50 31.25 62.50
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2X Sample buffer
100 mM TRIS-HCl (pH 6.5), 4% SDS, 0.2% Bromophenol blue, 20% Glicerol
10 ml
1 M TRIS-Hcl (pH 6.5) 1 ml
10 % SDS 4 ml
2 % Bromophenol blue 1 ml
80% Glicerol 2.5 ml
*Agregar DTT (dithiothreitol) a una concentracin final de 200 mM en el buffer 2X antes de
usar este buffer.
10.2. Electroforesis en Geles de Poliacrilamida Denaturante SDS (SDS-PAGE)
Elegir una de las 2 fracciones colectadas con el buffer fosfato sdico 20 mM (pH 7.4),
NaCl 0.5 M, imidazol 40 mM, separar 15 uL de dicha fraccin en un tubo de 1.5 mL.
De las 2 fracciones colectadas con el buffer fosfato sdico 20 mM (pH 7.4), NaCl 0.5
M, imidazol 60 mM tomar 15 uL de cada una colocndonos en 2 tubos de 1.5 mL.
Elegir una de las 2 fracciones colectadas con el buffer fosfato sdico 20 mM (pH 7.4),
NaCl 0.5 M, imidazol 500 mM, separar 15 uL de dicha fraccin en un tubo de 1.5 mL.
A los 15 uL del extracto crudo y de las fracciones elegidas agregar 15 uL de Sample
Buffer 2X, calentar las muestras durante 5 minutos a 95 C.
Cargar 12 uL de las muestras preparadas en los geles de poliacrilamida y 4 ul de
marcador de peso molecular. Correr el stacking gel a 10-15 mA y el resolving gel a 20-
25 mA. La tincin de los geles se realizar con el colorante azul de coomasie.
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Prctica 11: Ensayo de Wayne para verificacin de la actividad

enzimtica de la Pirazinamidasa. Cuantificacin proteica por mtodo
de Bradford
Jefe de Prctica: MSc(c) Roberto Alcntara
Introduccin
La Pirazinamidasa (PZAsa) es una enzima, es decir, una protena con funcin cataltica, que en
Mycobacterium tuberculosis convierte la pro-droga Pirazinamida (PZA) a su forma activa, el
cido Pirazinoico (POA-), mediante una reaccin de hidrlisis (Figura 9.1). Por ello, resulta
importante que la PZAsa presente actividad enzimtica y se encuentre funcional para lograr el
efecto de la PZA como droga en el tratamiento farmacolgico contra la Tuberculosis.
Hidrlisis de la PZA a POA por accin de la PZAsa (PncA)
PZA: Pirazinamida POA: cido pirazinoico
Figura: Mecanismo de accin de la PZA y su hidrlisis por la PZAsa
La verificacin de la actividad enzimtica de la PZAsa, denominada tambin actividad

pirazinamidasa, es posible mediante el ensayo de Wayne, el cual es un mtodo colorimtrico
cualitativo que permite detectar la presencia de POA- y visualizarlo de color rosado (Figura 9.2).
Tal coloracin es producto de la reaccin del POA- con el Sulfato de Amonio Ferroso. Este
mtodo constituye una forma indirecta para determinar susceptibilidad a PZA en cepas de M.
tuberculosis ya que estudios previos han concluido que existe una fuerte correlacin entre la
prdida de actividad pirazinamidasa y la resistencia a PZA, al encontrar que cepas resistentes a
PZA carecen de actividad PZAsa.
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Ensayo de Wayne en cultivos con Ensayo de Wayne en eluidos con PZAsa

