Aislamiento y caracterización de bacterias lácticas bacteriogénicas de M-Tuba y Tepache,

dos bebidas fermentadas tradicionales en México

Resumen

La tuba mexicana (M-Tuba) y el tepache son bebidas fermentadas mexicanas preparadas

principalmente con pulpa de piña y palma de coco, respectivamente. En la actualidad, faltan
informes sobre la microbiota y los efectos nutricionales de ambas bebidas. El propósito de este
estudio fue determinar si M-Tuba y Tepache contienen bacterias de ácido láctico (LAB) cultivables
capaces de producir bacteriocinas. Tepache y M-Tuba contienen bacterias mesófilas aerobias, LAB
y levadura. Bacillus subtilis, Listeria monocytogenes, Listeria innocua, Streptococcus agalactiae,
Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Salmonella typhimurium y
Salmonella spp, fueron los microorganismos más susceptibles a los metabolitos producidos por los
aislamientos bacterianos. M-Tuba y Tepache contienen bacterias que albergan genes que codifican
nisina y enterocina, pero no pediocina. El ADN de 16S identificó la presencia de Lactococcus lactis y
E. faecium en M-Tuba y Tepache. Estas bacterias produjeron bacteriocinas de ~ 3.5 kDa y 4.0-4.5
kDa, respectivamente. Las bacteriocinas purificadas parciales mostraron un efecto inhibitorio contra
Micrococcus luteus, L. monocytogenes, L. innocua, Str. agalactiae, S. aureus, Bacillus cereus, B.
subtilis, E. faecalis y K. pneumoniae. Caracterizamos, por primera vez, microbiota cultivable de M-
Tuba y Tepache, y específicamente, identificamos bacterias lácticas candidatas (LAB) presentes en
estas bebidas que eran capaces de sintetizar péptidos antimicrobianos, que colectivamente podrían
proporcionar funciones conservadoras de alimentos.

Introducción

Las bacteriocinas son péptidos antimicrobianos sintetizados ribosómicamente por diversas

bacterias. Estos péptidos constituyen un tipo de arsenal microbiano secretado por bacterias para
inhibir el crecimiento de microbios competitivos, incluidos otros procariotas, hongos y parásitos
(Muñoz-Rojas 2004; Dufour et al. 2007; De la Fuente-Salcido et al. 2013) . Varios de estos péptidos
antimicrobianos muestran actividad a alta temperatura y un amplio rango de pH, pero pueden ser
inactivados por las proteasas intestinales. Como tales, estas propiedades hacen que las
bacteriocinas sean adecuadas y atractivas para su uso como bioconservadores de alimentos (Stiles
1996; Cotter et al. 2005; Gálvez et al. 2007; De la Fuente Salcido y Barboza-Corona 2010;
Udhayashree et al. 2012 ) En particular, las bacterias del ácido láctico (LAB) están presentes en la
microbiota de diferentes alimentos como la carne, el queso y el yogur, y se consideran probióticos.
Se han consumido en diferentes productos fermentados durante milenios sin informes de efectos
adversos para la salud. LAB sintetiza metabolitos que no solo contribuyen a sabores alimentarios
distintivos, sino que también producen conservantes de bacteriocina que son reconocidos como
seguros por las agencias reguladoras, incluida la Administración de Alimentos y Medicamentos
(FDA) y la Autoridad Europea de Seguridad Alimentaria (EFSA) (Millette et al. 2008 ; Panel de la EFSA
sobre riesgos biológicos (BIOHAZ) 2010; Halasz 2009).

