PRÁCTICA Nº 9

MÉTODO MICROBIOLÓGICO DE CULTIVO Y AISLAMIENTO DE

SECRECIONES FARÍNGEAS

1. TÉCNICAS DE CULTIVO:

 PRINCIPIOS DE LA TÉCNICA:
 Uno de los sistemas más importantes para la identificación de microorganismos es
observar su crecimiento en sustancias alimenticias artificiales preparadas en el
laboratorio. El material alimenticio en el que crecen los microorganismos es el Medio de
Cultivo y el crecimiento de los microorganismos es el Cultivo.

 Para que las bacterias crezcan adecuadamente en un medio de cultivo artificial debe
reunir una serie de condiciones como son: temperatura, grado de humedad y presión de
oxígeno adecuadas, así como un grado correcto de acidez o alcalinidad. Un medio de
cultivo debe contener los nutrientes y factores de crecimiento necesarios y debe estar
exento de todo microorganismo contaminante. 1-2

 La mayoría de las bacterias patógenas requieren nutrientes complejos similares en

composición a los líquidos orgánicos del cuerpo humano. Por eso, la base de muchos
medios de cultivo es una infusión de extractos de carne y Peptona a la que se añadirán
otros ingredientes.

 El agar es un elemento solidificante muy empleado para la preparación de medios de

cultivo. Se licúa completamente a la temperatura del agua hirviendo y se solidifica al
enfriarse a 40 grados. Con mínimas excepciones no tiene efecto sobre el crecimiento de
las bacterias y no es atacado por aquellas que crecen en él.

 En los diferentes medios de cultivo se encuentran numerosos materiales de

enriquecimiento como hidratos de carbono, suero, sangre completa, bilis, etc. Los
hidratos de Carbono se adicionan por dos motivos fundamentales: para incrementar el
valor nutritivo del medio y para detectar reacciones de fermentación de los
microorganismos que ayuden a identificarlos. El suero y la sangre completa se añaden
para promover el crecimiento de los microorganismos menos resistentes. 2

 UTILIDAD PRINCIPAL:
 En biología, bacteriología y específicamente en microbiología, un cultivo es un método
para la multiplicación de microorganismos, tales como lo son bacterias en el que se
 prepara un medio óptimo para favorecer el proceso deseado. Un cultivo es empleado
como un método fundamental para el estudio de las bacterias y otros microorganismos
que causan enfermedades en medicina humana y veterinaria.
 Un microorganismo se puede sembrar en un medio líquido o en la superficie de un
medio sólido de agar. Los medios de cultivo contienen distintos nutrientes que van,
desde azúcares simples hasta sustancias complejas como la sangre o el extracto de
3
caldo de carne.
 La principal diferencia entre un medio de cultivo sólido y uno líquido es que el medio
de cultivo sólido contiene un 1,5–2% de agar-agar, mientras que el medio líquido no
contiene agar-agar.
 El desarrollo adecuado de los microorganismos en un medio de cultivo se ve afectado
por una serie de factores de gran importancia y que, en algunos casos, son ajenos por
completo al propio medio: 4
 Disponibilidad de nutrientes adecuados.
 Consistencia adecuada del medio.
 Presencia (o ausencia) de oxígeno y otros gases.
 Condiciones adecuadas de humedad.
 Luz ambiental.
 pH.
 Temperatura.
 Esterilidad del medio.

 TIPOS:
 Atendiendo a su estado físico:

o líquidos.

o Semisólidos.

o Sólidos.

 Atendiendo a su utilidad práctica:

Medios para aislamientos primarios:

o Para usos generales: no selectivos, para cultivo de una amplia variedad de

organismos difíciles de hacer crecer. A menudo están enriquecidos con materiales

como: sangre, suero, Hemoglobina, FX, FV, glutamina, u otros factores accesorios
para el crecimiento de las bacterias (Agar Sangre, Schaeadler, etc).
o Selectivos: (pueden ser de moderada o de alta selectividad) se añaden sustancias

que inhiban el crecimiento de ciertos grupos de bacterias, permitiendo a la vez el

 crecimiento de otras. Variando las sustancias añadidas, se varía el tipo y grado de
selectividad (Mac Conkey, Kanamicina-Vancomicina).
o Enriquecidos: ralentizan/suprimen el crecimiento de la flora competitiva normal

potenciando el cultivo y crecimiento deseado (Selenito, medio con Vitamina K).

o Para aislamientos especializados: formulaciones nutritivas especiales que

satisfacen requerimientos de grupos específicos de bacterias, ayudando a su

identificación (Lowenstein).
Medios para identificación:
o Diferenciales: formulaciones especiales en las que se estudian las peculiaridades

fisiológicas (nutrición y respiración, sobre todo) específicas de las bacterias.

