Evolución cromosómica en Lophyohylini (Amphibia,

Anura, Hylinae)
Pablo Suárez , Conceptualización , Análisis
formal , Investigación , Metodología , Supervisión , Visualización , Escritura - borrador
original , Escritura - revisión y edición , # 1 Juan M. Ferro , Conceptualización , Análisis
formal , Investigación , Metodología , Supervisión , Visualización , Escritura - original
borrador , Redacción - revisión y edición , # 2, * Cleusa Y.
Nagamachi , Conceptualización , Administración de proyectos , Supervisión , Redacción - revisión
y edición , 3 Dario E. Cardozo , Conceptualización , Análisis
formal , Investigación , Metodología , Redacción - revisión y edición , 2 Ailin Blasco-
Zúñiga , Investigación , Redacción - revisión y edición ,  Jéssica B. Silva , Redacción - revisión y
4 

edición , 3 Euvaldo Marciano-JR ,Investigación , Metodología , Redacción - revisión y

edición , 5, 6 Marco A. Costa , Redacción - revisión y edición , 5 Victor GD Orrico , Redacción -
revisión y edición , 5 Mirco Solé , Redacción - revisión y edición , 5 Igor J. Roberto , Redacción -
revisión y edición , 7 Miryan Rivera , Redacción - revisión y edición , 4 John E.
Wiley , Investigación , Redacción - revisión y edición , 8 Julián
Faivovich , Conceptualización , Adquisición de fondos , Administración de
proyectos , Supervisión , Redacción - revisión y edición , 9, 10 Diego
Baldo , Conceptualización , Análisis formal , Adquisición de
fondos , Investigación , Metodología , Administración de proyectos , Supervisión , Redacción -
borrador original , Redacción - revisión y edición , 2, ‡ * y Julio C.
Pieczarka, Conceptualización , Adquisición de fondos , Administración de
proyectos , Supervisión , Redacción - revisión y edición 3, ‡

Resumen

La tribu hyline Lophyohylini incluye 87 especies de ranas arbóreas, de las cuales se han estudiado
aspectos citogenéticos en menos del 20% de ellas. Para evaluar la evolución de algunos de sus
caracteres cromosómicos (posición NOR, bandas C y bandas DAPI / CMA 3 ), estudiamos los
cariotipos de 21 lophyohylines, 16 de ellos por primera vez, y los analizamos en una filogenética.
contexto. La mayoría de las especies mostraron cariotipos similares con respecto al número de
cromosomas (2n = 24) y la morfología (FN = 48), a excepción de Phyllodytes
edelmoi y Osteocephalus buckleyi con 2n = 22 (FN = 44) y 2n = 28 (FN = 50), respectivamente. La
ubicación de NOR fue variable entre las especies y proporcionó información filogenética valiosa.
Este marcador se ubicó en el par 11 en todas las especies deTrachycephalus , Itapotihyla
langsdorffii y Nyctimantis arapapa , que representan la condición plesiomórfica de Lophyohylini.
Además, otros estados apomórficos se recuperaron para los clados que
comprenden N . rugiceps y N . siemersi (NOR en el par 5) y Dryaderces
pearsoni , Osteocephalus y Osteopilus (NOR en el par 9). Las filoditas presentaron variación para la
posición de los NOR; estaban en el par 2 en p . edelmoi , par 7 en P . melanomystax , y par 8
en P. gyrinaethes y P . praeceptor . Se observaron polimorfismos en tamaño, el número y la
actividad de este marcador para N . siemersi , Osteocephalus fuscifacies y algunas especies
de Trachycephalus . Sorprendentemente, en N . Se detectaron NOR de siemersi en un solo
cromosoma en las dos muestras estudiadas por esta técnica, lo que plantea la cuestión de cómo se
mantiene este complejo polimorfismo. Secuencias teloméricas intersticiales se encontraron
en P . edelmoi , P . melanomystax y Osteocephalus buckleyi, y su presencia parece no estar
relacionada con los eventos de reorganización cromosómica. Finalmente, algunas especies
mostraron reordenamientos espontáneos, posiblemente como consecuencia de un fenómeno
poco común en la citogenética de anuros: la presencia de sitios frágiles o constricciones
secundarias no asociadas con NOR. Proponemos que esta característica rara hubiera jugado un
papel importante en la evolución de este grupo de ranas. A partir de la evidencia obtenida en este
y en estudios anteriores, concluimos que Lophyohylini presenta una evolución cromosómica
compleja.

Introducción

Las ranas arbóreas de la subfamilia Hylinae son componentes esenciales de la diversidad de

