Revista de cromatografía B 1152 (2020) 122226

Listas de contenidos disponibles en ScienceDirect

Revista de cromatografía B

revista Página de inicio: www.elsevier.com/locate/jchromb

Cuantificación de metadona, buprenorfina, naloxona, opioides y sus derivados en sangre

completa por cromatografía líquida-espectrometría de masas de alta resolución: análisis de su
participación en casos forenses fatales

Catherine Feliu, Celine Konecki, Laurent Binet, Damien Vautier, Cyril Haudecoeur, Olivier Oget, Aurelie Fouley, Hélène Marty,
Claire Gozalo, Yoann Cazaubon, Zoubir Djerada •

Departamento de Farmacología, EA3801, SFR CAP-santé, Hospital Universitario de Reims, 51, rue Cognacq-Jay, 51095 Reims Cedex, Francia

INFORMACIÓN DEL ARTÍCULO RESUMEN

Palabras claves: Los opioides representan una amplia familia de compuestos que se pueden usar en varias indicaciones: analgésicos, antitusivos, terapia de
Opioides de espectrometría de masas de alta resolución sustitución de opioides (por ejemplo, metadona, buprenorfina ...). Cuando estos productos se usan mal, a menudo son adictivos. Por lo tanto, nuestro
objetivo fue desarrollar un método analítico capaz de cuantificar rápidamente varios opiáceos y opioides (6-monoacetilmorfina, buprenorfina, codeína,
Análisis toxicológico Análisis de casos
dihidrocodeína, 2-etil-1,5-dimetil-3,3-difenilpirrolidina, etilmorfina, heroína, metadona, morfina, nalbufina, naloxona, norbuprenorfina, norcodeína,
forenses fatales
norpropoxifeno, oxicodona y propoxifeno) en sangre completa mediante cromatografía líquida de ultra alto rendimiento combinada con
espectrometría de masas de alta resolución (UHPLC-HRMS). El ensayo validado requiere solo 100 µL de la muestra de sangre. La muestra se
prepara mediante una extracción rápida líquido-líquido utilizando sulfato de zinc al 5% (W /

V), metanol y acetonitrilo. Las curvas de calibración varían de 0,98 a 1000 µg / L, excepto la buprenorfina (0,39–100 µg / L) y la
norbuprenorfina (0,20–100 µg / L). La precisión inter e intraanalítica fue inferior al 15%. Por lo tanto, describimos el desarrollo y la validación
completa de un ensayo preciso, sensible y preciso utilizando UHPLC-HRMS para el análisis de opioides en sangre total. Después de la
validación, este nuevo ensayo se aplica con éxito en una aplicación de laboratorio de rutina.

1. Introducción
Los opioides representan una gran familia de compuestos que se pueden usar en varias
indicaciones: analgésicos, antitusivos, terapia de sustitución de opioides (por ejemplo, metadona,
buprenorfina ...). Cuando estas moléculas se usan mal, a menudo es adictivo. En caso de uso
excesivo, se observarán las consecuencias clínicas asociadas con la intoxicación o la sobredosis de
opioides: depresión respiratoria, frecuencia cardíaca reducida, somnolencia, miosis, coma y posible
muerte. Durante los últimos 15 años, Estados Unidos y Europa se han enfrentado a una crisis de
opiáceos cada vez mayor
Según los datos más actualizados, las muertes relacionadas con la metadona han superado las
muertes relacionadas con la heroína en Croacia, Dinamarca, Francia e Irlanda [3] . En respuesta a
esta crisis mundial de salud pública, muchos países han estado trabajando en sus políticas de salud,
principalmente para mejorar la regulación de recetas y limitar el uso indebido de estas sustancias. La
cuantificación de los opioides y sus derivados en los fluidos biológicos es de considerable
importancia en la toxicología clínica y forense en muchas situaciones, como conducir bajo la
influencia, comprender la causa de la muerte, investigar los agentes antidopaje o presentar
sustancias químicas. [5] . Se pueden utilizar diferentes matrices biológicas para el análisis de opioides
y derivados. [6–8] .

[1–3] . El número de muertes por sobredosis de opioides en los Estados Unidos ha seguido
aumentando, con más de 50,000 muertes reportadas en 2016 [4] . En Europa, los opioides están
presentes en el 81% de los casos de sobredosis mortal [3] . La heroína o sus metabolitos están
implicados en la mayoría de las sobredosis fatales declaradas, frecuentemente en combinación con
otras sustancias. Otros opioides, principalmente metadona y dosis altas de buprenorfina, también se
informan a menudo en informes toxicológicos de sobredosis fatales. [1–3] .
La sangre completa es la matriz de elección para la cuantificación de las drogas ilícitas. [5,7] .
Como las concentraciones en sangre pueden ser muy bajas, los métodos analíticos deben ser muy
sensibles. Los límites de cuantificación recomendados son entre 5 y 10 µg / L para todos estos tipos
de analitos en la sangre.
[5] . En la década de 1990, la cuantificación de opioides se realizó por cromatografía de gases junto
con espectrometría de masas (GC-MS) [9] . En los últimos años, gracias a la mejora de la tecnología
en términos de especificidad,

• Autor para correspondencia en: Departamento de Farmacología, EA3801, Facultad de Medicina, Hospital Universitario de Reims, 51, rue Cognacq-Jay, 51095 Reims Cedex, Francia.

Correos electrónicos: zoubir.djerada@univ-reims.fr , zdjerada@chu-reims.fr (Z. Djerada).

https://doi.org/10.1016/j.jchromb.2020.122226
Recibido el 26 de diciembre de 2019; Recibido en forma revisada el 2 de junio de 2020; Aceptado el 4 de junio de 2020

Disponible en línea el 09 de junio de 2020

1570-0232 / © 2020 Elsevier BV Todos los derechos reservados.

