GPeUE& Gholi’ Con.o3. on f Vox a 2 5 eon eo 124 Universidad de Buenos. estites q Bavuliad de Basmacie y Bioquimien | CALIDAD DE MEDICAMENTOS GUIA DE TRABAJOS PRACTICOS 2015 | 22 Parte Dra. Adriana |. SegallCONTROL DE CALIDAD DE MEDICAMENTOS SEELE CALIDAD DE MEDICAMENTOS. Para la presente edicién participaron: Marta Asero Silvana Basualdo Raul Casaubon Rita Ceresole Claudio Coifman Leonardo Ferello K Marcelo Palacios ‘a Manco TRABAJOS PRACTICOS SEGUNDA PARTE AUTORES DE LA VERSION REVISADA, Vanina Perez Eduardo Rodriguez Maria Ana Rosasco Laura Simionato Sebastian Stamer Guillermo Uemura Fabiana Vitale Patricia Zubata ‘ADEMAS COLABORARON EN LA VERSION ORIGINAL Daniel Colombari Irma Ercolano Dolores Gilemberg. Florencia Hormaechea Esteban Orecchia Sergio Teves Prof. Dra. Adriana I. Segall Paula Otafio Horacio Pappa Ma. Teresa Pizzorno Nicolas Regiero José Luis TombazziCONTROL DE CALIDAD DE MEDICAMENTOS TRABAJOS PRACTICOS SEGUNDA PARTE "CAPITULO NOMBRE PAGINA [42 CROMATOGRAFIA 223-271 Ff DA TA 13 CROMATOGRAFIA LIQUIDA DE AL = | EFICIENCIA INAS DE FASE REVERSA - COLUMINAS DE FASE REVE oo QUIMICAMENTE UNIDAS 15 CROMATOGRAFIA DE GASES 332-355 | 16 | BIODISPONIBILIDAD 356-372 = DISOLUCION DE FORMAS = “| FARMACEUTICAS SOLIDAS | Li D Y | 18 ESTABILIDAD DE DROGAS oe MEDICAMENTOS [49 MATERIAL DE ACONDICIONAMIENTO 428 — 462 [- CONTROL MICROBIOLOGICO DE 20 ; a 463-489 | | FARMACOS + 4 ~ TEMPERATURA DE FUSION Y METODOS. 21 DE ANALISIS TERMICO 1.13- 12.13 PooCatedra dé Control de Calidad de Medicamentos CROMATOGRAFIA - INTRODUCCION GENERAL La cromatografia es un método muy utilizado, que permite la separacién, identificacién y ‘determinacién de los componentes quimicos en mezclas complejas. Ningtin otro método de separacién es tan potente y de aplicacién tan general como la CROMATOGRAFIA, El boténico ruso Tswett publicé la primera descripcién de un sistema en 1906. Este autor utilizé este método para separar pigmentos coloreados de las plantas (xantofilas y clorofilas). Colocé los extractos de la planta en la punta de una columna de vidrio llena de carbonato de calcio y después vertié un disolvente organico; los diferentes pigmentos se separaron en funcién de su afinidad relativa por el carbonato de calcio o el disolvente organico. Las especies separadas aparecian como bandas coloreadas sobre la columna, ‘lo que explica el nombre de este procedimiento. La cromatografia se define como un procedimiento mediante el cual se separan solutos Por un proceso dindmico de migraci6n diferencial en un sistema que consta de dos fases, una de las cuales se mueve continuamente en una direccién dada y en la que las sustancias individuales presentan diferentes movilidades a causa de diferencias de adsorcién, particién, solubilidad, presién de vapor, tamafio molecular o densidad de carga lonica. Las sustancias individuales asi separadas se pueden identificar o determinar mediante procedimientos analiticos. La técnica cromatogréfica general requicre que un soluto se distribuya entre dos fases, una fija (fase estacionaria) y otra mévil (fase mévil). La fase mévil transfiere el soluto a través del medio, hasta que éste finalmente emerge separado de otros solutos que eluyen antes o después. En general, el soluto es transportado a través del medio de separacion Por medio de una corriente de disolvente liquido 0 gaseoso denominado" eluyente” .La fase estacionaria puede actuar mediante adsorcién, como en el caso de adsorbentes como ta allimina activada y el gel de silice, o puede actuar por disolucién del soluto, produciendo una particién del soluto entre la fase estacionaria y la mévil. En el Ultimo proceso, se utiliza -como fase estacionaria un recubrimiento liquido aplicado sobre un soporte inerte o unidoCatedra de Control de Calidad de Medicamentos quimicamente al gel de silice, o aplicado directamente en la pared de un capilar de silice fundida. La particién es el mecanismo predominante de separacién en la cromatografia gas liquido, en la cromatografia en papel y en las formas de cromatografia en columna y cromatograt en capa delgada denominada separacién liquidio-Iiquido. En la practica, las separaciones son frecuentemente el resultado de una combinacién de efectos de ‘adsorcién y de particién. Otros principios de separacién incluyen el intercambio iénico, la formacién de pares iénicos, la exclusion por tamajio, la interaccién hidréfoba y el reconocimiento quiral. Resumiendo, la CROMATOGRAFIA es una técnica en la cual los componentes de una mezcla se separan a partir de las diferencias de velocidad a la que son transportados a través de una fase fija 0 estacionaria por una fase mévil gaseosa o liquida. La velocidad de migraci6n es funcién de la diferencia de afinidad entre las fases estacionaria y mévil. Entre mayor sea la afinidad de las sustancias por la fase estacionaria, mayor es la retencién de das mismas. Los tipos de cromatografia ttiles en el andlisis cualitativo y cuantitativo que se emplean en los procedimientos cromatograficos son: = Cromatogratia en columna * Cromatografia de gases * Cromatografia en papel. + Cromatografia en capa delgada * Cromatografia de Ifquidos presurizados (cominmente llamada cromatografia liquida de alta resolucién), Las cromatografias en papel y en capa delgada son por lo general més illiles para fines de identificacién, debido a su comodidad y sencillez. La cromatografia en columna oftece una mayor vatiedad de eleccién de fases estacionarias y es util para la separacién cuantitativa de compuestos individuales contenidos en una mezclaCROMATOGRAFIA GAS- LIQUIDO Liquide adsorbido.o | Reparto entre gas y GASEOSA unido a una superficie liquido. solida. GAS- SOLIDO Sélido Adsorci6n CROMATOGRAFIA / LIQUIDO- LIQUIDO © | Liquide adsorbido o | Reparto entre liquids LIQUIDA PARTICION unido a una superficie inmiscibles. sélida LIQUIDO SOLIDO O Sélido Adsorcién ADSORCION INTERCAMBIO Resina de Intercambio iénico lonico intercambio iénico EXCLUSION POR Liquidos en los Reparto o tamizado TAMANO intersticios de un sélido polimero lr AFINIDAD Liquido con grupo especifico unido a una superficie solida Reparto entre liquido superficial y liquide movil: Catedra de Control de Calidad de Medicamentos CLASIFIGACION DE LOS METODOS CROMATOGRAFICOS _ METODO cRomaToGRAFICO — | DESCRIPCION CLASIFICACION La fase estacionaria esta contenida en un tubo estrecho *CROMATOGRAFIA CROMATOGRAFIAEN | y se fuerza el paso de la fase GASEOSA l- COLUMNA mévil a través del tubo, ya sea | Por presion o por capilaridad | *cROMATOGRAFIA LIQUIDA | La fase estacionaria esta sostenida sobre una placa *CROMATOGRAFIA EN plana o en los poros de un PAPEL papel. La fase mévil se CROMATOGRAFIA PLANA. | desplaza a través de la fase estacionaria por capilaridado | *cROMATOGRAFIA EN i por efecto de la gravedad. CAPA DELGADA TEORIA DE LA CROMATOGRAFIA DE ADSORCION Los primeros trabajos en la cromatografia se basaron en la adsorcién de especies de analitos en una superficie sdlida. Aqui, la fase estacionaria es la superficie de un sdlido Polar finamente dividido. Con dicho empaquetamiento, el analito compite con la fase mévil Por los sitios sobre la superficie del empaquetamiento y la retencién se debe a las fuerzas de adsorcién. La silice y la alimina finamente divididas son las Unicas fases estacionarias de uso generalizado en la cromatografia de adsorcién.En la adsorcién intervienen enlaces intermoleculares de poca energia que son de tres tipos: 1) Fuerzas de van der Waals 2) Enlaces por puentes de hidrégeno. 3) Complejos de transferencia de carga entre dadores y aceptores de electrones. En el proceso cromatografico sélo interviene la fisisorcién. Una molécula fisisorbida no pierde su identidad. 1) Fuerzas de Van der Waals Son fuerzas de atraccién, no especificas: 1a) Las fuerzas de Keesom resultan de la interaccién electrostatica entre moléculas polares. 1b) Las fuerzas de Debye resultan de un momento dipolar inducido, proporcional a la polaridad. 1c) Las fuerzas de London, son fuerzas de dispersién originadas por el movimiento electrénico. En un instante determinado una molécula puede distorsionarse de tal forma que produce un dipolo en el cual una parte de la molécula es mas negativa que el resto. En el instante siguiente las posiciones de los dipolos negatives y positives se cancelan de modo tal que las moléculas no polares presentan la cualidad de cancelar sus dipolos en un medio dado.C&tedra de Control de Calidad de Medicamentos ‘Sin embargo esta propiedad varia con los medios, de este modo existen medios que en la misma molécula inducen la formacién de dipolos en moléculas vecinas, creandose deformaciones en las nubes electrénicas del macro sistema’ con las consecuentes ‘atracciones entre dipolos negativos y positivos. Las fuerzas de atraccién entre estos dipolos instantaneos se denominan* Fuerzas de London” . Las fuerzas de London mas fuertes se presentan entre las moléculas grandes y complejas que poseen grandes nubes electrénicas que se distorsionan o polarizan facilmente. En el caso de las moléculas no polares, las Fuerzas de London son las tnicas fuerzas intermoleculares que existen. Las Fuerzas de London dependen del tamajio de la molécula. 