En México se produce una amplia variedad de productos destilados (tequila, heces, mezcal,
bacanora) y no destilados (pulque, tesgüino, tepache, colonche, pozol, tuba y axokot) (Blomberg
2000; Guyot et al. 2003; Escalante et al. 2004; Hui y Özgül Evranuz 2012). Estas bebidas fermentadas
se han consumido durante muchos años y están fuertemente conectadas con la cultura mexicana y
las antiguas tradiciones. En particular, el “Tepache”, consumido desde la edad prehispánica, se
prepara principalmente con pulpa de piña, y también con maíz, manzana y naranja (Battcock y
Azam-Ali 1998; Corona-González et al. 2006). La “tuba” es otra bebida hecha de palma de coco, y
con frecuencia se consume mezclada con nueces, principalmente en las regiones costeras de los
estados de Colima, Michoacán y Guerrero. La tuba se prepara usando la savia (néctar o agua de
miel) recolectada de la inflorescencia de las palmas de coco (Velázquez-Monreal et al. 2011;
Chandrasekhar et al. 2012). Curiosamente, una bebida fermentada también llamada "Tuba",
obtenida a partir del exudado de espata de coco sin abrir, se consume no solo en México sino
también en Filipinas y otros países (Kadere y Kutima 2012). Productos similares de Tuba tienen
diferentes nombres en todo el mundo, por ejemplo, Toddy, Tuak, Legmi, Mnazi, Emu, Kallu en Sri
Lanka, Indonesia, Tunia, Kenia, Nigeria e India, respectivamente (Chandrasekhar et al. 2012).

La presencia de bacterias productoras de bacteriocina en estas bebidas fermentadas es de particular

importancia no solo porque protegen los alimentos fermentados de la contaminación microbiana y
el deterioro y son responsables del sabor y el aroma, sino también porque protegen indirectamente
a los consumidores de posibles bacterias patógenas. En la actualidad, faltan informes sobre la
microbiota y los efectos nutricionales de la tuba y el tepache mexicanos. En este sentido, el
propósito de este estudio fue determinar si estas dos bebidas contienen bacterias cultivables
capaces de producir bacteriocinas. Demostramos que los LAB potenciales probióticos y productores
de bacteriocina como L. lactis TuAB1, L. lactis TeA1, E. faecium TuAB2 y E. faecium TeA2 constituyen
parte de la microbiota cultivable de Tepache y M-Tuba que potencialmente elaboran inhibitorios.
efectos contra bacterias patógenas de importancia clínica.

Material y métodos

Recolección de muestras y cepas bacterianas.

La Tuba mexicana (M-Tuba en adelante para diferenciar la Tuba producida en otros países) y el
Tepache se obtuvieron de tres productores artesanales diferentes en Colima y Guanajuato,
respectivamente. Las muestras fueron transportadas en refrigeradores inmediatamente para
análisis microbiológicos y bioquímicos. Las cepas utilizadas como control positivo para los ensayos
de reacción en cadena de la polimerasa fueron Lactococcus lactis subsp lactis ATCC 19435 (Colección
de Cultivo Microbiano, CINVESTAV México DF), Enterococcus faecium UQ1 (Universidad Autónoma
de Querétaro), Enterococcus faecalis ATCC 10541 y Pediococcus Tecnológico acético (Veracruz). ,
México). Estas cepas producen nisina, enterocina y pediocina, respectivamente. Los
microorganismos utilizados como bacterias indicadoras para el método de superposición o el ensayo
de difusión fueron Listeria innocua, L. monocytogenes, Staphylococcus aureus ATCC 25923,
Streptococcus agalactiae, Bacillus subtilis ATCC 6633, Enterococcus faecalis ATCC 10541, Escherichia
coli ATella spp. ATCC 14022 y Klebsiella pneumoniae. Las bacterias se mantuvieron como reservas
congeladas a −20 ° C en glicerol al 30% (v / v) y se cultivaron rutinariamente a 35 ± 2 ° C en MRS
(DIFCO) o TSB (caldo de tripticasa de soja) (BD) para la prueba de PCR o la detección de actividad
antimicrobiana.