cepas de Mycobacterium tuberculosis recombinante purificada
Figura: Ensayo de Wayne
Una vez comprobada la actividad PZAsa, que a su vez corrobora la presencia de protena, se
hace necesario estimar la cantidad de enzima. Una forma de cuantificarla es mediante el mtodo
de Bradford, que permite determinar la concentracin de protenas.
El mtodo de Bradford est basado en el cambio de color que sufre el colorante Coomassie
brilliant blue G-250 en respuesta a diferentes concentraciones de protenas. Este compuesto
interacciona con aminocidos bsicos (especialmente arginina) y aromticos. La unin del
colorante con las protenas provoca un cambio en el mximo de absorcin del colorante
desde 465 a 595 nm. Por lo tanto, el Azul Brillante de Coomasie G-250 puede presentarse
en dos formas con colores diferentes: rojo y azul (Figura 9.3). La forma roja se torna azul
cuando el colorante se une a la protena. Experimentalmente se mide la diferencia de
Absorbancias entre 465 y 595.
Figura: Cuantificacin de Pirazinamidasa mediante el mtodo de Bradford
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En la presente prctica, se verificar la actividad PZAsa mediante el Ensayo de Wayne y se

determinar cualitativamente, con el mtodo de Bradford, la concentracin de enzima presente
en los eluidos obtenidos en el proceso de purificacin de la PZasa recombinante.
11.1 Determinacin de la actividad enzimtica de la pirazinamidasa (Prueba de Wayne)
Colocar las fracciones obtenidas en orden ascendente segn la concentracin de buffer

empleado en la purificacin: 20mM, 40 mM, 60 mM y 500 mM. Adems de ello, se
dispondr de un concentrado de PZAsa que se emplear como Control Positivo.
Preparar el siguiente mix:
Reactivo 1 Reaccin (L) 15 Reacciones (L)

10 mM Buffer Citrato pH 5.5 50.0 750.0
121 mM PZA 16.5 247.5
Agua MQ 23.5 352.5
Volumen total 90.0 1350.0
Segn se muestra en la imagen inferior, alicuotar 90 L del mix en cada pozo, de

acuerdo al nmero de fracciones obtenidas. Adicionalmente, se considerar un pozo
para el Control Negativo C(-) y otro para el control positivo C(+).
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Agregar 10 L de cada fraccin a los pozos en donde se alicuot los 90 L del mix para
las fracciones. En el pozo correspondiente al C(-), alicuotar 10 L de Agua MQ; en el
pozo correspondiente al C(+), alicuotar 10 L del concentrado de PZAsa.
Incubar por 10 minutos a temperatura ambiente.
Agregar 10L de sulfato de amonio ferroso al 20% (p/v) a cada uno de los pozos
anteriores. Observar el color.
Interpretacin: La aparicin de un color rojo-naranja indica la presencia de POA obtenido

por la hidrlisis enzimtica de PZA por accin de la PZasa, comprobndose de esta forma la
actividad enzimtica de la pirazinamidasa recombinante clonada y expresada en el presente
curso.
11.2 Determinacin cualitativa de la concentracin de Pirazinamidasa: Mtodo de

Bradford
1) Hacer una dilucin 1:5 de cada una de las fracciones obtenidas (conservar el orden
ascendente segn la concentracin de buffer empleado en la purificacin: 20mM, 40
mM, 60 mM y 500 mM):
Volumen de Agua MQ Volumen total de la

Dilucin
muestra (L) (L) solucin (L)
1:5 20 80 100
2) Diluir el reactivo 1/5 (1ml de reactivo assay Protein + 4ml de Agua MQ).
3) Segn se muestra en la imagen a continuacin, en toda una fila, alicuotar 20 L de cada

una de las fracciones; en la siguiente fila, agregar 20 L de las diluciones 1:5
correspondientes a cada una de las fracciones. Adicionalmente, se considerar un pozo
para el Control Negativo C(-) y otro para el control positivo C(+). En el pozo
correspondiente al C(-), alicuotar 20 L de Agua MQ; en el pozo correspondiente al
C(+), alicuotar 20 L del concentrado de PZAsa.
50
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4) Agregar 200 L del reactivo diluido en los pozos de ambas filas donde se alicuot las
fracciones, sus diluciones y los controles negativo y positivo.
5) Dejar reposar a temperatura ambiente por lo menos 5 minutos. Observar el color.
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ANEXO 1: Mapa vector pET28a
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ANEXO 2: Cuadro Resumen Clulas y Vectores ms usados en clonacin y