anuros neotropicales, que actualmente comprenden 724 especies [ 1 ], organizadas en siete
tribus [ 2 ]: Cophomantini, Dendropsophini, Hylini, Lophyohylini, Pseudini, Scinaxini y
Sphaenorhynchini. Lophyohylini consta de 87 especies que están ampliamente distribuidas
en América Central y del Sur [ 1 , 3 ]. La monofilia de esta tribu está bien respaldada,
principalmente por caracteres moleculares [ 3 - 11 ]. Blotto y col. [ 3 ] recientemente
realizó el análisis filogenético más inclusivo para Lophyohylini y recuperó tres clados
principales: (1) Uno temprano divergente compuesto por Itapotihyla yFitotriadas ; (2) Un
clado que incluye Trachycephalus , estrechamente relacionado
con Corythomantis y Nyctimantis (redefinido por ellos para incluir todas las especies
anteriormente en Aparasphenodon , Argenteohyla y una especie de Corythomantis ), y (3)
Un clado compuesto de Tepuihyla como taxón hermano de Dryaderces y Osteocefalia ,
más Osteopilus y Phyllodytes . Aunque la monofilia de todos los géneros reconocidos
actualmente en Lophiohylini está bien respaldada por estudios previos, no es el caso de sus
principales clados que todavía tienen poco apoyo.
Varias contribuciones han estudiado la evolución cromosómica en diferentes clados de
Hylinae (p. Ej., [ 12 - 17 ]). Más recientemente, Schmid et al. [ 18 ] resumió la mayoría de
la información citogenética conocida para Hylidae, contribuyendo aún más con nuevos
cariotipos para 14 especies de Hylinae (2 Cophomantini, 2 Hylini, 2 Scinaxini y 8
Dendropsophini).
La información cromosómica disponible para Lophyohylini es muy escasa y está
restringida a solo el 19% de los taxones incluidos, lo que corresponde a 16 especies de 7
géneros [ 19 - 22 ]. Todas las especies estudiadas tienen cariotipos diploides, siendo el
número haploide más extendido n = 12 [ 22 ], propuesto como una sinapomorfía de Hylinae
[ 4 , 17 ].
Entre los Lophyohylini, los cariotipos de Osteopilus y Phyllodytes son distintivos con
respecto al número haploide y la morfología de los cromosomas. Los reordenamientos de
fusión y fisión, que implican el cariotipo plesiomórfico, se propusieron como posibles
mecanismos para explicar la variabilidad descrita en la tribu [ 19 , 22 ]. En Os . wilderi (n =
14) y Os . ocellatus (n = 17), Cole [ 23 ] y Anderson [ 19] informaron incrementos en el
número de cromosomas, lo que resultó en la aparición de dos y diez pares de cromosomas
telocéntricos, respectivamente. Por otra parte, se observó una reducción en el número de
cromosomas en phyllodytes edelmoi y P . luteolo (n = 11, [ 22 ]). Curiosamente, en las
especies anteriores, Gruber et al. [ 22 ] informaron secuencias teloméricas intersticiales o
ITS en los pares 1 y 2. Otras características notables informadas en Lophyohylini son la
presencia de sitios frágiles o constricciones secundarias intersticiales que no están
asociadas con NOR en Osteocephalus [ 19 ] y heteromorfismos conspicuos de tamaño
NOR en varias especies de los
géneros Corythomantis, Itapotihyla , Nyctimantis , Phyllodytes y Trachycephalus [ 21 , 22 ]
.
El objetivo principal de este estudio fue aumentar el conocimiento sobre la evolución
cromosómica de los híbridos, centrándose principalmente en Lophyohylini. Para esto,
estudiamos diferentes aspectos de los caracteres cromosómicos, incluido el número y la
morfología de los cromosomas, la tinción de bandas diferenciales (bandas C, Ag-NOR,
DAPI y fluorocromos CMA 3 ) y el mapeo de secuencias repetitivas de ADN ribosómico y
telomérico mediante hibridaciones fluorescentes in situ. Analizamos los cariotipos de 21
especies de Lophyohylini, 16 por primera vez. Los resultados fueron interpretados y
discutidos en base a la hipótesis filogenética más reciente e inclusiva para esta tribu [ 3 ].
Materiales y métodos
Se analizaron cariotipos de 50 especímenes de 21 especies de Lophyohylini pertenecientes
a los
géneros Dryaderces ( D . Pearsoni ), Itapotihyla ( I . Langsdorffii ), Nyctimantis ( N . Arap
apa , N . Rugiceps ,
y N . Siemersi ), Osteocephalus ( O . Buckleyi , O . fuscifacies , O . leprieurii , O . planicep
s, O . oophagus ,
y O . taurinus ), Osteopilus ( Os . septentrionalis y Os . vastus ), phyllodytes ( P . edelmoi , 
P . gyrinaethes , P . praeceptor ,
y P . melanomystax ), Trachycephalus ( T . dibernardoi , T . helioi , T .jordani ,
y T . tifonio ). La recolección, la eutanasia y la preservación de especímenes se llevaron a
cabo con la aprobación del Comité Ético en Uso Animal (CEUA - números de permiso
002/12 y 014/15 UESC, Ilhéus, BA, Brasil) y las siguientes instituciones: Argentina,
Administración de Parques Nacionales (APN, PD-187/02); Ministerio de Ecología y
Recursos Naturales Renovables (MEyRNR, 048/2013, 072/2014, 061/2015, 073/2016,
035/2017, 047/2018 y 005/2019), Programa de Recursos Naturales y Medio Ambiente
(PRNyMA, 01 / 2016); Brasil, Instituto Chico Mendes de Conservación de la Biodiversidad
(ICMBio, Sistema de Autorización e Información en Biodiversidade SISBIO, 12920-3).
Ecuador, Ministerio del Ambiente Ecuador 011-2018-IC-FAU-DNB / MA.
Se estudian los cariotipos de 16 especies aquí por primera vez ( pearsoni
Dryaderces , Nyctimantis arapapa , N . Rugiceps , Osteocephalus
buckleyi , O . Fuscifacies , O . Oophagus , O . Planiceps , O . Leprieurii , O . Taurinus , Os
teopilus vastus , phyllodytes gyrinaethes , P . melanomystax , P . praeceptor ,Helioi
Trachycephalus , T . dibernardoi , y T . jordani ). Los datos de localidad de cada muestra y
las técnicas citogenéticas empleadas se indican enFigura 1 y tabla 1, respectivamente. Se
proporciona información adicional para cada muestra en el archivo S1 . Para O . taurinus ,
seguimos la hipótesis filogenética de Jungfer et al. [ 11 ], considerando las muestras
analizadas en este estudio como O . taurinus sensu stricto , y los estudiados previamente a
partir de la Guayana francesa por Anderson [ 19 ] como O . especie candidata taurinus 5
[ 11 ]. Además, porque Schmid et al. [ 18] No indican el lugar de recolección de la muestra
de Venezuela estudiado por ellos, no hemos podido determinar la situación taxonómica
exacta de esa muestra, ya que se producen tres especies candidatas filogenéticamente
relacionados con O . taurinus en este país ( O . taurinus especies candidatas 2, 3 y 5,
[ 11 ]).

Figura 1
Mapa de América del Sur que muestra las localidades de recolección de las especies
encuestadas en el presente estudio.
Santa Fe (SF), Corrientes (CO), Misiones (MI), Bahía (BA), Maceió (MA), Pernambuco (PE), Pará
(PA), Morona Santiago (MS), Pastaza (PS), Pichincha (PI ) Para obtener información adicional del
comprobante, consulte el archivo S1 . El mapa fue creado usando SimpleMappr
( https://www.simplemappr.net ), una herramienta en línea para producir mapas de puntos con
calidad de publicación con licencia bajo CC0 1.0 (Dedicación de dominio público).

Tabla 1

Las preparaciones de cromosomas mitóticos se obtuvieron de la médula ósea y el epitelio

intestinal [ 24 ] y se tiñeron con solución de Giemsa tamponada al 5% o se sometieron a
métodos de tinción diferencial. Realizamos tinción con plata para detectar la ubicación de
las regiones organizadoras nucleolares activas o Ag-NORs [ 25 ] y bandas C para
evidenciar heterocromatina constitutiva [ 26 ]. La hibridación fluorescente in situ (FISH) se
realizó en preparaciones mitóticas siguiendo a Pinkel et al. [ 27] protocolo: se detectaron
sondas de ADNr 18S marcadas con biotina (BioNick DNA Labeling System, Invitrogen)
con avidina-Cy3 o avidina-FITC, y se revelaron regiones teloméricas utilizando sondas
marcadas con digoxigenina de telómero totalmente humano (TTAGGG) n (Oncor P4097-
DG5), siguiendo el protocolo del fabricante y detectado con anti-dig-FICT (o anti-dig-
Cy3). Los dos fluorocromos específicos de base DAPI (4 ', 6-diamino-2-fenilindol) y
CMA 3 (cromomicina A3) se usaron después de Schweizer y Ambros [ 28 ] después de
preparaciones desnaturalizadas con el procedimiento FISH siguiendo las modificaciones de
Barros e Silva y Guerra [ 29 ] Cromosomas de Os . septentrionalis y Os . vastose
obtuvieron de células de linfocitos cultivadas que fueron tratadas con BrdU después de
Wiley et al. [ 30 ] y Wiley y Little [ 31 ]. Utilizamos la terminología propuesta por White
[ 32 ], considerando n como el número de cromosomas gametoso o haploide, 2n como el
número de cromosomas somáticos y FN como el número fundamental (es decir, el número
total de brazos de cromosomas por célula mitótica). Debido a que todas las especies
cariotipadas en Lophyohylini y casi todos los Hylidae son diploides, nos referimos al
número de gametos (n) y al número básico (x) como iguales.
La longitud relativa de los cromosomas mitóticos y su índice centromérico (IC) se
obtuvieron utilizando el software Micromeasure 3.3 [ 33 ], que se denomina brazos
cromosómicos cortos y largos como p y q, respectivamente. La morfología cromosómica se
clasificó como metacéntrica, submetacéntrica, subtelocéntrica y telocéntrica, según lo
sugerido por Green y Sessions [ 34 ].
Optimizamos el número de cromosomas haploides y la posición NOR entre las lofiohilinas
(ver la Tabla S1 para información de cromosomas en Lophyohylini) sobre la hipótesis
filogenética de Blotto et al. [ 3 ], siguiendo las consideraciones expuestas por Ferro et
al. [ 17 ] Consideramos los estados de caracteres n = 11, 12, 14 y 17; y NOR en los pares 2,
5, 7, 9, 11 y 17. Las optimizaciones se realizaron con TNT v1.1 [ 35 ], considerando los
estados de ambos caracteres como transformaciones no ordenadas.
Resultados