Conteo estándar, aislamiento e identificación bioquímica preliminar de LAB

Se añadieron diez ml de las bebidas fermentadas a 90 ml de solución salina estéril (NaCl al 0,85%)
(p / v) y luego se diluyeron en serie (10-1 a 10-6). De cada dilución, se inocularon muestras
duplicadas de 0,1 ml en diferentes medios de cultivo: (1) Métodos estándar de agar (BD Bioxon,
Cuahutitlán Izcalli, Estado de México, México) a 35 ± 2 ° C, 48 h para el recuento de bacterias
mesofílicas; (2) agar MRS a 30 ° C durante 48 h en condiciones anaeróbicas (BD GasPak EZ Anaerobe
Container System) para la detección de bacterias lácticas (LAB); y (3) agar de papa dextrosa (PDA)
(BD Bioxon) más cloranfenicol (0.004 mg L − 1), a 25 ° C durante 48 h para levadura (NOM-142-SSA1-
1995). El aislamiento LAB se realizó utilizando dos medios, es decir, MRS más glucosa (10%) y agar
de leche peptonizado (BD Bioxon). Las placas se incubaron a 35 ± 2 ° C en condiciones aeróbicas y
anaeróbicas utilizando un sistema de contenedor anaerobio BD GasPak EZ (BD Bioxon, Cuahutitlán
Izcalli, Estado de México, México) durante 48 h. Los aislamientos se almacenaron en placas de agar
nutritivo a 4 ° C o en glicerol estéril en caldo MRS (30% v / v) para almacenamiento a largo plazo a -
70 ° C. Una vez que se aislaron las bacterias, se identificaron preliminarmente por tinción de Gram,
morfología colonial y celular. Simultáneamente, se evaluaron varias características fisiológicas y
físicas, incluidas la catalasa y oxidasa, fermentación de carbohidratos (glucosa, lactosa, sacarosa)
con producción de gas, producción de dióxido de carbono (CO2) a partir de glucosa, aminas a partir
de arginina, motilidad y la capacidad de aislamientos para crecer a diferentes temperaturas, pH y
concentración de sal. Todas las pruebas se realizaron de acuerdo con los protocolos establecidos
(Tang et al. 1998; Salminen et al. 2004; Barbu 2008).

Detección de bacterias productoras de bacteriocina por el método de superposición

Las cepas indicadoras (sensibles) se cultivaron durante la noche en caldo MRS, caldo de nutrientes,
caldo de infusión de cerebro y corazón, caldo de Luria, TSB o caldo de tetrationato con agitación
orbital (180 rpm) a temperatura óptima (28 o 35 ± 2 ° C) a densidad celular de 108-109 células / ml.
Los posibles aislamientos de LAB se cultivaron durante 24-48 h en caldo MRS (15 ml) incubados
tanto en condiciones aeróbicas como anaeróbicas con agitación orbital. Estos aislamientos también
se inocularon en rayas paralelas duplicadas (1 cm) o gotas (10 µL) en placas de agar MRS y se
incubaron durante la noche para detectar un crecimiento óptimo a 35 ± 2 ° C. Una de las placas MRS
se superpuso con agar blando TSB (0,75%) que contenía 105 µL (0,7%) de cada cepa indicadora (~
108 células / ml) y se incubó a 35 ± 2 ° C durante 24 h. La otra placa se usó para seleccionar colonias
bacteriocinógenas que mostraron efectos inhibitorios en el ensayo de recubrimiento (Barboza-
Corona et al. 2007).

Detección de genes de bacteriocina por reacción en cadena de la polimerasa multiplex (mPCR)

Las bacterias con características de LAB que mostraron actividad inhibitoria contra cepas sensibles
se usaron para cribar genes de bacteriocinas por mPCR. Se cultivaron grupos de bacterias en caldo
MRS durante 36 a 48 h. Luego, se centrifugaron 1,5 ml de cada cultivo (16,000 × g), y los sedimentos
se resuspendieron en 200 µL de Tris 10 mmol / L, pH 8.0. Las muestras se incubaron a -20 ° C durante
30 minutos, luego durante 10 minutos en agua hirviendo y se centrifugaron para eliminar los restos
celulares (Barboza-Corona et al. 2007). El ADN presente en los sobrenadantes se usó como plantilla
para amplificar regiones conservadas de nisina (clase I), enterocina y pediocina (clase II) genes. Los
amplicones se obtuvieron mediante mPCR usando el Taq pol (Invitrogen, Carlsbad, CA) y una mezcla
de oligonucleótidos de bacteriocinas específicos (Tabla 1) informados previamente (Suwanjinda et
al. 2007; Wieckowicz et al. 2011). La amplificación se realizó en un ciclador térmico táctil C1000 (Bio-
Rad, Hercules, CA) durante 30 ciclos de la siguiente manera: 95 ° C durante 30 segundos; 45–55 ° C
durante 45 segundos, 68 ° C durante 45 segundos, seguido de un ciclo de terminación de 4 minutos
a 68 ° C. Los tamaños de amplicón se compararon con los obtenidos de LAB que sintetizan nisina,
enterocina y pediocina, respectivamente, Lactococcus lactis, Enterococcus faecium y Pediococcus
acidilactici. Además, los amplicones del tamaño esperado se clonaron en el vector pCR 4-TOPO

