RESUMEN

Describimos un protocolo para inducir la aterosclerosis en la raíz aórtica

de ratones ApoE - / - alimentados con una dieta aterogénica, a través de una
liberación continua de aldosterona. También se describen métodos para
caracterizar la composición de la placa.

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Marzolla, V., Armani, A., Mammi, C., Feraco, A., Caprio, M. Inducción de placas
ateroscleróticas a través de la activación de receptores de mineralocorticoides en
ratones con deficiencia de apolipoproteína E. J. Vis. Exp. (139), e58303, doi:
10.3791 / 58303 (2018).

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RESUMEN

La aterosclerosis se debe a una respuesta inflamatoria crónica que afecta el

endotelio vascular y es promovida por varios factores como la hipertensión, la
dislipidemia y la diabetes. Hasta la fecha, hay evidencia que respalda el papel de
la aldosterona circulante como factor de riesgo para el desarrollo de enfermedades
cardiovasculares. Se han generado modelos de ratones transgénicos para
estudiar procesos celulares y moleculares que conducen a la aterosclerosis. En
este manuscrito, describimos un protocolo que aprovecha la infusión continua de
aldosterona en ApoE - / -ratones y genera placas ateroscleróticas en la raíz aórtica
después de 4 semanas de tratamiento. Por lo tanto, ilustramos un método para la
cuantificación y caracterización de lesiones ateroscleróticas a nivel de la raíz
aórtica. El valor agregado de la infusión de aldosterona está representado por la
generación de lesiones ateroscleróticas ricas en lípidos y células inflamatorias
después de 4 semanas de tratamiento. Describimos en detalle los procedimientos
de tinción para cuantificar el contenido de lípidos y macrófagos dentro de la
placa. En particular, en este protocolo, realizamos la inserción de tejido cardíaco
en OCT para preservar la antigenicidad del tejido cardíaco y facilitar la detección
de antígenos de interés.

INTRODUCCIÓN

La aterosclerosis es una de las principales causas de mortalidad y morbilidad en

todo el mundo 1 . Se caracteriza por un estado inflamatorio crónico donde los
vasos sanguíneos están infiltrados por lípidos y leucocitos que determinan la
formación de placas ateroscleróticas. La mayoría de los eventos cardíacos agudos
están asociados con eventos trombóticos debido a la ruptura de la placa. Las
placas propensas a la ruptura se definen como "vulnerables" y se caracterizan por
una mayor infiltración de leucocitos proinflamatorios, un núcleo necrótico y una
delgada capa fibrosa 2 . En las últimas décadas, los estudios clínicos y
experimentales han aclarado la compleja fisiopatología de la enfermedad. Se
utilizan varios modelos animales para investigar los mecanismos moleculares
implicados en la inducción de la aterosclerosis 3.. Actualmente, el ratón es la
especie más utilizada para estudiar la aterosclerosis a pesar de algunas
diferencias específicas de especie existentes en su fisiopatología en comparación
con los humanos. En particular, el colesterol circulante está compuesto
principalmente por lipoproteínas de alta densidad (con propiedades
antiaterogénicas) en modelos de ratón, mientras que en humanos el colesterol
circulante se transporta principalmente como lipoproteínas de baja densidad
(LDL), lo que probablemente representa la razón principal por la que los ratones
de tipo salvaje No desarrollar aterosclerosis espontánea 4 . Además, los ratones de
tipo salvaje son generalmente resistentes a la absorción de colesterol de la dieta,
mientras que los humanos absorben alrededor del 50% del colesterol en la
dieta 4. Para superar estas limitaciones, se han generado varios modelos de
ratones genéticamente modificados. El ratón deficiente en apolipoproteína E
(ApoE - / - ) y el ratón deficiente en receptor de LDL (LDLr - / - ) son ampliamente
utilizados. En una dieta alta en grasas colesterol alto, ApoE - / - ratones desarrollan
placas más rápidamente en comparación con los de LDLr - / - ratones, y por esta
razón, el uso de la ApoE - / - ratones es más extendida que la de los de
LDLr - / - ratones 5 , 6 . El ApoE - / -los ratones desarrollan lesiones en cualquier etapa
de la aterosclerosis y son comparables a los observados en humanos, aunque las
placas de los ratones no muestran un fenotipo inestable 7 . En general,
los ratones ApoE - / - desarrollan espontáneamente aterosclerosis y este proceso se
acelera con una dieta occidental 3 . La gravedad de la aterosclerosis se puede
evaluar a nivel de la arteria carótida, pulmonar, femoral y braquiocefálica, y la raíz
aórtica 6 . En particular, la raíz aórtica representa un sitio anatómico propenso a
desarrollar lesiones ateroscleróticas en ratones. Por esta razón, es una práctica
común evaluar la formación de placas ateroscleróticas en esta región.

