Los métodos basados en el cultivo se utilizan principalmente para el análisis de rutina de productos

concentrados de jugo de frutas, ya que estas técnicas son fáciles de realizar y confiables (Baumgart y
Menje, 2000). Durante los últimos diez años, se han desarrollado muchos métodos de enchapado
directo y medios de agar para la detección y cuantificación de Alicyclobacillus y pueden explicar la
variedad de métodos de aislamiento que se usan actualmente en la industria de bebidas de frutas en
todo el mundo (Murray et al., 2007 ) Los parámetros que juegan un papel importante durante el
aislamiento de Alicyclobacillus a partir de productos concentrados de jugo de fruta son el tipo de medio
de crecimiento y la acidificación, la dilución de la muestra, los pasos de filtración, los tratamientos de
choque térmico, los procedimientos de enriquecimiento previo y el tiempo y las temperaturas de
incubación (Tabla 3) (Murray et al., 2007; Pacheco, 2002; Yokota et al., 2007).

Los medios de crecimiento utilizados con frecuencia para la detección de Alicyclobacillus a partir de
productos concentrados de jugo de frutas son el medio Bacillus acidocaldarius (BAM) y el agar Bacillus
acidoterrestris thermophillic (BAT) (Deinhard et al., 1987a; Eguchi et al., 1999; IFU, 2007), levadura agar
de almidón y glucosa (YSG) (Goto et al., 2006; Matsubara et al., 2002), agar de papa dextrosa (PDA)
(Baumgart y Menje, 2000; Durak et al., 2010; Pinhatti et al., 1997), naranja agar sérico (OSA) (Pettipher y
Osmundson, 2000) y agar K (Chen et al., 2006; Walls y Chuyate, 1998). Se descubrió que los mejores
medios para la recuperación de Alicyclobacillus a partir de concentrados de fruta sin diluir son PDA (pH
3.7) y OSA (pH 5.5) después de la incubación a 50 ° C durante 3-5 días, en comparación con el agar K,
agar YSG y BAM (Witthuhn et al., 2007). Los medios, independientemente del tipo, generalmente se
acidifican a pH 3.5-5.6 por HCl o H2SO4, que se agrega estérilmente después del autoclave para evitar la
hidrólisis del agar. Las temperaturas de incubación están entre 37 y 55 ° C y los tiempos de incubación
varían de 1 a 7 días (Chang y Kang, 2004; Pettipher y Osmundson, 2000; Walls y Chuyate, 1998).

Varios métodos de aislamiento incluyen un tratamiento de choque térmico cuando se prueban materias
primas concentradas, donde es más probable que los aliciclobacilos estén presentes como endosporas
(IFU, 2007; Yokota et al., 2007). El tratamiento de choque térmico se aplica a las muestras para matar las
células vegetativas y obtener una activación y germinación uniforme de las endosporas latentes de
Alicyclobacillus (Yokota et al., 2007). La Asociación Brasileña de Exportación de Cítricos (ABECitrus) y la
Federación Internacional de Productores de Jugo de Frutas (IFU) recomiendan un tratamiento a 80 ° C
(Eguchi et al., 1999; IFU, 2007; Murray et al., 2007). ) Otros tratamientos de choque térmico incluyen 80
° C durante 20 min (Terano et al., 2005), 90 ° C durante 20 min (Wisse y Parish, 1998) y 70 ° C durante 10
min (Jensen, 2000). Un tratamiento de choque térmico a 70 ° C durante 20 minutos se usa con
frecuencia para la activación de endosporas en productos concentrados de frutas y es propuesto por la
Asociación de Jugos de Frutas de Japón (JFJA) (Baumgart y Menje, 2000; Eiroa et al., 1999; Pacheco,
2002; Yokota et al., 2007). Si bien existen varios tratamientos de choque térmico, alguna forma de
tratamiento térmico es esencial para la detección de Alicyclobacillus, ya que una subestimación
constante de los recuentos viables totales de Alicyclobacillus será inevitable si no se aplica un
tratamiento de choque térmico antes del recubrimiento de los medios (Pinhatti et al. al., 1997). Los
tratamientos de choque térmico generalmente son seguidos por procedimientos de incubación de
enriquecimiento previo a 40–50 ° C durante 48 h. Este paso permite la detección de endosporas que
generalmente están presentes en niveles muy bajos en los productos concentrados de jugo de fruta
(Pinhatti et al., 1997; Walker y Phillips, 2008a). Además, se descubrió que la agitación intermitente de
las muestras que se almacenaron a temperaturas subóptimas (30–35 ° C) antes del muestreo aumentó
el crecimiento y las tasas de detección probables de A. acidoterrestris (Walker y Phillips, 2005).