coli (BioRad). Se seleccionó el transformante y el plásmido recombinante se purificó usando el kit

de extracción de gel QIAquick (Qiagen, Valencia, CA), y se sometió a secuenciación al Laboratorio
Nacional de Genómica para la Biodiversidad (Langebio, en CINVESTAV- Irapuato, México), las
secuencias se compararon con los reportados en las bases de datos de NCBI
(www.ncbi.nlm.nih.gov).

Identificación de bacterias bacteriocinógenas.

Las bacterias en cada grupo que mostraron amplificación de genes de bacteriocina se analizaron
individualmente. La identificación a nivel de género y especie se determinó utilizando el sistema API
50 CH (sistemas API, BioMéreux, Boston, MA, EE. UU.) Y mediante la amplificación de ADNr 16S
utilizando el par de oligonucleótidos universal que amplificaron los dominios bacteriano y
-AGAGTTTGATCCTGGCTGAG- -
GGTTACCTTGTTACGACTT- -Galván y col. 2009). Para la amplificación de 16S rDNA, se usó
una enzima de alta fidelidad (BioRad) en las siguientes condiciones: 5 min a 95 ° C; 30 ciclos de 30
segundos a 95 ° C, 30 segundos a 55 ° C y 1:40 min a 68 ° C; y finalmente 5 min a 72 ° C.

Producción, determinación del tamaño molecular y actividad de bacteriocinas.

La producción de bacteriocinas a partir de cepas seleccionadas se llevó a cabo en caldo MRS

inoculado con un precultivo de cada cepa (109 células / ml) cultivadas durante la noche en el mismo
caldo a 35 ± 2 ° C y 180 rpm. Después de 24 h, cada caldo de cultivo se centrifugó a 10 000 × g
durante 15 min, se precipitó con sulfato de amonio (saturación al 80%) a 4 ° C, se resuspendió en
tampón fosfato 100 mmol / L (pH 6,8) y se dializó. durante la noche usando una membrana de corte
de 1 kDa (Amersham Biosciences Corp., Piscataway, NJ, EE. UU.). Los extractos crudos dializados se
trataron por separado con proteinasa K (NEB) a una concentración final de 1 mg / ml. El extracto sin
tratar más el tampón, el tampón sin extracto y las soluciones enzimáticas se usaron como controles.
Todas las reacciones se incubaron a 42 ° C durante 2 h al pH recomendado por los proveedores. Las
mezclas se calentaron a 100 ° C durante 10 minutos para detener la reacción enzimática. La actividad
antibacteriana después del tratamiento enzimático se determinó utilizando el método de difusión
de pocillos modificado (Barboza-Corona et al. 2007). Brevemente, ~ 25 ml de agar de ensayo más
2% de tween 20 (v / v) o TSB con agar blando 0.7% (p / v) se mezclaron con 75 µL de cada cepa
indicadora (M. luteus, L. innocua, L. monocytogenes, E. faecalis) y luego se vierte en placas de Petri.
Se cavaron pozos de 8 mm de diámetro en el agar y se agregaron 100 µL de extractos de
bacteriocinas a cada pozo y se incubaron durante 12 ha 4 ° C, seguido de una incubación adicional
a 28 ° C o 35 ± 2 ° C durante 24–48 h. Se midieron los diámetros de las zonas de inhibición. Los
ensayos se repitieron por triplicado y se registró el promedio. Se definió que una unidad de actividad
de extracto era igual a 1 mm2 de la zona de inhibición del crecimiento de la bacteria indicadora
(Barboza-Corona et al. 2007). La actividad antibacteriana se determinó contra las cepas utilizadas
en el método de superposición (Str. Agalactiae, S. aureus, B. subtilis, K. pneumonia, E. coli,
Salmonella spp y S. typhimurium). Las masas moleculares de bacteriocinas se determinaron por
detección directa en un ensayo de recubrimiento de gel de poliacrilamida. Las muestras se
fraccionaron por duplicado en un gel de poliacrilamida de dodecilsulfato de sodio (SDS) al 16% (SDS-
 PAGE) (Schägger y Von Jagow 1987). Luego, un gel se tiñó con azul brillante G (Serva) y el otro se
usó para la detección directa de la actividad antibacteriana. Este segundo gel se fijó en isopropanol
al 20% (v / v) y ácido acético al 10% (v / v) a temperatura ambiente durante 0,5 h y se lavó con agua
destilada estéril durante 1 h. Finalmente, el gel se superpuso con agar blando TSB suplementado
con 1% (v / v) de cultivos de caldo de diferentes bacterias indicadoras y luego se incubó durante la
noche a 28 ° C o 35 ± 2 ° C.