C. Feliu y col. Revista de cromatografía B 1152 (2020) 122226

precisión y sensibilidad, la cromatografía líquida junto con la espectrometría de masas ha

reemplazado el "estándar de oro viejo", GC-MS [10] . La LC-MS se usa ampliamente en toxicología

Retention time (min)

clínica y forense para la detección y cuantificación de fármacos en diferentes matrices biológicas
complejas
[11-24] . En los últimos años, un nuevo enfoque físico y analítico que utiliza espectrometría de masas

2.43
3.48
2,11
2.05

3.53
2.63
3.12
3.59

1.09

2.13

3.59

3.57
de alta resolución (HRMS) ha surgido en los laboratorios de toxicología. [25–31] . Gracias a esta

316
2.7

3.3
2
tecnología, la identificación y cuantificación de compuestos se basaron en la medición precisa de
iones de masa y fragmentos. El objetivo de este estudio fue, por lo tanto, desarrollar y validar un
método rápido, sensible y cuantitativo para el análisis de 16 opioides y derivados:

C12 H12 N O2 ???

6-monoacetilmorfina (6- MAM), buprenorfina, codeína, dihidrocodeína, 2-etil-1, 5-dimetil-

C14 H15 N3 O2
C24 H30 N O4

C19 H22 N O4

C16 H16 N O2
C16 H15 N O2
C25 H34 N O3

C16 H18 N O2
C15 H15 O3

C14 H13 O3

C15 H13 O2
C5 H10 N O
C17 H16 N

C19 H24 N
fragment

C7 H5 O
C13 H9
Confirmation fragment ion ( m/z) Measured values
3,3-difenilpirrolidina (EDDP), etilmorfina, heroína, metadona, morfina, nalbufina, naloxona,
norbuprenorfina, norcodeína, norpoxifeno, oxicodona y propoxifeno en cromatografía líquida de alto
rendimiento junto con espectrometría de masas de alta resolución (UHPLC- HRMS) .

165.07043
396.21748
243.10212

234.12827
257.11643
328.15488
105.03404

229.08647

253.11028
396.25387
225.09155
100.07624
256.13375
266.19087
202.0868

254.1181
theorical
2. Materiales y métodos

165.06974
396.21281
243.10133

234.12741
257.11703
328.15423
105.03381

254.11728
253.10949
396.25326
225.09099
100.07619

266.19032
measured

229.0861

256.1331
2.1. Análisis LC-MS

C13 H15 N3 O2C15 H17 O3 202.09387

2.1.1 Productos quimicos

Todos los estándares de referencia y sus estándares internos (IS) fueron adquiridos de Cerilliant
(Round Rock, Texas, EE. UU.). El acetonitrilo, el metanol, el ácido fórmico y el agua, todos LC-MS
hipergrados para la fase móvil, se obtuvieron de Biosolve (Dieuze, Francia). El sulfato de zinc y el
formiato de amonio se obtuvieron de Sigma-Aldrich (Saint-Louis, Missouri, EE. UU.). Se compró

C19 H21 O C17

C25 H36 N O4

C13 H15 N3 O
C17 H18 N O2

C21 H26 N O3
C19 H20 N O3

C17 H20 N O3

C15 H15 N O2
C21 H26 N O
sangre completa de donantes sanos del Etablissement Français du Sang (EFS, Reims, Francia).

C14 H 11 O2

C14 H15 O2

C13 H13 O2
C18 H18 N
Quantification fragment ion ( m/z) Measured values

C6 H13 O
fragment

C3 H8 N
H19 N3
2.1.2. Condiciones cromatográficas y de espectrometría de masas.
Para desarrollar y validar se utilizó un sistema de cromatografía líquida de ultra alto rendimiento

245.11777

265.15790
theorical

245.11722 245.11642665

265.15823 265.15924023
con una bomba de alta presión Dionex Ultimate 3000 (ThermoFisher Scientific, San José, EE. UU.)
211.07518 211.07590
414.26303 414.26443
215.10667 215.10720

249.15085 248.14392
229.12213 229.12151

201.09094 201.09155
340.19045 340.19127
310.14352 310.14432
101.09634 101.09664

308.20089 308.20144
241.10925 241.11028
268.1327 268.13375

268.1366 286.14432

58.06603 58.06567
Junto con un espectrómetro de masas híbrido cuadrupolo QExactive Orbitrap (ThermoFisher
Scientific, San José, EE. UU.) este método.
measured

La separación cromatográfica se logró utilizando una columna UHPLC Waters Acquity HSS T3
de 1,8 μm (2,1 × 50 mm) (Waters Corp; Milford, MA, EE. UU.), Mantenida a 50 ° C. Las fases móviles
estaban compuestas de agua + ácido fórmico al 0.1% (V / V) (fase móvil A) y acetonitrilo + ácido
Retention time (RT), transition of precursors and fragments ions, mass spectrometry parameters for 16 opioids.

Collision energy (eV)

fórmico al 0.1% (V / V) (fase móvil B). Se usó un gradiente de fase móvil programado a una velocidad
de flujo de 0.5 mL / min durante 5 min de ejecución: 0 min, 3% B, siguiendo la curva cóncava; 3 min,
95% de B; 4 min, 95% de B, siguiendo la curva cóncava; 4.3 min, 3% B siguiendo la curva lineal. El
análisis y el tiempo de adquisición fueron 5,10 min.
35
35
25
30

25
25
25
15

25
25
25
35
25
10
35
15

El acoplamiento del detector se realizó utilizando una fuente de ionización por

Precursor ion ( m/z)
Theorical values

electropulverización calentada (HESI) que funciona en modo de ionización positiva, con los siguientes
ajustes: gas de revestimiento a 45 unidades arbitrarias (AU), gas auxiliar a 15 AU, velocidad de flujo
468,31084
300,15942
302,17507

278,19033
314,17507

310,21654

286,14377
358,20128
328,15433
414,26389
286,14377
326,21146
316,15433
340,22711
370,1649

de gas de barrido a 1 AU, voltaje de pulverización a 3.50 kV, temperatura capilar de transferencia de
iones a 300 ° C, nivel de RF de lente S a 70 AU y temperatura de calentamiento a 350 ° C. La
adquisición se realizó usando un modo de monitoreo de reacción en paralelo (PRM). El espectrómetro
de masas QExactive Orbitrap puede adquirir un rango de masa de 50 a 2000 m / z. La adquisición de
6-monoacetylmorphine 6-monoacetylmorphine-D3 328,15433

la ejecución fue de 0 a 5,25 min. Los ajustes para la adquisición fueron los siguientes: alta resolución
norbuprenorphine-D3

desde 17,500 (la resolución se calculó a todo el ancho a la altura media máxima a m / z 200); objetivo
dihydrocodeine-D3
buprenorphine-D4

propoxyphene-D5

propoxyphene-D5
Internal standard

1 e5
methadone-D3

oxycodone-D6
morphine-D3

morphine-D3
morphine-D3
morphine-D3

morphine-D3
codeine-D3

heroin-D9
EDDP-D3

del control automático de ganancia (AGC); Tiempo máximo de inyección (IT) 50 ms. Las energías de
colisión se han optimizado para cada analito. Se seleccionaron dos transiciones PRM: la primera
para cuantificación y la segunda para confirmación de analitos ( tabla 1 )