2) Cuando un dtomo muy electronegative A (A = F, O, N, etc.) se une a un atomo de hidrégeno, se produce una polarizacién interna de esta unién. Al tomo A se le puede atribuir el incremento de carga negativa a ~y al Atomo H, el incremento de carga positiva, 4 *, la unién forma asi un dipolo electrostatico. La interaccién entre dos dipolos se llama enlace por puente de hidrégeno: B-5+5-5+ A-H-A-H En comparacién con un enlace covalente, es un enlace de poca energia y gran longitud. Su existencia permite que las moléculas se orienten en el seno del liquido, se ordenan en el espacio lo que baja la entropia del liquido, su energia libre, lo que se traduce en una ganancia de estabilidad. Ejemplo HO es mds estable que H2S. El numero de enlaces por puentes de hidrégeno que se establecen en una soluciénCatedra de Control de Calidad de Medicamentos depende de la temperatura. El proceso de adsorcién puede ser descripto por medio de las denominadas Isotermas de Adsorcién que muestran la cantidad de soluto adsorbido por unidad de peso del adsorbente (Xa) versus la concentracién de soluto en la solucién (Xm). Donde: Xa = Cantidad de soluto adsorbido / Unidad de peso del adsorbente De este modo son posibles varios tipos de Isotermas, siendo las mas clasicas las que se ‘Teproducen a continuacién: comosnte. de gat, Ldneal (1) convene (2) cénoave (3) En todos, los casos se alcanzan un limite en la adsorcién por saturacién del adsorbente yes probable que ello ocurra, cuando el 75 % de la superficie se cubra con una capa mono molecular. En la mayoria de los casos el proceso de adsorcién responde a una isoterma del tipo 2, aun cuando muchas consideraciones tedricas se llevan a cabo sobre isotermas del tipo 1Catedra de Control de Calidad de Medicamentos TEORIA DE LA CROMATOGRAFIA DE PARTICION En la cromatografia de particidn, las sustancias que se desean separar se dividen entre dos liquidos inmiscibles, uno de los cuales, la fase inmévil o estacionaria, se adsorbe en un soporte sélido, presentando de este modo un area de contacto muy grande con el disolvente que fluye o fase movil. El grado de particion de un compuesto dado entre las dos fases liquidas se expresa por un COEFICIENTE DE PARTICION. Esta es una propiedad intrinseca de cada sustancia y representa la capacidad de la misma de repartirse entre dos fases. El coeficiente de Particién es una magnitud real que resulta de comparar mediante una relacion de orden, la concentracién de una sustancia entre dos fases. Por ejemplo, la Kp de la Clorpromazina en octanol - agua representa el cociente entre las concentraciones de esa sustancia entre las fases mencionadas. Mientras mayor sea la Kp mas disuelta estard la sustancia en octanol que en agua La cromatografia de particién puede dividirse en variantes: = Liquido - liquido = Liquido - fase enlazada __ Ladiferencia entre ambas radica en la forma de mantener la fase estacionaria sobre las particulas de soporte del empaquetamiento. En la cromatografia liquido-liquido, el tiquido se mantiene por adsorcién fisica, mientras que en la de fase enlazada se enlaza quimicamente. En sus inicios, la cromatografia de particién, sélo era liquido-liquido, pero actualmente predomina la de fase enlazada dada su mayor estabilidad.Catedra de Control de Calidad de Medicamentos = Empaquetamientos de fase enlazada Muchos empaquetamientos de fase enlazada se preparan por reaccién de un organo clorosilano con los grupos OH formados en la superficie de particulas de silice por hidrdlisis en Acido clorhidrico diluido caliente. El producto es un organosiloxano. La seaccién de uno de estos sitios SiOH en la superficie de una particula puede representarse como sigue: CH, Uf, + 4 fis wD eee a ae CHs kent) Donde R es frecuentemente un grupo octilo u octaldecilo de cadena recta. Otros grupos funcionales organicos que se han enlazado en superficie de silice son las aminas alifaticas, éteres y nitrilos, asi como hidrocarburos aromaticos. Asi pues, estan disponibles muchas ‘polaridades distintas para la fase estacionaria enlazada. Los empaquetamientos de fase enlazada tienen la ventaja de una estabilidad mucho mayor que las fases estacionarias que se mantienen inméviles fisicamente. NOTA: Se aclara el siguiente concepto. POLARIDAD Este concepto involucra la distribucion de cargas dentro de una molécula y por consiguiente modifica directamente las Fuerzas de London descriptas mas arriba. El concepto de polaridad se relaciona con el caracter idnico de las moléculas por lo tanto se acepta que los compuestos iénicos son altamente polares. Consecuentemente los compuestos covalentes tienen también (por deformacién de sus nubes electronicas) ciertoCAtedra de Control de Calidad de Medicamentos caracter (iénico) polar. En el proceso de separacién cromatogréfica la polaridad de una sustancia influye en: 1) El comportamiento de la sustancia en solucién. Las sustancias sdlidas tienden a disolverse en liquidos de polaridad semejante, por lo que: * Los compuestos polares se disolveran en solventes polares tales como el - agua, el metanol, el etanol, el acetonitrilo, etc., y/o mezclas entre ellos. = Los compuestos no polares se disolveran en solventes no polares tales como benceno, cloroformo, diclorometano, etc. y/o mezclas entre ellos. = Los compuestos de polaridad intermedia se disolveran en solventes de polaridad intermedia. 2) El poder adsorbente de una FE aumenta con la polaridad del soluto. Asi mismo los sitios activos de la fase estacionaria (que son los lugares donde se werifican los intercambios de materia) tienen mayor afinidad hacia aquellas sustancias que presenten cardcter idnico. La inversa es valida. CROMATOGRAFIA EN PLACA DELGADA Un principio fabuloso: separacién por adsorci6n, Erase una vez un rey poderoso que reinaba en un pais lejano. Como es de esperar, tenia una hermosa hija a la que queria casar precisamente con el hombre mas fuerte y vigoroso de su reino. Pero como encontrarlo? Hizo llamar a todos los sabios de su reino y les pidié consejo. Fue dificil ya que los sabios padecian todos de falta de creatividad. Excepto uno llamado Cromos. Este tenia una idea original: “ Majestad” , dijo al oeste de vuestro reino fluye un rio impetuoso.Catedra de Control de Calidad de Medicamentos Utilizadlo para un super concurso. Haced que vuestros ingenieros fijen en el rio estacas separadas regularmente, suficientemente altas y gruesas para que un nadador pueda asirlas. Si arrojais entonces un hombre al rfo, podré asirse a la estaca, donde también se agarraré. Cuanto mas fuerte sea el hombre mas a menudo y durante mds tiempo conseguira mantenerse agarrado. Si habéis fijado suficientes estacas entre el principio y el final, con toda seguridad llegaré a la meta primero el hombre mas débil y en tiltimo lugar e! hombre més fuerte. Va a ser una apasionante carrera para vuestros stbditos. El rey, siempre abierto a nuevas ideas deportivas, hizo acondicionar el recorrido de la carrera. No debia ganar el mas rapido sino el mas lento. Y asi sucedié de esta manera tan simple. Elegante y sin derramamiento de sangre se buscé al vencedor, quien se casé con la hija del rey. Los eruditos del deporte llamaron al rio fase movil, a las estacas, fase estacionaria y al tiempo que un atleta necesitaba para efectuar el recorrido, tiempo de retencién ya que la retencién equivale a agarrarse o permanecer y en honor al sabio consejero el rey llamaron al nuevo deporte CROMATOGRAFIA y como todos estos conceptos sonaban muy ‘cientificos, un buen dia los cientiicos se dieron cuenta de las fabulosas posibilidades del nuevo deporte. No enviaron al recorrido aspirantes a la mano de la hija del rey sino sustancias quimicas. En lugar de un rio impetuoso eligieron un solvente como fase mévil. Sustituyeron las estacas por sustancias adsorbentes, como el gel de silice o el dxido de aluminio. Y como podra verse en éste resumen, atin hoy se hacen cromatografias. Ya en tiempo de Aristoteles se utilizaban los efectos adsortivos de distintas tierras para tratar el agua de mar. La paternidad (y la denominacién) de las separaciones cromatograficas corresponde al botdnico ruso Tswett, como ya se mencioné con ‘anterioridad. Pasaron aproximadamente 30 afios hasta que fue reconocida la utilidad dela cromatografia de adsorcién como técnica analitica (por R. Kuhn y colaboradores, en 1931) Poco afios mas tarde, unos investigadores rusos trasladaron el principio a capas delgadas de adsorbentes. Dtahl y Kirchner desarrollaron a partir de aqui la cromatografia de capaCatedra de Control de Cal. fina La cromatografia en placa delgada es una de las técnicas més utlizadas en la Separacion ¢ identificacion de drogas. Es de igual aplicacién para drogas en estado puro Como Para aquellas extraidas de formulaciones farmacéuticas. Se ha mantenido como un Iétodo analitico primario por su simplicidad, bajo costo y selectividad de deteccién a través del uso de diversos procedimientos. Es un método de cromatografia en el cual la fase movil se mueve Por capilaridad a ‘ravés de una capa delgada uniforme de fase estacionaria uniformemente dividida (adsorbente) unida a un plato. Cuando una miezela de drogas se siembra sobre laplaca y Se desarrolla la cromatografia con una fase movil, las drogas correran a través de la placa dependiendo de su solubilidad, valores de pKa y capacidad de formar uniones puente de hidrégeno. Aunque TLC es una téenica de separacién primaria bajo condiciones controladas puede ser utilzada para identificacion y cuantificacién, Posee ciertas ventajas sobre GLC y HPLC: el aparato es mas barato, se puede correr un nlimero de muestras simulténeamente, hay una gran flexibilidad en la eleccién dela ase estacionaria (FE) y la fase mévil (FM). También posee la ventaja que la sustancia colocada sobre la placa permanece alli, olvidéndose de problemas de deteccién asociados con no elucién, inestabilidad térmica o enmascaramiento en el frente de solvente. TLC posee menor sensibilidad y resolucién que GC yHPLC aunque con el advenimiento de TLC de alta performance (HPTLC) se han reducido estas desventajas. FASE ESTACIONARIA __L@capa delgada correspondiente a la fase estacionatia esta unidaa una placa de vidrio, aluminio 6 plastico (tereftalato de polietileno). La adherencia a la Placa esta asegurada por la mezcla de sulfato de calcio con la FE. Las placas de vidrio son las mas comunes pero 'es otras poseen la ventaja que pueden cortarse en placas mas chicas y conservarse. EnCatedra de Control de Calidad de Medicamentos este caso las placas de vidrio se colocan sobre un papel o se fotografian. En la cromatografia de _adsorcién las FE son adsorbentes (silica 6 altimina) y la separacin se produce por las interacciones entre las drogas y la superficie de la FE (se muestra apropiada sobretodo para la separacién de componentes de polaridad distinta ‘cuyas energias de interaccién con un mismo adsorbente sean distintas. En contraposicién otro principio el de la cromatografia de particion utiliza otras FE, opera Por el proceso de particién entra dos fases inmiscibles (FE y FM),. De todos modos siempre existe una compleja interaccién entre los procesos de vadsorci6n y particion.Catedra de Control de Calidad de Medicamentos La componente 4 permanece pre | = erentemente en la superticie de Ia Taso estacionaria (adaorcien) © Sion fon la fase liquida estacionaris (per ticiéey, mientras que ta sustancla © ermanece preterenterente en Alu nueva tase mévil tas maléou- las Que se encontaban en el elu Yenta son transportacas mas lejos, huevo preterentemente a la compo onto Al mismo tiempo, las molkculas Breviamonte sdsorbidas o diaueltas Sn ia fase estacionaria paran’ fase movil y son taisponaes ‘Tras multiples repeticiones de estos 5 processing dow susanag se hen ereke | Eeredo a niociae gue el) permanecen proferenismente ee 7 fenta que las moisculae f. ee En otras palabras: el A, de 2 6s cm oe manor que oho ©. +s (FIGURA 1) Figura 1. Fenémenos de equilibrio en el proceso cromatografico: Absorcién (A) y Particion (B) G: soporte de la capa (placa de vidrio), O: superficie de la fase estacionaria, M: fase mévil, S: fase estacionaria “Cuando la FE es més polar que la FM el sistema se denomina Fase Normal(ej. Silica ycatedra de Control de Calidad de Medicamentos sv. no