La mayoría de las especies mostraron cariotipos con 2n = 24, a excepción de Phyllodytes

edelmoi y Osteocephalus buckleyi que tenían 2n = 22 y 28, respectivamente (Figura 2) La
morfología de los cromosomas de cada especie se detalla en la Tabla S2 . En general, los cariotipos
tenían un solo par de homólogos con sitios NOR, en la mayoría de los casos asociados con
constricciones secundarias, siempre manchando CMA 3 + (DAPI - ) y mostrando señales de
hibridación brillantes con la sonda 18S. En todas las especies estudiadas, la heterocromatina era
notablemente escasa, y las bandas C se asociaron con los sitios NOR o tenían una distribución
centromérica. En la última situación, casi todas las especies mostraron marcas centroméricas
positivas para el fluorocromo CMA 3 ( Fig . S1 ). Consulte la tabla S1 para ver un resumen de la
información citogenética de Lophyohylini.
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Figura 2
Giemsa teñió los cariotipos de filoditas y osteocefalia .
A. Phyllodytes
edelmoi . B. P . gyrinaethes . C. P . praeceptor . D. P . melanomystax . E. Fuscifacies de
osteocefalia . F. O . Taurinus . G. O . oophagus . H. O . leprieurii . I. O . Buckleyi . J. O . planiceps 
. Los cuadros muestran cromosomas con los NOR después de la tinción con plata (I ) y con FISH
utilizando una sonda de ADN 18S ( II ).
La reconstrucción del estado de los caracteres ancestrales de ambos caracteres, el número
haploide y los NOR, en la hipótesis filogenética de Blotto et al. [ 3 ] se muestran enFig.
3y S2 Fig . El número de cromosomas haploides de n = 12 se recuperó como el estado
plesiomórfico de Lophyohylini y n = 14 es una autapomorfia de Osteopilus
wilderi . Además, un NOR en el par 11 es plesiomórfico para la tribu, mientras que los
NOR en los pares 8 y 9 optimizados como sinapomorfias de un subclade de Phyllodytes , y
el clado que incluye Osteopilus , Phyllodytes , Tepuihyla , Dryaderces y Osteocephalus ,
respectivamente. Otras transformaciones para ambos personajes se analizan a continuación.
Fig. 3

Reconstrucción de estado de carácter ancestral de la posición de NOR (izquierda) y el número

haploide (derecha) en Lophyohylini en un árbol condensado a partir de la hipótesis filogenética
de Blotto et al. [ 3 ]

Para las optimizaciones completas, incluidos todos los taxones, consulte S2 Fig .

Filoditas
Phyllodytes gyrinaethes , P . melanomystax , y P . praeceptor tenido cariotipos con 2n = 24
(FN = 48), mientras que P . edelmoi tenía 2n = 22 (FN = 44) (Figura 2A – 2D) El NOR
sitios estaban localizados distalmente en pares 2q en P . edelmoi (Fig. 2A), 8q
en P . gyrinaethes y P . praeceptor (Fig. 2B y 2C), Y 7q en P . melanomystax (Fig 2D),
Corroborado por FISH en P . edelmoi y P . gyrinaethes (Fig. 2A y 2B)
Se observaron bandas C en los centrómeros de los pares 2–3, 5 y 7‒11 de Phyllodytes
edelmoi (Fig. 4A) Fluorescente CMA 3 + bandas, adicionales a la NOR sitios, se detectaron
en los centrómeros de P . edelmoi y P . preceptor y, en este último, también en los brazos
largos de los pares 3–4 y 7 ( Fig . S1 ).
Higo 4

Cariotipos con banda C de filoditas y osteocefalia .

A. Phyllodytes edelmoi . B. Osteocephalus
taurinus . C. O . oophagus . D. O . leprieurii . E. O . Buckleyi .
En las tres especies estudiadas por FISH con sonda de ADN telomérico, Phyllodytes
edelmoi (Fig. 5A), P . melanomystax (Fig. 5B), Y P . gyrinaethes ( S3 Fig ), se detectaron
señales fluorescentes en la región distal de todos los cromosomas. (ITS) se observaron
sitios teloméricas intersticiales adicionales en P . edelmoi y P . melanomystax , aunque
varía en la intensidad y ubicación de las señales. En p . edelmoi las ITS estaban presentes
en un brazo de par 1 y ambos brazos de par 2, mientras que en P . melanomystax , ITS
pericentroméricos conspicuos estaban solo en un brazo de cromosomas del par 1 (Fig. 5A y
5B)
Higo 5

Secuencias teloméricas intersticiales (ITS) en Lophyohylini.

Placas de metafase que muestran ITS detectados con FISH con sonda de ADN telomérico (usando
fluorocromo FITC). A. Phyllodytes edelmoi . B. Phyllodytes melanomystax . C. Osteocephalus
buckleyi . Las puntas de flecha blancas indican el ITS. Cabe señalar que a fin de mejorar la
detección de ITS en P . melanomystax , las señales teloméricas distales no se visualizan en la
metafase que se muestra en ( B ).