La calibración de masa se realizó una vez por semana en un modo positivo y negativo de
Norbuprenorphine

Norpropoxyphene
Dihydrocodeine
Buprenorphine

acuerdo con las recomendaciones del fabricante, utilizando una solución de calibración externa
Propoxyphene
Ethylmorphine

Norcodeine
Nalbuphine

Oxycodone
Methadone
Compound

(Pierce ®, ThermoScientific, San José, EE. UU.).

Naloxone
Morphine
Codeine

Heroin
Table 1

EDDP

TraceFinder Forensic 3.3 se utilizó para el monitoreo de LC-MS, administración de bibliotecas,

adquisición y procesamiento.

2
C. Feliu y col.
2.2. Preparación de soluciones estándar, estándares de calibración y muestras de control de calidad.
Estas soluciones se almacenaron durante un mes a -20 ° C. Para preparar los patrones de
calibración, se preparó una solución de trabajo (calibrador superior) con un volumen apropiado de
metanol y luego se diluyó en serie a la mitad. Los estándares de calibración oscilaron entre 0,98 y
1000 µg / L, excepto la buprenorfina (0,39–100 µg / L) y la norbuprenorfina (0,20–100 µg / L). Luego
se añadieron diez microlitros de cada dilución a 100 µl de sangre entera en blanco y se trataron como
paciente. Los controles de calidad (QC) se prepararon en nuestro laboratorio a diferentes
concentraciones correspondientes a 3 veces LLOQ (nivel bajo, QCL), 40% (nivel medio, MCQ) y 80%
(nivel alto, QCH) de los estándares más altos. Estas muestras de control de calidad se prepararon
recientemente antes del análisis con soluciones stock diferentes de las utilizadas para la preparación
estándar. Además, cuatro controles de calidad internos (BTMF A, BTMF B, Tabla 1 suplementaria )
Los controles de calidad internos se prepararon de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
2.3. Procesamiento de muestras
Se preparó una solución madre en acetonitrilo, que contenía todos los analitos a una
concentración final de 10 mg / L, excepto buprenorfina y norbuprenorfina a 1 mg / L. Se preparó una
solución estándar interna en las mismas condiciones para obtener una concentración final de 1 mg /
L cada una. Se agregaron diez microlitros de la solución estándar interna a 100 µL de la muestra de
sangre completa. Se realizó la desproteinización con 100 µl de sulfato de zinc al 5% (p / v), 100 µl de
metanol y 200 µl de acetonitrilo. Después de 60 s de mezcla de vórtice, la muestra se centrifugó a
10,000 sol por 5 min. El sobrenadante (150 µL) se evaporó bajo nitrógeno a 40 ° C. El extracto seco
se reconstituyó con 100 μl de agua (hipergrado LC-MS) que contenía ácido fórmico al 0,1% (V / V).
Se inyectaron veinte microlitros de este extracto en el sistema UHPLC-HRMS.
2.4. Procedimiento de validación
La validación se realizó de acuerdo con las recomendaciones internacionales [32-34] . La
linealidad, precisión, exactitud, selectividad, efecto de matriz (EM), arrastre y estabilidad se evaluaron
como se describió anteriormente. [35] .
2.4.1 Linealidad
Siguiendo las pautas, se determinó el límite inferior de cuantificación (LLOQ) para cada analito
como la concentración más baja para la cual la precisión estaba entre 80% y 120% y la precisión por
debajo del 20% (n = 6). El límite superior de cuantificación (ULOQ) también se determinó como la
alta concentración con una precisión entre 80% y 120% y una precisión por debajo del 20%. Se
probaron diferentes funciones de ponderación en 10 rangos de calibración para cada analito para
seleccionar la calibración de regresión (lineal, 1 / X, 1 / X2, 1 / Y ...). La precisión de los controles de
calidad, el análisis de la distribución de las desviaciones de la predicción de la regresión o el valor
residual (distribución gaussiana verificada por la prueba de D'Agostino Pearson) y la precisión de los
estándares a ± 15% (± 20% a LLOQ) de la concentración nominal fueron criterios para determinar el
modelo de regresión [35] .
2.4.1.1. Precisión y exactitud. Tres controles de calidad preparados en nuestro laboratorio (QCL,
QCM, QCH) y cuatro niveles de controles de calidad internos (BTMF A, BTMF B, BTMF C y STM A
adquiridos de ACQ Science,
Tabla 1 suplementaria ) se utilizaron para evaluar la precisión y exactitud del método. Se evaluaron la
precisión y precisión dentro del ciclo y entre ciclos analizando 10 muestras por nivel de control. La
precisión se expresó como la desviación estándar relativa y tenía que estar dentro de ± 15%. Para
mayor precisión, la concentración media tenía que estar dentro de ± 15% de la concentración
objetivo en cada nivel de control probado.
3
Revista de cromatografía B 1152 (2020) 122226
2.4.2 Selectividad
Seis muestras de sangre completa de donantes fueron pretratadas y analizadas individualmente
como espacios en blanco para investigar las interferencias. Como se recomendó, se aceptó la ausencia
de componentes interferentes cuando las respuestas de los blancos fueron inferiores al 20% del LLOQ
para los analitos y al 5% para el estándar interno correspondiente [32,33] .
2.4.3 Efecto matriz
El efecto de matriz (EM) se evaluó con seis muestras de sangre completa de diferentes fuentes,
según Matuszewsky et al. [34] . Después de la extracción, se agregaron dos conjuntos de matrices
con estándares internos y todos los analitos a una concentración baja o alta: 2.94 µg / L u 800 µg / L
respectivamente para todos los analitos, excepto para la buprenorfina (1.17 µg / L o 80 µg / L) y
norbuprenorfina (0.6 µg / L u 80 µg / L).
El factor de efecto de matriz se calculó comparando el área bajo el pico derivado de la matriz
añadida después de la extracción y el área bajo el pico de una solución pura a la misma
concentración. El factor normalizado del efecto de matriz se define para cada matriz y analizando
comparando el factor de matriz del analito y el factor de matriz del estándar interno apropiado. La
desviación estándar relativa de los factores normalizados debe ser inferior al 20%.
2.4.4 Estabilidad
La estabilidad de las drogas ilícitas en sangre total ha sido descrita en la literatura. [5,6,36–38] .
Los opiáceos, la morfina y la codeína son estables a -20 ° C incluso durante varios años. [36] . Bajo las
mismas condiciones de almacenamiento, 6-MAM se degrada más rápidamente [36] .
La estabilidad de la solución de los estándares de calibración y la solución IS se evaluó
comparando soluciones de 1 mes y soluciones recién preparadas.
La estabilidad de los controles internos de ACQ Science se evaluó durante 3 meses
comparando los controles almacenados a -20 ° C durante 3 meses y el control recién reconstituido.
La estabilidad posterior a la preparación se evaluó manteniendo las muestras tratadas (ETS)
colocadas en viales de vidrio en el automuestreador (+10 ° C) durante 24 h.
2.4.5 Efectos transferidos
La transferencia se evaluó analizando muestras en blanco (n = 6) inmediatamente después del
estándar de concentración más alta. Como se recomendó, la señal debe ser inferior al 20% del LLOQ
y inferior al 5% del estándar interno.
2.5. Revisión forense de casos fatales
Se realizó una revisión de dos años de casos forenses fatales en nuestro laboratorio. Las
muestras fueron analizadas utilizando este método analítico. Se ha estudiado la implicación de los
opioides o sus derivados. También se han informado otros compuestos que pueden aumentar la
toxicidad.
2.6. análisis estadístico
GraphPad Prism 5.0 (GraphPad Software, San Diego, CA, EE. UU.) Se utilizó para el análisis
estadístico.
3. Resultados y discusión
3.1. Optimización del método.
En un estudio anterior, el procedimiento de extracción se realizó con cloroformo: acetato de etilo
50/50 (v / v) y 20 μL de solución tampón de carbonato de sodio (20%, p / v) a pH 11, y se optimizó
para garantizar suficientes señales para los opioides. y en particular la morfina [13] . Esta extracción
se analizó para determinar otros opioides y no fue suficiente para la buprenorfina, la metadona y sus
metabolitos. Desproteinización utilizando 100 µL de sulfato de zinc al 5% (p / v), 100 µL de metanol y
200 µL
C. Feliu, et al. Journal of Chromatography B 1152 (2020) 122226