polares). Cuando la FM es més polar que la FE se denomina en fase reversa (é| ‘Placa impregnada con parafina usando agua como FM). En la cromatografia de particién las sustancias disueltas en la fase mévil se distribuyen entre esta fase y un segunda fluida adherida a un soporte fijo (por ej. gel silica en fase reversa 0 celulosa). Para ambos equilibrios y para bajas concentraciones de una sustancia A (pocos y gde muestra) es valida la relacion simplificada: K=Cs/Cm - donde Cs y Cm son las concentraciones de equilibrio de la sustancia A en las fases estacionaria y movil respectivamente. La figura 2 muestra gréficamente esta relacién. Cuando la concentracién de la sustancia en la fase mévil es alta (cercana a la concentracién de saturacién) deja de ser valida esta relacin simplificada. La curva llamada isoterma se dobla. La figura 3 muestra claramente el efecto del valor de K en el comportamiento cromatografico de dos sustancias A y B. Como puede observase a mayor K mayor afinidad de la sustancia por la fase estacionaria y menor velocidad de elucién. Cs= Conc. de equilibrio de la sustancia | get > 7 7 ie = tone ot iow Aen la fase __ estacionaria. Cs= Conc. de equilibrio de la sustanciaCatedra de Control de Calidad de Medicamentos Fig. 2. concentraciones de equilibrio de una Relacién entre las sustancia en la fase mévil y en la fase estacionaria. La curva representada se. llama isoterma de sorcién. Cm = Conc. de equilibrio de la Fig. 3. Dependencia de la velocidad cromatogréfica de avance de dos sustancias A y B (arriba) con las isotermas de sorcién (abajo). Co = Conc. de saturacién de la fase estacionaria sustancia A en la fase movil. Existe ademas la cromatografia de intercambio iénico que utiliza fase estacionaria con grupos cargados positiva o negativamente y es especialmente adecuada para la separacién de cationes y aniones asi como proteinas. La cromatografia de gel permeacién separa sustancias segtin el tamafio molecular. Para ello se emplean como fase estacionaria geles hinchados que presentan huecos bien definidos. Descripcién de las fases estacionarias FASES POLARES NO INJERTADAS: SILICA GEL Es el mas popular adsorbente de TLC. Es dcido silicico hidratado y es levemente acidico por naturaleza. Contiene en su superficie grupos Si-OH que pueden formar enlaces por puente de hidrégeno entre ellos o con sustancias polares. La cantidad maxima de grupos Si-OH disponible y por lo tanto la maxima actividad la presenta el gel de sflice activado a 150 °C; este tratamiento le hace perder el agua adsorbida. Cuando se utiliza sulfato de calcio como adherente se denomina Silica Gel G. Las placas tienen una distribucién uniforme de tamafio de particula que es normalmente de 20 ym deCAtedra de Control de Calidad de Medicamentos didmetro. En general se utilizan de un espesor de 250 jim hasta 2 mm en preparativa. Principio de retencién: Adsorcién / Particién (excepcionalmente). Campo de aplicacién: Sustancias no polares 0 poco polares. ALUMINA Es dxido de aluminio levemente basico. Necesita ser activada para mejores separaciones. Principio de retencién: Adsorcién / Particion. Campo de aplicacién: Separacién de compuestos basicos. KIESELGUHR Es Acido silicico amorfo de esqueletos de diatomeas y se denomina tierra silicea de diatomeas. Principio de retencio 1: Particion Campo de aplicacién: Sustancias polares. SILICATO DE MAGNESIO (FLORISIL) Se utiliza para separaciones especiales una vez que los otros adsorbentes has fallado. CELULOSA Simula a la cromatografia en papel. Las placas de celulosa en general, a igual espesor corren mas despacio que las placas de silica. Principio de retencién: Particion.‘ Campo de aplicacién: Separacién de moléculas polares (azticares, aminodcidos). Catedra de Control de Calidad de Medicamentos DIETILAMINOETILCELULOSA Principio de retencién: Intercambio iénico. Campo de aplicacién: Metabolitos catecolaminas. CELULOSA IMPREGNADA DE POLIETILENIMINA Principio de retencién: Intercambio iénico. Campo de aplicacién: Aniones inorganicos. POLIAMIDA 6 u 11 Principio de retencién: Particion Campo de aplicacién: Fenoles / Flavonoides. FASES INJERTADAS NO POLARES O POCO POLARES La diversidad de fases injertadas es relativamente limitada en comparacién con la que se tiene para HPLC, pero est4 en progreso continuo. Aunque este modo de cromatografia (fase reversa) no es tan aceptada para capa delgada por las dificultades practicas que limitan la aplicaci6n. La limitacién principal es el cardcter hidrofébico de las placas injertadas con C18, C12, C8 y C2 coriercialmente disponibles. Esto hace que la utilizacin de fases moviles con grandes cantidades de agua (superior a 40%) sea impracticable 0 solamente posible con tiempos de revelado muy largos (mas de 10 2 horas)-Celulosa acetilada 10, 20, 30, 40% Particién Poco usado Silices injertados Gel de silica 60 A° silanizado Alquilo (C2, C8, C18) Adsorcién en el caso de mezclas con gran contenido de disolvente organico Particion Sustancias no polares Acidos grasos, grasa, productos aromiticos y policiclicos. ‘Sustancias polarés con la utilizacion del apareamiento iénico Las ventajas de la Cromatografia planar en fase inversa son: 1) Aumenta el campo de aplicacién a sustancias polares y no polares. 2) Existencia de una relacién lineal entre la fuerza eludtropa y el Rf de muy grandes proporciones, que no és el caso con el silice. Los inconvenientes: incompatibilidad con disolventes muy acuosos por:oarC&tedra de Control de Calidad de Medicamentos Particion Amidas Disolvente acuoso Clanopropilo CN Adsorcién Compuestos polares Disolvente organico a Compuestos poco Gliceropropilo (Stlice diol) Adsorcién polares FASES ESTACIONARIAS DE INTERCAMBIO Y A PAREAMIENTO DE IONES El silice injertado amino es una sustancia de intercambio de aniones de caracter débil pero suficiente: Si- O- Si- (CH2)3- NH2 en medio débilmente Acido (pH 4)se protona y da Si- R- NH3¥. Esta propiedad se utiliza para separar los fosfatos. Para que una cromatografia de intercambio iénico se realice el soluto debe estar ionizado, lo que significa en casi todos los casos el uso de una solucién acuosa. Los polietilenos imina y las dietilaminocelulosas son sustancias de intercambio de aniones. Las placas Fixion ® consisten en resinas del tipo poliestireno / divinilbenceno en la forma de sulfonato o de amonio cuaternarios. Las sustancias para apareamiento iénico més comunes son los sulfaios o sulfonatos por una parte y los amonios cuaternario por otra. Son particularmente tiles para sustancias de alto peso molecular y para materiales anfotéricos. Se utilizan como FM acido fuertes y alcalis.Catedra de Control de Calidad de Medicamentos SEPARACION DE ENANTIOMEROS: La celulosa y sus derivados, triacetato de celulosa, permiten obtener selectividades notables. Las ciclodextrinas son moléculas enantioselectivas, que tienen una estructura en forma de tronco cénico cuyo borde consiste en unidades glucosidicas que puéden formar puentes de hidrégeno. FASE MOVIL La eleccién de una FM de un solvente simple o de una mezcla depende de los compuestos a separar y de la FE a utilizar. Los solventes deben ser faciles de obtener en forma pura, estables al aire o cuando son mezclados con acidos 6 alcalis capaces de ser removidos con facilidad de la placa después de la corrida cromatografica, no téxicos y no deben reaccionar con las sustancias a separar. Se debe advertir acerca de una confusién de concepto: la composicién de la mezcla eluyente (FM) puede aunque no necesariamente debe, ser idéntica a la FM efectiva cromatogréficamente porque’ el eluyente también esté sometido al proceso cromatogrdfico. Este fenémeno se pone de relieve cuando se utilizan eluyentes de mas de un componente dando lugar a los llamados frentes &. Un ejemplo: si cromatografiamos sobre una capa de gel de silice empleando como eluyente ciclohexano y éter. El éter, polar, se retrasa cromatogréficamente, con lo que el frente se compone tnicamente de ciclohexano. A una cierta distancia del mismo empieza a aparecer una mezola de ciclohexano y éter. En este punto hay un salto en la polaridad en el eluyente Io que se conoce como frente B . Las sustancias poco polares que no avanzan con ciclohexano sélo se agrupan enCatedza de Control de Calidad de Medicamentos esta posicién. Lo mismo ocurre a menudo a las Impurezas de la propia capa. Al fenémeno descripto se le superponen ademas otros efectos como la evaporacién y la condensacidn. => APARATO El equipo y los materiales aceptables para la cromatografia en capa delgada comprenden lo siguiente: = Placa para cromatografia en capa delgada (TLC) o para cromatografia en capa delgada de alta resolucion (HPTLC). Las placas se encuentran recubiertas con soporte de vidrio, aluminio o poliéster. El tamaiio mas empleado es de 20 cm x 20 cm. Puede ser.necesario limpiar las placas antes de la separacién. Esto se puede lograr mediante migracién de un disolvente adecuado o inmersion en él Las propiedades cromatograficas de una placa de TLC pueden ser modificados por tratamiento de la FE con distintos agentes. Pueden ser realizados por medio de spray 0 sumergiendo la placa en la solucién apropiada 6 agregando el modificador en el momento que se prepara la FE. Pequefios cambios de pH pueden ser efectuados tratando las placas de silica con solucién de hidréxido de potasio, disminuyen los tiempos de retencién y dan manchas més redondeadas las sustancias basicas. Las placas buffereadas también permiten la aplicacién de sales Acidos y bases libres. Otro ejemplo es Ia utilizacién de nitrato de plata que puede aumentar la separacién de compuestos particularmente aquellos que poseen dobles enlaces carbono-carbono {esto se denomina argentacién TLC). Otros materiales que pueden ser incluidos son: agentes de pareo iénico e indicadores fluorescentes. Las FE adsorbentes pueden ser activadas por calentamiento a 120 °C durante 20 minutos. Para aumentar la adsorcién yCatedra de Control de Calidad de Medicamentos el tiempo de retencién, La fase estacionaria de las placas de TLC tiene un tamafio de particula promedio de 10 a 15 um y el de las placas de HPTLC un tamafio de particula promedio de 5 um. Micropipetas, microjeringas o capilares calibrados desechables, para sembrar las muestras en la placa. Una Camara de vidrio cilindrica o rectangular de aproximadamente 30 om de altura por 30 cm de ancho y 16 cm de fondo, provista de una tapa del mismo material que permita el cierre hermético para saturarla con los vapores de la fase movil. Fase mévil constituida por mezcla de solventes orgdnicos 0 soluciones acuosas segiin se indique en las monografias correspondientes. Reactivos reveladores especificos indicados en las monografias correspondientes. Un pulverizador