Osteocefalia
Osteocephalus fuscifacies , O . leprieurii , O . oophagus , O . planiceps , y O . taurinus ,
cariotipos compartido con 2n = 24 con todos los cromosomas-bi armado (FN = 48),
mientras que una 2n = 28 se observó en O . buckleyi , con pares 4, 6 y 7 telocéntricos (FN =
50) (Fig. 2E – 2J) El NI sitios estaban ubicados en los intersticios 9Q
en O . fuscifacies (Fig. 2E), O . taurinus (Fig. 2F), O . oophagus (Fig. 2G),
Y O . planiceps (Fig. 2J), Y en 11q par en O . buckleyi (Fig. 2I) En O . Las fuscifacies , el
único espécimen estudiado con Ag-NOR (QCAZ 74202), les mostró un tamaño
heteromórfico. En O . leprieurii , aunque no fue posible detectar NOR debido a la calidad
de las preparaciones, se observaron constricciones secundarias conspicuas en una posición
intersticial en 9q (Higo 2H)
Leprieurii Osteocephalus , O . oophagus , y O . taurinus mostró patrones similares de
bandas C, caracterizadas por la presencia de conspicuas intersticiales y bandas teloméricas
en los pares 6p, 8q, 9q y 12q (Fig. 4B – 4D) Osteocephalus buckleyi mostró bandas C + en
todos los pares de cromosomas, con bandas teloméricas adicionales en los pares 11q y 13p
(Fig. 4E) En los cariotipos de las cuatro especies estudiadas con el DAPI fluorocromos y
CMA 3 ( O . Buckleyi , O . Oophagus , O . Planiceps , y O . Taurinus ), centrómeros eran
CMA 3 + , además de NOR sitios ( S1 Fig ).
Los experimentos de FISH con las sondas de ADN teloméricas mostraron señales distales
en planiceps Osteocephalus y O . taurinus ( S3 Fig ), mientras que en O . buckleyi , se
detectó un ITS adicional en la región centromérica de uno de los homólogos del par 12
(Fig. 5C)
En tres placas de metafase de dos muestras de Osteocephalus taurinus (2 de 22 células en
PS 430, 1 de 10 células en PS 467) se detectaron variaciones cromosómicas resultantes de
reordenamientos de fusión y fusión espontánea (Fig. 6A – 6C) Una célula mostró dos
fragmentos de cromosomas pequeños adicionales, pero no fue posible identificar los
cromosomas involucrados en este fenómeno, ya que no se detectaron diferencias
morfológicas importantes en el cariotipo (Fig. 6A) En las dos células restantes, por otro
lado, se observaron fragmentos de cromosomas y cromosomas dicéntricos, en los que estos
últimos se formaron por reordenamientos que involucran cromosomas no homólogos de los
pares 1 y 2 (Fig. 6B y 6H), o ambos homólogos del par 1 (Fig. 6C y 6I)

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Higo 6

Reordenamientos espontáneos y sitios frágiles en Lophyohylini.

A – C, H, I. Osteocephalus taurinus . D. Nyctimantis siemersi . E. Trachycephalus

typhonius . F. Osteopilus vastus . G. Dryaderces pearsoni . Las puntas de flecha rojas apuntan a
fragmentos de cromosomas ( A – D ), mientras que las puntas de flecha azules indican las
constricciones secundarias no asociadas con los sitios NOR ( D – G ). En ( B ) y ( C ), las flechas
negras muestran los cromosomas dicéntricos resultantes de reordenamientos espontáneas
en O . taurinus , y su respectiva representación esquemática se muestra en ( H ) y (Yo ) Recuadro:
metafase mitótica parcial de Os . vasto .

Nyctimantis
Todos los Nyctimantis analizaron cariotipos compartidos con 2n = 24 (FN =
48). En n . siemersi , los tres especímenes estudiados (2♂ y 1♀) tuvieron una sola
constricción secundaria pericentromérica en 5q. Ag-NORs fueron estudiados en los dos
especímenes masculinos (LGE 11192, 11194) y corroborados por FISH en solo uno de
ellos, LGE 11192 (Fig. 7A) En n . rugiceps los NOR se ubicaron pericentroméricamente en
el par 5p (Fig. 7B) Y, en N . arapapa distalmente en el par 11q (Fig. 7C)

Higo 7

Cariotipos de Nyctimantis .

A, D. N . siemersi . B, E. N . rugiceps . C, F. N . arapapa . Tinción convencional (izquierda) y

bandas C (derecha). Los cuadrados muestran cromosomas que llevan sitios NOR: I. Ag-
NOR, II. PESCADO con 18S rDNA.
Nyctimantis siemersi mostró bandas C en las regiones centroméricas y pericentroméricas de
todos los cromosomas (Fig. 7D), con marcas CMA 3 + en esta posición ( S1
Fig ). En n . Rugiceps , las bandas heterocromáticas se restringieron a las regiones
intersticiales de los pares de cromosomas 8q y 11q, y las regiones pericentroméricas de 10p
(Fig. 7E) De manera similar, en esta especie, se observaron bandas fluorescentes de
CMA 3 + en 5p asociadas con NOR y los centrómeros ( Fig . S1 ). En n . arapapa , todos los
pares de cromosomas mostraron débiles bandas C centroméricas (Fig. 7F) que eran, además
de los sitios NOR, DAPI - / CMA 3 + ( S1 Fig ). En esta especie, el FISH con la sonda
telomérica mostró señales positivas en la región distal de todos los cromosomas
( Fig . S3 ). En una sola célula de un individuo de Nyctimantis siemersi (LGE 11194), fue
posible detectar una ruptura cromosómica en el par 5q, que involucra una cromátida en la
región intersticial de los sitios NOR (Fig. 6D)

Traquicefalia
Las cuatro especies analizadas de este género tenían cariotipos con 2n = 24 (FN = 48). Los
NOR sitios estaban ubicados en 11q, en forma intersticial Trachycephalus jordani , y
distalmente en T . dibernardoi , T . helioi , y T . tifonio (Fig. 8A – 8D)

Higo 8

Giemsa tiñó los cariotipos de Trachycephalus , Itapotihyla , Osteopilus y Dryaderces .

A. Trachycephalus jordani . B. t . helioi . C. T . dibernardoi . D. T . typhonius . E. Itapotihyla
langsdorffii . F. Osteopilus septentrionalis . G. Os . vasto . H. Dryaderces pearsoni . Los cuadros
muestran cromosomas que llevan los NOR después de la tinción con plata ( I ) y con FISH usando
una sonda de ADN 18S ( II ).
Las bandas C se distribuyeron principalmente en los centrómeros de todas las especies (Fig.
9A – 9D), con bandas adicionales observadas distalmente en el par de cromosomas 1p
en Trachycephalus jordani (Fig. 9A), De manera intersticial en 4p y 12q en T . helioi (Fig.
9C), Y distalmente y intersticialmente en pares 8q y 9q en T . typhonius , respectivamente
(Fig. 9D)

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Higo 9

Cariotipos con banda C de Trachycephalus , Itapotihyla , Osteopilus y Dryaderces .