Resultados

Recuento total, propiedades bioquímicas y crecimiento de aislados bacterianos en diferentes

condiciones físicas.

Una pantalla de la microbiota presente en M-Tuba y Tepache capaz de crecer en MRS, y la

determinación del número total de bacterias mesofílicas y de ácido láctico (LAB) y levaduras se
llevaron a cabo de acuerdo con las Normas Oficiales Mexicanas (NOM-142-SSA1 -1995,
www.dof.gob.mx/index. Php) para las bebidas fermentadas. Tepache contenía 7.992,5.077 y 4.984
log UFC / ml, mientras que M-Tuba albergaba 6.948, 4.967 y 5.10 log UFC / ml de bacterias aerobias
mesófilas, LAB y levadura, respectivamente. De estos, 158 aislamientos bacterianos fueron
estudiados más a fondo. Cuando los aislamientos se cultivaron en agar MRS, las colonias de
bacterias eran predominantemente pequeñas, convexas, blancas, circulares y con bordes
redondeados. De estos, el 74% de los aislamientos eran cocos, de los cuales el 53% eran
grampositivos, el 68% negativos a la catalasa, el 84% negativos a la oxidasa y el 90% eran bacterias
no formadoras de esporas (Tabla 2).

Tabla 2. Propiedades bioquímicas y propiedades biofísicas de bacterias aisladas de Tepache y M-

Tuba

Ilustración 1 (+) Reacción positiva, (-) Reacción negativa, (±)

Reacción variable.
Detección de bacterias productoras de bacteriocina utilizando el método de superposición

Los aislamientos grampositivos fueron probados por su capacidad de inhibir el crecimiento de

diferentes bacterias usando el método de superposición. Analizamos la actividad inhibitoria contra
cinco gramnegativos (Listeria innocua, L. monocytogenes, Staphylococcus aureus, Streptococcus
agalactiae, Bacillus sub tilis) y cuatro gramnegativos (Escherichia coli, Salmonella spp., Salmonella
typhimurium, Klebsiella pneumoniae) bacterias dicadoras (tabla 3). Observamos que ambas bebidas
fermentadas contenían aislamientos con actividad inhibitoria contra bacterias indicadoras probadas
por el protocolo de superposición. La bacteria más susceptible fue B. subtilis seguida de L. mono-
cytogenes, E. coli, L. inoccua, K. pneomoniae, S. typhimurium, Str. agalactiae, S. aureus y Salmonella
spp., (Tabla 3).