que permita aplicar el reactivo revelador, resistente al ataque del mismo. Una fuente de luz UV adecuada para realizar observaciones bajo luz UV de longitud de onda corta (254 nm) y larga (365 nm). Un dispositive para documentar adecuadamente el resultado cromatografico visualizado. => PROCEDIMIENTO Pasos a seguir cuando se realiza una cromatografia:Catedra de Control de Calidad de Medicamentos * Preparar la cuba Colocar en la cémara una cantidad suficiente de fase mévil hasta obtener una capa de 1,5 om. Adherir hojas de papel de filtro embebidas en la fase mévila las paredes de la c4mara, pata facilitar la saturacién de la misma con el vapor del liquido, a menos que se indique de otro modo en la monografia correspondiente. Cerrar la cémara herméticamente. La cuba se deja luego equilibrar con su vapor durante al menos 30 minutos. La saturacién de la cuba influye de manera importante en el resultado de la separacién. La figura 4 muestra esquematicamente lo que sucede en una cuba no saturada. La placa de capa fina se ha introducido inmediatamente después de verter el eluyente, Durante la separacién se evapora eluyente de la placa predominantemente de la zona del frente. Se requiere mas eluyente para un mismo recorrido del frente y los Rf aumentan. Si por el contrario se reviste la cuba con papel de filtro empapado con el eluyente sus vapores se distribuyen en poco tiempo por todo el volumen de la cuba con lo que ésta se satura. Si se introduce una placa de separacién en una cuba preparada de esta manera la capa seca se impregna de eluyente. Se requiere entonces menos eluyente para un mismo avance del frente y los Rf son menores. La diferencia entre los Rf de cubas no saturadas y saturadas es sin embargo sélo aparente. En el primer caso ha fluido por la placa més eluyente del que corresponderia al recorrido del frente. En el segundo, el vapor del eluyente condensa deiante del frente aparentando un mayor recorrido de mismo,cAtedra de Control de Calidad Figura 4 * Sembrar las muestras Trazar una linea a 2,5 cm del borde inferior y lateral de la placa. Aplicar por separado sobre la linea trazada anteriormente y a no menos de 2 cm entre cada aplicacién las soluciones a sembrar, empleando una micropipeta para obtener una mancha lo mas pequefia posible (preferentemente con un diametro no mayor de 5 mmo bien en una banda perpendicular al sentido del desarrollo del cromatograma, de 10a 20 mm de largo y 2 a 6 mm de ancho). La aplicacién puede realizarse en porciones sucesivas que permitan acumular la cantidad de material requerido, dejando secar cada vez, antes de efectuar la siguiente aplicacién. El solvente de dilucién de las muestras es conveniente que sea volatil o de baja polaridad para que en la siembra la mancha no difunda mucho.Catedra de Control de Calidad de Medicamentos Es importante que las manchas estén secas al finalizar la aplicacion especialmente si la solucién contiene agua, ya que una pequefia porcién de un solvente polar adsorbido sobre la placa puede alterar las caracteristicas cromatograficas. Para andlisis cualitativos se usan a menudo tubos de punto de fusién con puntas estiradas:a modo de capilares de aplicacién. La realizacién practica se representa a modo de ejemplo en Ia figura. Si es necesario sembrar muchas muestras existen equipos automaticos sembradores, de cantidad y lugar preciso tanto en punto como en banda; tienen el inconveniente de ser caros, dificiles de limpiar y usualmente requieren pre- concentracién de la muestra. Figura 5Fit Ss Ruveriencion cn 68 GAMAC 1tiomnat Fe a) epee t) Naas de. gadesniczarm on aearscnsaieta, Iniffeaclunes y sugsin-nictas: ~ Fn aii cuseiiiabwck slab utiRearie tt fet pote earspocsde: aphcanian aul wee o Afuser ciples data ‘pominrsestencin s 980 2: Hamers vars # er us YoaiBebye, ~ Pavauriont, tas soi-sioned de geneigistl ‘avis paleo go! nit itrle y itar srlow de tn sess. ah agguriss oe asa ae of Heinadss © wacale Oethe carctaense api aolackneade ve aodidalerada pee te fsceend both Je nc so wen pinta: Lab eioluerti's tatinte voistins iment we) a capita. Gdns En todos etiton ‘os aw elnkr ey it oota job pe, wadersCatedra de Control de Calidad de Medicamentos Algurias placas cromatograficas poseen zonas de pre-concentracién. Estas placas contienen dos zonas de diferentes adsorbentes con una zona limite bien definida entre ambas. La FM no encuentra resistencia en pasar de una zona ala otra, Una zona es normalmente Kieselguhr de 3 cm de longitud y 150 ym de grosor que posee comparativamente pobre propiedad adsorbente: cualquier tamafio de mancha se transformard en aguda cuando alcance la fase analitica de silica. Otros tipos de placas para aplicaciones especiales son aquellas que poseen una zona de pre-concentracién de octadecil-silica y la parte analitica de silica: estas placas simplifican mucho la siembra de las muestras y aumentan la sensibilidad pero son muy caras comparadas con las placas convencionales. Se puede obtener un resultado aproximado usando las placas de silica y corriendo los primeros 0,5 cm con metanol; esto convierte a las manchas en finas bandas que luego se pueden correr con el solvente de eleccién. * Desarrollo de la placa Cuando los vapores se han equilibrado se coloca la placa en posicién vertical dentro de la cémara de modo que la fase mévil Ilegue al borde inferior de la placa, Existen equipos especiales que permiten la colocacién de 5 placas simultaneamente dentro de la cuba. Es importante colocar nitrégeno dentro de la cuba si las drogas son facilmente oxidables 0 cubrir la misma si son fotosensibles. Estas consideraciones también deben ser tenidas en cuenta cuando se siembran las muestras y se evapora el solvente especialmente si la droga es termolabil. Cerrar la camara y desarrollar los cromatogramas hasta que el frente de solvente haya recorrido aproximadamente tres cuartos de la longitud de la placa.Catedra de Control de Calidad de Medicamentos Si se deja correr una placa de 20 om. una distancia de al menos 10 6 18 cm. esto puede demandar la espera de hasta 2 hs., para una FM viscosa en un dia frio. El tiempo de desarrollo puede disminuir si se corren solo § cm., porque existe una relacin exponencial entre el tiempo de corrida y el aumento de la distancia. Por ejemplo: una corrida de 5 cm de metanol sobre silica dura 15 minutos mientras que para 10 cm. 45 minutos. La otra ventaja de las corridas de poca distancia es el aumento de sensibilidad (debido a que las manchas no difunden mucho); pero fa mayor desventaja es la pérdida de resolucién: si pierde cerca de un 20 % al pasar de 10 cm a 5 om de corrida. Retirar la placa de la c4mara, marcar el frente del solvente y dejar secar. Corridas cromatograficas continuas y multiples. ‘Aunque es posible separar completamente hasta 10 componentes usando una corrida de 10 cm. Una simple corrida no siempre separa todos los compuestos de interés. En estos casos se puieden hacer sucesivas corridas usando la misma FM, aunque a veces es mejor usar otra FM de mayor polaridad o a un pH distinto y correr la placa en igual direccién. Esto generalmente es muy util cuando se separan compuestos de diferentes polaridades. También existe la TLC bidimensional que puede ser muy util cuando se necesitan separaciones especiales. La placa se corre en una direccién con la primera FM se seca se gira 90 °C y se corre nuevamente utilizando otra FM. Este método es mejor que la separacién lineal pero toda la placa se debe utilizar para la separacién de todos los componentes de una muestra. La posibilidad de eluir simulténeamente un patrén en cada recorrido se da también en a elucién bidimensional. Sin embargo el patrén no puede eluirse bidimensionalmente sobre el mismo cromatograma ya que se mezclaria con la muestra. Figura 6Catedra de Control de Calidad de Medicamentos gq. 15 Bluray bidmensional, cc & Sustanciaa neporadas de le-sotusiin problema (oampe aentral y de tn solucién patrén sharstag laterntes), iuyante. tt * Localizar las manchas La luz blanca permite observar sustancias coloreadas, la luz ultravioleta permite ver sustancias fluorescentes al recibir esas longitudes de onda.Catedra de Control de Calidad de Medicamentos Como la mayoria de los compuestos organicos son incoloros se deben visualizar preferentemente mediante una técnica no destructiva. Para facilitar la deteccién, los fabricantes de placas mezclan un indicador fluorescente en la capa de adsorbente, puede ser una sal Inorganica que da a la placa un color amarillo (acetato de uranilo) o verde amarillo (silicato de cinc). El que se usa mas es un sulfuro mixto de cinc y cadmio fluorescente a 254 nm, de donde la denominacién F254.. Los compuestos que absorben se ven como manchas oscuras. Las sales organicas son fluorescentes a 366 nm en general; las que se utilizan mas son el trisulfonato-5,8,10-hidroxi-3-pireno (sal de sodio), la rodamina B, la dicloro 2,7 fluoresceina y los derivados del estilbeno. En el caso de las fases injertadas, se utiliza una sal de tungsteno y sodio. Los compuestos aparecen en forma de manchas sombreadas sobre fondo luminoso; se trata de una disminucién de fluorescencia, no de una extincién. Las manchas pueden ser marcadas sobre las placas con un ldpiz. Muchas drogas no absorben la luz Ultra Violeta porque se encuentran en la forma i6nica incorrecta debido al tipo de placa o al pH del buffer utilizado. Por ejemplo: los barbitiricos no son visibles si la placa es acidica pero si se observan con vapores de amonjaco de la misma manera, muchas bases se pueden ver si se expone la placa a vapores de Acido clorhidrico. Otros métodos no destructives pueden ser utilizados tal como la exposicién de la placa a vapores de iodo para observar la apaticién de manchas marrones. Otro ejemplo es la exposicién de la placa a pelicula fotografica para revelar la posicién de sustancias radiactivas. Cuando el soluto no posee ningtin grupo croméforo que permita una deteccién bajo la lampara UV, se debe transformar el soluto por reaccién con un reactivo especifico. Las reacciones de derivatizacién se utilizan cuando las fracciones individuales no reaccionan ala radiacién UV 0 cuando la sensibilidad de la deteccién es insuficiente. EsCatedra de Control de Calidad de Medicamentos itrelevante que él reactivo se utllice antes de la aplicacién de la sustancia (derivatizacion precromatografica) o después del desarrollo (derivatizacién postcromatografica), La derivatizacién precromatografica sirve no sélo pata visualizar sino también para aumentar la selectividad del sistema de separacién por los compuestos investigados 0 transformar los compuestos Iébiles en estables. La derivatizaci6n postcromatogréfica sirve sobre todo para revelar las sustancias ‘separadas o