A. Trachycephalus jordani . B. t . dibernardoi . C. T . helioi . D. T . typhonius . E. Itapotihyla
langsdorffii . F. Osteopilus septentrionalis . G. Os . vasto . H. Dryaderces pearsoni .
Trachycephalus jordani , T . dibernardoi , y T . helioi mostraron DAPI centromérica - /
CMA 3 + marcas en todos los cromosomas, mientras que en T . dibernardoi los centrómeros
también eran DAPI , pero no estaba claro un patrón diferencial para
el fluorocromo CMA 3 ( Fig . S1 ).
Se detectaron sitios de ADNr adicionales en los cromosomas de los pares 2 y 8
en Trachycephalus helioi (Fig. 8B) Y de pares 7 y 10 en T . tifonio (Fig. 8D), que se
observó en un espécimen de cada especie (PS 294 y LGE 18980, respectivamente). En
ambos casos, los cromosomas involucrados mostraron señales positivas después de FISH
pero fueron negativos para la tinción con Ag-NOR de plata. En t . helioi , las señales
brillantes de hibridación 18S estaban presentes (i) en ambos cromosomas del par 2p pero
diferían en su ubicación, intersticialmente en uno de los homólogos y
pericentroméricamente en el otro; y (ii) pericentroméricamente en uno de los homólogos
del par 8p. En t . typhonius , se observó hibridación en solo uno de los homólogos de los
pares de cromosomas 7q (pericentroméricamente) y 10q (intersticialmente).
Otra variación respecto a la NOR sitios se evidenció por el tamaño de Ag-NOR entre
cromosomas homólogos en Trachycephalus jordani , T . dibernardoi , y T . tifonio (Fig.
8A, 8C y 8D) En t . dibernardoi y T . typhonius , fue posible detectar triplicaciones y
quintuplicaciones respectivamente en metafases mitóticas de buena calidad teñidas con Ag-
NOR, que también fue corroborada por FISH (Fig. 8A y 8D) En t . dibernardoi , por otro
lado, esta técnica no se realizó en la muestra que mostró el heteromorfismo.
Finalmente, en Trachycephalus typhonius se detectaron constricciones secundarias
pericentroméricas o sitios frágiles en los cromosomas del par 3q que no estaban asociados
con NOR o bandas C (Fig. 6E) Esta característica se encontró en cinco especímenes de
localidades argentinas, en ambos homólogos en tres muestras (homocigosis) o solo en un
cromosoma en dos de ellos (heterocigosis).

Itapotihyla langsdorffii
Itapotihyla langsdorffii tenía un cariotipo con 2n = 24 (FN = 48), con sitios NOR ubicados
pericentroméricamente en el par 11p (Fig. 8E) Se observaron bandas C en las regiones
centroméricas de todos los cromosomas y distalmente en los pares 1–3q (Fig. 9E)

Osteopilo
Osteopilus septentrionalis y Os . Vastus compartió cariotipos con 2n = 24 (FN = 48), con
sitios NOR intersticiales en el par 9q en ambas especies (Fig. 8F y 8G)
Las dos especies tenían patrones similares de bandas C que estaban restringidas a los
centrómeros, con heterocromatina adicional presente en Osteopilus
septentrionalis distalmente en el brazo largo de los cromosomas más grandes (1-4) (Fig. 9F
y 9G) Las bandas fluorescentes DAPI - / CMA 3 + se observaron intersticialmente en el par
9q en ambas especies, coincidiendo con los sitios NOR, en la región distal de la mayoría de
los cromosomas de Os . septentrionalis y en todos los centrómeros en Os . vasto ( S1 Fig ).
En dos especímenes de Osteopilus vastus , se observó una constricción secundaria
intersticial conspicua no asociada con sitios NOR en los cromosomas 1p (Fig.
6F) Curiosamente, esta constricción secundaria siempre involucraba solo una cromátida de
dicho cromosoma. En una muestra (Os.5), estaba presente en ambos cromosomas 1 en
aproximadamente la mitad de las células analizadas (14 de 26 células), mientras que en la
otra muestra (Os.8), esta característica se observó solo en un cromosoma 1 y más
infrecuentemente (3 de 48 células).

Dryaderces pearsoni
Esta especie tenía un cariotipo con 2n = 24 (FN = 48) con NOR ubicadas intersticialmente
en el par 9q (Higo 8H) La heterocromatina mostró un patrón centromérico, aunque se
observaron bandas C notables intersticiales en los pares 6p, 8q, 9q y 12q, y distalmente en
11q (Fig. 9H) Los centrómeros de casi todos los cromosomas mostraron bandas DAPI - /
CMA 3 + , además de los sitios NOR. Ambos homólogos del par 12q exhibieron una
constricción secundaria intersticial adicional no asociada con NOR compuestas de DAPI + /
CMA 3 rico - heterocromatina (Fig. 6G, S1 Fig )
Discusión
La información citogenética disponible para Lophyohylini actualmente comprende datos
sobre 31 especies cariotipadas de las 87 especies (36%) de la tribu, que muestran una
amplia diversidad en varios caracteres cromosómicos. Se informaron diferentes números
haploides para la tribu, aunque los cariotipos con n = 12 que están compuestos por todos los
cromosomas bi-armados (FN = 48) son características comunes presentes en todos los
géneros estudiados, y representan los estados plesiomórficos para n y FN, respectivamente [
18, este estudio]. Las reducciones se registraron en phyllodytes edelmoi y P . luteolo (n =
11, 2n = 22, FN = 44), mientras que al contrario, se observaron incrementos
en Osteocephalus buckleyi (n = 14, 2n = 28, FN = 50), Osteopilus wilderi(n = 14, 2n = 28,
FN = 52) y Os . ocellatus (n = 17, 2n = 34, FN = 48).
Tepuihyla y el género monotípico Phytotriades ( P . Auratus ) siguen siendo la única dos
géneros de Lophyohylini carece de cualquier información citogenético. Sin embargo, de
acuerdo con diferentes hipótesis filogenéticas disponibles para la tribu [ 3 , 6 , 9 ],
cualesquiera que sean los números haploides y (o) fundamentales presentes en estos
taxones, los estados de carácter plesiomórfico para Lophyohylini, n = 12 y FN = 48
permanecen sin cambios.
Se sugirió que dentro de Lophyohylini (excepto la especie candidata a Osteocephalus
taurinus 5), hay una discontinuidad notable en el tamaño de los primeros 5 pares de
cromosomas y los 7 restantes [ 4 , 21 ]. Sin embargo, esta característica no es evidente
cuando se comparan las diferencias entre el porcentaje de tamaño del conjunto haploide de
los pares 5 y 6 en los cariotipos de lofiohilinas con 2n = 24 ( Tabla S3 ).