Varios estudios han demostrado que la aldosterona está implicada en el desarrollo

de la aterosclerosis 8 , 9 , 10 . La infusión de aldosterona
en ratones ApoE - / - alimentados con una dieta aterogénica acelera el desarrollo de
lesiones ateroescleróticas de la raíz aórtica que inducen la formación de placas
inflamadas y ricas en lípidos 10 .

En resumen, describimos un protocolo que incluye infusión de aldosterona,

alimentación con dieta aterogénica, inclusión de tejidos cardíacos, cuantificación y
caracterización de lesiones ateroscleróticas en ratones ApoE - / - . Este
procedimiento promueve una formación eficiente de placas ateroscleróticas
inflamadas y ricas en lípidos y representa un modelo valioso para el estudio de la
aterogénesis.
 PROTOCOLO

El estudio fue aprobado por los Institutos Nacionales Italianos de Comités de

Atención y Uso de la Salud, número de autorización 493/2016-PR. Todos los
procedimientos se llevaron a cabo según las pautas de la Comunidad Europea
para el uso de animales de experimentación (Directiva Europea, 2010/63 / UE).

Nota: Implantación subcutánea de minibomba osmótica que contiene vehículo

(etanol en solución salina) o aldosterona (240 µg · kg -1 · d -1 ) en ratones machos
de 8-10 semanas deficientes para el gen ApoE . En general, los ratones ApoE - /
-
 machos de 8-10 semanas de edad pesan alrededor de 25-26 g.

1. Disolviendo la aldosterona

1. Disuelva 5 mg de aldosterona en polvo en 1 ml de etanol absoluto.

2. Agregue 56.7 µL de aldosterona (disuelto en etanol) a 68.3 µL de solución
salina para obtener una concentración de 2.27 µg / µL. Llene completamente las
minibombas osmóticas con 125 µL de esta solución (la capacidad máxima de cada
minibomba es 125 µL).
3. Utilice un caudal de minibomba de 0,11 µL / h; por lo tanto, se liberan 2,64
µL de la solución cada 24 h. Dé a cada ratón alrededor de 6 µg · d -1 de
aldosterona durante 28 días.

2. Llenado e implantación de bomba osmótica

Nota: Las bombas se suministran en dos partes separadas: el cuerpo principal de

la bomba y el regulador de flujo.