Seleccionando los medios adecuados se puede llegar a la identificación de casi
cualquier bacteria (Oxidación-Fermentación). 2

 Zárate MS, Dadamio J, Alí S, Giordanelli A, Smayevsky J, Torres M. "Desarrollo y

evaluación de una muestra para control de calidad en Microbiología". Acta
Bioquímica Clínica Latinoam. 2015 Mar;41(1):57–61.
 PROTOCOLO DEL MÉTODO MICROBIOLÓGICO DE CULTIVO Y
AISLAMIENTO DE SECRECIONES FARÍNGEAS

1. MATERIALES: (OBTENCIÓN DE SECRECIONES FARÍNGEAS)

 Hisopos de algodón estéril en tubos de ensayo, para recolectar muestras.
 Baja lengua estéril.
 Mascarilla protectora.
 Tubo estéril.
2. PROCEDIMIENTO:
1. El paciente debe permanecer sentado en la posición
más cómoda y con una buena iluminación.

2. Indicar al paciente que abra la boca, que diga

“ahh..” sin sacar la lengua.

3. Mientras el paciente dice “ahh..” bajar las 2/3

partes anteriores de la lengua con el
bajalenguas empleando la mano izquierda.

4. Se debe observar las amígdalas, en el fondo

de la faringe limitada por los pilares y la

úvula.
<

5. Introducir el hisopo, ubicar el lugar inflamado de la garganta, frotar el hisopo con firmeza y hacerla girar,
evitar tocar la lengua, que se encuentra cubierta de microorganismos.
 6. Introducir el hisopo en el tubo estéril.
1. MATERIALES: (PARA EL CULTIVO)
 Matraz de Erlenmeyer y varilla.
 Portaobjetos, pipeta Pasteur y Agar sangre.
 Tira oxidasa, Peróxido de Hidrógeno (Catalasa).
 Campana de anaerobiosis.
2. PROCEDIMIENTO: (Estreptococos β-hemolíticos; Columbia ANC +
5% sangre de cordero - agar)

1. Después de obtenida la muestra,

transportarla en un tubo de ensayo, sacar el
hisopo y realizar la siembra por “estrías” en
la superficie del Agar sangre.

2. Incubar la muestra primera muestra en un

medio “Aerobio” a 37ºC por 24h.
 3. Incubar la segunda muestra en un medio
“Anaerobio” a 37ºC por 24 horas.
4. Preparar el Caldo Soya Tripticasa, 30g – 1L. (Práctica Nº 10 ANTIBIOGRAMA)
5. Colocar el Caldo Soya Tripticasa en el Matraz de
Erlenmeyer y agregar agua destilada 50ml.
6. Mezclar el caldo con 50 ml de agua destilada y agregar 2ml a los tubos de ensayo y almacenarlos.

7. Después de 24h observar las muestras

(existencia de colonias de crecimiento bacteriano).

8. Observar la placa de Petri con la muestra sometiéndola a la luz UV, para la identificación de
“Halos” en bacterias β-hemolíticas. Deben tener una coloración “Amarillo verdusco”.
9. Realizar la tinción Gram, para diferenciar tanto la
forma, agrupación, morfología, pared bacteriana,
Gram (+) o Gram (-). Extraer la muestra para la
tinción.
10. Colocar la muestra en la lámina
portaobjetos y seguir los pasos de la
tinción Gram.
11. Dejar que la muestra seque a temperatura
ambiente.
 12. Agregar el Cristal de Violeta 1’ y lavar, agregar
Lugol 2’ y lavar, agregar el alcohol cetona 1’ y
lavar, y por último agregar la Safranina 30’.
13. Realizar la observación microscópica a 100X con una gota de aceite de cedro, e identificar los
datos antes expuestos.

INTERPRETACIÓN:
 Gram positivos (Violeta): Presencia de Estreptococcus y Estaphylococcus.
 Gram negativos (Rojo grosella).

La prueba de la catalasa: Se realiza con el fin de diferenciar el género Streptococcus del

2
género Staphylococcus , en esta prueba se determina por el burbujeo, resultando una prueba
negativa (sin burbujeo) que significa predominio de Estreptococcus puesto que no tienen la
enzima catalasa.

2. ¿QUÉ TECNICAS DE CULTIVOS SE UTILIZA PARA AISLAR

ENTEROBACTERIAS PATÓGENAS PARA EL HOMBRE Y EN QUE
TIPOS DE MUESTRAS?