para aumentar la sensibilidad de la deteccién. Usualmente los reactivos de deteccién se pulverizan sobre la placa o folio. Algunos se comercializan ya preparados aunque la mayoria debe prepararse en el laboratorio y Pulverizar mediante atomizadores adecuados. La pulverizacién debe realizarse siempre bajo campana de extraccién con buen tiraje ya que las nieblas de los reactivos son generalmente téxicas y agresivas. Cuando se ha formado una neblina uniforme se dirige el chorro del atomizador sobre la placa y se pulveriza de manera uniforme generalmente hasta que se empieza a hacer transparente. Pulverizar en exceso puede producir la disolucién o el arrastre de alguno de los compuestos de la placa demas de los dispositivos de pulverizacién se dispone también de dispositivos de inmersi6n. La inmersién y extraccién verticales asi como el tiempo de permanencia en la cuba de inmersién (algunos segundos) pueden seleccionarse a voluntad y se realizan de manera automatica A menudo los cromatogramas han de calentarse en una estufa o sobre una placa calefactora después de agregar los reactivos de deteccién para activar la reaccién (por ej. 10 a 15 minutos a 105-110 °C). Un método de uso general, pero destructivo es el spray de Acido sulfirico sobre la placa y luego calentamiento, las sustancias organicas producen manchas marrones 0 negras. Otra opcién es calentar la placa en un estufa en atmésfera de bicarbonato de amonio, muchos compuestos dan derivados fluorescentes, la sensibilidad es 10 vecesCatedra de Control de Calidad de Medicamentos mayor que con el tratamiento con dcido sulfirico. En caso del spray de reactivos puede ser utilizado para detectar la presencia en general de alguna droga (éj.: iodo en metanol) la presencia de algtin grupo funcional (@j.: fluorescamina para aminas primarias) y otros que pueden reaccionar con un, grupo general de compuesto (ej.: Dragendorff para alcaloides). Existen otros reactivos que brindan una gama de colores dependiendo de las distintas sustancias (¢.: reactive de Marques y Mandelin). Figura 7. A Fig, B: A: Represents wzeuemition oot ‘proceed oe pulverizecton Bi Esnuama de te utes * Almacenamiento de las placas Las placas de aluminio y de plastico que son flexibles pueden ser almacenadas pegandolas o sujeténdolas en cuademos pero también pueden ser dibujadas sobre Papel indicando los colores de las manchas, también pueden ser fotografiadas oCétedra de Control de Calidad de Medicamentos fotocopiadas en colores. Las placas de vidrio pueden ser preservadas mediante la realizacién de un spray con un polimero (polivinil propionate) que la cubre de un film plastico, este film puede retirarse del vidrio con la ayuda de agua y luego colocarse ‘sobre una placa de plastico, INTERPRETACION DE LOS CROMATOGRAMAS Para un sistema cromatografico dado es posible caracterizar un soluto por la distancia que recorre con respecto al frente del disolvente, La medida cromatografica de una sustancia en TLC es el Rf que se define: dis tan cia que recorre el soluto desde el origen dis tan cia que recorre el disolvente desde el origen Una sustancia elufda bajo condiciones idénticas puede emplearse como patrén para determinar un valor relativo de R, el Re o Ret Rst = Distancia de la sustancia desde el origen / Distancia de la sustancia patron desde el origen Al contrario del Rf, que toma valores que van de 0 a 1, el Rs puede ser también mayor de 1. Se puede utilizar el valor obtenido de Rf x 100, para evitar el uso de decimales. La figura muestra como se determinan ambos parametros.Fg 2 Eeneenin para Us determinacion dy IAs ye FB A Pardmetra 8 Panimetra A, Frauin del tuyere Sustuncs Fume de parts La distancia recorrida por la mancha se mide desde en centro de la mancha que es facil de determinar si la mancha es redonda, pero en las manchas con cola, se determina desde el centro de la zona mas densa. El valor del Rf es afectado por un gran ntimero de factores por lo que siempre es conveniente realizar una corrida con el compuesto de referencia en la misma placa. Factores que afectan la reproducibilidad del valor de Rf FE: la calidad del adsorbente, presencia de impurezas y uniformidad de grosor, son pardmetros que deben ser mantenidos en los distintos lotes. Si las placas deben ser activadas el procedimiento debe ser siempre el mismo. Las placas se deben almacenar— e CAtedra de Control de Calidad de Medicamentos ‘ en un desecador con silica gel antes de ser usadas y las muestras deben ser sembradas répidamente para que no adsorban vapor de agua de la atmésfera. Debido a las dificultades asociadas con los procesos de activacién es preferible usar placas mantenidas a temperatura ambiente. La oficacia de separacién de un adsorbente esta determinada por su estructura geométrica, el tamafio de particula y su distribucién y se manifiesta en el ensanchamiento que experimenta la mancha aplicada de la sustancia a lo largo del recorrido cromatografico. La selectividad de un adsorbente depende de la estructura quimica del material y expresa la diferencia entre los Rf de las sustancias separadas, Cuénto menores son las particulas y cuanto més estrecha es la distribucién de tamafio de granulo tanto mejor es la eficacia de separacién. Los didmetros de las particulas deberian ser ademés lo mas uniformes posible (distribucién de tamafio de particula estrecha). FM: debe ser preparada fresca para cada corrida, debido a que los solventes pueden ser volatiles 0 higroscépicos y a partir de solventes puros. ‘Cuba: se debe dejar equilibrar el solvente con el vapor por lo menos 30 minutos antes de colocar la placa. Es importante la utilizaci6n de papel de filtro para obtener las condiciones de saturacién. Temperatura: aunque no es necesario un preciso control de la temperatura, la cuba no debe colocarse cerca de fuentes de calor ni luz de sol directa ya que los solventes volatiles se evaporan, el solvente corre mas rapido y el valor del Rf decrece levemente.Catedra de Control de Calidad de Medicamentos Distancia de la corrida: existe un aparente aumento en el valor de Rf cuando aumenta la distancia de corrida que corresponde al aumento de evaporacién del solvente de las partes superiores de la placa pero en general no existen cambio de valor de Rf cuando cambia la distancia de corrida. Cantidad de muestra: aumentando la cantidad de muestra sobre la placa, puede frecuentemente, aumentar el valor de Rf de la muestra especialmente si forma colas en el sistema. Por ¢).: si usamos placas de silica gel y como FM cloroformo - acetona (4:1) y sembramos 5 u g de dcido benzoico, éste tiene un Rf de 26 pero si sembramos 20 Ug tiene un Rf de 34, De cualquier manera, si la placa esta muy sobrecargada, se ‘dbtendré una mancha con cola y dard el efecto de una aparente disminucién del valor de Rf. Estas dos situaciones son faciles de distinguir por la intensidad de la mancha. En general los valores de Rf son menos reproducibles en la mitad del cromatograma que a valores altos o bajos. Estas diferencias en reproducibilidad no son dramaticas y pueden ser consideradas como independientes del valor de Rf. La mejor forma para aumentar la reproducibilidad es correr una sustancia patron al mismo tiempo o correrla muestra junto con distintas sustancias de referencia (generalmente 4), cuyos valores de Rf son conocidos; el valor de Rf de la muestra puede ser corregido por un método grafico o por andlisis de regresién lineal. Esto se realiza graficando los valores experimentales de Rf en funcién de los valores conocidos y extrapotando. TECNICAS ESPECIALES TLC preparativa. La mayor utilidad de la técnica de TLC es un proceso de separacién y purificacién. TLC preparativa es muy Util para separar muestras en una mezcla, tanto para serCatedra de Control de Calidad de Medicamentos empleado en una técnica analitica, como para obtener sustancias puras como estaéndares. Una TLC analitica utiliza placas de 100 a 260 p m de espesor, mientras que en una TLC preparativa van de 0,5 a 2 mm, Pueden aceptar de 10 a 100 mg de droga dependiendo de numero de componentes y de su naturaleza quimica. Como regia general, la cantidad que puede ser aplicada sin sobrecargar su capacidad, aumenta con la ralz cuadrada del grosor de la capa adsorbente. Es mejor aplicar la muestra en forma de banda que de punto, asi una mayor cantidad de muestra puede ser cromatografiada al mismo tiempo. Frecuentemente, es mas facil eluir drogas de silica, que de celulosa o alumina, y las fases quimicamente unidas solo pueden ser utilizadas en sistema de fase reversa, de no ser asi, se correrfa el riego de eluir también la parte organica. Todos estos puntos se deben tener en cuenta cuando se elige una fase estacionaria. La ubicacién de las manchas se debe realizar por métodos no destructivos: como el uso de luz ultravioleta o de vapores de iodo. Si se utiliza un reactivo en spray, se debe aplicar sobre una delgada banda para permitir la maxima utilizacién del resto del material. Existen soluciones spray que poseen efectos irreversibles como el complejo formado por drogas basicas con solucionies de iodoplatinato de potasio, que puede descomponerse con una solucién acuosa acida conteniendo 10 % P/V de sulfito de sodio. Cuando el érea conteniendo la muestra ha sido localizada, se retira utilizando una pipeta Pasteur, y filtrando por lana de vidrio o centrifugando para separar la FE. Se debe utilizar un solvente de alto poder de elucién como el metanol. Las sustancias altamente adsorbidas (o sea aquellas de bajos Rf) pueden llevar varios minutos en eluir de la Fe. A veces; es mejor humedecer la FE antes de extraer con el solvente organico 6 mejor primero extraer con un solucién acida o alcalina y luego extraer la fase acuosa con el solvente organico, previo cambio de pH. Es importante tratar otra area de la placa de similar tamafo, sin droga presente, para que actiie como blanco. Utilizando estosCatedra de Control de Calidad de Medicamentos Procedimientos se pueden obtener hasta un 99 % de eficiencia aunque generalmente el porcentaje de recuperacién es del 50 al 80 %. Cromatografia en placas delgada de alta perfomame HPTLC La disponibilidad de nuevos materiales, métodos e instrumentacién en los uiltimos 10 afios, han cambiado la técnica de TLC, dando esta nueva forma que es la HPTLC. Estas técnicas utiizan placas que poseen particulas de mucho menor tamafio y mejor distribuidas. Esto hace que el método sea mucho més rapido, reproducible, sensible, y mejor para trabajos cuantitativos. Su uso se ha incrementado a partir de las aplicaciones de muestras con sembradores automaticos y la cuantificacién por medio de densitémetros. Cuadro comparativo entre TLC y HPTLC. Condiciones tipicas TLe Dimensiones de la placa (cm) 