1. Rellene y manipule las minibombas con guantes quirúrgicos.

Nota: los aceites para la piel pueden interferir con el rendimiento de las
minibombas. Los siguientes pasos deben realizarse en una campana de flujo
laminar estéril.
2. Conecte el tubo de llenado (suministrado con las minibombas) a una jeringa
de 1 ml y extraiga la solución de aldosterona o el vehículo.
Nota: Es importante evitar que entre aire en la jeringa mientras se aspiran
soluciones del tubo para evitar la formación de burbujas de aire en la bomba.
3. Inserte el tubo de llenado a través del orificio en la parte superior de la
minibomba hasta que no pueda avanzar más ( Figura 1A -1B ). Llene lentamente
la bomba con la aldosterona o el vehículo. Observe la sombra oscura dentro de la
bomba que indica el nivel del líquido. Observe este aumento de nivel junto con la
bomba de llenado.
1. Deje de llenar la bomba cuando una gota de líquido salga del cuerpo
de la bomba.
4. Retire con cuidado el tubo de llenado e inserte el regulador de flujo en el
cuerpo de la minibomba ( Figura 1C ). Asegúrese de que el regulador esté
asentado firmemente contra el cuerpo de la bomba. Deje las bombas osmóticas
llenas en un vaso de precipitados que contenga solución salina estéril a 37 ° C
durante hasta 24 h antes de la implantación en el ratón (procedimiento de
cebado).
5. Realice la cirugía en un área desinfectada con etanol al 70% que promueva
la asepsia.
6. Aplique 1-3 gotas en el sitio de incisión de 0.25% de bupivacaína y
anestesie al animal con 3% de isoflurano. Encienda el suministro de gas y
configure el medidor de flujo a 500-1000 ml / min. Coloque el animal en la cámara
de inducción y selle la parte superior. Encienda el vaporizador al 5% de isoflurano
y controle el mouse hasta que esté reclinado.
1. Cambie el sistema para que fluya hacia la nariz. Retire al animal de
la cámara y colóquelo en la nariz. En 2-3 minutos, el mouse comienza a
despertarse. Reinicie el flujo de gas con el medidor de flujo a 100-200 ml / min y el
vaporizador al 3% de isoflurano.
2. Asegure una profundidad adecuada de anestesia antes de realizar
los procedimientos probando la retirada del pedal y los reflejos
palpebrales. Monitoree la respiración y la respuesta a la estimulación durante el
procedimiento y ajuste el vaporizador según sea necesario.
3. Proteja las córneas de la desecación aplicando una pomada
oftálmica.
7. Prepare al animal quitando el vello del sitio quirúrgico con una navaja
( Figura 1D ). El sitio habitual para la implantación subcutánea de bombas está en
la parte posterior.
8. Prepare el sitio quirúrgico con material de almohadilla no tejido saturado
con alcohol isopropílico al 70%.
9. Use un espacio limpio y dedicado (desinfectado con etanol al 70%) y
cubierto con una cortina estéril. Coloque la punta de los instrumentos en un
esterilizador de cuentas de vidrio. Comience la cirugía con instrumentos
esterilizados y manipule los instrumentos asépticamente.
10. Use unas tijeras quirúrgicas para hacer una incisión de 0.8-1 cm (alrededor
de 2 cm cerca de la cola), como se muestra en las Figuras 1E-1F. Mantenga la
esterilidad al no tocar nada fuera del espacio quirúrgico dedicado con guantes
estériles o puntas de instrumentos.
11. Tenga cuidado de cortar solo la piel pero no los tejidos subyacentes. Use
una mano para sostener las pinzas para abrir la incisión. Use la otra mano para
sostener el trocar para extender la piel con el fin de crear un bolsillo para la bomba
desde la parte posterior hacia arriba hasta la escápula (en el lado derecho o
izquierdo del mouse).
12. Inserte la bomba en la incisión. Empuje suavemente la bomba
completamente en el bolsillo ( Figura 1H ). Debe haber suficiente piel libre para
cerrar la herida sin necesidad de tensión o estiramiento de la piel. Una vez que se
ha insertado la bomba, suture la incisión con alambre quirúrgico (poliglactina 910
con tamaño de sutura 6-0)
Nota: La cabeza del regulador debe estar orientada hacia la parte frontal del ratón
( Figura 1G ).
13. Aplique ungüento tópico de povidona / yodo al 10% con un hisopo limpio
( Figura 1I ) y mantenga al animal en una etapa de calentamiento. No deje a los
ratones desatendidos hasta que recuperen la reclinación esternal. Evaluar el
estado de hidratación y administrar 0,5 ml de solución salina al 0,9% por vía
subcutánea si es necesario. Devuelva al animal a su vivienda habitual.
14. Siga las pautas institucionales para la documentación (por ejemplo,
complete un formulario quirúrgico con información operativa y postoperatoria,
actualice la tarjeta de la caja con el procedimiento y la fecha) y proporcione
analgésicos (buprenorfina, 0.05 mg / kg) para reducir el dolor y los antibióticos
posquirúrgicos (enrofloxacina 85 mg / kg) para evitar la infección posquirúrgica.
1. Continúe monitoreando diariamente y examine si hay signos de
dolor. Preste atención a que la herida esté completamente cerrada y la minibomba
se mantenga en el bolsillo subcutáneo. La herida puede abrirse y el ratón puede
perder la minibomba.