 Un microorganismo se puede sembrar en un medio líquido o en la superficie de un

medio sólido de agar. Los medios de cultivo contienen distintos nutrientes que van,
 desde azúcares simples hasta sustancias complejas como la sangre o el extracto de
caldo de carne.
 La principal diferencia entre un medio de cultivo sólido y uno líquido es que el medio
de cultivo sólido contiene un 1,5–2% de agar-agar, mientras que el medio líquido
no contiene agar-agar.
 Aislación de enterobacterias patógenas para el hombre: 1-2

3. ¿ E N Q U É T I

Estafilococcus aureus Y Estreptococcus β-Hemolíticos Y EN QUE TIPO

DE MUESTRAS?
 Estafilococos aureus: crecen rápidamente en casi todos los medios bacteriológicos
bajo condiciones aerobias o microaerofílicas. Las muestras clínicas principalmente
se cultivan en medios de agar enriquecidos con sangre de carnero. Cuando se trata
de una muestra contaminada, debe ser inoculada primero en agar Columbia
adicionado con clistín y ácido nalidíxico o alcohol fenil-etílico.
 Los Medios diferenciales para S.aureus son el medio manitol-salino o Chapman y
el medio Baird-Parker, CHROMagar Staph aureus (Sensibilidad epidemiológica:
96,8%, 20 horas de incubación), S. aureus ID agar (Sensibilidad epidemiológica:
91,1%, 20 horas de incubación). Estos medios comerciales verifican la presencia de
α-glucosidasa durante el desarrollo. 4
 Estreptococcus β-Hemolíticos: Los Medios diferenciales de cultivo para el
Estreptococcus β-Hemolíticos es en agar sangre. El método comúnmente
empleado en los laboratorios clínicos para la identificación presuntiva en cultivos de
Streptococcus Beta-hemolítico del grupo A (Streptococcuss pyogenes) es la prueba
de susceptibilidad a la bacitracina o Taxo A. Otra manera es detectar el antígeno A
mediante enzimoinmunoanálisis o inmunoaglutinación. 5

4. ¿EN QUÉ CASOS SOLICITARÁ UN ATIBIOGRAMA A UN

LABORATORIO?
  Es una prueba que se pide cotidianamente al laboratorio, a fin de seleccionar el
antibiótico más eficaz en el tratamiento de una infección determinada. 7-8
 El antibiograma tiene cuatro utilidades principales: 9
 La utilidad básica del antibiograma es la instauración de un tratamiento
antibiótico correcto al paciente. Es necesario conocer si el microorganismo
responsable de la infección posee mecanismos que le confieran inmunidad frente
a algún antibiótico para no incluirlo como terapia.
 En cuanto al tratamiento el antibiograma no sólo es necesario en la instauración,
también resulta útil en el seguimiento e incluso en la confirmación de
tratamientos empíricos. En ocasiones la enfermedad infecciosa resulta grave y se
comienza el tratamiento antes de conocer los datos de sensibilidad de la cepa. El
antibiograma tiene que confirmar, o en su caso corregir el tratamiento.
 Otra aplicación de las técnicas de estudio de resistencia es la epidemiología. Es
necesario detectar el aumento de los niveles de resistencia en los aislamientos
clínicos para tomar medidas correctoras.
 Por otro lado, también puede tener utilidad diagnóstica porque el perfil de
resistencia puede en algún caso orientar en la identificación bacteriana.

5. ¿MANIFIESTE USTED POR QUÉ ES IMPORTANTE CONOCER EL

FUNDAMENTO DE LOS MÉTODOS MICROBIOLÓGICOS DE
CULTIVO Y AISLAMIENTO?

 Conocer los fundamentos es esencial en la práctica médica, saber de dónde

proviene, y saber qué pedimos es fundamental y se debe poner en práctica una
serie de acciones que le permitan asegurar una adecuada práctica en el aislamiento,
identificación y caracterización de agentes etiológicos y su correspondiente prueba
de susceptibilidad como una guía de la terapia conociendo el fundamento de estos
procedimientos. Se debe poner especial énfasis en la capacitación permanente del
personal puesto que la medicina es basada en evidencias y existe constante
cambios en todo tipo de procedimientos que conociendo el fundamento podremos
estar al margen con la tecnología y los avances.

BIBLIOGRAFÍA (VANCOUVER)
1. Castro J., MÉTODOS DE DETERMINACIÓN Y SU INTERPRETACIÓN. Rev Médica
Hondureña. 2014;69:118–120. 14(2). Available at:
http://sisbib.unmsm.edu.pe/bibvirtualdata/tesis/salud/Tananta_V_I/Bibliografia.p
df [Accessed 13 May 2017].
 2. Zárate MS, Dadamio J, Alí S, Giordanelli A, Smayevsky J, Torres M. "Desarrollo y
evaluación de una muestra para control de calidad en Microbiología". Acta
Bioquímica Clínica Latinoam. 2015 Mar;41(1):57–61.