20x20 Tamajio de particulas (silica, ym) cerca de 20 Grosor de la placa (analit, ym) 100-250 Volumen de muestra (i!) 1-40 Diametro de la mancha antes de la corrida (mm) #4 Diadmetro de la mancha después de la corrida (mm) 5-10 Distancia de cortida (cm) 30-120 Numero de mtas. por placa 10-15 HPTLC 10x10 cerca de 5 150-200 #0,1 #15 5-15 30-40Cétedra de Control de Calidad de Medicamentos Llimite de deteccién (absorcién, ng) * 10-100 0,5-5 Limite de deteccién (fluoresc., ng) * 04-4 0,01-0,1 Reproducibilidad del valor de Rf cerca 3% cerca 1% Reproducibilidad de cuantificacién cerca 5% 2-3 % “para drogas fuertemente absorbentes o fluorescentes La mayor desventaja de HPTLC es la incapacidad de utilizar otro método de identificacién luego de eluir la muestra (ya que se utilizan muy pequefias cantidades) y la existencia de interferencia de materiales co-extraidos. Seleccién de los sistemas TLC La seleccién del mejor sistema para una aplicacién en particular dependera del uso que se le dara. Para cuantificacién, es més importante que tanto la droga como el esténdar interno produzcan manchas redondeadas y con adecuada separacién. Para identificacién, los valores de Rf deberdn ser lo mas reproducibles posible y producir la mejor separacién de drogas. Si una droga debe ser separada de otras sustancias, puede utilizarse la serie eluotrépica (ver ultima pagina), con poder de elucién creciente, hasta que la separacién se realice. Cuando se deba separar una gran cantidad de componentes hay que tener en cuenta: 4. Que el sistema tenga una buena distribucién de valores de Rf, de las sustancias de interés a lo largo de la placa, para una mayor probabilidad de separacién. 2. Los valores de Rf sean lo mds reproducibles posibles.CAtedra de Control de Calidad de Medicamentos 2. Los valores de Rf sean lo mas reproducibles posibles. 3. Lacorrelacién entre las propiedades cromatograficas de distintos sistemas debe ser baja, para obtener informacién extra, con propésitos de identificacion. Las caracteristicas de sensibilidad y velocidad de corrida son similares, cualquiera sea el sistema elegido. Al considerar légicamente las interrelaciones de los factores FM, FE, y sustancia a analizar se obtiene el esquema general de la figura 10. Cuando se dirige un vértice del triangulo hacia una propiedad dada de uno de los tres factores, las de los otros dos quedan mas 0 menos automaticamente determinadas. Figura 9 ADSORCION PARTICION ee ONE Sa] GER = Se a 0 aD 0 sn CDP sone ia [[Seetanca a anata Fee eae eae eee EVALUACION Tras finalizar una TLC deben evaluarse los resultados. Existe una gran variedad de métodos adecuados a cada tipo de problematica. Los més importates son:Catedra de Control de Calidad de Medicamentos Los cromatogramas de TLC se realizan para identificar sustancias de una mezcla, pero también para comprobar purezas o separar mezclas. Sirven especialmente para el control de sintesis 0 del transcurso de una reaccién. EI Rf indica la posicién del cromatograma en que se encuentra la sustancia. Es conveniente tratarlo como valor meramente indicativo ya que son tantos los factores que intervienen durante la cromatografia que es muy dificil y laborioso obtener RF exactamente reproducibles. Con fines de identificacién es necesario relacionar los Rf de los compuestos analizados con los de una sustancia patron. Si coinciden es probable (pero no seguro) que se trate de las mismas sustancias. La certeza en la identificacin sdlo se consigue realizando, ademas de la cromatografia en capa fina, estudios espectroscépicos (por ej. espectroscopia Infrarroja, Resonancia Magnética Nuclear, de masas, el acoplamiento de las mismas con TLC). Evaluacién semicuantitativa: La evaluacion semicuantitativa se utiliza cuando hay que determinar si se esta claramente por encima 0 por debajo de unos valores limite, 0 cuando bastan indicaciones aproximadas. En cualquier caso se cromatografia junto a la muestra, varias concentraciones del patrén, La evaluacién se realiza por comparacién visual o por medicién del diémetro 0 de la superficie de las manchas. La exactitud maxima se sitta alrededor del 1) 10 % Evaluaci6n cuantitativa indirecta: Una posibilidad de evaluacién indirecta, consiste en raspar la region de la capa en que se encuentra la sustancia de interés, disolver la sustancia y, a continuaciéncAtedra de Control de Calidad de Medicamentos analizarla mediante un procedimiento analitico adecuado. Hay que tener en cuenta que la extraccién diluye la muestra y que generalmente hay que concentrarla de nuevo. También en este caso se recomienda cromatografiar patrones sobre la misma placa: La siembra de las muestras continua siendo el punto criticé de la TLC cuantitativa, aunque la utilizacin de micropipetas y microjeringas calibradas y el uso de standar interno, han resuelté mucho este problema. Evatuacion cuantitativa directa: En todos los métodos directos de evaluacién cuantitativa es esencial aplicar los mismos volimenes de muestra y patron sobre la misma placa. Las concentraciones deberian ser del mismo orden y los Rf deberian estar comprendidos entre 0,3 y 0,7. Los recientes avances en densitometyia y procesamiento de datos han llevado a la TLC cuantitativa a un rango de precisién similar GLC y HPLC (coeficiente de variacién de 2-5 %). Los densitometros pueden funcionar con transmitancia, quenching de fluorescencia 0 reflactancia, para medir absorbancias y también pueden medir fluorescencia que es més sensible para aquellas drogas que poseen esta capacidad. Las placas se pueden leer con un alto grado de resolucion (12 1 m) y las manchas se miden muchas veces para aumentar la relacién sefial/ruido. Cuando se realizan medidas cuantitativas usando standar intemo, las curvas de calibracion de concentracién vs altura de pico 6 area de pico, son normalmente no lineales. A pesar de ser esto una desventaja, un procesador de datos unidos a un densitémetro puede asegurar que la exactitud no se ha perdido. La capacidad de HPTLC de corer 40 muestras simultneamente, puede hacer del uso de {a densitometria, una propuesta viable para los programas de monitoreo de drogas terapéuticas, para estudios farmacocinéticos cuando se deben analizar un gran niimeroCAtedra de muestras similares de Control de Calidad de Medic: amentos Aunque menos populares, el uso de detectores de radiactividad juegan un papel importante en el andlisis de drogas radiactivas y metabolitos. Altemativamente, la placa puede ser raspada y contada en un equipo de centelleo. | Fig. |{: Métodos de evaluacién, | j Cualitativa ‘| [ Semicuantitativa [ Cuantitativa | Indirecta | Directa (in situ) (— Recorridos: — Comparacién de la = Colores/intensided —intonsidad del color - —~ = Gomportamiento UW —Comparacion de la | Extraccién = Combinacion 0 intersidad de acoplamiento con forescencia IR, EM,RMN, CG —Comparacién det rotometia ~ Densitometrfa tamafio de marcha — Gravimetria ~ Espectrofotometria = !der con una sere Volumetia = Medidas de centoleo de diuciones —_ Polarmatia === Rahometria ~ Potarographia = IR. EM, RIN ~ Media de isétopos = Fostoreacencia — Fluorescencia =EAA = Dalorminecién | encimstioa Figura 11Catedra de Control de Calidad de Medicamentos Se Eluotrépica Pentano Hexano Iso-octano Ciclohexano Tolueno 1-Clorobutano Eter Cloroformo Cloruro de metileno Tetrahidrofurano Acetona Acetato de ettilo Dietilamina Acetonitrilo Alcohol isopropilico Etanol Metanol 0,00 0.01 0.01 0.04 0.29 0.30 0.38 0.40 0.42 0.45 0.56 0.58 0.63 0.65 0.82 0.88 0.95CAtedra de Control de Calidad de Medicamentos Metanol 0.95 Acido acético v ‘Agua w Bibliogratia -Clarke’s, Isolation and Identification of Drugs 3 »@ Edition - 2004. -Cromatografia de Capa Fina- Una introduccién - Bauer K. ; Gros L., Sauer W. , Merck 1992. -Analisis Quimicos Farmacéuticos de Medicamentos ~ Pradeau Analisis Instrumental - D.A.Skoog, DM. West -Fundamentos de Quimica Analitica, Skoog, West, Holler, Crouch -USP 30 <621> -Farmacopea Argentina, Séptima edicion <100>CAtedra de Control de Calidad de MedicamentosCatedra de Control de Calidad de Medicaiientos CROMATOGRAFIA LIQUIDA DE ALTA EFICIENCIA La Cromatografia Liquida de Alta Eficiencia (HPLC) es la técnica mas comunmente utilizada para la cuantificacién de principios activos en formulaciones farmacéuticas. Como en cualquier otra técnica cromatografica, el sistema esta constituido por dos fases, una fija 0 estacionaria y otra mévil. Las separaciones se logran a través de procesos de particién, adsorcién o intercambio idnico, segin el tipo de fase estacionaria empleada. La mayoria de los analisis farmacéuticos se basan en la cromatografia de particién y se completan en un plazo de tiempo breve. Como en Ia cromatografia de gases, el comportamiento de un compuesto puede ser caracterizado por su factor de capacidad, &, que depende de la naturaleza quimica del compuesto analizado, la composicién y la velocidad de la fase mévil, y la composicién y el area superficial de la fase estacionaria. La longitud de la columna es un pardmetro determinante de la resolucién. Sélo los compuestos que tienen diferentes factores de capacidad pueden ser separados por HPLC. Principio: La fase mévil es bombeada bajo presién a través de una columna de acero que contiene particulas de fase estacionaria (didmetro: 3-10 um). el analito llega hasta la cabeza de la columna por una tuberia a través de una valvula de inyeccién de muestra, y recorre la fase estacionaria interaccionando con ella segiin las caracteristicas del analito y del sistema. Alli, entran en juego distintos tipos de interaccién entre cada uno de estos componentes, Interacciones hidrofébicas, puentes de hidrégeno, interacciones dipolares y electrostaticas, son as responsables de la mayor o menor afinidad de cada uno de los componentes de la muestra por la fase mévil o la fase estacionaria. Asi el componente mas afin 2 la fase estacionaria se retiene més y tarda mas en eluir y el mas afin a la fase novil se retiene menos y eluye antes. El efluente puede ser analizado por una variedad de detectores,Catedra de Control de Calidad de Medicaiitentos Formas de Cromatografia Liquida © Cromatografia Liquido-Sélido o de adsorcién: es la modalidad cromatografica més antigua. Se realiza sobre fases estacionarias hidrofilicas como la silice 0 alimina y con solventes de mediana a baja polaridad como fase movil. Es un método apropiado para la separacién de solutos de polaridad mediana a alta y es de suma utilidad para la separacin de isémeros posicionales con sustituyentes polares. El mayor inconveniente de este método se debe a la alta actividad del material de relleno, que tiende a absorber agua y solventes polares en su superficie. Como consecuencia, su comportamiento puede modificarse