Parte 1 - Preparación de la muestra

La clave para una identificación exitosa es comenzar con una muestra "buena". Muchas
bacterias patógenas no crecen bien en medio de cultivo sólido, haciendo difícil la identificación
por medios tradicionales. (¿Por qué?) Sin embargo, incluso los cultivos bacterianos de
crecimiento deficiente pueden identificarse con los métodos utilizados en este laboratorio. En
este laboratorio, usted actuará como patólogo o tal vez como técnico de laboratorio de
patología en un hospital de investigación bien equipado. Su tarea es identificar una muestra
bacteriana recibida de un clínico. Asumiendo que usted ha logrado crecer colonias bacterianas
en un plato de cultivo medio sólido, el primer paso es recoger una sola colonia y dejarla caer
en un tubo de microcentrifugación.

El proceso de extracción de ADN bacteriano consiste en disolver la pared celular con un

tampón digestivo (en la botella con tapa blanca) disponible como un kit comercial. El tampón
contiene enzimas proteolíticas que "se comen" la pared celular. Este paso puede tardar varias
horas. Ya que usaremos otras enzimas en el siguiente paso, necesitamos deshacernos de las
enzimas proteolíticas antes de poder proceder. Las enzimas se desnaturalizan calentando la
muestra en un baño de agua a 100°C. A continuación, los residuos celulares se hilan hacia
abajo en la centrífuga y aparece como un depósito sólido (pellet) en el fondo del tubo. El ADN
está contenido en el sobrenadante (el líquido), que luego se transfiere al tubo de PCR.

Parte 2 - Amplificación PCR

Haga clic aquí para aprender ¿Qué es la PCR? Paso 1: Añadir Master Mix Para preparar la
reacción en cadena de la polimerasa (PCR), añadiremos la solución PCR Master Mix a nuestra
muestra de ADN. La solución PCR Master Mix (en la botella con tapa roja) contiene lo
siguiente: agua; un tampón para mantener la mezcla al pH correcto para la reacción PCR;
grandes cantidades de los cuatro nucleótidos adenina, citosina, guanina y timina; grandes
cantidades de oligonucleótidos cebadores de ADN que se unen a la región de 16S rDNA para
iniciar el proceso de replicación (¿Qué son cebadores?); y una polimerasa de ADN
termoestable que extiende la copia de la cadena de ADN.

Al mismo tiempo que la reacción de prueba, prepararemos reacciones de control negativas y

positivas. En lugar de la muestra de ADN, la reacción de control positivo contiene ADN de
control positivo (la solución de 16S rDNA en el frasco con tapa verde) mientras que la reacción
de control negativo contiene agua desionizada estéril. Ambas reacciones contienen la solución
PCR Master Mix. Paso 2: Ejecutar PCR Una vez que los tubos de reacción se cargan en el
termociclador (la "máquina de PCR"), el proceso automático de replicación de ADN se inicia
(consulte la animación). La máquina utilizada en este laboratorio tiene lecturas que describen

lo que está sucediendo:

(de izquierda a derecha: temperatura, tiempo restante, número de ciclo, fusión, recocido y
extensión) El control de temperatura se establece de la siguiente manera: Paso inicial de
incubación: 95°C durante 10 minutos 30 ciclos de la siguiente secuencia de pasos: Fusión: 95°C
30 segundos Anexo: 60°C 30 segundos Extensión: 72°C 45 segundos Paso final de extensión:
72°C 10 minutos Paso final: 4°C almacenar a esta temperatura

Durante cada ciclo, el primer paso (fusión) es separar las dos cadenas de ADN en la doble
hélice calentando el vial que contiene la mezcla de reacción de PCR a 95°C durante 30
segundos. Los cebadores no pueden unirse a las hebras de ADN a una temperatura tan alta,
por lo que el vial se enfría a 60°C. A esta temperatura, los cebadores se unen (anneal) al ADN
de una sola hebra. (La razón por la que las dos hebras separadas de ADN no son reanneales es
que hay un gran exceso de cebadores en la solución; por lo tanto, es más probable que las
hebras de ADN se unan a los cebadores en lugar de uno al otro.) El paso final (Extender) es
permitir que la polimerasa de ADN extienda la copia de la cadena de ADN elevando la
temperatura a 70°C durante 45 segundos.

Los tres pasos -la separación de las hebras, el recocido de la imprimación a la plantilla y la
síntesis de nuevas hebras- toman menos de dos minutos. Cada uno se lleva a cabo en el mismo
vial. Al final de un ciclo, cada pieza de ADN en el vial se ha duplicado. El ciclo se puede repetir
30 o más veces, y cada pieza de ADN recién sintetizada actúa como una nueva plantilla.
Después de 30 ciclos, se pueden producir 1 millón de copias de la pieza inicial de ADN.