Figura 1. Cromatogramas reconstruidos para todos los analitos (A) del estándar 6 y su estándar interno (B). Se observó una intensidad de señal mínima para la buprenorfina (1.49e6) y la intensidad de señal
máxima para la metadona (8.71e8).

Tabla 2
Límite de detección (LOD), límite inferior de cuantificación (LLOQ), límite superior de cuantificación (ULOQ), precisión (desviación estándar relativa (RSD)) y precisión de LLOQ y ULOQ (n = 6).

Fármaco LOD (µg/L) LLOQ (µg/L) Precision (RSD %) of LLOQ Accuracy (%) of LLOQ ULOQ (µg/L) Precision (RSD %) of ULOQ Accuracy (%) of ULOQ

6-Monoacetylmorphine 0.5 0.98 6.28 96.77 1000 6.64 91.24

Buprenorphine 0.15 0.39 19.80 82.48 100 7.76 103.06
codeine 0.5 0.98 6.03 100.43 1000 5.70 92.73
dihydrocodeine 0.5 0.98 7.88 99.47 1000 10.00 85.48
EDDP 0.5 0.98 5.07 115.82 1000 5.70 99.35
Ethylmorphine 0.5 0.98 5.64 100.15 1000 7.90 109.64
Heroin 0.5 0.98 4.78 102.96 1000 5.30 96.94
Methadone 0.5 0.98 4.87 117.33 1000 3.51 96.01
Morphine 0.5 0.98 3.16 81.16 1000 0.84 99.42
Nalbuphine 0.5 0.98 2.63 106.51 1000 6.18 104.45
Naloxone 0.5 0.98 3.67 110.27 1000 3.19 102.39
Norbuprenorphine 0.1 0.20 14.26 106.75 100 7.59 90.19
Norcodeine 0.5 0.98 4.51 88.03 1000 3.02 103.46
Norpropoxyphene 0.5 0.98 10.72 88.06 1000 10.38 111.64
oxycodone 0.5 0.98 8.64 103.25 1000 6.59 110.10
Propoxyphene 0.5 0.98 4.62 95.68 1000 6.39 108.50

de acetonitrilo se realizó. Este procedimiento se eligió porque permitió obtener señales satisfactorias
para todos los compuestos. La elección de la columna, el gradiente curvilíneo y los parámetros
cromatográficos se optimizaron como se describe [13] . Después de eso, se probaron diferentes
modos de adquisición de espectrometría de masas: exploración completa y monitoreo de reacción
paralela (PRM). El modo de exploración completa no pudo discriminar isomérico
compuestos (morfina / norcodeína y 6-MAM / naloxona), por lo que se eligió el modo PRM. Para cada
compuesto, se optimizó la energía de colisión, y se seleccionaron dos iones de fragmentos, el
primero para la cuantificación y el segundo para la confirmación de los analitos ( tabla 1 ) Figura 1 representa
el cromatograma reconstruido del estándar 6 para todos los analitos.

4
 C. Feliu, et al.

Table 3
Intra- and inter-assay precision and accuracy for 8 opiates and derivates determined on ACQ science quality controls ( n = 10). RSD: relative standard deviation (%).