Tabla 3. Detección de aislados bacterianos de M-Tuba y Tepache con actividad inhibitoria

Detección de genes de bacteriocina en

aislamientos de LAB de bebidas
fermentadas

Las bacterias del ácido láctico de la misma

bebida fermentada que mostraron actividad
inhibitoria se agruparon en elementos de
decenas. Los grupos se analizaron para
determinar si contienen genes de
bacteriocina putativos que codifican nisina,
enterocina y pediocina mediante mPCR.
Primero, estandarizamos la condición para el
Ilustración 2 Caldo MRS, caldo Man Rogosa Sharpe; NB, caldo
de nutrientes; BHI, caldo de infusión cerebro-corazón; LB, caldo mPCR usando oligonucleótidos específicos.
de Luria; TSB, caldo de tripticasa de soja; TB, caldo de La PCR de genes de L. lactic, E. faecium y P.
tetrationato.
acidilactici produjo amplicones de 0.608,
0.412 y 0.332 kbp, que corresponden al
tamaño esperado de nisina, enterocina y pediocina, respectivamente (Fig. 1A). El mPCR demostró
que los genes de nisina y / o enterocina estaban presentes en todos los grupos, pero no las
pediocinas, lo que sugiere que M-Tuba y Tepache contenían aislamientos capaces de sintetizar
nisina y enterocina (Fig. 2). Para detectar qué bacteria de cada grupo alberga un gen de bacteriocina,
los aislados en grupos positivos se analizaron individualmente mediante mPCR, y luego se
seleccionaron para una mayor identificación bioquímica y genética. Los amplicones se clonaron en
el vector pCR 4- TOPO (Invitrogen) y se sometieron a secuenciación. Las secuencias mostraron ~ 99%
a las reportadas en los datos de GenBank para nisina y enterocina.

Identificación bacteriana y detección directa de la actividad bacteriocina en el ensayo de

recubrimiento de gel

Las bacterias de cada grupo con amplicones positivos para los genes de nisina y enterocina se
identificaron mediante la prueba API 50 CH. Con base en los patrones de utilización de carbohidratos
y la amplificación del ADNr 16S, identificamos dos bacterias: Lactococcus lactis y Enterococcus
faecium. Las bacterias aisladas de M- Tuba (Tu) y Tepache (Te) se denominaron L. lactics TuAB1, E.
faecium TuAB2 y L. lactis TeA1, E. faecium TeA2, respectivamente. L. lactis y E. faecium, albergaron
genes de nisina y enterocina, respectivamente. El efecto inhibitorio de las cuatro cepas se probó
contra diferentes bacterias utilizando el método de difusión de pozos. Mostraron efectos
inhibitorios contra M. luteus, L. monocytogenes, L. innocua, Str. agalactiae, S. aureus, B. cereus, B.
subtilis, E. faecalis y K. pneumoniae (Tabla 4).

Figura 1. Detección de genes de nisina, enterocina y pediocina en diferentes cepas bacterianas

aisladas de M-Tuba y Tepache. (A) Estandarización de condiciones para PCR multiplex (mPCR). Las
mezclas de muestras de ADN de Lactococcus lactis, Enterococcus faecium y Pediococcus acidilactici
se usaron como controles positivos para amplificar nisina, enterocina y pediocina, respectivamente.
Carril 1, DNA Ladder 1 Kb Plus DNA (Invitrogen); carriles 2–9, amplicones obtenidos de bacterias
positivas usando un intervalo de alineación de temperatura de 48.0 a 57.5 ° C (intervalos de 57.5,
56.8, 54.5, 55.7, 53.9, 51.5, 49.9, 48.7 y 48.0 respectivamente). Para una mayor amplificación,
seleccionamos las temperaturas de alineación de 54.5 ° C, que corresponden a la amplificación en
el carril 4. (B) PCR multiplex de aislamientos obtenidos de Tepache y M-Tuba. Carril 1, escalera de
ADN de 100 pb (NEB); carriles 2–7 y 10, amplicones correspondientes al gen de la enterocina (~ 412
pb); carril 8, nisina (~ 608 pb). (C) Identificación de genes de nisina y enterocina de diferentes
aislados. Carril 1, DNA Ladder 1 kb Plus DNA (Invitrogen); carril 2, amplicón de nisina de L. lactis
utilizado como control positivo; carriles 3 y 4, amplicones correspondientes a nisina de L. lactis
TuAB1 y L. lactis TeA1; carril 5, amplicones de enterocina de E. faecium TuAB2. Se obtuvo un
amplicón similar al de E. faecium TuAB2 con E. faecium TeA2 (datos no mostrados). La confirmación
de que los amplicones corresponden a los genes de nisina y enterocina se realizó mediante
secuenciación.
Figura 2. Determinación de la actividad antibacteriana por el método de difusión de bacteriocinas
secretadas por cepas aisladas de M-Tuba (Tu) y Tepache (Te). Inhibición de (W) M. luteus, (X) L.
monocytogenes (Y) L. innocua, (Z) y E. faecalis utilizando diferentes bacteriocinas. Nisina de (A) L.
lactis utilizada como control, (B) L. lactis TuAB1 y (C) L. lactis TeA1. Enterocina de (D) E. faecium UQ1
utilizada como control y (E) E. faecium Tu AB2.