Parte 3 - Purificar PCR Producto

El tubo debe contener ahora muchas copias de 16s rDNA, cada uno alrededor de 1.500 pares
de bases (bp) de largo. En este momento, es prudente ejecutar un gel para confirmar que la
reacción de PCR funcionó. El gel debe contener tres carriles: uno para el control negativo (es
decir, agua), que no debe tener un producto a menos que el agua esté contaminada; otro para
el control positivo (producto de PCR de una secuencia de ADN conocida) para asegurarse de
que la propia PCR funcionó; y el último carril para tu muestra.

Si está seguro de que la PCR funcionó, puede proceder a la purificación del producto PCR.
Ejecutar un gel es en realidad un método de purificación. Una vez que el producto PCR está en
el gel, puede cortar la banda correspondiente al producto PCR y aislar el ADN del gel. Hoy en
día, se pueden comprar microfiltros compactos para filtrar el ADN del tubo de PCR sin correr
un gel. Usaremos tales columnas de microconcentrador en nuestro procedimiento: Inserte la
columna de microconcentrador de tamaño apropiado en un tubo de recolección. Añadir 400
µL de buffer a la columna. Añadir todo el contenido de PCR (~100 µL) a la columna. Girar la
columna a 3.000 rpm en una centrifugadora de ángulo fijo durante 15 minutos. El producto
PCR debe quedar atrapado en la columna, mientras que el tubo de recogida debe contener
todos los cebadores, nucleótidos y otros compuestos pequeños que ya no necesitamos. Retire
el tubo de recogida y deséchelo. Invierta la columna y colóquela en un nuevo tubo de recogida.
Añada 50 µL de tampón a la columna invertida. Este paso debe aflojar el ADN de la columna en
el tubo de recolección. Girar la columna invertida a 3.000 rpm durante 2 minutos para recoger
la muestra en el tubo de recogida. Descartar la columna. El tubo de recolección final ahora
debería tener muchas piezas de 16S rDNA de 1500 bp de largo, con una cantidad muy pequeña
de hebras de ADN más largas (que son contaminantes).

Parte 4 - Prepárese para la secuenciación

La muestra de ADN ha sido purificada; su tubo de PCR ahora debe contener casi nada más que
copias del 16S rDNA. Ahora, podemos preparar la muestra para la secuencia automática. La
tecnología de secuenciación de ADN es otra área de la biología molecular que ha visto una
impresionante cantidad de refinamiento. El método predominante, ilustrado aquí, se llama
secuenciación de ciclos PCR. (Aprenda sobre la secuenciación de ciclos antes de proceder.)

En este laboratorio, usamos un conjunto de 12 cebadores; seis para cada hebra del ADN de
doble hebra. Teóricamente es posible utilizar un primer único en la secuenciación del ciclo de
PCR, pero no es factible para secuencias largas. Con múltiples cebadores, se secuencian tramos
cortos y superpuestos de ADN para obtener la secuencia completa. Además, no es
absolutamente necesario secuenciar ambas hebras, aunque secuenciar ambas hebras genera
datos redundantes, reduciendo así el error. El número exacto y la ubicación de los cebadores
utilizados en una reacción dependen de la disponibilidad de cebadores adecuados. Los
cebadores utilizados aquí están disponibles de una fuente comercial y se unen a regiones
conservadas del gen 16S rDNA. Por lo tanto, deben ser capaces de unirse a la secuencia
independientemente de la fuente bacteriana.

Cada tubo verde y azul contiene una "cerveza secuenciadora" que consiste en tampones,
cebadores (uno diferente en cada tubo), polimerasas de ADN, nucleótidos y terminadores de
fluorescencia etiquetados en proporciones adecuadas. El producto PCR del paso anterior se
añade a cada tubo y se ejecuta otro PCR. Esta vez el objetivo no es producir copias idénticas de
ADN, sino muchas copias de longitud variable. La animación ilustra lo que está sucediendo en
un tubo que contiene el primer 651R. Cada hebra de ADN se une a la imprimación en un
extremo y tendrá un terminador marcado con fluorescencia en el otro extremo.

Parte 5 - Secuenciación de ADN

Desde el último paso, usted tiene 12 tubos que contienen el producto final de PCR, una mezcla
de piezas de ADN de longitud variable. Todas las piezas de ADN en cada tubo comienzan con la
misma imprimación pero terminan con un nucleótido diferente etiquetado con un marcador
fluorescente (color diferente para cada nucleótido A, T, G, C). Lo que queda por hacer es
separar las piezas individuales de ADN e identificar el nucleótido final.