3. Disección del corazón.

1. En el momento del sacrificio, anestesie los ratones con 80-100 mg / kg de

Zoletil administrado por vía intramuscular. Zoletil induce anestesia profunda. Nota:
compruebe que los ratones estén a una profundidad adecuada de anestesia antes
de realizar los procedimientos probando el pedal y los reflejos palpebrales; los
ratones serán perfundidos mientras estén profundamente anestesiados. Abra la
cavidad torácica, usando tijeras y pinzas, cortando las costillas lateralmente al
esternón, con el esternón retraído hacia la cabeza.
2. Perfundir el ratón a través del ventrículo izquierdo mediante el sistema de
perfusión por gravedad con 10-15 ml de solución salina tamponada con fosfato de
Dulbecco (PBS) helada y luego con 40-50 ml de formalina tamponada neutra al
10% para fijar la vasculatura. La fijación está indicada cuando los ratones exhiben
fuertes contracciones musculares y se vuelven rígidos.
Nota: El proceso de fijación se realiza en 10-20 min. Es posible utilizar los órganos
y tejidos fijos para realizar análisis de inmunofluorescencia o
inmunohistoquímica. Es importante destacar que tales tejidos fijos no pueden
usarse para la expresión génica y los análisis de transferencia Western.
3. Separe el corazón de la aorta sosteniéndolo con las pinzas y cortando con
tijeras o una hoja de bisturí, perpendicularmente al eje de la aorta, lo más cerca
posible del corazón sin causar daño ( Figura 2A ). Use una cuchilla de bisturí para
 cortar transversalmente a lo largo de una línea recta que une los puntos inferiores
de la aurícula derecha e izquierda ( Figura 2B ).
4. Llene la porción superior del corazón seccionado (a través de la cavidad del
corazón) con un compuesto de corte óptimo (OCT) ( Figura 2D -2E ). Coloque el
tejido dentro de un molde de plástico de criosección con el eje de la aorta
colocado perpendicularmente a la base del molde rectangular y cubra con OCT
( Figura 2F ). No debe haber burbujas de aire atrapadas. Si hay alguna burbuja
presente, intente desplazarla hacia el borde.
5. Coloque una placa de metal sobre hielo seco y luego coloque
cuidadosamente el molde ( Figura 2G ). Cuando el OCT se vuelva blanco,
envuelva el molde con papel de plata y luego almacene a –80 ° C.

4. Cortar secciones de la raíz aórtica

1. Ajuste la máquina de criostato a –20 ° C. Antes de cortar, coloque el tejido

incrustado y déjelo allí durante unos 15 minutos para ajustarlo a esta
temperatura. Ajuste la temperatura del portamuestras a -17 ° C ( Figura 3A ).
2. Coloque el bloque cardíaco congelado dentro de la máquina de criostato
para equilibrar la temperatura del bloque con la del criostato ( Figura 3B ) y saque
el bloque cardíaco congelado del molde ( Figura 3C ). Corte el exceso de OCT del
bloque congelado para adaptar mejor las dimensiones del bloque al soporte de la
muestra ( Figura 3D ).
3. Monte el bloque cardíaco congelado en el soporte de la muestra orientado
con el ventrículo hacia afuera ( Figura 3E -3I ) e inserte el soporte de la muestra
en la cabeza de orientación de la muestra ( Figura 3J ). Ajuste la orientación del
soporte de la muestra para permitir el corte del bloque para hacer que la raíz
aórtica sea perpendicular a la cuchilla ( Figura 3K ).
4. Corte el bloque y deseche las rebanadas hasta alcanzar la raíz aórtica
( Figura 3L -3N ). Recoja secciones en serie y colóquelas en los portaobjetos de
vidrio ( Figura 3O ). Monitoree el perfil anatómico de la raíz aórtica bajo el
microscopio hasta que aparezcan las 3 válvulas aórticas ( Figura 3P -3Q ).
5. Recoja las secciones a 10 µm / sección para la tinción Oil Red O y Picro
Sirius Red, y a 6 µm / sección para la tinción MAC3 ( Figura 3R ). Recoja
alrededor de 6-8 diapositivas (para cada corazón) hasta que una de las tres
válvulas desaparezca o ya no esté intacta.

5. Inmunohistoquímica

Nota: Todos los pasos de tinción informados en los siguientes protocolos se

realizan en frascos de vidrio Coplin.