Secuencias teloméricas intersticiales en Lophyohylini

Las secuencias de ADN teloméricas intersticiales o ITS son un fenómeno frecuente
observado en vertebrados, y pueden ser la consecuencia evolutiva de los reordenamientos
cromosómicos (p. Ej., Inversiones o fusiones), pero también de una variedad de
mecanismos moleculares que implican la transposición y amplificación de secuencias de
ADN teloméricas [ 24 , 36 , 37 ]. Entre los anuros, se ha informado de la presencia de ITS
en 45 especies (ver [24,38, para revisiones, este estudio]).
El ITS rara vez se ha relacionado con taxones que han sufrido un proceso de reducción
cromosómica. Sin embargo, es posible encontrar esta asociación en algunas especies
de Aplastodiscus y Scarthyla goinorum (Hylidae)
y Leptodactylus aff. podicipinus (Leptodactylidae). En Aplastodiscus , dos reducciones
independientes cambiaron el número haploide plesiomorphic de n = 12 para n = 11 en las
especies de la A . albofrenatus grupo, y para n = 10 y n = 9 en la especie de
la A . grupo albosignatus [ 39 - 41 ]. Se afirmó que el ITS informó en Aplastodiscuspuede
no estar directamente relacionado con las reducciones cromosómicas observadas en el
género [ 40 ]. Sin embargo, cabe señalar que los STI solamente se detectaron en las
especies con cariotipos reducidas y no en una . perviridis , el único taxón con n = 12
estudiado por FISH con una sonda de ADN telomérico. Del mismo modo, Scarthyla
goinorum es la única especie dentro de Pseudini que tiene un cariotipo reducido (n = 11),
además de la presencia de ITS en los cromosomas del par 3 [ 15 ]. Con base en estos dos
hechos, Suárez et al. [ 15] propuso que el ITS en esta especie estaría directamente
relacionado con la reducción del cariotipo. Debe notarse en este punto que solo FISH había
estudiado una especie adicional de la tribu con un cariotipo no reducido (n = 12) (es
decir, Lysapsus laevis ). En Leptodactylus sp. aff. podicipinus (n = 10, 2n = 20), su están
presentes en la región centromérica de un pequeño par de cromosomas, pero su
centroméricas también se confirmaron en L . podicipinus , una especie relacionada
filogenéticamente que muestra el cariotipo plesiomórfico de Leptodactylidae (n = 11, 2n =
22, [ 42 ]).
En 14 especies de lophyohylines ADN telomérico se mapeó por peces y su estaban
presentes en 4 de ellos: itapotihyla langsdorffii , phyllodytes
edelmoi , P . melanomystax y Osteocephalus buckleyi [19,22, este estudio]. De una manera
similar a lo que se observa en casi todas las otras especies de anuros, el ITS
heterocromatínicas (SU-het) patrón observado en el cariotipo de I . langsdorffii representa
una condición apomórfica, probablemente relacionada con los mecanismos de dispersión y
amplificación responsables de la internalización de secuencias de ADN de tipo telomérico
[ 22 ].
Gruber y col. [ 22 ] informaron ITS en Phyllodytes edelmoi , más tarde descrito como het-
ITS por Schmid y Steinlein [ 38 ] y Schmid et al. [ 18 ] Sin embargo, debe mencionarse que
de acuerdo con la descripción original, no se detectaron bandas C para esta especie [ 22 ].
De hecho, no detectamos para esta especie bandas C positivas aparte de las de los
centrómeros. La morfología bruto similar de pares 1 y 2 entre las especies estudiadas
de phyllodytes [22, este estudio] y la presencia de ITS en los cromosomas de par 2
en P . melanomystax, sugieren que estos pares no habrían participado en la reducción del
cariotipo del género (de 24 a 22) y que ITS tendría un origen evolutivo más temprano. Sin
embargo, no podemos descartar reordenamientos adicionales que involucren estos pares de
cromosomas (ver sitios NOR y su información filogenética en Lophyohylini ). La
ausencia de sus señales en P . gyrinaethes proporciona evidencia para proponer que el ITS
del par de cromosomas 2 puede representar una sinapomorfia putativa de un clado interno
de Phyllodytes , que comprende especies con 2n = 22 y 2n = 24. Sin embargo, es necesario
un mejor muestreo ya que solo 5 de 14 especies del los géneros fueron cariotipados, y solo
tres de ellos fueron estudiados por FISH con ADN telomérico.
Entre seis especies estudiadas de Osteocephalus [19, este estudio] hay un cariotipo
plesiomorphic exceptuando O . buckleyi (n = 14, 2n = 28, FN = 50). Las diferentes fuentes
de evidencia (es decir, bandas C, NOR, tamaño de cromosomas y morfología) brindan más
apoyo de que los seis pares menores se conservan en el
clado Osteocephalus + Dryaderces (ver más abajo). La presencia de ITS pericentromeric en
ambos homólogos de par 13 en O . buckleyi no estaría asociado con la reorganización
cromosómica observada en esta especie, y posiblemente se originaría por diferentes
mecanismos.