en detrimento de la reproducibilidad de resultados. © Cromatografia Liquida-Liquido o de particién: en esta modalidad, las moléculas de soluto se distribuyen entre dos liquidos, uno es la fase movil y el otro la fase estacionaria, que se encuentra homogéneamente dispersa en un soporte sélido, finamente dividido. Casi siempre se emplea para compuestos orgénicos de peso molecular menor de 1000. Las fases estacionarias modernas para la cromatografia de liquidos en fase reversa constan de una fase organica quimicamente unida a silice u otros materiales. Esta forma de cromatografia de particién es llamada en Fase Ligada (BPC) y es un caso particular de LLC. Este tipo de cromatografia se transformé rapidamente en la forma mas comin de HPLC. Ala cromatografia de particién (sea de fase unida 0 no) se la clasificé en: Fase Normat si la fase estacionaria es mas polar que la fase mévil (amino 0 ciano) Fase Reversa: si la fase estacionaria es menos polar que la fase mévil (C1, C4, C8, C18, fenilo) ® Cromatografia de Intercambio lénico (IEC): Se emplea para separar compuestos ionizables y solubles en agua de peso molecular menor de 1500. Las fases estacionarias, en estos casos, son generalmente resinas orgénicas sintéticas; las resinas de intercambio catiénico contienen sitios activos con cargaCAtedra de Control de Calidad de Medicaitentos negativa y se emplean para separar sustancias bdsicas, como las aminas, “0 mientras las resinas de intercambio aniénico tienen sitios activos con carga positiva para la separacién de compuestos con grupos con carga negativa, como el fosfato, sulfonato o carboxilato. Los compuestos idnicos 0 ionizables, solubles en agua, son atraidos a las resinas y las diferencias en la afinidad producen la separacién cromatografica. El pH de la fase mévil, la tomperatura, el tipo de ion, la concentracién iénica y los modificadores organicos afectan el equilibrio; estas variables pueden ajustarse para obtener el grado de separacién deseado. Este tipo de cromatografia se utiliza para la separacién de aminodcidos, Acidos carboxilicos, complejos inorganicos, aniones y cationes en general © Cromatografia de Exclusién por Tamafio (SEC): esta modalidad emplea materiales de porosidad controlada, que funcionan como un filtro o tamiz y clasifica las moléculas de la muestra segiin un orden decreciente de tamafio molecular (las moléculas mas grandes son las primeras en eluir, ya que no entran en los poros de la fase estacionaria, y las mas pequefias se introducen en los poros y son retenidas por mas tiempo). Si se dispone de estandares apropiados, de peso molecular adecuado (proteinas para el andlisis de proteinas, dextranos para el ensayo de dextranos, etc). Puede evaluarse el peso molecular de un compuesto desconocido, o bien la distribucion de pesos moleculares de un polimero sintético. En areas biolégicas se lo conoce como Sephadex. Existen dos tipos: Cromatografia de Permeacién en Gel, que se utiliza para solutos de alto peso molecular insolubles en Agua cuya principal aplicacién es en polimeros sintéticos y elastémeros, y Cromatografia de Filtracién en Gel, que se utiliza para solutos de alto peso molecular hidrosolubles, y cuya principal aplicacién es en macromoléculas biolégicas como péptides, proteinas, Acidos nucleicos, hidratos de carbono, etc.Catedra de Control de Calidad de Medicatientos éPor qué es necesaria la Cromatografia Liquida de Alta Eficiencia? Estas son algunas de las principales caracteristicas de otros métodos cromatograficos, que permiten su comparacién con el HPLC: © Cromatografia Liquida Clasica (CL) -las columnas deben ser descartadas luego de su uso -cada preparacién requiere un lecho nuevo ~cuidado en aplicacién de la muestra -la fase mévil fluye por gravedad -larga, tediosa -deteccién por analisis de! liquido recolectado ~analisis en horas a dias. © Cromatogratia en placa delgada -preparacién del soporte: mas simple y barato que la cromatografia Iiquida oldsica (descarte) -se venden cromatofolios ya preparados -la fase mévil fluye por capilaridad -deteccién por rociado, visual, o UV -andlisis en horas. © Cromatografia gaseosa (CG) -distintas aplicaciones que HPLC ~til para PM hasta 500 -solo 20% de las sustancias orgdnicas se pueden analizar por GC -usado para gases y sustancias volatiles -anélisis en minutos a horas ~cantidad minima detectable (segiin detector) 109- 10-12 g Ventajas del uso de HPLC Las ventajas del uso de HPLC sobre CL son:Catedra de Control de Calidad de Medicaitientos -Velocidad -Resolucién Sensibilidad: los detectores de absorcién al UV pueden medir hasta cantidades del orden del nanogramo y los de fluorescencia y los electroquimicos detectan en el orden de los picogramos. -Columnas re-usables -Es ideal para moléculas grandes y especies idnicas. -Facil recoleccién de la muestra eluida. Instrumental Instrumentacién esténdar 5 © Reservorio de solventes © La bomba: capaz de bombear bajo una presién de 4000 psi y un flujo de 10 mUmin. © Inyector con loop: el loop puede usarse para inyectar un volumen fijo o variable (20pL son los loops mas usados) © Columna: generalmente construidas de acero, conteniendo la fase estacionaria empacada en su interior. © Detector: los mas usados son los UV/visible © Sistema de procesamiento de datos: puede usarse un integrador computarizado 0 una PC con software adecuado para esta aplicacién. © Tuberias, uniones y férulas: son accesorios fabricados de distintos materiales y unen las distintas partes del instrumental. © Otros instrumentales mas avanzados son: inyectores autométicos de muestras, horno para columna que permite fijar la temperatura de la cromatografia, bomba que permite mezclar 2 0 més solventes y variar sus proporciones en el tiempo para producir un gradiente de fase mévil, degasificadores on-line de fase mévil, y enfriadores de muestras que permiten conservar la muestra a baja temperatura, muy util para muestras poco estables en el tiempo.CAtedra ‘de Control de Calidad de Medicaiientos Inyecsién de Mest Reservorio de la fase mOvit. puede emplearse como reservorio de la fase mévil cualquier frasco de laboratorio de buena calidad (de vidrio o polimero resistente), con una tapa adecuada para prevenir el ingreso de particulas ambientales al sistema 0 su evaporacién. Al extremo del tubo de salida de solvente se conecta un filtro de acero inoxidable 0 ceramica (buzo) de 2 0 10 um de porosidad que impide el ingreso de particulas a la bomba. La capacidad del frasco depende del consumo esperado: pocos mililittos en el modo microbore, 0,5 a 1 Lt o mas en los métodos convencionales y hasta varios litros en cromatogratia preparativa. Los sistemas que necesitan procesos de desgasificacién continua estan provistos de una tapa especialmente disefiada para tal fin, en la cual se puede encontrar un orificio para la entrada de gas inerte de desgasificacién, otro para la salida del solvente y una valvula que permite una presién positiva del gas sobre el solvente venteando el exceso.partes del instrumental. Las tuberias deben ser inertes y de acuerdo a su ubicaci6n en el sistema cromatogréfico, resistentes a altas presiones, Se emplean tubos de acero inoxidable (316 0 304) o poliméricos (tefién, polipropileno, PEEK), siendo las tuberias de acero 316 y la de teflén las més comtinmente utilizadas. Las tuberias de acero se utilizan para conectar los componentes sometidos a alta presién (desde bomba hasta el detector), y los materiales poliméricos para conectar los componentes donde la presién es atmosférica o ligeramente superior {reservorio de solvente - bomba, detector - frasco de desperdicios). Se seleccionan las tuberias de menor didmetro interno (0,2 mm) para conectar los instrumentos por donde circula la muestra (entre inyector y detector) para no provocar fenémenos de difusién. Las conexiones por donde no circula la muestra son de didmetro interno 0,5 - 0,7 mm para no incrementar la presién del sistema. Las tuberias demasiado largas conducen a ensanchamientos extracolumnares de los picos. Uniones: permiten conectar las tuberias. Una unién consiste en dos piezas de acople perfecto, generalmente roscadas. Deben ser inertes a las fases moviles y muestras, deben cerrar herméticamente y no deben contribuir en forma notable al ensanchamiento de banda extracolumnar por la presencia de voltmenes muertos. De acuerdo a su ubicacién en el sistema, suelen ser de acero inoxidable o poliméricas Bombas. impulsan cantidades exactas de fase mévil desde el reservorio de solventes a la columna mediante una tuberia y uniones aptas para soportar altas presiones. Existen bombas capaces de entregar desde L/min para la cromatografia microbore, unos pocos mL/min para la cromatografia analitica Convencional hasta valores mucho mayores para la cromatografia semipreparativa y preparativa. Las bombas pueden dispensar en general hasta 10 mL por minuto y generar presiones de hasta 6000 psi. Sin embargo, los caudales tipicos son de 1 a 2 mL por minuto, con presiones no mayores a 2000 6 2500 psi. Las bombas empleadas para el andlisis cuantitativo deben construirse con materiales inertes aCatedra de Control de Calidad de Medicaifientos los componentes corrosivos de la fase mévil y ser capaces de entregar la fase mévil en una velocidad. constante, con fluctuaciones minimas, durante periodos prolongados. Tipos de bombas: Bombas_reciprocantes: en la actualidad la mayoria de los equipos cromatograficos utilizan bombas de este tipo. Tipos: de un solo pistén, de dos pistones, de tres pistones, bomba tandem, bomba a piston y diafragma. Las bombas reciprocantes permiten variar el caudal entregado por alguno de los siguientes mecanismos: -variando el recortido del pist6n -variando la velocidad de movimiento del piston. Bomba a diafragma: es un tipo particular de bomba reciprocante. En lugar de pistén contiene un diafragma que separa el mecanismo de la camara de bombeo, El diafragma esta constituido por un material flexible, en general acero inoxidable y Teflén Bomba jeringa: es un dispositivo de desplazamiento continuo. El solvente contenido en un cilindro es impulsado hacia el inyector por medio de un movimiento continuo y hacia delante del pistén. El recorrido del piston y el volumen desplazado es suficiente para efectuar un nimero de ensayos completos, sin necesidad de recargar su camara. Este sistema es ideal para la modalidad microbore y capitar en las cuales el rango de trabajo se limita a pocos uL/min. Inyectores. es el dispositive que permite introducir la muestra en solucién sin interrumpir el caudal de solvente a través del sistema, Debe reunir una serie de caracterfsticas importantes: -debe ser inerte al ataque quimico -debe ser preciso en cuanto a la cantidad de muestra