BTMF A BTMF B

Intra-assay Inter-assay Intra-assay Inter-assay

Precision Accuracy Precision Accuracy Precision Accuracy Precision Accuracy

(RSD %) (%) RSD %) (%) (RSD %) (%) (RSD %) (%)

6-Monoacetylmorphine 2.78 77.41 6.58 75.55 0.87 85.30 7.14 86.94

Buprenorphine Not available
Codeine 3.44 85.08 5.12 90.04 3.41 86.40 6.65 91.47
Dihydrocodeine 5.92 87.39 14.84 93.67 8.52 92.28 14.49 101.02
EDDP Not available
Methadone
Morphine 2.04 85.13 6.09 87.94 1.58 97.57 5.82 109.37
Norbuprenorphine

5
BTMF C STM A

Intra-assay Inter-assay Intra-assay Inter-assay

Precision Accuracy Precision Accuracy Precision Accuracy Precision Accuracy

(RSD %) (%) (RSD %) (%) (RSD %) (%) (RSD %) (%)

6-Monoacetylmorphine Not available

Buprenorphine Not available 10.64 92.22 12.93 89.79
Codeine 1.86 97.01 5.87 93.88 Not available
Dihydrocodeine 4.09 90.66 9.36 98.6
EDDP Not available 4.77 80.22 6.82 84.17
Methadone 4.27 85.01 3.13 87.8
Morphine 1.51 90.6 7.28 104.12 Not available
Norbuprenorphine 4.72 85.08 13.44 97.06
Journal of Chromatography B 1152 (2020) 122226
C. Feliu, et al. Journal of Chromatography B 1152 (2020) 122226

3.2. Validation of the method

Accuracy (%)
3.2.1. Linearity, precision and accuracy

100.94

101.92
101.12
100.63

101.20
95.83
96.65
99.83
93.60

95.09
96.21
99.28

98.23
97.97
87.50

96.63
For all analytes, quadratic regression (Y = ax 2 + bx) without weighting satisfied all the predefined
criteria [35] . Within the con- sidered concentration range, regression coefficient ( r 2) of the calibra- tion
curves were always higher than 0.997 (n = 10) with back-calcu- lated concentrations for the
calibration samples within±15% (±20% at LLOQ) of nominal concentration.
Inter-assay

Accuracy (%) Precision (RSD

12.95

13.65

10.25

13.66

10.74
8.63

6.74
7.70

5.39
9.86
8.79
6.48
6.52
9.25

6.22

6.96
%)

The precision and accuracy (n = 6) of the LLOQ and ULOQ for each analyte were within the
recommended limits ( Table 2 ). The relative standard deviations of quality controls (commercial QC Table
3 , home- made QC table 4 ) were comprised between 0.87 and 14.98% for both intra- and inter-assay
precision (n = 10) and were within acceptance criteria [38,39] . Evaluation of the accuracy of the
105.89
102.79

104.24
108.06

106.50

100.15
93.46
94.60

88.96
91.34
92.30
99.36
99.60

95.84

98.59

95.35
quality controls showed a relative standard deviation (n = 10) less than ± 15% (85.01−109.96%) from
target concentration at each tested level ( Table 3 and 4 ) except for 6-MAM and EDDP in commercial
quality control. For both compounds, accuracy for intra- and inter- assay was less than 85%, but the
result was still in the confidence range of the quality control with exact precision.
Intra-assay

Accuracy (%) Precision (RSD

11.21
QCH

2.42
7.38
4.96
4.43
8.31
5.81
4.59
4.63
2.65
7.03
1.31
3.77
2.20

3.50
4.38
%)

3.2.2. Specificity and selectivity

92.24
94.32
94.22
93.24
97.02
91.64
89.30
92.01
93.96
96.92
89.77
93.35
90.78
89.31
98.30
97.24

Analysis of 6 different blank whole blood samples did not show any interference at the retention
time windows for each specified PRM. For each sample, the response was less than 20% of the lower
limit of quantification for analytes and 5% for internal standards. supplemental Fig. 1 represents
overlapped chromatograms of LLOQ and blank sam- ples for all compounds.
Inter-assay

Accuracy (%) Precision (RSD

13.99

11.86

10.76

14.74
Intra- and inter-assay precision and accuracy for 16 opiates and derivates ( n = 10) at three levels of concentrations (3xLLOQ, 40% and 80% of ULOQ) (n = 10).

6.47

6.87
5.03

9.01
6.34

6.31
6.78
4.24
8.10
5.72

6.75
8.15
%)

3.2.3. Matrix effect

Matrix factor (MF) and the internal standard normalized MF ranged from 0.8 to 1.85 ( Supplemental
102.55
109.07
92.38
90.67

89.17
86.82
88.09
93.35
95.31
97.09
98.91
95.40
92.58
91.90
97.45
94.71

Table 2 ). As recommended, the relative standard deviation of normalized matrix factors of each
analyte was below 15% (n = 6) [32] .

3.2.4. Stability
Intra-assay

Accuracy (%) Precision (RSD

All analytes were stable (±15%, n = 6) in the processed samples (all standards) stored for 24 h in
13.05
QCM

5.11
8.93
3.97
3.29
8.55

7.08
4.87
2.48
7.19
7.17
2.96
3.70
8.75
2.76
1.81

the autosampler (+10 °C).

%)

Long-term storage at −20 °C, for 3 months, did not show any de- gradation of analytes in the
stock solution or the ACQ quality controls (±15%, n = 6).
101.65

105.77

109.96
101.94
92.92

97.32
97.57
92.08
96.25
88.93
87.06

105.6
99.52
87.04
86.80
86.52

3.2.5. Carry-over effects

The signals observed for all analytes in the blank samples processed immediately after the
highest standard was less than 20% of the signals of a LLOQ sample and less than 5% of the signal
of the corresponding internal standard.
Inter-assay

Accuracy (%) Precision (RSD

10.41

11.61
10.38

11.22

14.71
14.98
10.74
8.51
7.26

5.15
9.92
3.10
9.24

8.20
9.95
9.42
%)

These results confirm the absence of contamination and therefore, the choice of appropriate
chromatographic conditions.