Tabla 4. Actividad de bacteriocinas producidas por bacterias aisladas de bebidas fermentadas.

Ilustración 3 1 Entre paréntesis se indica que la actividad inhibitoria se determinó mediante el método de difusión de
pocillos. Una unidad se definió como igual a 1 mm2 de la zona de inhibición del crecimiento de la bacteria indicadora
(24).

Determinación del peso molecular y la actividad inhibitoria de bacteriocina en muestras crudas

Para determinar la naturaleza bioquímica de las bacteriocinas purificadas parciales de L. lactis y E.

faecium, las muestras se trataron con proteinasa K. Observamos que la actividad de bacteriocina se
abolió después del tratamiento con proteinasa K, lo que indica la naturaleza proteica de los
compuestos bactericidas. Cuando los péptidos secretados de L. lactics TuAB1, E. faecium TuAB2, L.
lactis TeA1 y E. faecium TeA2 fueron sometidos a Tris-tricine SDS-PAGE, se obtuvieron especies de
~ 3.5 kDa y 4.0-4.5 kDa, que corresponden a las masas moleculares de nisina y enterocina utilizadas
como controles (Fig. 3).
Figura 3. Detección directa de la actividad antibacteriana de bacteriocinas en el secretoma
(extractos crudos) de cepas aisladas de M-Tuba y Tepache. L. lactics y E. faecium producen nisina y
enterocina, respectivamente. (A) Tris-tricina SDS-PAGE. (B) Detección directa de la actividad
inhibitoria de bacteriocinas aisladas de M-Tuba y Tepache por ensayo de recubrimiento de gel. Carril
1, L. lactics TuAB1; carril 2, L. lactics TeA1; carril 3, E. faecium TuAB2; Carril M, marcador de proteína
(BioRad); carril 4, nisina comercial utilizada como control (Sigma). (B) El gel se superpuso con M.
luteus. Se observaron resultados similares cuando el gel se superpuso con L. innocua y L.
monocytogenes. Los triángulos indican la posición de la nisina y la enterocina.

Discusiones

Los mercados mexicanos de alimentos son invadidos continuamente por bebidas artificiales que
tienen poco o ningún valor nutricional significativo. Además, se sabe que muchos de estos productos
contribuyen a la obesidad y la diabetes, entre otras enfermedades, que son perjudiciales para las
familias mexicanas (Barquera et al. 2008; Astudillo 2014). Como alternativa a las bebidas
comerciales, muchos mexicanos en diferentes ciudades y comunidades continúan tomando bebidas
fermentadas tradicionales. Aunque las bebidas fermentadas tradicionales se han asociado con la
presencia de poblaciones microbianas con algunos beneficios particulares para la salud, existe poca
o ninguna información científica que confirme los efectos protectores o nutricionales positivos del
consumo de estas bebidas (ben Omar y Ampe 2000; Sun-Waterhouse 2011 ; Katan 2012; Marsh et
al.2014). Como no se han publicado informes previos sobre LAB cultivables de M-Tuba y Tepache
capaces de sintetizar bacterias, nos interesó caracterizar la microbiota y luego, en trabajos
posteriores, estudiar la microbiota no cultivable a través del análisis metagenómico y también los
beneficios para la salud de estos productos fermentados para obtener información sobre el valor
nutricional-probiótico y los factores microbianos que contribuyen a la integridad de estos
productos. Estas ideas podrían permitir el desarrollo de nuevos productos fermentados utilizando
las bacterias aisladas.