Sitios frágiles y su posible papel en la evolución cromosómica de

Lophyohylini.
Las constricciones secundarias o lagunas cromosómicas suelen ser consecuencia de
regiones cromosómicas asociadas con los sitios NOR, aunque también pueden estar
formadas por heterocromatina constitutiva o sitios frágiles [ 24 ]. Los sitios frágiles se
definen como regiones cromosómicas específicas que son propensas a romperse y
participar en reordenamientos cromosómicos. A diferencia de los anuros, esta característica
ha sido ampliamente estudiada en humanos, y dependiendo de su prevalencia en una
población, se pueden definir como sitios frágiles raros o comunes (ver [ 43 ] para una
revisión).
Al igual que en otros grupos de anuros, la aparición de reordenamientos cromosómicos
espontáneos en poblaciones naturales de Hylidae es extraordinariamente infrecuente y,
hasta donde sabemos, solo se han documentado dos casos aislados además del presente
estudio. Feitosa y col. [ 44 ] estudiaron los efectos de la radiación natural en la frecuencia
de reordenamientos cromosómicos en poblaciones de Aplastodiscus perviridis y Boana
albopunctata de Morro do Ferro (Minas Gerais, Brasil). Además, Anderson [ 19 ] describió
anormalidades cromosómicas en los dos géneros de
lophyohylines Osteocephalus y Osteopilus .
En este trabajo, encontramos variaciones en varias especies de Lophyohylini con respecto a
constricciones secundarias no asociadas con NOR en Dryaderces pearsoni , Osteopilus
vastus y Trachycephalus typhonius ; reordenamientos cromosómicos espontáneos
en Nyctimantis siemersi y Osteocephalus taurinus ; y polimorfismos NORs de sitio
en N . siemersi y algunas especies de Trachycephalus . Aunque no evaluamos
sistemáticamente esta variación porque no era nuestro objetivo principal, la frecuencia de
ocurrencia de esta reorganización es notable en comparación con otros grupos de anuros y
merece ser discutida.
Anderson [ 19 ] pone de relieve que, en los especímenes de Osteocephalus
taurinus especies candidatas 5 de la Guayana francesa (como O . Taurinus ), había sitios
intersticiales frágiles en coincidencia con las regiones heterocromáticas en medianas y
pequeñas cromosomas (pares 6 y 9). También podríamos inferir la presencia de sitios
frágiles en O . taurino , por la aparición de reordenamientos espontáneos que generaron
cromosomas dicéntricos y fragmentos de cromosomas pero que involucran a los dos
primeros pares de cromosomas. Aunque casi todas las bandas intersticiales
heterocromáticas descritas previamente por Anderson [ 19 ] (inferidas de la figura del
ideograma), no se detectaron en el presente estudio paraO . taurinus , es tentador proponer
que hay co-ubicación entre los sitios putativos que tales puntos de ruptura de cromosomas
se produjeron en O . taurinus y esas bandas heterocromáticas intersticiales de O . especies
candidatas de taurinus 5.
Se observó una brecha cromatídica o constricción secundaria, no asociada con NOR o
heterocromatina, en dos especímenes de Osteopilus vastus : presentes en una sola
cromátida de solo uno (heterocigosis) o en los dos cromosomas del par 1 (homocigosis).
Como se indicó, nuestras preparaciones celulares de Osteopilus se obtuvieron de cultivos
de linfocitos sometidos a un tratamiento con BrdU. Aunque no tenemos una explicación
sobre esta característica rara, es interesante observar que todos los registros en ambos
especímenes ocurrieron precisamente en la misma región cromosómica. Bajo ciertas
condiciones, los sitios frágiles pueden ser inducidos a baja frecuencia como brechas o
roturas de cromátidas simples en células cultivadas [ 43] Aunque esto podría ser una
posible causa de este fenómeno extraordinario, esto nunca se mencionó en estudios
similares que realizan la inducción de BrdU en anuros (p. Ej.,
[ 14 , 21 , 22 , 30 , 31 , 45 - 49 ]). Curiosamente, la notable similitud entre los cromosomas
1 y 2 de Os . Ocellatus y Os . wilderi , respectivamente [ 18 , 19 , 23 ], se asemeja a la
morfología del cromosoma 1 de Os . vastosi consideramos una fisión cromosómica en ese
sitio, lo que sugeriría que el supuesto sitio frágil observado en Os . Vastus podría haber
desempeñado un papel en la evolución cromosómica del género.
Casi todas las especies de Osteopilus comparten el número de cariotipo plesiomórfico, con
la excepción de Os . wilderi [ 19 ] y Os . ocellatus [ 18 , 19 , 23 ]. Los diferentes números
diploides presentes en estas dos especies podrían explicarse por la ocurrencia de
translocaciones que involucran brazos enteros (es decir, translocaciones Robertsonianas),
aunque otros reordenamientos podrían desempeñar un papel en el cambio de FN de 48 a 52
observado en Os . wilderi . Las relaciones filogenéticas de Osteopilus [ 3 , 9] sugieren
orígenes independientes para los cambios observados en Os . Ocellatus y Os . wilderi . Sin
embargo, debe tenerse en cuenta que el cariotipo de Os . marianae (inferido de la
representación del ideograma en [ 19 ]), difiere en morfología cromosómica y tamaño de la
de otras especies del género con 2n = 24 cromosomas, particularmente con respecto a los
pares 4 y 5. Es posible que el cariotipo de Os . marianae podría haber tenido
reordenamientos adicionales que han llevado a imitar el estado plesiomórfico. En este
sentido, es esencial estudiar la citogenética de Os . crucialis, la especie hermana
de Os . ocellatus , y también realizan técnicas citogenéticas diferenciales en Os . marianae .

Sitios NOR e información filogenética

Dentro de Lophyohylini, la mayoría de las especies muestran un solo par de NOR ubicadas
en pequeños pares de cromosomas con morfología similar [18, este estudio]. Esta condición
también está presente en Cophomantini [ 17 ], Scinaxini [ 13 , 16 ] e Hylini [ 18 ], lo que
sugiere una supuesta homeología entre los cromosomas que llevan este marcador
[ 13 , 14 ]. Además, la información del patrón de bandas de replicación BrdU recopilada de
diferentes especies neotropicales de híbridos refuerza esta hipótesis [ 21 , 49 ].
Al igual que otros grupos de Hylidae, los NOR de las lophyohylines muestran una
variación interesante. En primer lugar, su presencia en los cromosomas de par 11 que es la
condición plesiomorphic, observa en casi todas las especies de la mayor clado que
comprende Trachycephalus , Corythomantis , y Nyctimantis , que también se comparte por
el basal monotípico género Itapotihyla (es decir, I . Langsdorffii ) [ 21,22,50, este estudio];
en este contexto, sería la condición más parsimoniosa esperada para su taxón
hermano Phytotriades auratus . En Nyctimantis , hay dos patrones para la ubicación
cromosómica de los NOR. En n . arapapa, N . bokermanni , y N . brunoi , son terminal en
11q par (como par 10 en [ 21 , 22 ], este estudio), mientras que
en N . siemersi y N . rugiceps son pericentroméricos en el cromosoma par 5 [20, este
estudio]. Los NORs en el par 5 observaron en N . rugiceps y N . siemersi , probablemente
tendría un origen común y es una sinapomorfia putativa de un clado menos inclusivo dentro
de Nyctimantiseso incluye estas especies. Las diferencias en la posición intracromosómica
de este marcador entre ellos, en 5p y 5q respectivamente, posiblemente serían la
consecuencia de modificaciones posteriores (por ejemplo, inversión pericéntrica). De
hecho, esta suposición no es irrazonable ya que ambos taxones están estrechamente
relacionados de acuerdo con varios estudios filogenéticos [ 3 , 6 - 9 , 51 , 52 ]. Sin embargo,
para probar esta hipótesis, todavía es necesario estudiar N . galeata y N . pombali incluido
en este clado, y están más estrechamente relacionados con N . rugiceps .
Tres géneros del clado compuesto
por Tepuihyla , Osteocephalus , Dryaderces , Osteopilus y Phyllodytes [ 3 ] comparten
sitios NOR localizados intersticialmente en un par de cromosomas metacéntricos de
pequeño tamaño (es decir, el par 9 [19, este estudio]), que difieren significativamente en
tamaño del par 11 observado en otras lophyohylines. Los NORs en el par 9 se encuentran
en especies de Osteocephalus ( O . Taurinus especies candidatas
5, O . Taurinus , O . Oophagus , O . Planiceps , yO . leprieurii inferido en este estudio por
la presencia de constricciones secundarias), Dryaderces ( D . pearsoni ),
y Osteopilus ( Os . dominicensis , Os . septentrionalis , y Os . vastus ). Del mismo modo,
en Osteocephalus buckleyi y Os . wilderi, a pesar de tener un mayor número de
cromosomas y NOR en los pares 11 y 9, respectivamente [19, este estudio], la similitud
entre los cromosomas que llevan NOR en estas especies y aquellos con 2n = 24 también
sugiere la homeología de estos elementos. De esta manera, los NOR en el par 9 representan
una supuesta sinapomorfía de este clado mal apoyado y queda por estudiar en Tepuihyla .
Por otra parte, una banda C intersticial en el par 8 en las especies de Osteocephalus ,
incluyendo las observaciones en O . buckleyi (en el par 10), y en Dryaderces pearsoni [19,
este estudio], representa una sinapomorfia putativa para Dryaderces + Osteocephalus .
Los NORs se producen en el par 2 en phyllodytes edelmoi y P . luteolus [22, este estudio],
el par 7 en P . melanomystax , y el par de 8 en P . gyrinaethes y P . preceptor (este
estudio). Esta variación y las diferencias cromosómicas adicionales (es decir, la morfología
de los pares 4, 6 y 7) sugieren que la citogenética es una fuente prometedora de
información para la sistemática de las filoditas ; sin embargo, su interpretación filogenética
está fuertemente limitada por el muestreo citogenético aún escaso y disperso del género.