3.3. Applicability
101.60
113.23

100.10
104.89
88.82

93.43
95.00
92.50
94.14
85.94

86.80
85.01
92.06
96.30
92.04
86.8

This method has been applied for the quantification of opioids and their derivatives in whole
blood for clinical and forensic toxicology purposes. Due to a complex metabolism and
Precision (RSD %)

pharmacokinetic para- meters of each substance, it was essential to propose a method to quantify
Intra-assay

these metabolites [5,6] . For example, heroin is the most commonly used illicit opioid. Still, considering
RSD (%): relative standard deviation.

its very short half-life (3–9 min in blood), it will only be detectable in blood for a few minutes after
6.51
4.18
6.59
5.61
7.87
9.40
4.56
3.94
4.99
3.20
5.57
5.78
5.02
6.17
3.09
QCL

administration. On the contrary, its metabolites, 6-MAM and mainly morphine, with longer half-lives,
will be detectable for 1–2 h and for more than 8 h, respectively. Considering pharmacokinetics
6-monoacetylmorphine 5.53

parameters, heroin will only be detectable in the blood for a few min- utes, 6-MAM 1 to 2 h, while
morphine and codeine will be detectable more than 8 h after intake. Other synthetic opioids such as
Norbuprenorphine

Norpropoxyphene
Dihydrocodeine
Buprenorphine

methadone
Propoxyphene
Ethylmorphine
Compounds

Norcodeine
Nalbuphine

Oxycodone
Methadone

Naloxone
Morphine
Codeine

Heroin
Table 4

EDDP

6
C. Feliu, et al.
Fig. 2. Example of result: chromatograms and calibration curve obtained for a sample positive for methadone (A), EDDP (B), codeine (C) and morphine (D).
and buprenorphine are also being misused [3] . Methadone and bu- prenorphine, synthetic opioids
used in substitution treatment, are me- tabolized to EDDP and norbuprenorphine, respectively [5,6] . It
there- fore seemed appropriate to develop a method to quantify these various opioids and their
metabolites.
Fig. 2 illustrates an example of positive results obtained on a patient sample: chromatograms of
the quantification ion, the confirmation ion, and the internal standard are presented, as well as the
corresponding calibration curves. The sample was positive for methadone (296 µg/L), EDDP (14
µg/L), morphine (32 µg/L) and codeine (6 µg/L). The sup- plemental Fig. 2 illustrates another positive
sample analysis for mor- phine (279 µg/L), 6-MAM (20 µg/L) and codeine (19 µg/L).
A two-year review of the fatal forensic cases analyzed at the tox- icology laboratory of the Reims
hospital was carried out. Opioids and their derivatives were implicated in 16.2% of fatal cases (n =
186). Morphine was the most commonly detected opioid (41%), followed by methadone (26%),
codeine (21%), 6-MAM and buprenorphine (both 6%). In 86% of cases, the opiates detected were
associated with other substances: benzodiazepines (50%), THC (15.5%), cocaine (7.7%), or with
each other. Opioids were also associated with opioid substitution therapies, methadone (23%) and
buprenorphine (3.8%). The median,
7
Journal of Chromatography B 1152 (2020) 122226
first and third quartiles concentrations for the different compounds were as follows: 6-MAM (3 µg/L,
3–8), buprenorphine (2.8 µg/L,
2.7–2.9), codeine (12 µg/L, 5–88.25), EDDP (18 µg/L, 9.2–30.5), me- thadone (139 µg/L,
128.15–188.7), morphine (22.4 µg/L, 6.3–129.5), norbuprenorphine (5.3 µg/L, 3.15–5.45) and
norcodeine (29 µg/L,
13.25–52.25).
3.4. Comparison with reported methods
Ultra-high-performance liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry
(UHPLC-MS/MS) has become a well-estab- lished analytical technique for the determination of drugs
of abuse in clinical and forensic toxicology laboratories in whole blood and serum. The first
application using high-resolution mass spectrometry for the quantification of opioids and their
derivatives was performed with a Time of Flight (TOF) mass spectrometer [11,12] . Concerning
sample pre-treatment, solid-phase extraction (SPE) is the most common in the literature [11,12,14–20,24]
. Many procedures use SPE columns for whole blood analysis, despite the risk of obstruc- tion of the
SPE column. To avoid this problem, some authors propose to work at low temperatures [18] or to add
a step of sonication of the
C. Feliu, et al. Journal of Chromatography B 1152 (2020) 122226

Fig. 2. ( continued)

sample by centrifugation before loading the column with the super- natant. [12,16] . Feliu et al. propose and even the concentration and that the best calibration model often differs by compounds and
a liquid-liquid extraction of whole blood with chloroform and ethyl acetate [13] . Moreno-Vicente et al. method.

[21] , and Sartori et al. [22] propose methanol plasma precipitation. In this work, we describe the
4. Conclusion
precipitation of whole blood using acetoni- trile, zinc sulfate and methanol.

In this work, we describe the development and the full validation of a precise, sensitive and
For the mass spectrometer, many procedures referenced in the lit- erature use a
accurate UHPLC-HRMS method which can si- multaneously quantify 6-MAM, buprenorphine,
triple-quadrupole mass spectrometer with multiple-reac- tion-monitoring (MRM) mode. Due to its high
codeine, norcodeine, dihydrocodeine, EDDP, ethylmorphine, heroin, methadone, morphine,
sensitivity and specificity, MRM is considered as a reference for quantitative analysis [11,13–22] .
nalbuphine, naloxone, norbuprenorphine, oxycodone, norpropoxyphene, and propoxyphene. The
Rosano et al. proposed a multi-drug and metabolite quantification by liquid
assay only requires a small volume of whole blood and a simple pre-treatment. After validation, this
chromatography-high-resolution mass spectrometry in whole blood using a UHPLC–MS E/ TOF [12] .
new assay was routinely applied for the analysis of clinical and forensic cases.
Quantification was performed using precursor ion data obtained with a mass extraction window of± 5
ppm. Fragment and residual precursor ion acquisitions at ramped collision energies were evaluated
as additional analyte identifiers. In parallel, UHPLC–MS/MS analysis showed comparable precision
and bias. Viaene et al. also compared a triple-quadrupole and a quadrupole time- of-flight mass
analyzer to quantify 16 opioids in human plasma [11] . They concluded that the most efficient system Declaration of Competing Interest

depends on the compound

The authors declare that they have no known competing financial interests or personal
relationships that could have appeared to influ- ence the work reported in this paper.

8
C. Feliu, et al. Journal of Chromatography B 1152 (2020) 122226

Acknowledgements: Drug Monit. 35 (2013) 510–521, https://doi.org/10.1097/FTD. 0b013e31828e7e6b .