1. Aceite Rojo O Mancha para grasas neutras

1. Fije las secciones en 70 ml de formaldehído al 37% durante 5
min. Lave bien con agua corriente y seque el exceso de agua.
2. Diluya 48 mL de Oil Red O (0.5% en isopropanol) en 32 mL de agua
destilada para obtener Oil Red O 0.3%.
3. Teñir las secciones en 70 ml de Oil Red O 0.3% durante 10
min. Lave las secciones en agua corriente durante 10 min.
4. Se tiñe durante 1 minuto en 70 ml de hematoxilina de Mayer. Lave
las secciones en agua corriente durante 1 minuto.
5. Sumerja las secciones en 70 ml de 0.5% de carbonato de litio. Lavar
en agua corriente durante 1 min.
6. Monte las secciones con un medio de montaje acuoso y capture
imágenes usando una cámara digital montada en un microscopio óptico.
2. Picro Sirius Red Stain para colágeno
1. Corte secciones congeladas de 10 µm y móntelas en la parte inferior
del portaobjetos.
2. Fije las secciones en 70 ml de acetona durante 5 minutos, seque al
aire y enjuague brevemente con agua destilada.
3. Coloque las secciones en 70 ml de ácido fosfomolibdico al 0.2%
durante 5 min. Enjuague brevemente en agua destilada.
4. Coloque las secciones en 70 ml de solución Picro Sirius al 0.1%
durante 90 min. Enjuague una vez con 70 ml de HCl 0.01 N. Desechar la solución.
5. Coloque en 70 ml de HCl 0.01 N durante 2 min. Enjuague
brevemente en agua destilada. Secar al aire.
6. Colocar brevemente en 70 ml de etanol al 70%.
7. Cuando se seque por completo, lugar en 70 ml de agente de
eliminación de origen terpeno y montar secciones utilizando poli (butil
metacrilato co -metil metacrilato) de montaje a base de media y de captura de
imágenes utilizando una cámara digital montada en un microscopio de luz.
Nota: Una de las ventajas de la tinción Picro Sirius Red es que es posible
distinguir las redes de fibra de colágeno Tipo I (fibras gruesas, birrefringencia
amarillo-naranja) y Tipo III (fibras finas, birrefringencia verde) mediante
microscopía de luz polarizada 11 .
3. Mac3 Stain para tinción de macrófagos
1. Corte secciones congeladas de 6 µm y móntelas en la parte inferior
del portaobjetos.
2. Fije las secciones en 70 ml de acetona fría durante 5 min. Sumergir
en 70 ml de PBS durante 2 min.
3. Con una pipeta, cubra las secciones con una solución de dodecil
sulfato de sodio (SDS) al 1% e incube durante 5 minutos a temperatura ambiente
(RT) para recuperar el antígeno. Sumergir en 70 ml de PBS durante 5 min.
4. Con una pipeta, cubra las rodajas con peróxido de hidrógeno al 0.3%
durante 20 min. Lavar en 70 ml de PBS 3 veces durante 5 min.
5. Use el kit Avidin-Biotin Complexes (ABC) -HRP para los siguientes
pasos.
6. Usando una pipeta, bloquee las secciones en suero de conejo
normal a temperatura ambiente durante 20 min. No enjuagar.
7. Tinción con MAC3 (1: 300) durante 90 min. a temperatura
ambiente Lavar en 70 ml de PBS 3 veces durante 5 min.
8. Se tiñe con IgG anti-rata biotinilada secundaria (1: 200) durante 45
minutos a temperatura ambiente. Enjuague con 70 ml de PBS 3 veces durante 5
min.
9. Cubra las secciones con Rabbit IgG ABC durante 30 minutos a
temperatura ambiente. Enjuague con 30 ml de PBS 3 veces durante 5 min.
10. Cubra las secciones con 3-amino-9-etilcarbazol (AEC) durante 10
min. Enjuague con 70 ml de agua destilada por 10 veces.
11. Se tiñe durante 1 minuto en 70 ml de hematoxilina de Mayer. Lave
las secciones en agua corriente durante 1 minuto.
12. Sumerja las secciones en 70 ml de 0.5% de carbonato de litio. Lavar
en agua corriente durante 1 min.
13. Monte las secciones con un medio de montaje acuoso y capture
imágenes usando una cámara digital montada en un microscopio óptico.

6. Análisis de imagen de lesiones ateroscleróticas en secciones de raíz

aórtica

Nota: Las secciones de la raíz aórtica teñidas con Oil Red O o MAC3 o un
anticuerpo de interés pueden analizarse utilizando el software apropiado (indicado
en la Tabla de Materiales ). Los píxeles totales que se tiñen positivamente para el
componente de interés se normalizan al área de placa total. Las imágenes fueron
recolectadas y analizadas por un investigador cegado por el tratamiento.

1. Calibración
1. Abra el software y luego seleccione la imagen (en jpg) para analizar.
2. Seleccione el inicio | Crear | Calibración rápida .
3. Configure la calibración de la imagen dibujando una línea a lo largo
de la barra de escala de la imagen.
4. Guarde la configuración de calibración.
2. Análisis de imagen
1. Seleccione la calibración de configuración guardada en
el menú Opciones | Opción de calibración espacial .
2. Seleccione Calibración | Aplicar .
3. Seleccione la herramienta polígono en el menú Seleccionar y dibuje
el perímetro a lo largo de todas las lesiones ateroscleróticas.
4. Seleccionar recuento / tamaño | Tipos . Desde el menú,
agregue Área y Área de porcentaje .
5. Desde el menú Count / Size , seleccione Manual y se abrirá una
nueva ventana.
6. Desde esta ventana, haga clic en la herramienta Elegir color en la
imagen y seleccione el modo HSI .
7. Apunte el cursor del mouse sobre los píxeles positivos del marcador
de interés para crear una gama de colores.
8. Haga clic en Recuento y el valor Suma , observado en la Tabla de
medidas , indica el porcentaje del área del marcador (también expresado en
µm 2 ) con respecto al área total de lesiones ateroscleróticas.
RESULTADOS REPRESENTATIVOS