3. Mandela C., Zambo B. MICROBIOLOGÍA: TÉCNICAS MICROBIOLÓGICAS. Med Lab.

2010;16(07-08):311–354. [online] Scielo.org.pe. 5(2) Available at:
http://www.scielo.org.pe/scielo.php?
pid=S172646342005000100012&script=sci_arttext [Accessed 13 May 2017].
4. Solan Murray, P.: Manual of Clinical Microbiology. A.S.M Press, American Society
for Clinical Microbiology, Washington DC, 1999. Available at:
http://repositorio.binasss.sa.cr/xmlui/bitstream/handle/20.500.11764/284/3567.p
df?sequence=1[Accessed 13 May 2017].

5. López LE., Hernández M., Colín CA., Ortega S., Cerón G., Franco R. LAS TÉCNICAS
BÁSICAS EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA. [citado 13 de mayo de 2017];
Obtenido en: http://www.Medigraphic.Compdfsinvdisir-2014ir141b.Pdf

6. MINSA. MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO

DE LOS PARÁSITOS INTESTINALES EN EL HOMBRE. (2003). 1st ed. Lima: Instituto
Nacional de Salud. Available at: http://bvs.minsa.gob.pe/local/ins/165_nt37.pdf

7. Seidenfeld A., Glidden C. & Henrickson D.: Quality Assurance in the Clinical
Microbiology: Applying ISO 9000 Quality Standars. Clinical Laboratory News. The
American Association for Clinical Chemistry, Washington DC. 2012; 23 (8), 11-15.
Available at: https://conalepfelixtovar.wordpress.com/2012/09/26/tecnicas-y-
metodos-de-aislamiento-y-seleccion-de-microorganismos/

8. MINSA. MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO

DE LOS ORGANISMOS PATÓGENOS EN EL HOMBRE. (2010). 1st ed. Lima: Instituto
Nacional de Salud. Available at: http://bvs.minsa.gob.pe/local/ins/_nt37.pdf

9. Facundo, M., Carbajal, H. and Carbajal, R. (2013). “ Los medios de cultivo en

microbiología”. [online] 5(2) Available at:
http://www.microinmuno.qb.fcen.uba.ar/SeminarioMedios.htm [Accessed 13 May
2017].

PRÁCTICA Nº 10

MÉTODO MICROBIOLÓGICO: ANTIBIOGRAMA

PRINCIPIOS GENERALES
  Es una prueba que se pide cotidianamente al laboratorio, a fin de seleccionar el
antibiótico más eficaz en el tratamiento de una infección determinada.
 Consiste en efectuar un cultivo del microorganismo en el medio más apropiado y
después diseminarlo en placa Petri con agar, al que se le colocan discos de papel
de filtro impregnados con solución de antibiótico.
1. MATERIALES:
 Hisopos de algodón estéril en tubos de ensayo, para recolectar muestras.
 Placa con crecimiento bacteriano (Colonias).
 Mascarilla protectora.
 Guantes.
 Caldo Soya Tripticasa 30g – 1L se requiere (4ml).
 Estufa.
 Agar Mueller Hinton.
 Antibióticos.
2. PROCEDIMIENTO:
1. Extraer la muestra de una placa con crecimiento
bacteriano elegir unas 4- 5 colonias.

2. Sembrar en el caldo Soya Tripticasa previamente

elaborado en la anterior práctica.

PREPARADO EN LA ANTERIOR PRÁCTICA

3. Sembrar en el caldo Soya Tripticasa (4ml),

llevar a la estufa de 2 – 4 h, en este tiempo
debe desarrollar las bacterias y estar
comprable a una escala “Nefelómetro de
Macfarland Nº 5” se obtiene preparando:
 “ClBa2H2O 1% (0.5ml) + H2SO4 1% (0.5ml)” esto nos muestra la cantidad de bacterias de las 5
colonias (1.5x109 m.o.cc3).

4. Con ayuda de un hisopo estéril, realizar la siempre de manera horizontal, vertical y diagonal (para
que se desarrollen los m.o.) en una placa de agar de Mueller Hinton, que tiene que tener una
distancia de profundidad de 4mm (se consigue adicionando de 20 – 25 ml de agar)
5. Dejar la siembra por 5’ y agregar los discos de

antibióticos. Previamente marcado.

6. Agregar cada antibiótico correspondiente.

7. C
a
d
a

antibiótico debe estar separado por 3cm, dejar

reposar por 15’ y llevar a la estufa (incubar de 18 –
24 h).