[21] R. Moreno-Vicente, Z. Fernández-Nieva, A. Navarro, I. Gascón-Crespí, M. Farré-

This work was supported by Reims University Hospital, France.
Albaladejo, M. Igartua, R.M. Hernández, J.L. Pedraz, Development and validation of a bioanalytical method for
the simultaneous determination of heroin, its main metabolites, naloxone and naltrexone by LC-MS/MS in

Appendix A. Supplementary material human plasma samples: Application to a clinical trial of oral administration of a heroin/naloxone for- mulation,
J. Pharm. Biomed. Anal. 114 (2015) 105–112, https://doi.org/10.1016/j. jpba.2015.04.044 .

Supplementary data to this article can be found online at https://

doi.org/10.1016/j.jchromb.2020.122226 . [22] D. Sartori, T. Lewis, A. Breaud, W. Clarke, The development of a high-performance
liquid chromatography-tandem mass spectrometric method for simultaneous quantification of morphine,
morphine-3-β-glucuronide, morphine-6-β-glucuronide, hydromorphone, and normorphine in serum, Clin.
References Biochem. 48 (2015) 1283–1290,
https://doi.org/10.1016/j.clinbiochem.2015.05.023 .
[23] M. Dawson, B. Fryirs, T. Kelly, J. Keegan, L.E. Mather, A rapid and sensitive high- performance liquid
[1] L. Rutkow, J.S. Vernick, Emergency legal authority and the opioid crisis, N. Engl. J.
chromatography-electrospray ionization-triple quadrupole mass spectrometry method for the quantitation of
Med. 377 (2017) 2512–2514, https://doi.org/10.1056/NEJMp1710862 .
oxycodone in human plasma, J. Chromatogr. Sci. 40 (2002) 40–44 .
[2] K.L. Koenig, The Opioid Crisis in America: Too much, too little, too late, West. J.
Emerg. Med. 19 (2018) 557–558, https://doi.org/10.5811/westjem.2018.2.38087 .
[24] S. Ghassabian, S.M. Moosavi, Y.G. Valero, K. Shekar, J.F. Fraser, M.T. Smith, High-
[3] European Drug Report 2019: Trends and Developments | www.emcdda.europa.eu,
throughput assay for simultaneous quantification of the plasma concentrations of morphine, fentanyl,
(n.d.). http://www.emcdda.europa.eu/publications/edr/trends-developments/ 2019 (accessed June 10,
midazolam and their major metabolites using automated SPE coupled to LC-MS/MS, J. Chromatogr. B Analyt.
2019).
Technol. Biomed. Life. Sci. 903 (2012) 126–133, https://doi.org/10.1016/j.jchromb.2012.07.005 .
[4] National Institute on Drug, Overdose Death Rates, 2017. https://www.drugabuse.
gov/related-topics/trends-statistics/overdose-death-rates (accessed May 25, 2018). [5] P. Mura, P. Kintz, eds.,
[25] H.H. Maurer, Perspectives of liquid chromatography coupled to low- and high-re-
Drogues et accidentalité, EDP sciences, DL 2011, Les Ulis,
solution mass spectrometry for screening, identification, and quantification of drugs in clinical and forensic
France, 2011.
toxicology, Ther. Drug Monit. 32 (2010) 324–327, https:// doi.org/10.1097/FTD.0b013e3181dca295 .
[6] R.C. Baselt, Disposition of toxic drugs and chemicals in man, Biomedical
Publications, Foster City (Calif.), Etats-Unis, 2008.
[26] J.-L.H. Jiwan, P. Wallemacq, M.-F. Hérent, HPLC-high resolution mass spectrometry
[7] C. Feliu, A. Fouley, H. Millart, C. Gozalo, H. Marty, Z. Djerada, Clinical and ana-
in clinical laboratory? Clin. Biochem. 44 (2011) 136–147, https://doi.org/10.1016/
lytical toxicology of opiate, cocaine and amphetamine, Ann. Biol. Clin. (Paris) 73 (2015) 54–69, https://doi.org/10.1684/abc.2014.1009
j.clinbiochem.2010.08.018 .
.
[27] S. Ojanperä, A. Pelander, M. Pelzing, I. Krebs, E. Vuori, I. Ojanperä, Isotopic pattern
[8] V. Samanidou, L. Kovatsi, D. Fragou, K. Rentifis, Novel strategies for sample pre-
and accurate mass determination in urine drug screening by liquid chromato- graphy/time-of-flight mass
paration in forensic toxicology, Bioanalysis 3 (2011) 2019–2046, https://doi.org/
spectrometry, Rapid Commun. Mass Spectrom. RCM 20 (2006) 1161–1167, https://doi.org/10.1002/rcm.2429 .
10.4155/bio.11.168 .
[9] Y. Gaillard, G. Pepin, P. Marquet, P. Kintz, M. Deveaux, P. Mura, Identification and
[28] A.H. Wu, R. Gerona, P. Armenian, D. French, M. Petrie, K.L. Lynch, Role of liquid
quantification of benzoylecgonine, cocaine, methylecgonine-ester, codeine, mor- phine and 6-acetylmorphine
chromatography-high-resolution mass spectrometry (LC-HR/MS) in clinical tox- icology, Clin. Toxicol. Phila.
in whole blood, Toxicorama, 1996. [10] F. Peters, Recent advances of liquid chromatography-(tandem) mass
Pa 50 (2012) 733–742, https://doi.org/10.3109/
spectrometry
15563650.2012.713108 .
in clinical and forensic toxicology, Clin. Biochem. 44 (2011) 54–65, https://doi.
[29] H.H. Maurer, What is the future of (ultra) high performance liquid chromatography
org/10.1016/j.clinbiochem.2010.08.008 .
coupled to low and high resolution mass spectrometry for toxicological drug screening? J. Chromatogr.
[11] J. Viaene, K. Lanckmans, B. Dejaegher, D. Mangelings, Y. Vander Heyden,
A 1292 (2013) 19–24, https://doi.org/10.1016/j. chroma.2012.08.069 .
Comparison of a triple-quadrupole and a quadrupole time-of-flight mass analyzer to quantify 16 opioids in
human plasma, J. Pharm. Biomed. Anal. 127 (2016) 49–59,
[30] M.R. Meyer, A.G. Helfer, H.H. Maurer, Current position of high-resolution MS for
https://doi.org/10.1016/j.jpba.2015.12.055 .
drug quantification in clinical & forensic toxicology, Bioanalysis 6 (2014) 2275–2284, https://doi.org/10.4155/bio.14.164
[12] T.G. Rosano, S. Na, K. Ihenetu, T.A. Swift, M. Wood, Multi-drug and metabolite
.
quantification in postmortem blood by liquid chromatography-high-resolution mass spectrometry: comparison
[31] H.H. Maurer, M.R. Meyer, High-resolution mass spectrometry in toxicology: current
with nominal mass technology, J. Anal. Toxicol. 38 (2014) 495–506, https://doi.org/10.1093/jat/bku066 .
status and future perspectives, Arch. Toxicol. 90 (2016) 2161–2172, https://doi.
org/10.1007/s00204-016-1764-1 .
[13] C. Feliu, H. Millart, H. Guillemin, D. Vautier, L. Binet, A. Fouley, Z. Djerada,
[32] European Medicines Agency (EMA), Guideline on bioanalytical method validation.
Validation of a fast UPLC-MS/MS method for quantitative analysis of opioids, co- caine, amphetamines (and
21 July 2011. http://www.ema.europa.eu/docs/en_GB/document_library/
their derivatives) in human whole blood, Bioanalysis 7 (2015) 2685–2700, https://doi.org/10.4155/bio.15.157 .
Scientific_guideline/2011/08/WC500109686.pdf . (accessed June 2013)., (n.d.).
http://www.ema.europa.eu/docs/en_GB/document_library/Scientific_guideline/ 2011/08/WC500109686.pdf.
[14] M.J. Ahsman, B.C. van der Nagel, R.A. Mathot, Quantification of midazolam,
morphine and metabolites in plasma using 96-well solid-phase extraction and ultra- performance liquid
[33] US Food and Drug Administration, Guidance for industry. Bioanalytical method
chromatography-tandem mass spectrometry, Biomed. Chromatogr. BMC 24 (2010) 969–976, https://doi.org/10.1002/bmc.1394
validation; May 2001. http://www.fda.gov/downloads/Drugs/Guidances/ ucm070107.pdf . (accessed july 2010),
.
(n.d.). http://www.fda.gov/downloads/ Drugs/Guidances/ucm070107.pdf (accessed April 2, 2013). [34] B.K.
[15] A.I. Al-Asmari, R.A. Anderson, Method for quantification of opioids and their me- tabolites in autopsy blood by
Matuszewski, M.L. Constanzer, C.M. Chavez-Eng, Strategies for the assessment of matrix effect in quantitative
liquid chromatography-tandem mass spectrometry, J. Anal. Toxicol. 31 (2007) 394–408 .
bioanalytical methods based on HPLC-MS/MS, Anal. Chem. 75 (2003) 3019–3030 .