expresin de genes en E.coli
Clulas de
Utilizada principalmente para
Escherichia coli
Rpida transformacin y clonacin. Puede almacenar y mantener
NovaBlue
plsmidos. Es resistente a Tetraciclina.
Expresar protenas mediante la adicin de IPTG. Es parte de un
BL21(DE3)pLysS
sistema con vector pET28a
Mejorar la expresin de protenas de clulas eucariotas
Rosetta Usado para expresar protenas que tienen codn diferente al de
E. coli
Transformacin con alta eficiencia. No usado para expresin
pero s para mantenimiento de plsmidos. No tiene resistencia a
Dh5 alpha
ningn antibitico. Permite realizar el test de alfa
complementariedad.
Vectores de
Caractersticas
Escherichia coli
pET28a Confiere resistencia a kanamicina. No tiene gen lacZ
pUC18 Plsmido pequeo, posee gen lacZ y es resistencia a ampicilina.
Plsmido pequeo, posee gen lacZ y es resistente a ampicilina.
pUC19 Se diferencia de pUC18 por la direccionalidad del sitio de
clonacin mltiple.
53

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I.- Mtodos de extraccin de ADN

1) Extraccin de ADN mediante el mtodo de Digestin con Proteinasa K

Centrifugar el cultivo bacteriano a 3,500 rpm por 5 min.

Agregar 100 ul de NaCl 5M.

2) Extraccin de ADN mediante el mtodo de hervido con Chelex

3) Extraccin de ADN usando el Kit de QIAGEN (QIAamp DNA miniKit)

Centrifugar el cultivo bacteriano a 3,500 rpm por 5 min.

II.- Preparacin de gel de 0.8% agarosa

1. Pesar 0.8 gr de agarosa y transferirlo a 100 ml de 1X TAE en un matraz.

III.- Electroforesis de ADN en 0.8% agarosa

Preparar las muestras de ADN (obtenidas previamente con los 3 mtodos de

Sin Dilucin Tomar 20 ul de muestra de ADN.

Agregar 4 ul de 6X buffer de muestra (sample buffer o loading buffer) a cada uno de

IV.- Tincin del gel de agarosa

Una vez se ha finalizado la electroforesis, desconectar la fuente antes de manipular

V.- Medicin del rendimiento (cantidad en ng) y concentracin de ADN (ng/ul)

[ADN] = 60 ng/6 ul x 5 = 50 ng/ul

VI.- Medicin del rendimiento (cantidad en ng) y concentracin de ADN (ng/ul)

La concentracin del ADN puede tambin ser calculado a travs de la obtencin de su

Al inicio, limpiar el cabezal del nanodrop con un papel suave especial.

Prctica 2: Anlisis de bases de datos de secuencias y

Jefe de prctica: MSc(c). Katherine Vallejos

2.1. Bsqueda de secuencias de nucletidos en la Base de Datos del NCBI

o Nosotros deseamos obtener la secuencia de nucletidos del gen pnca que

o Haga clic en el acceso a la secuencia pncA de Mycobacterium tuberculosis

informacin contenida en este nuevo reporte. Haga clic en la secuencia codante

o Para descargar la secuencia, ubique Send en la parte superior, elija File en

herramienta online para obtener la reversa complementaria de secuencias se

Un ejemplo de secuencia de ADN que obtendremos es el siguiente reverso

2.2 Bsqueda de secuencias de aminocidos en la base de datos del NCBI,

Ingresar a la base de datos del NCBI y explore la base en bsqueda de la

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Usted debera obtener una ventana as:

Identifique la diferencia entre las estrellas amarillas y grises al costado de cada

Haga clic en el primer nmero de acceso Serum Albumin (mus musculus) e

Vaya a Sequences y en Tools modifique la herramienta a Compute pI/MW.

2.3 Anlisis de herramientas proteomicas en el portal ExPASy: identificacin

Como habr observado, la herramienta Compute pI/MW se encuentra dentro

De acuerdo a la base de datos UniProtKB, sabemos que la secuencia albumina

Ingrese a SignalP 4.1 (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)

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