Descubrimos que M-Tuba y Tepache contienen ~ 105 UFC / mL de bacterias mesofílicas, y las
bacterias lácticas (LAB) fueron más abundantes en Tepache que en M-Tuba. En contraste, el número
total de levaduras aisladas de M-Tuba fue mayor que en Tepache. El hallazgo de estos
microorganismos estuvo de acuerdo con informes anteriores que indican que el proceso de
fermentación de M-Tuba es el resultado de la acción de múltiples microorganismos, incluidos
Saccharomyces cerevisiae y LAB y bacterias productoras de ácido acético (Stringini et al. 2009). Se
espera que una microbiota similar pueda estar presente en M-Tuba y Tuba sintetizadas en otros
países (es decir, Toddy, Tuak, Legmi, Mnazi, Emu, Kallu), pero el uso de palma diferente y los
métodos utilizados podrían generar diferencias. para preparar la bebida (Chandrasekhar et al. 2012;
Kadere y Kutima 2012).
La presencia de L. lactics TuAB1 y E. faecium TuAB2 productoras de bacteriocina en M-Tuba, y L.
lactis TeA1 y E. faecium TeA2 en Tepache indican que estas bebidas fermentadas contienen una
fuente natural de antimicrobianos potenciales que podrían jugar un papel en la preservación de
estos productos. De hecho, demostramos que los genes de bacteriocinas, que codifican
supuestamente nisina y enterocina, están presentes, respectivamente, en L. lactis y E. faecium.
Además, los péptidos funcionales correspondientes a estas bacteriocinas se observaron en ensayos
de superposición.

Con respecto al efecto general de las bacteriocinas identificadas en el presente estudio (es decir,
nisina y enterocina), su capacidad para inhibir los organismos patógenos conocidos en nuestros
ensayos in vitro, sugiere que estos péptidos antimicrobianos pueden ser responsables de eliminar o
suprimir no solo la microbiota normal presente en los ingredientes naturales utilizados en la
fabricación de M-Tuba y Tepache, pero también en bacterias conocidas por ser agentes etiológicos
de enfermedades entéricas y de otro tipo, incluidas infecciones sistémicas y meningitis, es decir,
Staphylococcus aureus, Str. agalactiae y especies de Listeria, que podrían introducirse a través de la
contaminación cruzada involuntaria. Aunque las bacteriocinas producidas por LAB aisladas en este
estudio podrían desempeñar un papel principal en la supresión o eliminación de microbios y
comensales potencialmente dañinos presentes en estos productos naturales, se espera que otros
metabolitos contribuyan a la integridad bioquímica de estos productos; estos incluyen ácidos
orgánicos pequeños como los ácidos láctico, acético y fórmico, que acidifican el medio de
crecimiento (Broberg et al. 2007), y 2,3-butadiona, reuterina, acetaldehído y peróxido de hidrógeno
(Schnurer y Magnusson 2005; Pérez et al.2014).

En trabajos futuros, será importante determinar si L. lactics TuAB1 y E. faecium TuAB2 en M-Tuba,
y L. lactis TeA1 y E. faecium TeA2 en Tepache son responsables de las características típicas de esas
bebidas (es decir, aroma, equilibrio correcto de sabor, textura, acidificación, etc.), de modo que
puedan usarse como cepas iniciales para la producción en masa (Amenu 2013; Marsh et al. 2014) o
en la generación de nuevas bebidas fermentadas no lácteas. Además, el potencial de promoción de
la salud de M-Tuba y Tepache podría incrementarse, en interés de los consumidores, mediante la
adición de probióticos certificados (Marsh et al. 2014).

En conclusión, en el presente estudio caracterizamos la microbiota cultivable de Tuba (M-Tuba) y

Tepache mexicanos, y específicamente, identificamos bacterias lácticas candidatas (LAB) presentes
en estas bebidas que eran capaces de sintetizar péptidos antimicrobianos, como nisina, enterocina
y pediocina, que colectivamente podrían proporcionar funciones conservantes de alimentos.