[16] M.K. Bjørk, M.K.K. Nielsen, L.Ø. Markussen, H.B. Klinke, K. Linnet, Determination
of 19 drugs of abuse and metabolites in whole blood by high-performance liquid chromatography-tandem
[35] Z. Djerada, C. Feliu, C. Tournois, D. Vautier, L. Binet, A. Robinet, H. Marty,
mass spectrometry, Anal. Bioanal. Chem. 396 (2010) 2393–2401, https://doi.org/10.1007/s00216-009-3268-9 .
C. Gozalo, D. Lamiable, H. Millart, Validation of a fast method for quantitative analysis of elvitegravir,
raltegravir, maraviroc, etravirine, tenofovir, boceprevir and 10 other antiretroviral agents in human plasma
[17] D.J. Christoffersen, C. Brasch-Andersen, J.L. Thomsen, M. Worm-Leonhard,
samples with a new UPLC-MS/MS technology, J. Pharm. Biomed. Anal. 86 (2013) 100–111, https://doi.org/10.1016/
P. Damkier, K. Brøsen, Quantification of morphine, morphine 6-glucuronide, bu- prenorphine, and the
enantiomers of methadone by enantioselective mass spec- trometric chromatography in whole blood,
j.jpba.2013.08.002 .
Forensic Sci. Med. Pathol. 11 (2015) 193–201, https://doi.org/10.1007/s12024-015-9673-9 .
[36] G. Høiseth, B. Fjeld, M.L. Burns, D.H. Strand, V. Vindenes, Long-term stability of
morphine, codeine, and 6-acetylmorphine in real-life whole blood samples, stored at -20°C, Forensic Sci. Int.
[18] R. Coles, M.M. Kushnir, G.J. Nelson, G.A. McMillin, F.M. Urry, Simultaneous de- termination of codeine,
239 (2014) 6–10, https://doi.org/10.1016/j.forsciint.
morphine, hydrocodone, hydromorphone, oxycodone, and 6-acetylmorphine in urine, serum, plasma, whole
2014.03.008 .
blood, and meconium by LC-MS- MS, J. Anal. Toxicol. 31 (2007) 1–14 .
[37] R. Karinen, W. Andresen, A. Smith-Kielland, J. Mørland, Long-term storage of au-
thentic postmortem forensic blood samples at -20°C: measured concentrations of benzodiazepines, central
[19] K. Eckart, J. Röhrich, D. Breitmeier, M. Ferner, R. Laufenberg-Feldmann, R. Urban,
stimulants, opioids and certain medicinal drugs before and after storage for 16–18 Years, J. Anal. Toxicol.
Development of a new multi-analyte assay for the simultaneous detection of opioids in serum and other body
(2014), https://doi.org/10.1093/ jat/bku080 .
fluids using liquid chromatography-tandem mass spec- trometry, J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed.
Life. Sci. 1001 (2015) 1–8,
[38] O.H. Drummer, Postmortem toxicology of drugs of abuse, Forensic Sci. Int. 142
https://doi.org/10.1016/j.jchromb.2015.06.028 .
(2004) 101–113, https://doi.org/10.1016/j.forsciint.2004.02.013 .
[20] M. Fernandez, S. Wille, N. Kummer, V. Di Fazio, E. Ruyssinckx, N. Samyn,
[39] A. Makarov, Mass spectrometer; 1999 US Patent, 5886346, n.d.
Quantitative analysis of 26 opioids, cocaine, and their metabolites in human blood by ultra performance liquid
chromatography-tandem mass spectrometry, Ther.