En ratones Apo - / - de 8-10 semanas , se implantaron minibombas para infundir con

vehículo o aldosterona ( Figura 1E -1I ) y se alimentaron con una dieta
aterogénica (dieta de calorías ajustadas 42% de grasa) durante 4 semanas. Al
final del tratamiento, los ratones fueron sacrificados y perfundidos con PBS y
formalina al 10% como se describió anteriormente. La raíz aórtica se separó de la
porción apical del corazón y se incrustó en OCT ( Figura 2 ). Las secciones
transversales de las raíces aórticas se prepararon para diferentes tinciones
utilizando una máquina de criostato ( Figura 3 ).

La composición de la placa aterosclerótica se puede caracterizar a través de la

tinción de componentes específicos, que definen la etapa de desarrollo de la
placa. La tinción Oil Red O se usa para determinar el contenido de lípidos de las
lesiones ateroscleróticas como se describe en el paso 5.1, la tinción Picro Sirius
Red se usa para determinar el contenido de colágeno como se describe en el paso
5.2, y la tinción Mac3 se usa para medir el contenido de macrófagos descrito en el
paso 5.3. Después de 4 semanas de tratamiento con aldosterona, los ratones
mostraron un aumento significativo en el contenido de lípidos ( Figura 4A -4C ) y
macrófagos ( Figura 4D - 4F ) en placas ateroscleróticas a nivel de la raíz aórtica,
pero no se observaron diferencias en el contenido de colágeno ( Figura 4G -4I) en
comparación con los ratones tratados con el vehículo. De hecho, la aldosterona
aceleró la aterogénesis en este modelo, induciendo inflamación vascular pero no
fibrosis ( Figura 4 ).
Figura 1. Preparación e implantación de minibomba osmótica con vehículo o
aldosterona. AB) Pasos para llenar minibombas osmóticas con vehículo o
aldosterona. C) Pasos para cerrar el cuerpo de la bomba con el regulador de
flujo. DF) Pasos para crear una incisión para la implantación de la bomba en la
parte posterior del mouse. GI) Implantación de minibomba osmótica y sutura de
incisión. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Preparación del corazón y la raíz aórtica para incrustar y
seccionar. AB) El corazón se corta transversalmente a lo largo de una línea recta
que une los puntos inferiores de la aurícula derecha e izquierda. La parte apical
del corazón se procesa para cuantificar la composición de las lesiones
ateroscleróticas en la raíz aórtica. C) La raíz aórtica desde el interior del
corazón. DE) Llenado de la cavidad cardíaca con OCT. F) Orientación del corazón
disecado en un molde precargado con OCT (con la cavidad cardíaca en dirección
a la parte inferior del molde) G) Congelación del corazón disecado con OCT en el
molde. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Seccionamiento de la raíz aórtica utilizando un microtomo
criostato. A) Pre-enfríe el criostato y ajuste la temperatura adecuada para la
máquina y el mandril. BD) El bloque OCT sólido se separa del molde y el exceso
de OCT alrededor del corazón se elimina con una cuchilla. EI) El bloque de OCT
se fija, utilizando OCT líquido, en el soporte. JK) El soporte se inserta en el
mandril y se orienta con el ventrículo hacia afuera. LM) Seccione el bloque hasta
que el corazón disecado quede completamente expuesto. NO) Ajuste el grosor a
10 y / o 6 µm y recoja las rodajas en el vidrio. PQ) Verifique la presencia de las
tres válvulas bajo el microscopio. R)Las rodajas posteriores se recogen, como se
muestra, hasta que ya no se observan una o más válvulas. Haga clic aquí para ver
una versión más grande de esta figura.