introducida en el sistema. Puede realizarse llenando completamente un loop de volumen fijo (generalmente hasta 200j1L) o llenando con un volumen premedido un loop de capacidad superior (generalmente loops de 500pL)dra de Control de Calidad de Medicai -no debe provocar diluciones importantes de la solucién inyectada. Ya han sido definitivamente descartados los inyectores tipo septum, similares a los empleados en GC. Sus inconvenientes eran derivados del desprendimiento de material del septum que obstrufan la columna y de la contrapresin que debia vencerse al inyectar una muestra. Actualmente la totalidad de los inyectores son valvulas que orientan el caudal hacia la columna, pasando o no segun su posicién, a través de un loop en el cual se introduce la solucién a inyectar. Las valvulas pueden accionarse manual 0 autométicamente. También se utilizan con mayor asiduidad, inyectores automatics (autosamplers) controlados por software, que permiten establecer secuencias de inyeccién automaticas sobre varias muestras preparadas, prescindiendo del trabajo manual del analista Columnas: Es donde se produce la separacién efectiva de los componentes de la muestra inyectada. Existen dos mecanismos principales que provocan la retencién de un compuesto cuando pasa a través de una columna: En fase normal, el mecanismo es la adsorcién de los grupos polares de la molécula con los grupos polares de la fase estacionaria, y en fase reversa, el mecanismo es la particién de la porcién lipofilica de la molécula con la fase estacionaria. Silica gel y Octadecilsilano (ODS, C18) (fase ligada sobre un soporte de silica gel) son los rellenos més comtinmente utilizados para fase normal y reversa respectivamente, pero existe una gran variedad de rellenos para las mismas basados en modificaciones quimicas de la superficie de la silica, aunque en los Ultimos afios también se hallan disponibles fases estacionarias sobre polimeros organicos. Un compuesto quedara retenido dependiendo de su polaridad (en el caso de silica gel) 0 de su lipofilicidad (en el caso de ODS). El otto factor a considerar es la fase mévil. En general, cuanto més polar es la fase movil, mas rapido eluiré un compuesto de una columna de silica ge!_y cuanto mas lipofilica sea la fase movil, més rapido eluiré un compuesto de una columna de fase reversa. La polaridad deCatedra de Control de Calidad de Medicaiiientos la fase mévil se puede variar mediante el agregado de un segundo y, a veces, un tercer o hasta un cuarto componente. Por lo general, las columnas empleadas para las separaciones analiticas tienen diémetros internos de 2 a 5 mm; para la cromatografia preparativa se emplean columnas de diémetro mayor. En algunos casos las columnas pueden calentarse para mejorar la eficiencia durante la separacién, pero rara vez se las emplea a temperatura por encima de los 60°C, debido a la potencial degradacién de la fase estacionaria 0 a la volatilidad de la fase mévil. Las columnas se emplean a temperatura ambiente, a menos que se especifique de otro modo en la técnica respectiva. Detectores. es la parte del equipo que permite * ver" y ubicar en el tiempo y espacio la posicién de cada componente de una muestra a la salida de la columna. Los detectores deben reunir ciertas caracteristicas: -Alta sensibilidad -Respuesta a todos los solutos -Amplio rango de linealidad -Poseer una buena relacién sefial/ruido -No afectarse por cambios de temperatura y fase mévil -No contribuir al ensanchamiento de banda extracolumnar -Fécil de usar -No destructive -Respuesta rdpida Los detectores pueden clasificarse en generales y selectivos. Los detectores generales miden el cambio de alguna propiedad fisica de la fase mévil que contiene el analito en comparacién con la misma fase mévil pura, por ejemplo: detector de indice de refraccién y el de conductividad. Los detectores selectivos son aquellos sensibles a alguna propiedad propia del soluto, por ejemplo el detector UV que produce una sefial proporcional a la absorbancia del soluto a unaCatedra de Control de Calidad de Medicaitentos longitud de onda dada. También son detectores selectivos el de Fluorescencia y él Electroquimico. © Detector Ultravioleta - Visible de longitud de onda’ variable: Es el mas empleado en HPLC. Emplea una ldmpara de emisién continua de deuterio o de xenén. Se basa en la capacidad del analito de absorber la luz UV 0 visible. Es un detector robusto, con buena sensibilidad, y rango lineal que trabaja en un rango de 0,01 100 yg de compuesto en Ia columna. La sensibilidad del detector en parte depende del valor de absortividad del compuesto que se analiza. Estos detectores pueden trabajar a cualquier longitud de onda dentro del rango UV-visible (190 a 700 nm). No es destructivo y puede emplearse con gradientes de solventes, con la Unica limitacién de que estos sean transparentes en la longitud de onda de trabajo. © Detector por ordenamiento de fotodiodos (DAD): es un tipo avanzado de detector UV que posee la capacidad de registrar todo el rango de luz UV simulténeamente utilizando el ordenamiento de fotodiodos que detecta ta luz dispersada por un monocromador fijo en un rango de longitudes de onda, con una Tesolucién cercana a 1 nm. Es util para mezclas complejas que contiene compuestos con diferentes absorbancias en un amplio rango y para mezclas donde los picos se superponen cromatogréficamente pero pueden separarse en términos de absorbancia al UV. El detector provee un espectro completo de cada pico en el cromatograma que ayuda a la identificacion de sustancias desconocidas. © Detector de dispersién de luz por evaporacién (ELSD): se basa en la dispersion de un haz de luz, por particulas de un compuesto remanente después de la evaporacién de la fase mévil. Es un detector universal y no requiere que el compuesto posea un croméforo para su deteccién. Su aplicacién incluye el analisis de tensioactivos, lipidos y azticares. A diferencia del detector de indice de refraccién que es el que habitualmente se requiere para estos anilisis, se puede utilizar con gradiente de elucién y es suficientemente robusto para trabajar en un amplio tango de condiciones operativas. No se puede utilizar con sustancias no volatiles como buffers en la fase mévil o detectar analitos muy volatiles. LasCatedra de Control de Calidad de Medicaiiientos aplicaciones tipicas son: el andlisis de iones cloruro y sodio en productos” farmacéuticos, lipidos utilizados como componentes en formulaciones, azticares y polimeros de azticares. Posee una sensibilidad cercana a 10 ng de analito. © — Detector electroquimico: es generalmente utilizado en el modo coulombiméirico. Se aplica un potencial fijo entre un electrodo de trabajo y uno de referencia, La deteccién se basa en la produccién de electrones cuando se oxida un analito, que es la forma operativa utilizada mas cominmente, o el consumo de electrones en el modo reductor. Se mide el flujo de corriente a través de la celda del detector entre los electrodos de trabajo y el auxiliar. El electrodo de trabajo Neva a cabo la oxidacién o la reduccién y es generalmente fabricado con pasta do carbén. Es de utilidad en bicandlisis selectivos tales como drogas en plasma, por ejemplo: catecoles como la adrenalina y antirreumaticas como la penicilamina. © Detector amperométrico de pulsos: no existe realmente diferencia entre este detector y el electroquimico, a excepcién que este detector ha crecido ampliamente como parte de la cromatografia ionica y se utiliza en la forma amperométrica donde se mide la conduccién de una corriente provocada por un analito iénico entre dos electrodos, mas que una corriente de cargas provocada Por la reduccién u oxidacién de un analito. El electrodo de trabajo, en este caso, es generalmente de oro. El detector es altamente sensible a compuestos idnicos, es utilizado en cromatografia fosfatos y sulfatos. Su aplicacién t(picamente farmacéutica es ol analisis de cardendlidos y de antibisticos aminoglucésidos que no poseen croméforos, Posee una sensibilidad de hasta 1 ng de analito. Es ampliamente utilizado en glucobiologia, en el andlisis de azticares residuales derivados de glucoproteinas. En el modo de pulsos, se alternan las polaridades de los electrodos de forma tal de mantener sus superficies limpias. © Detector de indice de refraccién (RI): en este caso la deteccién se basa en los cambios del indice de refraccién cuando el analito pasa a través de la celda de muestra del detector, mientras que en la celda de referencia se halla fase movil Como el detector ELSD, el Ri es un detector universal con menor selectividad queCatedra de Control de Calidad de Medicaiitentos ELSD. Es muy sensible a la composicién de la fase mévil ya la temperatura lo quie™ hace que este detector sea poco robusto. Se continua utilizando como detector universal ya que es mas barato que el ELSD. Posee una sensibilidad cercana a 1 hig de compuesto. © Detector de fluorescencia: Se utiliza para el andlisis de sustancias que Presentan fluorescencia natural 0 conferida por derivatizacién con un reactivo fluorogénico. Su alta. sensibilidad y selectividad lo convierte en un detector adecuado para el andlisis de trazas. Se utilizan dos longitudes de onda, una de excitacion y otra de emision. Al excitar la muestra a una longitud de onda dada, varios componentes de la muestra podrian absorber energia, pero pocos emitiran ademas a la longitud de onda elegida. Muy utilizado en bioandlisis selectivos. Posee una sensibilidad menor a los nanogramos para compuestos altamente fluorescentes. Normalmente se utiliza una lampara de Xenén para la excitacién, Pero exiten equipos que poseen lémpara de Deuterio de alta intensidad para la excitacién en bandas de absorcién a longitudes de onda bajas. © Deteccién por espectrometria de masas: un problema fundamental es el acoplamiento de la cromatografia de liquidos con la espectrometria de masas debido al contraste entre los grandes vollimenes de disolvente de la primera y el requerimiento de vacio de la segunda. Para resolver este problema se han creado diversas interfases. En una de elas el efluente de la columna se divide y solo una mindscula fracci6n se introduce en el espectrémetro de masas. En otro sistema, el efluente se deposita sobre una cinta que transporta el solvente y el analito hacia una camara calorifica para eliminar el primero por volatilizacién, Tras la evaporacién, el analito ingresa en una zona de ionizacién donde tiene lugar la desorcién y la ionizacién. Otra interfase comercializada es la denominada “ termovaporizador’ que permite la introduccién directa de todo el efluente de una columna con caudales de hasta 2 mLimin.. Con esta interfase, el liquido se vaporiza al pasar por un tubo