Esto se hace mediante el uso de un secuenciador automático que realiza electroforesis de gel
en el ADN en cada tubo. La electroforesis en gel es un método para separar moléculas basado
en diferencias de tamaño. El secuenciador utilizado en este laboratorio tiene un tubo capilar
delgado unido en un extremo a un mecanismo de jeringa que contiene una solución
amortiguadora. El tubo se llena con la solución tampón y el otro extremo se inserta en uno de
los tubos que contienen las piezas de ADN. Luego, se aplica una corriente eléctrica para que el
extremo del tubo en contacto con el ADN tenga una carga negativa y la jeringa termine con
una carga positiva. Dado que las moléculas de ADN están cargadas negativamente, comienzan
a moverse a través del tubo hacia el extremo de la jeringa cargada positivamente, con las
piezas más pequeñas moviéndose más rápido que las más grandes. Cerca del extremo de la
jeringa, el tubo capilar pasa a través de un rayo láser que excita los marcadores fluorescentes,
y los detectores ópticos detectan el color de la fluorescencia.

Podemos asumir que un conjunto completo de piezas de ADN, todas de diferente tamaño por
exactamente un nucleótido, fueron generadas en el paso anterior. La pieza más pequeña de
ADN que tiene una etiqueta fluorescente conectada a ella es la imprimación. Este fragmento
de ADN viajará más rápido que los otros. Al leer el color (en nuestro ejemplo, rojo),
determinamos que el primer nucleótido más allá de la secuencia de imprimación es timidina
(T). La siguiente pieza más pequeña de ADN fluorizará con el color (verde) que representa el
siguiente nucleótido en la secuencia (A) y así sucesivamente (ver la animación). Al leer la
secuencia de nucleótidos basada en su fluorescencia a medida que las piezas de ADN pasan a
través del rayo láser, la secuencia del ADN se puede reconstruir.

El secuenciador elimina automáticamente el buffer del tubo, mueve la bandeja y vuelve a

ejecutar la electroforesis, repitiendo el programa hasta que se hayan examinado los 12 tubos.
Los conjuntos resultantes de secuencias son compilados por un programa de computadora
para construir la secuencia completa del gen rRNA 16S.
Parte 6 - Análisis de secuencias de ADN

Muestra A - Líquido del ganglio linfático (Consulte la sección Muestras para más información)
Después de que la información de la secuencia se ha reunido de todos los tubos de reacción, la
computadora construye la secuencia real haciendo coincidir diferentes piezas. Ahora tenemos
la secuencia de ADNr 16S para esta especie bacteriana, que se puede comparar con todas las
otras secuencias de ADNr 16S conocidas para la identificación. Aprenda sobre la ciencia detrás
de la concordancia de secuencias.

Existen muchas bases de datos de secuencias. Algunas bases de datos se venden

comercialmente como parte de un kit de identificación. En este ejemplo, utilizaremos la base
de datos pública GenBank disponible a través de la Biblioteca Nacional de Medicina. El
algoritmo de coincidencia se conoce como BLAST (Herramienta de búsqueda de alineación
local básica). Una coincidencia directa de la secuencia de ADN determina la especie bacteriana
exacta que has encontrado. Cuando la secuencia de ADN no es una coincidencia exacta, sino
una coincidencia cercana a otra que se encuentra en la base de datos de secuencias, es
necesario evaluar si se trata de una nueva especie o una variación de una existente. Obtenga
más información sobre los resultados de búsqueda de BLAST.

Ahora siga estos pasos para identificar su muestra: Paso 1: Abra la salida de datos del
secuenciador. (Esto abrirá una nueva ventana del navegador.) Seleccione y copie los datos de
la secuencia dentro de la caja gris. (ctrl-c en el PC o cmd-c en el Mac) Paso 2: Vaya al sitio web
de NCBI para realizar su búsqueda. (Esto abrirá una nueva ventana del navegador.)

Paso 3: En la página BLAST del sitio web del NCBI, bajo la sección "Entrar secuencia de
consultas", pega los datos de la secuencia del paso 1 en el cuadro etiquetado "Entrar
número(s), gi(s), o secuencia(s) FASTA." En la sección "Seleccionar conjunto de búsqueda: base
de datos", ya se deben seleccionar "bases de datos estándar (nr etc.)" y "Colección de
nucleótidos (nr/nt)". Cuando esté listo, haga clic en el botón azul "BLAST" más abajo en la
página. (Actualizado 4/29/2020) Paso 4: Siga las instrucciones proporcionadas por el sitio NCBI
para obtener sus resultados. Paso 5: Volver a esta página (que debe permanecer abierta) e
identificar las bacterias en la ventana del laboratorio a la izquierda.