Figura 4. Cuantificación de la composición de la placa aterosclerótica en

ApoE - / - tratada con aldosterona o con vehículo . AB) Secciones
representativas teñidas con Red Oil O de raíz aórtica en ratones ApoE - / - de 8-10
semanas de edad tratados con vehículo ( A ) o aldosterona ( B ) y alimentados
con una dieta aterogénica durante 4 semanas. C) Cuantificación del contenido de
lípidos como porcentaje de tinción positiva / área total de
placa. DE) Representante Mac3 teñido de secciones transversales de raíz
aórtica. F) Cuantificación del contenido de macrófagos como porcentaje de tinción
positiva / área total de placa. GH) Representante Picro Sirius Secciones
transversales teñidas de rojo de la raíz aórtica.I) Cuantificación del contenido de
colágeno como porcentaje de tinción positiva / área total de placa. Los valores se
expresan como media ± error medio estándar (SEM; n = 6 para cada grupo). Haga
clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

DISCUSIÓN

La aterosclerosis es un trastorno inflamatorio crónico asociado con vasos grandes

y medianos que implican interacciones entre múltiples tipos de células, como
macrófagos, linfocitos T, células endoteliales y células de músculo liso 1 . A pesar
de las limitaciones de los modelos aterogénicos murinos, existe una gran cantidad
de evidencia sobre el proceso aterosclerótico. Estos modelos tienen la ventaja de
generar rápidamente cohortes experimentales de una edad y género
específicos. Los ratones también muestran un fondo genético definido y
homogéneo.

El desarrollo de placas ateroscleróticas, observado en modelos de ratón

propensos a la aterosclerosis, se parece en parte a lo observado en sujetos
humanos, excepto por la formación de placas inestables 4 . La ruptura de la placa y
la trombosis posterior, la principal causa de infarto de miocardio en humanos, no
se observa en modelos aterogénicos murinos. En nuestros artículos recientes,
demostramos que la infusión de aldosterona puede inducir, después de 4
semanas, un fenotipo de placa inestable en ratones ApoE - / - alimentados con un
HFD 10 . De hecho, este tratamiento puede aumentar el área de la placa, el
contenido de lípidos y el área inflamatoria a nivel de la raíz aórtica, sin diferencias
significativas en el contenido de colágeno en comparación con los ratones no
tratados 10. Es de destacar que estos ratones muestran un mayor desarrollo de la
aterosclerosis independiente de la hipertensión, dado que el tratamiento con
aldosterona no alteró significativamente la presión arterial 10 .

En el presente manuscrito, ilustramos en detalle el procedimiento técnico para

incrustar el tejido cardíaco en OCT, así como los pasos secuenciales, es
decir,Seccionamiento de la raíz aórtica y análisis de placa. En comparación con la
parafina, OCT permite la preparación de secciones con un alto rango de
espesores (1-100 µm) con un microtomo de criostato y un procesamiento mínimo
del tejido. Las limitaciones incluyen la calidad del tejido congelado, que se ve
potencialmente afectado por la formación de cristales de hielo y puede alterar los
detalles subcelulares y generar artefactos detectables por tinción
inmunohistológica. De hecho, se cree que la criopreservación preserva mejor el
antígeno y la antigenicidad. De hecho, los tejidos congelados preservan la
estructura de los antígenos. Además, el procesamiento de tejido congelado para
inmunohistoquímica permite evitar el uso de formalina, que es un compuesto
tóxico y cancerígeno.
La raíz aórtica es un sitio relativamente sencillo de identificar para el
procesamiento histológico. Este sitio anatómico es un estándar de oro para
estudiar el desarrollo de lesiones ateroscleróticas en ratones propensos a la
aterosclerosis. Los datos obtenidos mediante el análisis de esta región específica
permiten comparaciones entre ratones que pertenecen al mismo grupo o
diferentes grupos experimentales. De hecho, durante el corte de la raíz aórtica, es
fácil reconocer una región específica caracterizada por la presencia de las tres
válvulas. Para obtener una región tan específica, se recomienda prestar especial
atención a varios pasos críticos durante la incrustación y el seccionamiento. Es
importante llenar la cavidad de la parte superior del corazón seccionado con OCT
para evitar la formación de burbujas de aire en el tejido que pueden comprometer
la integridad de las secciones. Además, Para garantizar que el ángulo de corte sea
exactamente perpendicular a la aorta ascendente durante el corte, es necesario
orientar adecuadamente el corazón seccionado superior perpendicular a la
superficie inferior del molde de tejido. Para obtener rodajas intactas, la
temperatura del criostato debe ser exactamente a -20 ° C. De hecho, una
temperatura más baja podría comprometer la calidad de las secciones (es decir, la
cuchilla podría desmoronar las secciones haciéndolas inutilizables).

Es de destacar que cuando aparecen las tres válvulas, se recomienda cortar el

tejido con diferentes grosores, según el tipo de análisis que se realizará. De
hecho, algunas diapositivas se usarán para determinar la progresión de la placa,
mientras que las diapositivas restantes se podrían usar para diferentes tinciones
( es decir , Picro Sirius, Mac3, etc. ).