Polimorfismos para los sitios NOR en Lophyohylini

En los anuros, los polimorfismos para la ubicación y el tamaño de los NOR son frecuentes,
y en aproximadamente la mitad de los casos notificados se han observado con detección in
situ con ADNr además de la tinción con Ag-NOR [ 24 , 30 , 39 , 50 , 53 - 65 ]. Este
marcador se estudió en casi todas las lophyohylines que muestran una variación
impresionante ( Tabla S1 ).
En Osteopilus septentrionalis , se informaron diferencias intra e intercromosómicas de la
ubicación de NOR (es decir, intersticiales en 9q), debido a las inversiones paracéntricas del
par 9 y a una translocación recíproca en la heterocigosis que involucra a los pares 6 y 9,
respectivamente [ 19 ]. Aunque dicha variación no se observó en otros estudios [18,23,66,
este estudio], en las cifras proporcionadas por Schmid [ 66 ] y Schmid et al. [ 18 ] para esta
especie (Fig. 8Cy 571, respectivamente), las marcas de Ag-NOR están ubicadas en una
posición pericentromérica. Además, se describieron múltiples Ag-NOR
en Os . ocellatus [ 18 , 19 ], apoyando la idea de que los NOR en Osteopilus son muy
variables.
Morand y Hernando [ 20 ] estudiaron los Ag-NOR en tres hembras de Nyctimantis
siemersi , informando que el 60% de las células tenían NOR en uno o dos cromosomas del
par 5, mientras que el 40% restante las tenía intersticialmente en un homólogo del par 1 En
nuestro estudio, se observaron Ag-NOR en un solo cromosoma del par 5 en dos machos,
corroborados por FISH en uno de ellos e inferidos por la presencia de una notable
constricción secundaria en una hembra. Una característica similar se informó en las
lophyohylines Corythomantis greeningi y Nyctimantis brunoi , aunque, en estas especies,
FISH rechazó la aparición de un solo Ag-NOR [ 21 ]. La eliminación completa de los sitios
NOR, como se observa en N. siemersi , es poco frecuente entre los anuros ([ 66 ]; ver [ 24 ]
para una revisión), siendo difícil de entender su alta prevalencia sin una asociación sexual.
En Trachycephalus , cuatro especies muestran constricciones secundarias visibles asociados
con Ag-NOR: T . dibernardoi , T . cunauaru (como Trachycephalus sp. en
[ 18 , 22 ]), T . jordani , y T . typhonius , que además fue confirmado por FISH en las dos
últimas especies [22, este estudio]. Se observaron heteromorfismos para el tamaño de los
NOR en otras especies de lophyohylines: Corythomantis greeningi , Itapotihyla
langsdorffii , Nyctimantis bokermanni ,Osteocephalus fuscifacies , y P . luteolo [21, este
estudio]. De hecho, la aparición de tamaño variable entre los homólogos que llevan los
sitios NOR se informa comúnmente, donde el cruce desigual entre los homólogos durante
la primera profase meiótica cambiaría la posición de los grupos de ADNr formando
multiplicaciones en tándem [ 66 , 67 ].
Por último, la falta de afinidad de impregnación de plata en las señales de ADNr positivos
después de FISH se confirmó en este estudio en las dos especies
de Trachycephalus , T . helioi y T . typhonius , que denota que fueron transcripcionalmente
inactivados (ver [ 24 ] para una revisión). La presencia de polimórfica silencio NOR sitios
en Anura es una característica poco frecuente describe sólo en Craugastor
fitzingeri [ 24 ], chrysoscelis Hyla , H . versicolor [ 30 ] y Scinax tripui [ 65] Aunque esto
podría ser la consecuencia del sesgo de muestreo, ya que la técnica FISH no se usa de
forma rutinaria en varias muestras para establecer una correspondencia entre las bandas Ag-
NOR y los sitios de ADNr. Debido a que esta característica hasta ahora ha sido poco
estudiada en este grupo, aún es prematuro sacar conclusiones sobre la presencia y la
posición de los sitios de ADNr silenciados.
Ir:
Conclusiones
Entre los vertebrados, la evolución cromosómica de los anuros se ha considerado
tradicionalmente estable debido al aparente alto conservadurismo de los cariotipos de
varios taxones. Sin embargo, el reciente descubrimiento de una variación significativa,
particularmente con respecto a alteraciones numéricas y estructurales espontáneas, ha
comenzado a desafiar esta idea. Por ejemplo, Schmid et al. [ 24 , 68 ] describieron tasas sin
precedentes de anomalías cromosómicas espontáneas en varias especies de ranas de
desarrollo directo de la familia Hemiphractidae, y particularmente de las familias de
braquiocefaloides Craugastoridae y Eleutherodactylidae, alcanzando frecuencias de 0.7%,
10% y 15% respectivamente. En el presente estudio, Lophyohylini también muestra una
evolución cromosómica compleja, lo que ha llevado a cambios cariotípicos complejos
(Osteopilus , Osteocephalus y Phyllodytes ). La alta tasa de reordenamientos observada en
las lofiohilinas representa evidencia confiable de que las fisiones y las translocaciones
recíprocas serían uno de los principales mecanismos candidatos responsables del aumento
de 2n y FN que se encuentran en Osteopilus y Osteocephalus .
Además, Lophyohylini exhibe otras variaciones cromosómicas interesantes que no solo se
limitan al número, el tamaño y la actividad de NOR o la aparición de ITS, sino que se
relacionan con la presencia de reordenamientos cromosómicos y los intrigantes sitios
frágiles. Este último probablemente presenta una diversidad aún no declarada, ya que no es
evidente un patrón claro, ya que pueden variar en el contenido de heterocromatina o tipo.
Por ejemplo, siendo DAPI + / CMA 3 - en Dryaderces pearsoni , DAPI - /
CMA 3   en Nyctimantis siemersi , neutral para ambos fluorocromos en Trachycephalus
+

typhonius , o incluso puede variar intracromosómicamente como en Osteopilus vastus. El

fluorocromo CMA 3 es otro personaje prometedor que ha mostrado un patrón centromérico
de CMA 3 + en casi todas las especies estudiadas de la tribu,
excepto Os . septentrionalis , phyllodytes melanomystax , P . praeceptor ,
y T . dibernardoi .
En un sentido amplio, con respecto a la variación citogenética informada, Lophyohylini se
asemeja a lo que se observa en las ranas de desarrollo directo de Brachycephaloidea y
Hemiphractidae. Otros estudios en Phytotriades y Tepuihyla y un muestreo ampliado en el
género variable Phyllodytes ayudarían a comprender la desconcertante citogenética de estas
intrigantes ranas.