Las lesiones ateroscleróticas en ratones tratados con aldosterona parecen ricas en

lípidos y macrófagos caracterizados por el uso de Oil Red O (para la tinción de
lípidos), Mac3 (para la tinción de macrófagos), rojo de Sirius (para la tinción de
colágeno) u otros anticuerpos específicos para proteínas de interés. Es importante
resaltar que la inclusión de OCT, a diferencia de la inclusión de parafina, evita el
uso de solventes orgánicos que eliminan el contenido de lípidos de las
lesiones. Por lo tanto, la tinción de lípidos con Oil Red O es factible en secciones
embebidas en OCT y el contenido de lípidos de las placas ateroscleróticas se
puede cuantificar con precisión.

En el presente manuscrito demostramos que la infusión de aldosterona es un

método valioso para promover la aterosclerosis en ratones ApoE - / - . De hecho, la
infusión de aldosterona en ratones ApoE - / - es capaz de: 1) aumentar la activación
de las células endoteliales, como lo demuestra el aumento de la expresión de
moléculas involucradas en la adhesión y migración de monocitos en las primeras
etapas de la formación de placa aterosclerótica 12 , 13 ; y 2) aumentar el contenido de
lípidos y macrófagos proinflamatorios a nivel de la raíz aórtica 10 , 13 . Estos efectos
no se deben a los efectos hemodinámicos de la aldosterona 10. En conclusión, el
protocolo propuesto representa un método válido para generar y caracterizar la
aterosclerosis en ratones; Esto podría ayudar a controlar las primeras etapas de la
enfermedad y los resultados de la intervención terapéutica y la rehabilitación en la
aterosclerosis.

REVELACIONES

Los autores no tienen nada que revelar.

EXPRESIONES DE GRATITUD

Este trabajo fue apoyado por subvenciones del Ministerio de Salud italiano
(Ricerca Corrente, GR-2009-1594563 y PE-2011-02347070 a MC)

MATERIALES

Numero de
Nombre Empresa Comentarios
catalogo

Dieta de calorías ajustadas (42% de grasa) Envigo TD.88137 dieta aterogénica

Minibomba osmótica con tubo de llenado Alzet modelo 1004 para realase continuo

Aldosterona SIGMA A9477 hormona

Etanol SIGMA 34852-M solvente

Preparaciones de Alchol saturadas con 70% de alcohol isopropílico Kendal Webcol 6818 Desinfectante

Alambre de cirugía (Vicryl 6.0) Demas 500004 cirugía

Ungüento de povidona / yodo al 10% Aplicare-Meriden 52380-0026-1 Antiséptico

Formalina 10% SIGMA HT5012 arreglar vascolatura

Cryomold Bio-Optica 07-MP1515 para empotrar

Compuesto OCT Sakura Finetek 4583 para empotrar

Criostato Leica CM1900 instrumento para sec

Solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco Aurogene AU-L0615-500 solución tampón

Diapositivas de adhesión de polisina VWR 631-0107 gafas de microscopio

Gafas de cubierta Bio-Optica 72015 gafas de cubierta

Formaldehído 37% SIGMA 252549 solvente

Solución de aceite rojo O (0.5% en isopropanol) SIGMA O1391 solución de tinción

Hematoxilina de Mayer SIGMA MHS32 solución de tinción

Carbonato de litio SIGMA 62470 tampón de lavado

Medio de montaje acuoso Thermo Scientific TA-125-AM solución de montaje

Acetona SIGMA 179124 solvente

Solución de ácido fosfomolibdico SIGMA HT153 para la histología

Direct Red 80 (Picrosirius Red) SIGMA 365548 solución de tinción

producto para la prep

Bio Clear (agente limpiador de origen terpeno) Bio-Optica 06-1782D
histológicas

Medio de montaje Eukitt Quick Hardening (Poli (metacrilato de butilo-metacrilato de metilo) SIGMA 3989 solución de montaje

Dodecil sulfato de sodio Fluka 71725 polvo

Solución de peróxido de hidrógeno (30%) SIGMA H1009 solución

Vectorstain ABC KIT que incluye: anti-IgG de conejo ABC, suero de conejo normal, IgG anti-rata secundaria Laboratorios
PK-6100 solución de tinción
biotinilada, vectoriales

Laboratorios
3-amino-9-etilcarbazol SK-4200 solución de tinción
vectoriales

Anticuerpo Mac3 BD Biosciences 553322 anticuerpo

ImagePro Premier 9 Cibernética de medios 050910000-2534 software para analiza